聚合物/生物實體合金的製備方法與流程

2023-04-27 02:59:26 2

技術領域

本發明涉及石化工業衍生的和/或生物來源的聚合物材料的製備方法，在聚合物材料的組成中含有生物實體，其選自能夠使其降解的酶和微生物。

背景技術：

近些年來，特別是在塑料領域，聚合物材料已被密集使用。這種普遍的密集使用已由環境中積聚的塑料反映出，這是視覺滋擾、廢地叢生以及土壤和海洋介質的汙染的根源。由於聚合物材料本身固有的特性，特別是它們的耐降解，衍生自這些材料的廢物的處理目前構成真正的環境和經濟問題。

目前，已提出幾種解決方案，其中之一是可生物降解塑料材料。它們的配方是特別針對適於環境微生物降解的。然而，這種降解通常是部分發生。此外，降解需要極其有利的條件，這特別在標準EN 13432中有詳細描述。這些條件在人工條件下才能遇到，比如工業堆肥。例如，這些材料通常在40℃以上的溫度降解。從能源和財務的角度看，要實現這些溫度條件是非常昂貴的。

處理廢物的標準替代方案，如焚燒或傾倒在垃圾場，證明是有害的，甚至當它們應用於可生物降解材料時，因為其降解並不完全發生。

此外，可生物降解材料在物理性能上，特別是對潮溼、溫度以及機械拉伸的耐受性方面有缺陷。這些缺陷使它們不適合用於標準塑料加工操作，如注射成型或擠出，同時它們也不適合有針對性的應用。

因此，這些可生物降解的材料，雖然有前途的，但不能滿足工業和環境要求。

已有人提出在由聚合物組成的材料中添加植物性填料以提高所述材料的可降解性。然而，降解是由於所述植物性填料的降解，這必然導致部分降解。此外，這種解決方案證明並不完善，因為它沒有保留聚合物的機械性能。也因此限制了這種材料在塑料加工領域的應用。

因此，需要可生物降解的材料，其具有與石化來源塑料相同的機械性能，且適用於塑料加工的標準操作。所述材料能夠以可接受的降解速率完全降解，且在與自然環境中通常發生的那些相適應的溫度、pH和溼度條件下完全降解。

技術實現要素：

經過長期深入的研究，本發明人已經研發出一種聚合物材料的製備方法，在該聚合物組成中含有使其能夠降解的生物實體。由此製得的聚合物材料或聚合物/生物實體合金(polymer/biological entities alloy)所具有的物化性能使其能夠在含水條件下完全降解而同時在固態條件下保持穩定。

本發明因此涉及一種聚合物/生物實體合金的製備方法，其包括在熱處理過程中，將聚合物與降解它的生物實體混合的步驟，所述熱處理在高於室溫的溫度T下進行且所述生物實體對所述溫度T耐受，其特徵在於所述生物實體選自能夠降解所述聚合物的酶和能夠降解所述聚合物的微生物。本發明人已表明，令人驚奇且出乎意料的是，這個製備方法使生物實體包含在固體聚合物的特有結構中，同時能夠保持所述生物實體的酶活性。

不希望受理論約束，當所述生物實體是一種酶時，本發明人提出一種假說：溫度的升高伴隨著聚合物中羥基的氣化，從而激活了酶。這種酶的激活引起聚合物的開始水解並因此玻璃化覆蓋酶表面。酶然後得以保護。

本發明人也已表明生物實體的存在實質上提高了所述合金的可降解性且沒有影響聚合物的機械性能。因此，所述合金的機械性能與單獨聚合物的機械性能非常類似，甚至完全相同。通過測定彈性、熔體流動指數、拉伸參數(如最大拉伸應力、斷裂伸長率、拉伸楊氏彈性模量)可以確定這些機械性能。因此，根據本發明的製備方法獲得的合金非常適合塑料加工的標準操作。

本發明人已表明，令人驚奇的是，生物實體在本發明的合金中保持酶活性。此外，所述合金不在溶液中時，保持穩定。只有當本發明的合金置於溶液中時，生物實體才被激活。因此，這些生物實體的存在使得可以控制本發明的合金的降解條件和降解率。

因此，本發明的合金具有不在溶液中時穩定的優點，一方面，這便於材料的儲存和運輸，另一方面，這表明存在一個生物實體的活化的「釋放」效果(或延遲效應)。這種釋放效果非常有利，因為這使得可以控制酶活性的激活和本發明合金的降解。

術語「聚合物/生物實體合金」和「本發明的合金」是指一種在其組成中含有使其能夠降解的生物實體的聚合物。因此這樣的表述包含聚合物/酶合金和聚合物/微生物合金。

術語「生物實體」是指一種酶或一種微生物。在本法明的上下文中，所述生物實體具有能夠降解目標聚合物的特點。

術語「聚合物/酶合金」是指一種在其組成中含有使其能夠降解的酶的聚合物。優選地，所述聚合物是可生物降解聚合物。使用可生物降解聚合物作為完成製備的起始材料能夠獲得具有更有利的降解性能的聚合物/酶合金。

術語「聚合物/微生物合金」是指一種在其組成中含有使其能夠降解的微生物的聚合物。通常，這些微生物產生降解所述聚合物的酶。

術語「熱處理」是指在所述聚合物溫度升高的過程中，全部聚合物的轉化操作，優選地，溫度高於室溫，更優選地，溫度高於50℃。優選地，所述熱處理允許包含生物實體。更優選地，所述熱處理由一種操作構成，所述操作選自擠出、注射成型、熱成型、旋轉成型、壓縮、壓延、熨燙、塗覆、分層、膨脹、拉擠、擠出吹塑、擠出膨脹和壓縮制粒。這些操作可以在聚合物液態或固態的形式下進行。在一個優選實施方案中，聚合物是固態形式。在另一個實施方案中，所述聚合物是漿的形式。

