一種用以增加動物攝食量的胜肽的製作方法

2023-04-27 22:20:21

專利名稱：：一種用以增加動物攝食量的胜肽的製作方法
技術領域：
：本發明是關於一種用以增加動物攝食量的誘食劑，特別是關於一種用以增加動物攝食量的胜肽。
背景技術：
：養殖業為一固有產業，在全世界均扮演重要的角色，這是因為它和人們的生活息息相關。養殖業主要的貢獻是為提供人們豐富多樣的食物選擇，以及優良的蛋白質來源。近年來，為了順應時代的潮流，養殖業逐漸朝高科技產業發展。養殖業中，水產養殖業佔了重要的部分。習知水產養殖業的水生動物中，除了少部分為觀賞用途外，大多數為食用用途。養殖業者於養殖時，首要關心的是如何使所養殖的水生動物保持良好的健康狀態，以及如何增加其肉質的肥美度。而想要達成此目的，首要的條件為水生動物需要具有良好的食慾。然而，放養密度、環境變化及性別成熟等壓力因子都可能影響水生動物的食慾。當所飼養的水生動物出現厭食的情況時，通常會造成水生動物生長的遲緩(shiggishness)與死亡率的上升等現象，進而造成養殖產量下降。以石斑魚為例，由於石斑魚肉質細緻且味道鮮美，己成為筵席上的最佳菜餚，因而受到水產養殖業者的喜愛。石斑魚在臺灣的養殖發展已有二十餘年，其中以點帶石斑(￡^"ep/7e/ico/o/des)、馬拉巴石斑(五.w"/a6an'cw力、鞍帶石斑(￡./a"ceo/"ms)，及棕點石斑(￡./kscogwtofus)等魚種為養殖的大宗。但是，石斑魚的詞養相當困難，這系因為石斑魚的攝食量不但會受到前述壓力因子的影響，而且其嘴形也較一般魚種小，並缺乏保存內生性營養(endogenousnutrition)的能力，加上開始攝食的速度較慢等因素所致。故提高石斑魚的食慾為石斑魚養殖重要的一環。為增加水生動物的食慾，即有人提出通過改變餵食時間來增加攝食量的方法，但此種方法對水生動物的食慾並無太顯著的影響。另外，亦有人提出通過控制環境因子，如光照期(photoperiod)(BolUetefa/.，2001)及溫度(Talbota"/.,1999)等，來增進水生動物攝食量的方法。此種方法雖可提高部分水生動物的攝食量，但控制光照期及溫度，需要特殊的設備，這會使得飼養的成本提高，此方式並不符合簡便經濟的原則。習知水生動物食慾是藉由腦部與周邊訊號的交互作用來進行調控。腦部(特別是海馬回)會產生刺激食物攝取(即，促食(orexigenic))或抑制食物攝取(即，厭食(anorexigenic))的重要參與者(actors)。為此，找出水生動物腦中刺激食物攝取的因子，藉由該因子來增加水生動物的攝食量應為一可行的方法。
發明內容為解決前述習知技術的問題，本發明的目的即在於提供一種用以增加動物攝食量的胜肽，藉以提高養殖的動物的攝食量，進而增加養殖產量。根據本發明所指出的用以增加動物攝食量的胜肽，其包含一如SEQIDNO:l所示的胺基酸序列。本發明的另一目的是為提供一種用以增加動物攝食量的組合物，其包含一胜肽片段，以及一藥理上可接受的載物，其中該胜肽片段具有如SEQIDNO:l所示的胺基酸序列。本發明前述的動物，可為畜產動物或水生動物，當為畜產動物時，較佳者為牛、羊、雞或豬，更佳者為雞。當為水生動物時，較佳者為魚類，更佳者為養殖魚類。在此所稱的養殖魚類係指可藉由人工飼養的魚類，較佳為水產養殖業者所養殖的魚類。作為前述的養殖魚類，在此可舉出的例子，包含石斑魚(grouper)、海鱺(cobia)、鯛魚(seabream)、比目魚(halibut)、鮭魚(salmon)、鱒魚(trout)、鯰魚(catfish)、鯉魚(carp)、金魚(goldfish)、吳郭魚(tilapia)與斑馬魚(zebrafish)等，但並不僅限於此。由於本發明的胜肽為一種神經胜肽Y(neuropeptideY，NPY)，這是一種廣泛分布於中心及周邊神經系統中的神經傳遞物質(neurotransmitter)。因此，本發明中的胜肽片段可取自天然的動物尤其是水生動物體中，或以習知的化學合成法合成，也可以用習知的分子生物學方法製備。