一種耐熱的內切－β－1,4－葡聚糖酶的製作方法
2023-04-27 21:34:16 4
專利名稱：一種耐熱的內切－β－1,4－葡聚糖酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種在高溫時有纖維素分解活性的酶，特別是內切-β-1，4-葡聚糖酶；編碼該有纖維素分解活性的酶的克隆DNA序列；提供編碼這種酶的基因的方法；生產這種酶的方法；一種含有所述具纖維素分解活性的酶的酶組合物；以及該酶和酶組合物的多種工業應用。
背景技術：
纖維素酶或纖維素分解酶是參與纖維素水解過程的酶。天然纖維素的水解中，眾所周知有三類主要的纖維素酶參與這一過程，即纖維素二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纖維素二糖水解酶，EC3.2.1.91)，內切-β-1，4-葡聚糖酶(內切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。
特別是內切-β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)構成一組可用於上述工業用途的引人注意的水解酶。內切-β-1，4-葡聚糖酶催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣多糖中1，4-β-D-糖苷鍵的內切水解，及混合β-1，3-葡聚糖，如穀類β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖(xyloglucan)和含有纖維素部分的其他植物材料中的β-1，4鍵的內切水解。其權威命名是內切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，本說明書使用簡稱內切-β-1，4-葡聚糖酶。可以參考T.M.Enveri，「微生物纖維素酶」，W.M.Fogarty，微生物酶類與生物技術，應用科學出版社，183-224頁(1983)；酶學方法(1988)160卷，200-391頁(Wood，W.A和Kellogg，S.T.編)；Beguin，P.「纖維素降解的分子生物學」，微生物學年度綜述(1990)，44卷，219-248頁；Beguin，P.和Aubert，J-P.「纖維素的生物降解」，FEMS微生物學綜述13(1994)25-58頁；Henrissat，B.「纖維素酶及它們與纖維素的相互作用」，纖維素(1994)，1卷，169-196頁。
纖維素酶在大量微生物中都能合成，包括真菌，放線菌，粘細菌和真細菌，也能由植物合成。特別是已鑑定到具有各種特異性的內切-β-1，4-葡聚糖酶。已描述過許多細菌內切-β-1，4-葡聚糖酶(Henrissat，B.和Bairoch，A.(1993)生物化學雜誌293781-788；Gilbert，H.J.和Hazlewood，G.P.(1993)普通微生物學雜誌139187-194)。
比較上位的分類組古生物(Archaea)分成兩個門Euryarchaeota和Crenarchaeota。古生物中Euryarchaeota門內的熱球菌目包含熱球菌屬(Pyrococcus)和熱球菌屬(Thermococcus)(Maidak等，1996)。這些生物體分離自海洋或陸地硫酸鹽環境中，它們是厭氧性生物，高度嗜熱。激烈熱球菌在100℃時生長情況最好，並且最高生長溫度是103℃。在15-35g/l NaCl存在時可達到最佳生長狀況。已有記載表明激烈熱球菌利用肽、蛋白質、澱粉以及麥芽糖作為碳源(Zilling，1992)。
來自多種古生物的各種細胞外酶已有記載。例如，已在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中克隆和表達了來自激烈熱球菌DSM 3638、最適溫度約為100℃的一種澱粉酶(國際專利申請PCT/DK/90/00074)。來自各種古生物的其它水解酶(如細胞外木聚糖酶、β-甘露糖苷酶和β-半乳糖苷酶)以及胞內蛋白酶都有記載(Halio等，1996)。
已記載、鑑定和克隆了一種來自激烈熱球菌DSM 3638的β-葡糖苷酶(Kengen，1993)。對該激烈熱球菌β-葡糖苷酶的鑑定工作揭示出，該酶對纖維素或其它β-連接的葡萄糖聚合物沒有活性(Bauer等，1996)。WO 97/44361(第115-117頁)中公開了一種多核苷酸序列，該序列編碼來自激烈熱球菌、具有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性的一種多肽。Thermophilum pendens是與古生物Crenarchaeota門熱棒菌屬有關的一種生物，已證實它能產生少量在88℃對羧甲基纖維素有活性的葡聚糖酶。然而，無論是酶還是分離物，都未見有進一步鑑定的記載(Bragger等，1989)。