術語「室溫」通常的是指20℃到30℃之間的溫度，更優選的溫度為約25℃。

術語「擠出」是指使用擠出機將顆粒或粉末形式的材料製成所需形式的聚合物。此術語包含型材擠出、擠出吹塑，擠出膨脹和擠出壓延。

擠出步驟在所述聚合物的熔點下進行。該聚合物此時處於部分或完全熔融狀態。溫度因此取決於所述聚合物的性質和目標生物實體的性質。本領域技術人根據其常識，可以容易地確定此溫度。在溫度和壓力的作用下，處於部分或完全熔融狀態的所述可生物降解聚合物與其它起始材料混合，特別是降解其的生物實體。優選地，所述溫度T在所述聚合物的玻璃體轉化溫度和熔點之間。更優選地，所述溫度T是所述聚合物的熔點。通常，所述溫度T取決於所述聚合物的性質和目標生物實體的性質，且其大於50℃,優選地大於60℃,優選地大於70℃,優選地大於80℃,優選地大於90℃,優選地大於100,優選地大於120℃,優選地大於140℃,優選地大於150℃。通常，此溫度T不超過300℃。

擠出機的主要功能是通過溫度和壓力的作用使聚合物能夠通過位於其末端的模具。通常，擠出機由一個或多個具有不同溫度水平的加熱護套、一個或兩個將材料沿加熱護套輸送的阿基米德螺杆、一個用於使顆粒或粉形式的待擠出材料進料到不同點的料鬥、一個位於加熱護套末端並賦予連續湧出的塑料材料所需的形狀和尺寸的更複雜或更不複雜的模具。優選地，擠出步驟在以名稱為Clextral出售的BC21雙螺杆擠出機上進行。

擠出步驟的運用屬於本領域技術人員的正常能力範圍內。通常按以下步驟進行：

-加入聚合物和降解其的生物實體的混合物；

-所述混合物通過擠出機；

-通過模具輸出杆狀物；

-冷卻所述杆狀物，可選擇性地後續加以乾燥；

-切割成作為所需形式的函數的規則顆粒形式；和

-乾燥，優選地，在迴轉爐中，在約40℃和約60℃的溫度間乾燥，更優選地，在約50℃的溫度乾燥。

通常，生物實體/聚合物的重量比在約0.1％至約10％之間，優選地在約0.5％至約8％之間，優選地在約1％至約6％之間，優選地在約1％至約5％之間，優選地在約1％至約4％之間，優選地在約1％至約3％之間，優選地在約1.5％至約3％之間，甚至更優選地，這一比率約為2％。本領域技術人員可採用作為生物降解聚合物的性質、所用生物實體的性質和所需結果，特別是通過本製備方法所獲得的合金的降解能力的函數的比率。

優選地，本發明方法還包括添加一種可以優化所述生物實體的降解能力的物質。通常，當所述生物實體是酶時，這些物質可以是所述酶的輔助因子，如二價陽離子。

在本發明的上下文中，術語「聚合物」包括來源於石化工業的聚合物、生物來源的聚合物和生物基聚合物。

在一個具體實施方案中，在本發明的上下文中相關的聚合物來源於石化工業。這些聚合物的優點是聚合過程和基本成分可控，其可確保容易轉化。通常，它們含有包含可水解鍵的單體單元，如酯或醯胺。

這些單體的非限制性列表包括己內酯、四亞甲基琥珀酸酯、酯、酯醯胺、丙烯，C1-C6的羥基鏈烷酸酯和己二酸-對苯二甲酸-丁二醇酯。

與實施本發明有關的聚合物的非限制性列表包括聚己內酯、聚四亞甲基琥珀酸酯、共聚酯、聚酯醯胺、聚丙烯、乙烯聚合物、聚(C1-C6羥基鏈烷酸酯)和聚(己二酸共-苯二甲酸-丁二醇酯)、醋酸纖維素、聚(琥珀酸丁二醇酯)和聚醯胺以及它們的混合物。

通常，所述聚醯胺是脂肪族聚醯胺，其選自：

聚己內醯胺(PA6),

通過月桂內醯胺的開環製得的聚月桂醯胺(PA12)，

從氨基十一烷酸製得的聚十一醯胺(PA11)，

從四亞甲基乙二胺和己二酸製得的聚己二醯丁二胺(PA 4-6),

聚己二醯己二胺(PA6-6),

從己二胺和1,9-壬二酸製得的聚壬二醯己二胺(PA 6-9),

從己二胺和癸二酸製得的聚醯胺6.6,癸二酸–1,6-己二胺(PA6-10)，和

從己二胺和1,12-十二烷二酸製得的聚十二碳二醯己二胺(PA6-12)。

優選地，所述聚醯胺是從氨基十一烷酸製得的聚十一醯胺(PA11)。

在本發明的另一個模式中，在本發明的上下文中有關的聚合物是生物來源聚合物。

術語「生物來源聚合物」是指來源於可再生資源的聚合物。這類生物來源聚合物偶爾與添加劑(如塑化劑)混合使用。在這類生物來源聚合物中，可生物降解的生物來源聚合物與不可生物降解的生物來源聚合物是有區別的，如：

聚醯胺，特別是聚醯胺PA11；

聚氯乙烯；

聚乙烯；和

聚丙烯。

優選地，所述聚合物選自聚己內酯(或CAPA)、聚乳酸、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚(對苯二甲酸丙二醇酯)、C1-C6的聚羥基鏈烷酸酯、醋酸纖維素，聚(己二酸-對苯二甲酸-丁二醇酯)、聚(琥珀酸丁二醇酯)和聚醯胺PA11以及它們的混合物。