可知，NPY系屬於G蛋白0耦合接受器超級家族(G-protein-coupledreceptorsuperfamily)的Y接收器(Yreceptor)的調控，經由動物的肌肉、心臟、腎臟、眼睛及腦中的血管收縮(vasoconstriction)作用，參與該動物的生長、繁殖、性別轉換(sexreversal)及血壓調控等過程。此外，NPY能夠影響動物體內的能量平衡以及生熱作用(thermogenesis)。綜上所述，習知的研究結果與公開的文獻中僅指出NPY和動物體的生長、繁殖、能量平衡及生熱作用的可能的關聯性，但並未揭示NPY和動物的食慾調控的任何相關可能性。本發明的又一目的是提供一種用以編碼如前述的用以增加動物攝食量的胜肽的核苷酸片段，其具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本發明的又一目的是提供一種用以篩選能增加動物攝食量的誘食劑的方法，其步驟包含(i)將該誘食劑與一飼料混合，藉以獲得一混合物；(ii)對該動物投予該混合物；(iii)檢測該動物體內如SEQIDNO:1所示的胜肽片段的表現量；以及(iv)以該胜肽片段的表現量高低來判斷該誘食劑對該動物攝食的影響。可應用於本發明前述步驟(iii)中，該胜肽片段的檢測方法的種類在此並沒有特別的限制。習知技藝者可輕易的藉由任何習知的方法檢測該胜肽片段的表現量，例如膠體電泳、西方墨點法、免疫反應法...等，但並不僅限於此；或是藉由檢測能編碼該胜肽片段的mRNA的表現量來判定，作為前述的mRNA的序列，例如由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列所轉錄而成的序列。前述的mRNA表現量的檢測法，例如北方墨點法，但並不僅限於此。本發明的又一目的為提供一種增加動物攝食量的方法，其步驟包含(1)提供一誘食劑，該誘食劑包含如SEQIDNO:l所示的胜肽；(2)提供一動物；以及(3)將該誘食劑投予至該動物的體內。該誘食劑可進一步包含一藥理上可接受的載物。前述的胜肽可取自天然的動物尤其是水生動物體中，或以眾所周知的化學合成法合成，亦可以用習知的分子生物學方法製備，方法如下(a)提供如SEQIDNO:2所示的核苷酸片段；(b)提供一表現載體；(c)將該核苷酸片段與該表現載體重組為一重組表現載體；(d)將該重組表現載體送入宿主細胞中；以及(e)使該宿主細胞表現該胜肽，該宿主細胞可以系酵母菌及動物細胞，但不僅限於此。以E.coli為例，可選定E.coli系統的表現質體後，再選定該表現質體中適當的限制酶切位(restrictionenzymesite),以該限制酶剪切來表現質體，亦以該限制酶剪切含有可編碼本發明的胜肽的核苷酸序列的核苷酸片段，將前述經限制酶剪切後的表現質體及核苷酸片段進行接合反應(ligation)。接著將含有可編碼本發明的胜肽的核苷酸序列的co//系統表現質體轉形(tmnsform)入E.coli菌體中，E.coli可為E.coliBL21TM(DE3)pLysS，轉形可用電轉形(electro-transformation)或熱休克(heatshock)等任何習知的轉形技術來進行，轉形後用誘導物(inducer)誘導Eco//表現本發明的胜肽，誘導物可為IPTG等習知誘導物。以酵母菌為例，則可選定酵母菌系統的表現質體及該表現質體中適當的限制酶切位後，以該限制酶剪切該表現質體，亦以該限制酶剪切含有可編碼本發明的胜肽的核苷酸序列的核苷酸片段，將以限制酶剪切後的表現質體及核苷酸片段進行接合反應。接著將含有可編碼本發明的胜肽的核苷酸序列的酵母菌系統的表現質體轉形入酵母菌中，轉形可用任何習知轉形技術來進行，例如可先去除酵母菌的細胞壁，使酵母菌形成原生質球狀體(spheroplast)再進行轉形，或是用鹼性陰離子(如LiCl或RbCl)加上熱休克來處理酵母菌以進行轉形，轉形後用誘導物誘導酵母菌表現本發明的胜肽，誘導物可為IPTG等習知誘導物。以動物細胞為例，可選定動物細胞系統的表現質體及該表現質體中適當的限制酶切位後，以該限制酶剪切該表現質體，亦以該限制酶剪切含有可編碼本發明的胜肽的核苷酸序列的核苷酸片段，將以限制酶剪切後的表現質體及核苷酸片段進行接合反應。