木糖葡聚糖酶活性不包括在酶命名法(1992)提供的酶分類中。迄今為止，這一酶促活性僅僅被歸類為葡聚糖酶活性，並常常被視為與纖維素分解活性(EC3.2.1.4)，即對纖維素或纖維素衍生底物中β-1，4-糖苷鍵作用的活性相同，或者至少是具有纖維素分解活性的酶的一種次要活性。然而，一種真正的木糖葡聚糖酶是一種真正的木糖葡聚糖特異性酶，能夠催化木糖葡聚糖溶解形成木糖葡聚糖寡糖，但不具有明顯的纖維素分解活性，如對常規所用纖維素樣底物CMC(羧甲基纖維素)、HE纖維素和Avicel(微晶纖維素)作用的活性。木糖葡聚糖酶切割木糖葡聚糖骨架內的β-1，4-糖苷鍵。
木糖葡聚糖酶活性由Vincken等人(1997)進行了描述，他們從綠色木黴(類似於T.reesi)中鑑定出了三種不同內切-β-1，4-葡聚糖酶，它們對纖維素或CMC都有很高活性，並且，EndoI[它確實屬於糖基水解酶的第5家族，參見Henrissat B.等(1991，1993)]對木糖葡聚糖基本上沒有(即非常少)活性，EndoV(屬於糖基水解酶的第7家族)和EndoIV(屬於糖基水解酶的第12家族)二者對木糖葡聚糖和CMC都分別有相同數量級的活性。因此，人們估計，第12家族的內切-β-1，4-葡聚糖酶也可能具有木糖葡聚糖酶活性。
纖維素分解酶一種非常重要的工業用途是用來處理纖維素纖維、紡織品或織物，例如作為洗滌劑組合物或織物柔軟劑組合物的成分，用於紡織工業中纖維素材料的酶促精練，機織織物的脫漿，新織物的生物拋光(衣物整理)，及獲得含纖維素織物(特別是粗斜紋布)的「石洗」外觀，這些處理過程的一些方法例如在GB-A-1 368 599，EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876，WO 91/17243，WO91/10732，WO91/17244，PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132中已被提及。纖維素分解酶另一個重要的工業用途是用於處理紙漿，如用於改善排水或回收紙張的除墨。
人們還知道，纖維素酶可以含有或不含有纖維素結合結構域(CBD)。CBD能夠增強酶與含纖維素之纖維的結合，並提高該酶催化活性部位的功效。
仍然需要提供新型纖維素酶製劑，可以用在那些希望有纖維素酶(優選是內切-β-1，4-葡聚糖酶)活性的應用中。
本發明的目的是提供新型酶組合物，所述酶組合物在高溫條件下具有顯著的纖維素分解活性，並且在紙漿加工、紡織品處理、洗衣過程、提取過程或動物飼養中的性能有所改進；優選新型纖維素酶，更優選性能很好的內切-β-1，4-葡聚糖酶，預計這些酶可通過重組技術產生或是通過重組技術產生的。
發明概述本發明人已經成功克隆和鑑定了一種來自古生物激烈熱球菌的DNA序列，它編碼一種在極高溫度下、很寬的pH範圍內具有纖維素分解活性的酶，從而有可能用它來製備具有所期望特性的單組分纖維素分解酶組合物。
因此，本發明第一方面涉及具有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶製劑，它在至少90℃、優選至少95℃、更優選至少100℃的溫度下具有最佳活性。該製劑可得自屬於古生物、優選屬於Euryarchaeota門、更優選屬於熱球菌(Thermococcoales)亞門的一個菌株，或者是其內源物。
本發明第二方面涉及一種DNA構建體，其中含有編碼一種酶的DNA序列，所述酶具有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性，並且最佳活性在90℃以上、優選95℃以上、更優選100℃以上，該DNA序列包含a)相應於SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列，或b)相應於SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列的相似物，它i)與相應於SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列同源，優選至少40％同源，或ii)與相應於SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列可雜交，或者iii)編碼一種多肽，該多肽與SEQ ID NO2的多肽或者由包含相應於SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分之DNA序列的DNA序列所編碼的多肽同源，優選至少45％同源，或者iv)編碼一種多肽，該多肽與針對純化的內切-β-1，4-葡聚糖酶產生的抗體有免疫反應性，所述內切-β-1，4-葡聚糖酶是由相應於SEQ IDNO1的DNA序列或可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列編碼的。