更優選地，所述聚合物是聚乳酸或PLA。PLA具有與某些石化熱塑料(如聚丙烯)類似的機械性能。

甚至更優選地，所述聚合物是聚己內酯或CAPA。

在另一實施方案中，所述聚合物是生物基聚合物。術語「生物基聚合物」是指使用天然來源的，最好是非石化來源的化合物製造的聚合物。

在本發明的上下文中，生物實體應優選一種酶，其能夠耐受根據本發明方法的擠出步驟的操作溫度。本領域技術人員具有能夠確定此溫度並鑑別能夠耐受此溫度的生物實體的常識。

術語「可生物降解聚合物」是指能夠被生物實體降解的材料。這類材料的降解結果是形成水、二氧化碳和甲烷以及選擇性的副產物。所述聚合物降解過程中產生的副產物是無毒的。

標準NE 13432:2000陳述了可通過堆肥和生物降解升級的包裝相關的要求。標準設定了材料應具備哪些特徵才能被定義為可堆肥。它基於下述標準：

可生物降解性：這通過材料代謝轉化為二氧化碳測定。使用標準方法EN 14046測定該性能。在少於6個月內分解程度達到90％。

崩解：這是指材料分裂且在最終堆肥中無法目視識別。這通過堆肥方法EN 14045測定。材料應在有機廢物的存在下，在少於3個月內崩解。此後，堆肥用2mm的篩子過篩。尺寸大於2mm的材料殘留物被認為是未崩解的。這部分物質的份額應少於初始質量的10％。

低含量重金屬且並對堆肥無負作用：根據OECD測試208的方法，對堆肥樣品進行植物生長測試。不應調整堆肥物的其他物化參數(相對於不含聚合物的堆肥)：鹽度以及氮、磷、鎂和鉀的％。

在第一個優選實施方案中，所述生物實體是酶，優選對擠出溫度耐受的酶。

術語「對擠出溫度耐受的酶」是指那些蛋白質結構和/或酶活性不受根據本發明方法的擠出步驟中的操作溫度影響的酶。因此這些酶非常適合在高於室溫的溫度下使用。

優選地，所述酶選自耐熱酶和熱穩定化的酶。

術語「耐熱酶」是指那些固有性質提供了對高溫的耐受性的酶，特別是根據本發明方法的擠出步驟中的操作溫度。

優選地，所述耐熱酶選自來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶PS、來自螢光假單胞菌的脂肪酶AK、來自南極念珠菌的脂肪酶B、蛋白酶K、C1-C6聚羥基鏈烷酸酯解聚酶和它們的混合物。

術語「熱穩定化的」或「熱保護的」酶是指那些酶，其不是天然耐熱的，但是以給予他們對根據本發明方法的擠出步驟中的操作溫度的耐受性的特定形式存在。優選地，熱穩定化的酶通過化學或物理過程獲得。

優選地，所述熱穩定化的酶選自封裝在與所述聚合物相同的材料所組成的納米膠囊中的酶、封裝在籠型分子中的酶和聚集在一起的酶。

這些熱穩定化的酶可以通過將非耐熱的酶封裝在納米膠囊中，優選地，封裝在與所述聚合物相同的材料所組成的膠囊中獲得。封裝技術是本領域技術人員熟知的。通常，採用納米乳液進行封裝。這種酶的封裝使控制酶活性成為可能。本發明的該實施方案對於將本發明的合金用於食品包裝中特別有利。

熱穩定化的酶也可以通過將酶封裝到籠型分子中獲得。這種封裝使得可以保護所述酶免遭溫度相關的降解。

術語「籠型分子」是指一種分子，其能夠插入所述酶的結構中使酶穩定並使酶能夠耐受高於室溫的溫度。

這些熱穩定化的酶也可以通過將非耐熱酶聚集在一起獲得。本領域技術人員有足夠的技術知識來進行這種聚集。

在一個具體實施方案中，所述酶的形式是脫輔基酶且在輔助因子的存在下激活。

在第二種實施方案中，所述生物實體是微生物。

通常情況下，這些微生物是可能會或可能不會形成孢子並產生降解目標聚合物的酶的微生物。優選地，這些微生物是細菌、真菌或酵母。

在一個實施方案中，本發明的合金是一種聚合物/微生物合金，優選地，是聚乳酸/微生物合金。

優選地，所述微生物選自蒼白桿菌屬的細菌、屬於厚壁菌門(Firmus cutis)的細菌、芽孢桿菌綱的細菌，特別是芽孢桿菌屬菌株，尤其是蠟樣芽胞桿菌G9241，和克勞氏芽孢桿菌屬菌株。

更優選地，所述微生物是一種稱為蒼白桿菌37S且根據布達佩斯條約於2009年7月23日以CNCM I-4212的編號保藏在以the Centre National de la Recherche Scientifique at the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes的名義，以CNCM I-4212的編號保藏的蒼白桿菌屬菌株或者其變種，所述變種可降解聚乳酸。

優選地，所述聚合物是聚乳酸且所述生物實體是蒼白桿菌37S細菌，所述細菌降解聚乳酸。

術語「變種」是指：

根據本發明的菌株的自然變種，即根據本發明的菌株在選擇性培養基上孵育後自發獲得的變種。自然變種是不通過操作者的任何遺傳操作下，只通過菌株的自然突變和在合適培養基上選擇這種突變的菌株而獲得，或者

根據本發明的菌株變種，其基因組中包含至少一個突變，所述突變是遺傳工程誘導的，例如通過定點突變或隨機突變。例如，隨機突變可以通過使用誘變劑進行，如輻射(紫外線、電離輻射、熱)或化合物(氮酸、甲烷磺酸乙酯、N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍、N-乙基-N-亞硝基脲、吖啶橙、原黃素等)。