接著將含有可編碼本發明的胜肽的核苷酸序列的動物細胞系統的表現質體轉染入動物細胞中，該動物細胞可為昆蟲細胞或哺乳動物細胞，轉染可用任何習知轉染技術來進行，如用微脂粒感染法(lipofection)或磷酸鈣(calciumphosphate)法來表現本發明中的胜肽。此外，為使本發明增加動物攝食量的方法處理的動物的攝食量能有效提升，前述的誘食劑可經由口服、注射或經鼻滴入的方式投予至該動物的體內。口服可以通過直接口服或添加於飼料中。當以口服方式投予時，為避免該誘食劑於通過該動物的消化道時被消化道中的消化液所破壞，該誘食劑可進一步藉由習知技術將其進行微包埋處理，以增強其對抗消化液的能力。作為本發明前述注射方式的例子，包括靜脈注射(IV)、肌肉注射(IM)及腹腔注射(IP)等，但並不僅限於此。當以靜脈注射方式投予至動物體內時，為使其能發揮最大的效果，該誘食劑較佳系注入該動物的腦部，更佳系注入該動物的側腦室。本發明的組合物或胜肽，可促進動物食慾，因此可增加動物攝食量，提升動物的生長表現，並能減少飼料餵食後的殘留量。另外，本發明的組合物或胜肽還可使動物初次開始攝食飼料的時間提早，以及縮短動物攝食的時間。本發明將藉由下述的實施方式做進一步的說明，下列的實例乃用以闡明本發明，並非用以限定本發明的範圍。熟習本發明的技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可做些許的改良與修飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。關於本發明的優點與精神可以藉由以下的發明詳述及附圖得到進一步的了解。圖1A為npy在石斑魚不同組織的基因表現。圖1G為npy在石斑魚不同組織的基因相對於P-肌動蛋白的表現。圖2A為石斑魚在安排餵食(scheduledfeeding)下npy的基因表現。圖2B為石斑魚在安排餵食下npy的基因相對於3-肌動蛋白的表現。圖3A為石斑魚在限制飲食下npy的基因表現。圖3B為石斑魚在限制飲食下叩y的基因相對於P-肌動蛋白的表現。圖4為石斑魚在食物剝奪下腦部npy的基因相對於P-肌動蛋白的表現。圖5A為石斑魚魚苗不同階段的形態。圖5B為石斑魚魚苗不同階段叩y的基因表現。圖5C為石斑魚魚苗不同階段npy的基因相對於3-肌動蛋白的表現。圖6為正常的石斑魚和厭食(anorexia)的石斑魚的叩y基因相對於P-肌動蛋白的表現。圖7為投予雞NPY胜肽後雞的攝食量的變化。具體實施方式實施例1本發明的胜肽片段的製備首先按照Chomczynski和Sacchi的方法(1987)從石斑魚(點帶石斑(Eco/o^^))的組織分離總(total)RNA。接下來，從10嗎總RNA合成cDNA，使用的系含有200UMolony鼠類血癌病毒反轉錄酶(Molonymurineleukemiavirusreversetranscriptase)、1mMdNTP、160URNase抑帝U齊!j(inhibitor)及1.6jig隨機引子(randomprimer)的1X反轉錄緩衝液。在42'C進行轉錄30分鐘。接著以PCR放大(amplify)npy基因，PCR系使用含有20嗎反轉錄產物、0.5UTaqDNA聚合酶及1嗎正反向npy引子的80plIXPCR緩衝液，正相npy引子具有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，反相npy引子具有如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。PCR會在DNA溫度循環反應器(thermalcycler)進行，PCR步驟為在55。C緩冷配對(annealing)1分鐘30秒，在72。C延長(extension)1分鐘30秒，在94"C變性(denaturation)1分鐘。共35個循環(cycle)。PCR反應終止後，取15^1的PCR產物以2M洋菜膠體(agamsegd)作電泳分析，接著進行溴乙烯(ethidiumbromide)染色。純化的PCR產物會被選殖進M13mpl8或pBluescript的Smal位置，並會以雙脫氧核醣鏈停止法(dideoxynucleotidechaintermination)定序。