術語「突變」是指根據本發明的菌株的基因組中增加、去除或取代至少一個核苷酸。

因此，本發明涉及聚合物/生物實體合金的製備方法，其包含下述步驟：

i)選擇聚合物，優選一種可生物降解聚合物；

ii)選擇能夠降解所述聚合物以及能夠耐受高於室溫的溫度T的生物實體；

iii)在溫度T下進行的熱處理過程中，混合所述聚合物和所述生物實體，

其特徵在於所述生物實體選自能夠降解所述聚合物的酶和能夠降解所述聚合物的微生物。

所有前面描述過的特徵都適用本製備方法。

本製備方法的優點是與塑料加工工業中使用的標準設備兼容，這使專業人員能迅速而直接地實施此方法而不必對常規使用的生產工具做重大修改，尤其是那些通常保留用於石化來源塑料生產的工具。

此外，本發明方法不需要使用對人體健康或環境有潛在害處的產品。該方法也不產生任何有這些害處的副產物。

本發明方法通過包含生物實體，特別是酶與聚合物，特別是可生物降解聚合物結合在一起(這決定由此獲得的合金的降解)，使獲得一種「定製的」聚合物/生物實體成為可能。

本發明因此能夠獲得一種聚合物/生物實體合金，為能控制降解速率而優選單一聚合物/酶合金。

這些聚合物/酶合金的非限制性列表包括聚己內酯/來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶PS；聚己內酯/來自南極念珠菌的脂肪酶B；聚乳酸/蛋白酶K；C1-C6聚羥基鏈烷酸酯/C1-C6聚羥基鏈烷酸酯解聚酶配對物。

優選地，本發明涉及聚合物/酶合金的製備方法，其包括，在聚己內酯的熔點下，以2％的酶/聚合物重量比，聚己內酯和脂肪酶(優選來自洋蔥假單胞菌的阿馬諾脂肪酶PS)的擠出。具體而言，本發明人已證實由此獲得的合金在水介質中經過4個月完全降解，然而不添加脂肪酶的聚己內酯在此時間段內沒有降解。

本發明人也表明並例證了這種合金在擠出溫度為80℃、100℃、120℃和140℃時降解。

在一個優選實施方案中，本發明還涉及一種聚合物/酶合金，其特徵在於所述酶降解所述聚合物且是熱穩定化的。

這些合金是非常有利的，這是因為，首先，當它們置於水溶液中時，具有改進的降解性。其次，它們具有適用於工業的機械性能。將酶包含在合金中沒有損害聚合物本身的性能。因此，所述合金的機械性能與聚合物本身的機械性能很相似，甚至是完全一樣的。

優選地，所述熱穩定化的酶選自封裝在由與所述聚合物相同的材料所組成的納米膠囊中的酶、封裝在籠型分子中的酶和聚集在一起的酶。

所有前面提到的有關所述聚合物和熱穩定化的酶的技術特徵都適用於此合金。

或者，本發明涉及一種聚合物/生物實體合金，其特徵在於所述聚合物是聚乳酸且所述生物實體是蒼白桿菌37S，所述細菌降解聚乳酸。

另一方面，本發明涉及本發明的聚合物/生物實體合金在農業、園藝、包裝、建築修繕、環境、交通、紡織、電子和醫藥行業領域的用途。在下文中，術語「本發明的合金」和「根據本發明方法的聚合物/生物實體合金」無差別地使用。

優選地，本發明涉及本發明的合金在包裝行業的用途，更優選地用於食品特別是水果和蔬菜的包裝，以及烘培行業。因此，本發明涉及將本發明的合金用作具有較長保質期的食品包裝。具體而言，本發明的合金非常適合與食品接觸，因為它沒有任何有害的影響，它可容易降解並構成了阻止二氧化碳、氧氣和水通過的屏障從而使食品免受損害。

本發明還涉及本發明的合金在農業領域的用途，特別是用於製備包含植物保護產品的小顆粒、覆蓋膜、隧道膜和捆綁材料。

本發明還涉及將所述合金用於生產瓶子的用途。

最後，本發明涉及本發明的合金在醫療領域的用途，特別是用於生產可吸收縫合線以及作為治療活性分子載體。優選地，這些合金以含有治療活性分子的納米粒子形式使用。本領域技術人員具有能夠從根據本發明的合金製備納米粒子的技術常識。

在治療中使用本發明的合金具有優勢，顯而易見地體現在幾個方面。首先，納米顆粒的降解使得可將藥物逐漸遞送到靶細胞。此外，它可以限制在某些組織(如諸如肝和腎之類的解毒器官)中治療分子積聚相關的副作用。最後，這種納米顆粒的可生物降解性限制了潛在的環境影響，這與納米粒子通過病人的自然分泌物而鋪展到外部介質有關。

根據本發明製備合金的方法能夠獲得具有適合所需用途的降解性的合金。因此，在治療的上下文中，本領域的技術人員將能夠使此方法適於獲得一種合金，它不會在治療的病人的某些器官中引起任何納米粒子的積聚，從而能夠避免可能與所述納米粒子的存在相關的副作用。

本領域技術人員還需要使治療活性分子適合作為待治療的病理學類型和納米粒子本身性質的函數被本發明的納米顆粒包封。具體而言，取決於所述納米粒子的物化性質(特別是它的重量、尺寸、親脂性、親水性和離子化的狀態)，它可能或可能無法跨越跨膜屏障。因此，對於給予了由本發明合金組成的納米粒子的個體而言，納米粒子的性質會影響治療活性分子在個體內的分布。

實施例:

實施例1:製備根據本發明的聚合物/酶合金

材料和方法

1.在擠出步驟期間酶包含到起始材料中

在「擠出」步驟期間將酶引入起始的可生物降解聚合物。

擠出步驟在Clextral牌BC21雙螺杆型擠出機(電機功率9kW，最大螺杆速度600rpm，最大電流18.9A)上進行。螺杆直徑d為25mm，兩螺杆間距離為21mm。護套的長度為600mm，即L/d的比率為24。

擠出步驟分5步：

1.引入可生物降解的聚合物/酶混合物，

2.所述混合物通過擠出機，

3.通過直徑為3米的圓形模具輸出杆狀物，

4.在冷水浴中冷卻3米長的杆狀物，後續用脈衝冷空氣「乾燥」，

5.由裝有旋轉刀片的系統切割成規則的顆粒狀。

材料配方隨可生物降解聚合物/酶比例的函數而變化。在本專利申請的實施例中，結果相應於材料中2％(m/m)酶的比例。

由擠出獲得的顆粒在50℃迴轉爐中乾燥15小時(裝配有具有循環油的夾套的旋轉混合器)以去除由於經過水箱而殘留的水分。通過裝配有紅外電阻的溼度分析儀在乾燥過程中監測水分含量。

2)製備試樣-注射成型

為了評估所得聚合物/酶合金的機械性能以及其降解能力，被稱為「試樣」的標準形式的成型件通過注射成型製得。

注射成型是用於賦予顆粒以三維成品形狀的一個批量過程。其原理在於，在進料護套中加熱塑料材料，以將熔融狀態的材料提供給檢測和壓縮區，以便通過活塞將其注射到模具中。成型件在模具中冷卻，然後噴出。

所用注射壓機為Arburg牌，Allrounder 1000-420C-250型。

注射成型試樣符合標準ISO 3167中的類型1。

結果

1.選擇液態介質中的酶

為了實施本製備方法，應該識別能夠降解可生物降解聚合物的酶，從而確定將在擠出步驟中使用的合適的酶/材料「配對物」。

我們開發了兩個簡單的測試來識別目標酶。這些測試分別在試樣中純材料或顆粒狀純材料的樣品上進行。

下面提出的測試在聚己內酯或CAPA(Perstorp；編號6506；50 000g/mol)的試樣或顆粒上進行。本發明人評價了兩種以其降解CAPA的能力而已知的商業酶：來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶PS和來自螢光假單胞菌的脂肪酶AK(Amano，日本)。

a)試樣的測試

置於生物降解條件下的未加工聚合物試樣來自CAPA顆粒的注射成型。全部生物降解測試在溫度調節為30℃的爐子內進行。

本研究所提出的測試在營養液中進行，根據標準ISO 14852:1999規定營養液的組成。或者，降解也可以在Fontaine Cristalline牌水中評估，即一種具有恆定組成的礦物質水，從而可以具有相同的介質條件。

在這些測試中，試樣保持完全浸泡在所述溶液中，所述溶液中選擇性地以最終濃度為200mg/L添加酶。

在介質中經過一段規定時間後，通過計算樣品質量的損失來檢測材料的降解。

本方法使用一系列13個相同的試樣，其中5個試樣用爐子在103℃處理48小時以確定樣品中水的損失量。這一步使得可以對置於生物降解中的樣品的質量損失的計算進行校正。其它8個試樣浸泡在降解介質中並置於溫度調節為30℃的爐子內。在規定時間之後將試樣取出以監測材料隨時間推移的行為。每次取出試樣後，試樣在103℃爐子內乾燥48小時並稱重。

根據下述公式計算質量的損失：

在室溫和103℃之間

其中mi:試樣的初始質量

mf:試樣的最終質量

結果顯示來自螢光假單胞菌的脂肪酶的存在不能提高聚己內酯的可生物降解性，因為降解程度基本上與不加酶時的一樣。

另一方面，對於來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶，在與介質接觸7天後第一組取出的試樣中，可以觀察到顯著的差異。具體而言，獲得了5％的降解率，然而經過相同時間沒有添加酶的試樣只損失了0.2％的質量。

然而，很快觀察到一個穩定的階段，生物降解率不再改變。所以決定改變添加酶的營養液(還是在200mg/L的營養液)。在降解開始44天後進行這個改變。這使得可以觀察到70天內，降解重新達到約9％。

b)顆粒的測試

本方法的優點是能夠在小反應體積進行，使得試驗較不昂貴。此外，能夠同時測試幾個酶和幾個濃度。最後，使用高濃度酶的可能性使得可以在短時間內獲得高的降解率。

在該試驗中，CAPA顆粒(近似體積：50mm3；近似質量：40mg)在1.9ml的緩衝液(25mM磷酸鹽緩衝液,pH 7,疊氮化鈉2g/L)中孵育，選擇性地以最終濃度為20mg/ml添加來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶PS。在28℃進行孵育。規則的時間間隔後，取出顆粒，用水徹底衝洗，然後在28℃孵育24小時用以乾燥。測定質量並與初始質量(即在反應介質中孵育之前)相比。

結果顯示在所述條件下，使用來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶PS，CAPA的降解率超過50％，這證實了用所述試樣獲得的結果。

本實驗方案可以用來確定隨後加入給定的聚合物中的最相關的酶。

此外，該試驗也使得可以識別某些具有優化降解活性的性能的「添加劑」。這類添加劑可以與酶一起在擠出步驟中加入材料中以加快其降解。

2.評估酶的耐熱性以確定最佳擠出溫度

在擠出步驟中，聚合物/酶混合物要經受相應於聚合物熔點的高溫。在CAPA的情形，我們將溫度設定在80℃。根據供應商的技術表，來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶PS的粉末形式在100℃保持穩定達幾個小時。

然而，這些數據指酶的脂肪酶活性，並沒有評估其CAPA解聚酶活性的耐熱性。

因此，我們對上述顆粒進行試驗，但是在80℃處理酶溶液(20mg/ml的酶)5分鐘。所選時間和溫度與擠出步驟中遇到的熱條件接近。

結果顯示該處理對酶的CAPA解聚酶活性影響小。具體而言，本發明人表明7天時僅有10％的活性損失。因此，來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶PS是製備CAPA/酶合金的極好的候選物。