npy基因經定序後得到如SEQIDNO:2所示的序列。另一方面，將純化的PCR產物與表現載體pET31b(+)分別以限制酶力wNI剪切，再將剪切後的PCR產物及pET31b(+)進行接合反應，將接合反應後所得含有PCR產物的pET3lb(+)轉形至表現宿主co//BL21TM(DE3)pLysS中，在37。C下以200rpm振蕩培養，並以不同濃度的IPTG進行誘導(induce)，結果以1mMIPTG誘導的效果最好。以12%SDS-PAGE分析，發現￡.co//BL21TM(DE3)pLysS所表現的NPY胜肽位於不可溶蛋白部分，其分子量約為26.4kDa，西方墨漬法亦證明其確為NPY胜肽。將所得不可溶蛋白部分以組胺酸親和層析法(His'Bind⑧chromatography)進行純化，接著以溴化氰(CNBr)進行剪切，藉此可得到純化的NPY胜肽。實施例2npymRNA在石斑魚體內的分布依Chomczynski及Sacchi的方法(1987)分離石斑魚(點帶石斑)的腦、鰓、心臟、肝臟、胃、腸、腎臟、脾臟、肌肉及血液的總RNA。再以寡(dT)(oligo(dT》纖維素分離聚(A)mRNA，方法為加1體積的結合2X緩衝液(binding2Xbuffer)到100-300u1的總RNA中，在65。C加熱RNA混合物10分鐘，接著冷卻到室溫。將RNA混合物加到1ml在結合IX緩衝液中的寡(dT)纖維素，在室溫溫和搖動15分鐘讓RNA和寡(dT)纖維素結合。接著在1,500xg離心15分鐘，離心後丟棄上清液。加500"l洗滌緩衝液(washbuffer)到寡(dT)纖維素，溫和搖動幾秒鐘。接著在1,500xg離心2分鐘，離心後丟棄上清液。加200iU洗提緩衝液(elutionbuffer)到寡(dT)纖維素並溫和搖動數分鐘。在1，500xg離心5分鐘，將上清液移到新的試管中。加0.1ml3M醋酸鈉及2.5體積乙醇到上清液中，加以混合併置於-2(TC整夜。在12,000xg離心15分鐘，所得沉澱物即為聚(A)mRNA。以lml70。/。乙醇洗滌沉澱物，在真空下使沉澱物乾燥，並將沉澱物再懸浮於適當體積的TE緩衝液，將懸浮液儲存於-7(TC。將聚(A)mRNA絞碎(mince)在10ul的反轉錄預混合物(premixture)中。反轉錄混合物的最終組成為10mMTris-HCl(pH8.3)、90mMKC1、1mMMnCl2、0.2mMdNTP、1mM寡(dT)、5mM隨機六聚物引子(randomhexamerprimer)及1.25單位的r77zDNA聚合酶(DNApolymerase)(Perkin-Elmer，CA)。將反轉錄混合物樣品在IOO(TC加熱1分鐘，在7(TC培養15分鐘，接著在42°C5分鐘以進行反轉錄。在反轉錄反應後，加入40ul的螯合(chelating)混合物(5V。甘油、10mMTris-HCl(pH8.3)、100mMKCl、0.75乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethyleneglycol-bis(b-aminoethylether)-N-tetraaceticacid，EGTA)、0.05%Tween20、1.5mMMgCl2及0.25mM叩y的每一正向引子和反向引子)，接著進行六十回的PCR(94。Cl分鐘，62°C2分鐘，72°C3分鐘)。PCR反應終止後，接著進行南方墨點法(Southernblot)。方法為先以1.2%洋菜膠體分析PCR產物，再轉印到尼龍膜(nylonmembrane)上，並以UV交連(cross-linked)。雜交(hybridization)系在55°C於雜交溶液及以DIG(digoxigenin，洋地黃毒)-l1-dUTP標定(DIG-1l-dUTP-labeled)的叩ycDNA探針中進行。接下來在室溫以5ml洗滌液I(washsolutionI)洗滌膜一次，在65°C以洗滌液II洗滌膜二次，並於10ml阻斷液(blockingsolution)中進行阻斷。以阻斷液稀釋抗DIG-AP(alkalinephosphatase,鹼性磷酸酶)標定物(conjugate)至濃度74mU/ml，將阻斷後的膜在10ml此抗DIG-AP溶液反應30分鐘，並在10ml偵測緩衝液(detectionbuffer)平衡2-5分鐘。最後進行呈色反應(coloringreaction),將膜置於10ml新鮮製備的顏色-受質溶液(color-substratesolution)中，並在黑暗中封於一盒內進行反應，以加入50ml的水來終止呈色反應。南方墨點法的結果(圖1A)可見到npymRNA在石斑魚腦部有顯著的表現。將該結果以STORMTM系統定量，且和用對P-肌動蛋白(P-actin)專一的探針獲得的量做比較。每一組織的平均值被用來測定npy:3-肌動蛋白的訊號比值(pX).05)。統計值以ANOVA(變異數分析)系統計算。相對npymRNA的量以6次SE的平均來表現。數據經單因子變異數(one-wayANOVA)分析，接著進行Student-Newman-Keuls多重比較(multiple-comparisons)試驗。P=0.05被認為是顯著的。圖lB為npy在石斑魚不同組織的基因相對於P-肌動蛋白的表現，當中可見到npymRNA在腦、鰓、肝臟及胃中都有表現，特別是腦中的表現量特別高，因此，可知NPY主要表現於腦部，必要時可從腦部進行分離。實施例3石斑魚在安排餵食(scheduledfeeding)下n。y基因表現本實施例共有七個實驗群組，每一群組包含10-12隻己適應65公升水族箱的石斑魚(點帶石斑)。所有的魚每天在安排的時間(下午3點)被餵食體重2%的飼料。在實驗日，石斑魚群組在安排的餵食時間前2小時、l小時、0小時(即安排的餵食時間)被犧牲，或在安排的餵食時間後15分鐘、0.5小時、1小時、2小時被犧牲。以和實施例2相同的方法對npymRNA的量進行偵測以及統計分析。圖2A為石斑魚在安排餵食(scheduledfeeding)下npy的基因表現，當中可見到石斑魚腦中npymRNA的量在安排的餵食時間(Oh)最高。圖2B為石斑魚在安排餵食下npy的基因相對於3-肌動蛋白的表現，可看到在石斑魚腦中，安排的餵食時間前兩小時(-2h)，npymRNA的量顯著較安排的餵食時間前1小時(lh)、安排的餵食時間(Oh)及安排的餵食時間後15分鐘(+(X25h)低，且可見至lj,在安排的餵食時間(0h)的前，隨安排的餵食時間的接近，npymRNA的量逐漸上升，在安排的餵食時間(Oh)達到最高，安排的餵食時間(Oh)後就開始下降。從本實施例可看到，npy基因的表現和禁食(fasting)間具有交互作用，npy基因表現量在禁食時上升，而在餵食後下降。由此可知，npy基因的表現和食慾有關，食慾上升時npy的基因表現量上升；食慾下降時npy的基因表現量下降。實施例4限制飲食增加石斑魚npy基因表現本實施例共有三個實驗群組，每一群組包含12隻已適應65公升水族箱的石斑魚(點帶石斑)。一群組餵食正常體重2%的飼料，另外兩個群組分別餵食體重1%和0.5%的飼料，共餵食7天。7天後魚被犧牲且其腦組織被收集。以和實施例2相同的方法對npymRNA的量進行偵測以及統計分析。圖3A為石斑魚在限制飲食下npy的基因表現，當中可見到當飼料量從20/。體重(控制組)降到1%體重及0.5%體重時，石斑魚腦部npymRNA的量顯著上升。而經P-肌動蛋白校正後，在圖3B可看到更顯著的結果。由此可知，石斑魚營養的不足會活化npy在石斑魚腦部的表現，再次推知npy基因的表現和石斑魚的食慾具有相關性，石斑魚食慾增加時叩y基因的表現亦增加。實施例5食物剝奪增加石斑魚npy基因表現本實施例的每一實驗群組包含12隻已適應65公升水族箱的石斑魚(點帶石斑)。控制組的魚餵食正常體重2%的飼料(0小時)，剩下的群組分別食物剝奪24、48、72、96、120及144小時。所有群組均在食物剝奪期間的最後被犧牲以取得腦組織。以和實施例2相同的方法對npymRNA的量進行偵測以及統計分析。圖4為石斑魚在食物剝奪下腦部npy的基因相對於3-肌動蛋白的表現，當中可見到和正常餵食的石斑魚比較，食物剝奪24小時並未顯著改變npymRNA的量，然而，食物剝奪48、72、96、120及144小時則造成npymRNA的量顯著改變，特別是在食物剝奪72小時的時候叩ymRNA的量上升了將近兩倍。