3.在聚己內酯的實施過程中，引入來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶PS

本發明人進行聚己內酯的擠出時，引入所述酶。為此，將粉末形式的聚合物和粉末形式的酶的混合物置於計量裝置上。

這裡提出的試驗中，調整兩個計量裝置的流量以獲得酶佔材料的百分比為2％(m/m)。也製備了不含酶的配方(對照)(表1)。

表1:本研究中製備的配方

擠出在80℃進行,以便具有高於CAPA的熔點(60℃)的溫度，但不是很高以避免使酶變性的風險。

擠出的精確參數在表2列出，兩組配方在相同條件下進行。

表2:本研究中進行的擠出的參數

表2中引用的術語「扭矩」對應於相對電機強度並代表由擠出機向擠出材料提供的機械能。

所得顆粒在迴轉爐內乾燥以去除殘留水分。

兩組配方然後進行注射成型步驟以獲得規範化試樣。兩種材料的注射成型條件相同。

表3顯示本研究中使用的注射壓機的設定

表3:Arburg 100/420C/250注射壓機的注射成型參數

在Cristalline礦物質水中評估降解功效。簡而言之，對於每組配方，將四個規範化樣品(事先測定其質量)浸泡在水箱中(Cristalline參照礦物質水)。水箱然後置於溫度調節為32℃並通風的室中。

在1、2、3和6個月後取出試樣並稱重(在103℃的爐子內處理48小時)。通過如前所述計算的質量損失的方式確定材料的降解性。

所得結果顯示，當將酶引入材料時，試樣在水中孵育102天或以上後，CAPA的完全生物降解，這表明酶承受了在擠出和注射成型步驟中所施加的熱處理。

本發明人因此表明酶能夠有效地從擠出階段將酶引入聚合物中，同時保持聚合物的降解性能。

這種方法因此構成了一種容易實施並能方便地將其採用於其它用於控制材料在自然介質內降解的聚合物/酶配對物的簡單的方法。

實施例2:本發明合金的表徵

本發明人比較了單獨的CAPA、與植物基進料混合的CAPA以及根據本發明方法製備的由CAPA和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶組成的合金的機械性能。

材料和方法

1.合金的製備

使用下面的起始材料製備CAPA/來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶合金：

表4:用於合金的配方的起始材料

擠出粒化步驟

擠出步驟使用Clextral BC21共旋轉雙螺杆擠出機分5步進行

-通過重量計量裝置和體積計量裝置加入設想比例的各種元素；

-在壓力下將材料熔化、揉捏、脫氣、混合併放置在擠出機的連續部分；

-通過直徑為3米的圓形模具輸出杆狀物；

-在冷水箱中冷卻3米長的杆狀物，然後用脈衝冷空氣「乾燥」，

-通過裝配有旋轉刀片的系統切割成規則顆粒形式。

製備了四組配方(百分比對應質量百分比)：

-100％CAPA；

-98％CAPA+2％脂肪酶；

-80％CAPA+20％小麥；

-55％CAPA+45％小麥。

植物進料(小麥粉)的添加是提高聚合物降解程度的標準替代方法。具體而言，最大降解程度對應於植物基進料的降解，聚合物作為粘合劑事實上並不被降解(見下文)。

通過擠出獲得的顆粒在40℃迴轉爐中乾燥12小時以去除由於經過水箱而殘留的水分。乾燥的顆粒接著能被注射成型和表徵。

注射成型步驟

注射成型步驟能夠將擠出獲得的顆粒轉化成表徵試樣。注射成型的原理在於在護套中加熱塑料材料以使材料熔化(塑化階段)，並在壓力下通過活塞注射到模具中。使材料在模具中固化並部分冷卻，然後噴出。所用壓機為Arburg牌，Allrounder 1000-420C-250型的壓機。

注射成型試樣符合標準ISO 3167中的類型1。

注射成型獲得的「97％CAPA+2％脂肪酶」試樣在表徵前經過後處理，包括在一個置於封閉紙箱內的拉鏈鎖密封的袋子中室溫下儲存一個月，這一步驟的目的是從機械性能和降解能力的角度評估儲存對材料穩定性的影響。

2.機械性能的測定

拉伸測試

根據國際標準ISO/R 527(拉伸性能的測定)中所述的建議測定拉伸性能。在恰當限定的關於溫度、溼度和鉗口的分離速度的條件下進行這些測試。

拉伸測試是使具有初始橫截面So和有用長度Lo的試樣伸長。將試樣的兩端安裝到鉗口裡。鉗口中的可移動的一個與按線性速度移動的驅動系統相連。使用電子力傳感器(10kN)進行功的測量。

測試中注意三點信息：

-最大拉伸應力(Cmax TR；MPa)，

-斷裂伸長率(％),

-拉伸楊氏模量(MPa).