本實施例中，食物剝奪造成石斑魚腦部和時間相關，且相當顯著的npymRNA量的上升。可知食物剝奪活化了腦部npy基因的表現及可能的蛋白質合成。又一次證明了NPY的表現和石斑魚的食慾間的相關性，石斑魚食慾上升時npy基因表現亦上升。實施例6石斑魚魚苗攝食增加npy基因表現以和實施例2相同的方法對npymRNA的量進行偵測，並以和實施例2相同的方法對npymRNA的量及食物攝取進行統計分析。圖5A為石斑魚魚苗不同階段的形態，當中Ll為孵化期(hatchingstage);L2為專性內生攝食(obligateendogenousfeeding)時(即卵黃吸收(yolkabsorption)),其時嘴被口咽膜(oropharyngealmembrane)覆蓋；L3為開口期(openmouthstage),其時口咽膜被破壞。孵化後的石斑魚(點帶石斑)幼魚(post-hatchinglarvae)以半定量RT-PCR分析其npy基因表現(圖5B)，再以3-肌動蛋白校正(圖5C)，指出在Ll及L2npy基因表現較低。而npy基因表現量在L3時顯著較高，且幼魚的後很快就開始攝食。可見npy基因表現和石斑魚攝食間具有正相關性。實施例7厭食(anorexia)的石斑魚n。y基因表現下降以和實施例2相同的方法對npymRNA的量進行偵測以及統計分析。本實施例中取得具有臨床厭食症狀的石斑魚(點帶石斑)，該些石斑魚顯示出生長緩慢、攝食不足、遲緩(sluggishness)、厭食(anorexia)、高死亡率(highmortaiity)及身體形狀改變等現象。這些具有臨床厭食症狀的石斑魚，其npymRNA的量下降了兩倍(請參閱圖6)。由本實施例可知石斑魚食慾下降時，其npymRNA表現量亦下降，因此可推知npymRNA表現量上升時，石斑魚的食慾亦上升。實施例8在石斑魚側腦室注射NPY胜肽增加石斑魚的攝食量以化學合成法合成NPY胜肽。依照Narnaware等人(1999)的描述，石斑魚(點帶石斑)在側腦室注射(intracerebroventricularinjection)後隨即回到試驗水族箱中，在2-5分鐘內會從麻醉恢復。為了正確測量每隻魚所消耗的食物量，攝食基值在側腦室注射前30分鐘被記錄。給予體重2%的詞料的石斑魚正常會在30分鐘內消耗飼料的50-75%。在實驗日，控制組的魚或不處理，或側腦室注射鹽水溶液(salinesolution)。進行側腦室注射15分鐘後，體重2%的飼料被加入槽中。在預備(preliminary)試驗中，注射NPY的魚在30分鐘的觀察期被觀察到消耗了體重的2%飼料，因此，在整個攝食實驗中均維持消耗體重的2%飼料。在飼料進入槽後立刻開始觀察攝食行為。依照Volkoff等人所描述的(1999)，攝食行為被定義為"完全(complete)"和"不完全(incomplete)攝食行為"。完全的攝食行為定義為魚接近飼料並消耗它。不完全的攝食行為定義為魚接近飼料並以閉著的嘴碰或撞它，或將飼料攝入口中接著吐出。完全及不完全的攝食行為均在給予伺料30分鐘內被記錄。每一條魚消耗的食物被轉換為30分鐘內溼體重(wetbodyweight)所消耗的食物毫克數，用飼料的平均重量來計算。每日在注射前3小時給予詞料，以確保石斑魚在攝食試驗時是飽足的。注射前，石斑魚在含有魚保安(tricainemethanesulphonate)(MS222,1:10，000)的水中被麻醉，在失去平衡後，石斑魚隨即在下午3點到3點半的間被注射。注射合成的石斑魚NPY(5-10ng/體重)後，食物攝取在下午3點到3點半的間，側腦室注射20分鐘後被測量。以和實施例2相同的方法對完全攝食及不完全攝食進行統計分析。在下午3點到3點半，比較單一側腦室注射石斑魚NPY(5-10ng/體重)和注射鹽水的石斑魚，可見到兩者在食物攝取上顯著的差異。腦部側腦室注射石斑魚NPY顯示以和劑量相關的方式刺激石斑魚攝食。和注射鹽水的群組比較，注射5ng/體重的NPY會增加近兩倍的食物攝取。本發明中，注射鹽水和未注射的控制組在食物攝取上沒有差異。本實施例直接證明了腦中NPY的增加，的確會增加石斑魚食物攝取的增加。