如標準所表明的，對每批材料的五個試樣進行測試，顯示的結果是這五個測定的平均值。位移速度設定為50mm/min並計算拉伸模量，數值在最大應力值的10％到50％之間。使用Zwick銷售的拉伸測試機。

夏比衝擊

本方法使得可以研究受到衝擊力的規定試樣的行為以估計試樣的脆弱性或強度。對於這些測試，本發明人使用了前面描述過的類型1的無缺口試樣。

使用的裝置是Zwick牌，能量為15焦耳的衝擊擺。該單元由記錄測量數值並分析的軟體驅動。在測試過程中，試樣在支撐物前水平放置並用衝擊擺擊打其中心。夏比衝擊阻力對應於試樣斷裂時吸收的能量與測試前橫截面的比(彈力)。

3.流變性能：熔體流動速率(MFR)

標準ISO 1133規定了在規定溫度和壓力條件下，測定熱塑性塑料的熔體流動速率(或MFR)的方法。這個測試使得可以測定所測試聚合物的級別以及給出對於給定溫度聚合物流過模具的能力(一個注射成型的重要參數)的相關信息。

所用設備是與精密天平相連並由能夠測定MFR(用g/10分鐘表示)的特定軟體驅動的Zwick牌擠出塑性計。

測試過程中，使用與活塞相連的進料鬥使在立筒內加熱的混合物通過模具而擠出。以規則的時間間隔切割五個擠出物，回收並稱重。設定的參數為筒溫、進料的重量和兩次切割之間的時間。

4.水降解測試

對於每個配方，將四個規範化試樣(預先測定103℃乾燥的質量)浸泡在水箱(Leclerc，參照Cristalline的礦物質水，)內。水箱放置在溫度調節為32℃並通風的室內。在1、2、3和4個月後取出試樣並稱重(在103℃爐子內處理48小時後)。通過按下面方式計算質量損失確定材料的降解能力。

損失(％)＝總質量損失—水分損失103℃)x 100

結果

1.機械和流變性能

所得結果示於下表：

表5：材料的性能

此表格表明酶的加入沒有改進在此所測CAPA的機械性能，也就是彈性、MFR或拉伸參數組。這與由55％CAPA+45％小麥組成的聚合物是非常顯著的對比，後者與單獨CAPA相比，所有機械性能都降低了。80％CAPA+20％小麥混合物本身可以保留與單獨CAPA相似的性能。

因此，本發明的合金非常適合提高CAPA的降解，同時保留其性能。

2.在水性介質中的降解

結果表明當浸泡在水環境中時，單獨的CAPA不降解。如果添加20％的植物基進料能夠提高該合金的降解，然而所達到的最大降解率小於20％。如所表明的，降解對應於小麥粉的降解，而材料本身保持不變。

生物降解的改善直接與合金中植物基進料的百分比增加相關，這必然導致機械性能的損傷。

結果也表明添加酶比添加植物基進料更加有利，因為它誘導了CAPA的降解(水中3個月後約70％)，同時保留純材料的機械性能。

本發明人已成功顯示所得組合物具有比用植物基進料更好的降解性，同時保留了聚合物的機械性能。

最後，將聚合物98％CAPA+2％脂肪酶儲存在黑暗中和密封袋中既不損傷其機械性能也不損傷其降解能力(選擇性地後處理後，比較聚合物98％CAPA+2％脂肪酶的行為)。當不在溶液中時，本發明的合金穩定且不降解，因此適合儲存。

總之，整個結果表明根據本發明的聚合物/酶的製備方法是用於開發短壽命材料的一種特別有吸引力的工業解決方案，同時減少對環境的負面影響，這對於殘渣散播到自然介質中是固有的。

實施例3.溫度對聚己內酯(CAPA)生物降解的影響

為了說明聚己內酯的轉化溫度對聚己內酯的生物降解沒有影響，在170℃擠出聚己內酯，並評價其生物降解性。

3.1.聚己內酯在170℃的擠出粒化步驟

如實施例1所限定的進行擠出步驟(見材料和方法部分1)，除了本實施例中的擠出溫度是170℃以及配方由100％CAPA(沒有酶)組成以外。擠出參數示於表6。

表6.本研究中進行的擠出的參數

3.2.注射成型

100％CAPA(cf.100m％CAPA 6506)顆粒進行注射成型步驟以獲得規範化試樣。如實施例1所述進行注射成型步驟。

表7示出本研究中所使用的注射壓機的設定。

表7.Arburg 100/420C/250壓機的注射成型參數

3.3.降解性的測定

在30℃水中降解：監測質量損失

在Cristalline礦物質水中評估降解性。四個規範化樣品(事先測定質量)浸泡在水箱中。然後將水箱置於溫度調節為32℃並通風的室內。

在15天、1、2和3個月後取出試樣並稱重(在103℃的爐子內處理48小時後)。通過如實施例1所述計算質量損失的方式來確定材料的降解能力。

對於配方100m％CAPA 6506(參見實施例2.),配方100m％CAPA 6506-170製備的試樣的「質量損失」2個月後沒有顯示任何降解。監測32℃水中的降解可以說明當CAPA在80℃到170℃的溫度擠出時，單獨的CAPA在水中不會隨時間推移而降解。