實施例9對NPY胜肽進行微包埋處理本發明中微包埋處理包括了溶媒揮發法(solventevaporation)以及褐藻酸鈉乳化法(sodiumalginate),溶媒揮發法系以一修飾過的溶煤揮發技術，將聚合微粒球(polymericmicrosphere)和NPY胜肽以三種不同比例一同膠囊化(co-encapsulate)。將卵白蛋白(ovalbumin)做為致孑L齊U(pore-formingagent)使NPY胜肽在體內得以釋放出來，卵白蛋白並可用來穩定NPY胜肽使其活性延長。前述的褐藻酸鈉乳化法，系將4重量％的NPY胜肽和20重量％的油混合，超音波振蕩IO秒以使NPY胜肽均勻的分散在油裡，再加入20重量％的褐藻酸鈉水溶液及2.5重量％的乳化劑(膽鹽)，超音波振蕩以形成水包油乳化液(oil-in-wateremulsion),該水包油乳化液中含有直徑15um的散布NPY胜肽的油滴。再加入2.5。/。硫酸鋁(Al2(S04)3)水溶液至100重量％以硬化褐藻酸鈉，最後進行冷凍乾燥即完成微包埋處理。實施例10投予雞NPY胜肽增加雞的攝食量將一日年齡大的雄肉雞飼養於無窗的房間，溫度固定在2sr並持續給予光照，雞可自由攝取市售初級飼料(starterdiet)及水。將雞分為四組，其中一組為注射組、二組為餵食組及一組為經鼻滴入組。注射組中，雞在第一天以微注射器(microsyringe)對雞靜脈注射10ug/10y1的NPY胜肽；餵食組中系將實施例9的經微包埋處理的NPY胜肽以370或740ppm的比例混合於雞飼料中，並讓雞在兩星期內自由攝食該飼料；經鼻滴入組中則系在第一天從雞的鼻子滴入10ug/10iU的NPY胜肽。兩個星期中每天測量食物攝取的情形，其系藉由測量預稱重的雞，其飼料消失的情形。雞的體重系由一準確度土lmg的電子數字秤來測量。由測量結果可知，以餵食的方式給予NPY胜肽，增加了雞20%的食物攝取量，結果請參閱圖7。由此可見，NPY胜肽不僅在水生動物可增加其食物攝取，對於畜產動物，也確實有增加其食物攝取的功能。實施例11NPY在不同動物的序列比對將具有如SEQIDNO:1所示序列的NPY胜肽和海鱺(cobia)做比對，發現兩者序列完全相同。亦將具有如SEQIDNO:1所示序列的NPY胜肽和其它動物，包括比目魚(halibut)、鱒魚(trout)、鯰魚(catfish)、鯉魚(carp)、金魚(goldfish)及斑馬魚(zebrafish)、雞(chicken)、牛(cow)、羊(sheep)等的NPY，進行序列比對。從表一中可以看到，SEQIDNO:1所示序列的NPY胜肽，其序列和所有進行比對的動物的NPY都具有很高的相似性(similarity)。憑此推論可知，本發明的胜肽亦應能促進其它物種的動物的攝食量。由上述說明及實施例可知，在安排餵食、限制飲食及食物剝奪下石斑魚NPY的基因表現，及石斑魚魚苗不同階段的NPY基因表現，還有厭食(anorexia)的石斑魚的NPY基因表現，均證實NPY的基因表現和石斑魚的食慾成正相關，npymRNA表現量上升時，石斑魚的食慾亦上升。在石斑魚側腦室注射NPY對攝食的影響更直接證明當NPY胜肽的量增加時，確實會增加石斑魚的攝食量，增加的攝食量可達原本的兩倍的多。投予雞NPY胜肽時，也可增加雞的攝食量。此外，NPY在不同動物的序列比對證實了本發明的胜肽和所試驗的動物均具有高度相似性，因此，本發明所提供的胜肽，確實具有促進動物攝食的功能。藉由以上較佳具體實施例的詳述，希望能更加清楚描述本發明的特徵與精神，而並非以上述所揭露的較佳具體實施例來對本發明的範疇加以限制。相反地，其目的是希望能涵蓋各種改變及具相等性的安排於本發明所欲申請的專利範圍的範疇內。表一tableseeoriginaldocumentpage18序列表<110〉吳金洌陸振岡〈120〉一種用以增加動物攝食量的胜肽〈160〉4Patentlnversion3.31PRT點帶石斑(Epi卿heluscoioides)1TyrProValLysProGluAsnProGlyAspAspAlaProAlaGluAsp151015LeuAlaLysTyrTyrSerAlaLeuArgHisTyrlieAsnLeulieThr202530ArgGinArgTyr35〈210>2108DNA點帶石斑(Epin印heluscoioides)2tacccggtgaaaccgg3gaaccctggggatgacgccccggcggaggacctggccaagtac60tactcagccctgagacactacattaacctcat;cacaagacagaggtat108321腿〈213〉點帶石斑(Epin印heluscoioides)3gcgcaaatctccctctcatcc21〈210〉421〈212〉DNA〈213>點帶石斑(Epin印heluscoioides)4tgccctcctccactttactgt2權利要求1.一種用以增加動物攝食量的胜肽，該胜肽具有如SEQIDNO1所示的胜肽序列。2.根據權利要求1所述的胜肽，其中該動物為畜產動物。3.根據權利要求2所述的胜肽，其中該畜產動物選自牛、羊、雞以及豬所組成的群組。4.根據權利要求3所述的胜肽，其中該畜產動物為雞。5.根據權利要求1所述的胜肽，其中該動物為水生動物。6.根據權利要求5所述的胜肽，其中該水生動物為魚類。7.根據權利要求6所述的胜肽，其中該魚類為養殖魚類。8.根據權利要求7所述的胜肽，其中該養殖魚類選自石斑魚、海鱺、鯛魚、比目魚、鮭魚、鱒魚、鯰魚、鯉魚、金魚、吳郭魚以及斑馬魚所組成的群組。9.一種用以增加動物攝食量的組合物，其包含根據權利要求1所示的胜肽序列，以及一藥理上可接受的載物。10.根據權利要求9所述的組合物，其中該動物為畜產動物。11.根據權利要求10所述的組合物，其中該畜產動物系選自牛、羊、雞以及豬所組成的群組。12.根據權利要求ll所述的組合物，其中該畜產動物為雞。13.根據權利要求9所述的組合物，其中該動物為水生動物。14.根據權利要求13所的的組合物，其中該水生動物為魚類。15.根據權利要求14所述的組合物，其中該魚類為養殖魚類。16.根據權利要求15所述的組合物，其中該養殖魚類選自石斑魚、海鱺、鯛魚、比目魚、鮭魚、鱒魚、鯰魚、鯉魚、金魚、吳郭魚以及斑馬魚所組成的群組。17.—種用以篩選能增加動物攝食量的誘食劑的方法，步驟包含(i)將該誘食劑與一詞料混合，藉以獲得一混合物；(ii)對該動物投予該混合物；(iii)檢測該動物體內根據權利要求l所示的胜肽片段的表現量；以及(iv)以該胜肽片段的表現量高低來判斷該誘食劑對該動物攝食的影響。18.—種編碼根據權利要求1所述的胜肽的核苷酸片段，其包含如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。19.一種增加動物攝食量的方法，其步驟包含(1)提供一誘食劑，該誘食劑包含根據權利要求1項所示的胜肽；(2)提供一動物；以及(3)將該誘食劑投予至該動物的體內。20.根據權利要求19所述的方法，該誘食劑進一步包含一藥理上可接受的載物。21.根據權利要求19所述的方法，其中該誘食劑是以口服的方法投予至該動物的體內。22.根據權利要求21所述的方法，其中該誘食劑經過微包埋處理。23.根據權利要求19所述的方法，其中該誘食劑是以注射的方法投予至該動物的體內。24.根據權利要求23所述的方法，其中該誘食劑是以靜脈注射的方法投予至該動物的體內。25.根據權利要求24所述的方法，其中該誘食劑是以靜脈注射的方法投予至該動物的腦部。26.根據權利要求25所述的方法，其中該腦部係為側腦室。27.根據權利要求23所述的方法，其中該誘食劑是以肌肉注射的方法投予至該動物的體內。28.根據權利要求23所述的方法，其中該誘食劑是以腹腔注射的方法投予至該動物的體內。29.根據權利要求19所述的方法，其中該誘食劑是以經鼻滴入的方法投予至該動物的體內。全文摘要本發明關於一種用以增加動物攝食量的胜肽，該胜肽具有如SEQIDNO1所示的胜肽序列。本發明的胜肽可用以有效增加動物的食慾，以提升其攝食量，藉以促進該動物生長，使該動物的肉質更為肥美，並增加養殖的產量。文檔編號A61K38/17GK101113171SQ20061010390公開日2008年1月30日申請日期2006年7月26日優先權日2006年7月26日發明者吳金洌,宋嘉軒,陸振岡申請人:吳金洌;陸振岡