實施例4.在100℃將2％來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶PS引入98％CAPA中

4.1.包含酶

本發明人對引入所述酶的聚己內酯進行了擠出。為此，98％(質量)的聚合物和2％(質量)的酶混合物置於計量裝置中。混合物中所用的量示於下表(見表8)。

表8.本研究中製備的配方

4.1.a.擠出

擠出在100℃進行。如實施例1所述完成擠出步驟。(參見材料和方法部分1)。

擠出參數示於表9。

表9.本研究中進行的擠出的參數

4.2.注射成型

配方進行注射成型步驟以獲得規範化試樣。本研究中注射成型壓機的設置與實施例3相同(參見表7)。

4.3.生物降解測定

通過在水中降解評估降解功效。

在30℃水中降解：監測質量損失

如實施例3(參見3.3部分)在Cristalline礦物質水中評估降解。

在15天、1、2和3個月後取出試樣並稱重(在103℃爐子內處理48小時後)。通過如實施例1所述計算質量損失的方式來測定材料的降解能力。

所得結果顯示2個月後的質量損失為54％的生物降解能力。這說明酶經受了在擠出和注射成型步驟中承受的熱處理。

本發明人因此表明能夠將酶有效地從100℃的擠出階段引入聚合物中，同時保持聚合物的降解性能。

實施例5.在120℃將2％脂肪酶PS引入98％CAPA

5.1.包含酶

本發明人對引入所述酶的聚己內酯進行了擠出。為此，聚合物置於一個計量裝置中，酶置於另一個計量裝置中，兩者都是粉末形式。

這裡所示的試驗中，設定兩個計量裝置的流速以獲得酶佔材料的百分比為2％(m/m)(參見表10)。

表10.本研究中製備的配方

5.1.a.擠出

通過在120℃擠出製備聚合物與酶之間的合金。如實施例1所述完成擠出步驟(參見材料和方法部分1)。

擠出參數示於表11。

表11.本研究中進行的擠出的參數

5.2.注射成型

配方進行注射成型以獲得規範化試樣。注射成型的條件與實施例3的相同(參見表7)。

5.3.生物降解測定

通過在水中降解評估降解功效。

在30℃水中降解：監測質量損失

如實施例3所述的相同條件下在水中評估降解。

所得結果顯示2個月後質量損失為27.5％的降解能力。這說明酶經受了在擠出和注射成型步驟中承受的熱處理。

本發明人因此表明能夠將酶有效地從120℃的擠出階段引入聚合物中，同時保持聚合物的降解性能。

實施例6.在140℃將2％脂肪酶PS引入98％CAPA

本發明人對引入所述酶的聚己內酯進行了擠出。為此，聚合物置於一個計量裝置中，酶置於另一個計量裝置中，兩者都是粉末形式。

這裡示出的試驗中，設定兩個計量裝置的流速以獲得酶佔材料的百分比為2％(m/m)(見表12)。

表12.本研究中製備的配方

6.1.a.擠出

通過在120℃擠出製備聚合物與酶之間的合金。如實施例1所述完成擠出步驟(參見材料和方法部分1)。

擠出參數示於表13。

表13.本研究中進行的擠出的參數

6.2.注射成型

配方進行注射成型以獲得規範化試樣。本研究中所用的注射成型壓機的設置與實施例3，3.2部分中所用的相同(參見表7)。

6.3.生物降解測定

通過在水中降解評估降解功效。

在30℃水中降解：監測質量損失

如實施例3(參見3.3部分)在Cristalline礦物質水中評估降解。

在15天、1、2和3個月後取出試樣並稱重(在103℃爐子內處理48小時後)。通過如實施例1所述計算質量損失的方式來測定材料的降解能力(參見結論1.a部分)。

所得結果顯示2個月後質量損失為4.5％的降解力。這說明酶經受了在擠出和注射成型步驟中承受的熱處理。

本發明人因此表明能夠將酶有效地從140℃的擠出階段引入聚合物中，同時保持聚合物的降解性能。

結論是，本發明人已舉例說明本發明的製備方法，能夠獲得在各種擠出溫度下降解的合金，特別是80℃、100℃、120℃和140℃。

實施例7:引入脂肪酶的方法

為了說明通過擠出包含脂肪酶對相應材料的生物降解的重要性，進行了各種在聚己內酯中引入脂肪酶的方法。

1.通過擠出引入脂肪酶(測試7a)

如實施例1所述的條件下(參見材料和方法部分)，在65℃擠出98m％聚己內酯(CAPA 6506)和2m％脂肪酶PS的混合物

擠出參數示於表14。

表14.本研究中進行的擠出的參數

配方進行注射成型步驟以獲得規範化試樣。注射成型壓機的設置與實施例3中所用的相同(參見表7)。

根據實施例3所述方法，通過在水中降解的方式評估所述注射成型件的降解功效。

2.通過在注射成型的聚己內酯件表面噴霧來引入脂肪酶(測試7b)

非擠出聚己內酯CAPA6506進行注射成型步驟以獲得規範化試樣。注射成型壓機的設置與實施例3中所用的相同(參見表7)。

然後將脂肪酶PS的水溶液噴到注射成型的聚己內酯件表面以獲得相當於98m％聚己內酯和2m％脂肪酶的混合物。

根據實施例3所述方法，通過在水中降解的方式評估所述注射成型件降解功效。

3.在水中降解的測試中所用水中引入脂肪酶(測試7c)

非擠出聚己內酯CAPA6506進行注射成型步驟以獲得規範化試樣。注射成型壓機的設置與實施例3中所用的相同(參見表7)。

根據實施例3所述方法，通過在接種有脂肪酶PS的水中降解的方式評估所述注射成型件編號7a的降解功效。加入的脂肪酶的量相當於98m％聚己內酯和2m％脂肪酶PS的混合物。

配方7a、7b和7c的質量損失整理於下表：

表15.樣品7a、7b和7c的水中的質量損失

這些結果顯示當脂肪酶通過噴霧或引入降解溶液中時，降解比脂肪酶包含在合金中時要明顯低。

換句話說，本發明人已顯示擠出步驟可以比脂肪酶的分散/溶液步驟獲得具有更好降解性的合金。

實施例8:其他測試

用於其他測試的起始材料如下：

-聚己內酯CAPA 6506；

-Rettenmaier提供的木粉Arbocel C320；和

-AMO提供的La Dorée小麥粉。

在實施例1(參見材料方法部分)所述的條件下，通過擠出製備聚己內酯、脂肪酶PS和/或植物基進料(小麥粉或木粉)的多種合金：

表16.本研究中通過擠出獲得的多種合金的組成

擠出參數示於表17：

表17.本研究的擠出參數

所得多種合金進行注射成型步驟以獲得規範化試樣。注射成型壓機的設置與實施例3中所用的相同(參見表7)。

根據實施例3所述方法，通過在水中降解的方式評估所述注射成型件編號7a、8、9、10和11的降解功效。這些功效示於下表：

表18.樣品7a、8、9、10和11的質量損失

本發明人因此顯示為了獲得高的生物降解性，添加酶比添加植物基進料明顯更有利。