在第三、四、五方面，本發明提供了帶有本發明克隆DNA序列的表達載體；含有克隆DNA序列或表達載體的細胞以及生產顯示有纖維素分解活性的酶的方法，該方法包括在允許該酶產生的條件下培養所述細胞，和從培養物中回收該酶。
本發明另一方面提供一種有纖維素分解活性的分離酶，其特徵在於(i)不含同源雜質，並且(ii)該酶由上述方法產生。
本發明進一步涉及有纖維素分解活性的分離酶，優選內切-β-1，4-葡聚糖酶，其由本發明的DNA構建體編碼。另外，本發明涉及本發明這種酶或酶製劑在工業應用中的用途，如在紡織業中用於改善纖維素纖維或織物的特性或者提供粗斜紋布的石洗外觀；或者用於纖維素纖維加工業中，特別是用於大麻、黃麻、亞麻或亞麻布的浸解中；或者用於工業清潔程序；或者用在熱擠壓聚合物材料中；或者用於生物質轉化成糖的過程中；或者用於生產乙醇；或者用於預消化例如飼料生產中所用的穀物；或者用於生產速溶咖啡或類似的提取過程；或者用於鑽油工業中；或者用於通過聚合物驅油法提高油開採量。
本發明還涉及含有纖維素酶編碼DNA序列之大腸桿菌菌株DSM11203的一種基本純的分離生物學培養物(克隆至大腸桿菌DSM11203內存在的質粒pSJ1678中的DNA序列纖維素酶編碼部分來源於古生物激烈熱球菌，或所述大腸桿菌菌株的任何突變體)。發明詳述本文中，術語「20種天然存在的胺基酸殘基」表示常見於蛋白質中的20種胺基酸殘基，慣稱丙氨酸(Ala或A)，纈氨酸(Val或V)，亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)，色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、甘氨酸(Gly或G)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬醯胺(Asn或N)、穀氨醯胺(Gln或Q)、天冬氨酸(Asp或D)、穀氨酸(Glu或E)、賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和組氨酸(His或H)。
本發明的酶和酶製劑在寬範圍pH都有活性，優選在大約pH4-11有活性，更優選在大約pH5.5--10之間有活性。
在一個優選的實施方案中，本發明的酶或酶製劑可得自一株菌或是其內源物，所述菌株屬於古生物，更優選屬於Euryarchaeota門，甚至更優選屬於熱球菌屬，特別是激烈熱球菌，如激烈熱球菌DSM3638。此外，人們確信，本發明的酶包括在糖基水解酶第12家族這一定義內，即本發明的酶優選是第12家族的內切-β-1，4-葡聚糖酶。本發明酶的分子量約為34kDa。然而，可以想見，本發明酶也可以具有約30-35kDa(即30，31，32，33，34或35kDa)的表觀分子量，這取決於在發酵和/或純化過程中對該酶N-末端胺基酸殘基序列作用的蛋白水解活性的存在與否。換言之，該酶可能在N-末端有所截短，但仍完全維持了內切-β-1，4-葡聚糖酶活性。
本文中，表達術語「克隆DNA序列」，無論是部分還是完整的，均是指採用基因工程中的標準克隆步驟，將一段DNA從它的天然位置重新放置於不同的位點(在該處它將被複製)，由此克隆的DNA序列。克隆過程包括切出和分離目標DNA片段，將該段DNA插入至載體分子內並將重組載體引入細胞，在細胞內將複製出多拷貝或多克隆的該DNA片段。
本發明的「克隆DNA序列」也可稱為「DNA構建體」或「分離DNA序列」。
該DNA序列可以是基因組DNA、cDNA或合成來源的，或者是它們的任意組合。克隆到大腸桿菌DSM11203中質粒pSJ1678上的DNA序列的內切葡聚糖酶或纖維素酶編碼部分和/或本發明的相似DNA序列可以從能產生有纖維素酶(優選內切-β-1，4-葡聚糖酶)活性的酶的古生物激烈熱球菌一個菌株、優選DSM3638菌株中克隆得到，或者可從以下進一步描述的其它或相關生物體中克隆得到。
或者，類似序列可以依據SEQ ID NO1的DNA序列或可從大腸桿菌DSM11203中質粒得到的DNA序列構建而成(例如是其亞序列)，和/或通過導入不會使該DNA序列編碼的纖維素酶胺基酸序列改變的核苷酸取代而獲得，所述取代與旨在用於生產該酶的宿主微生物的密碼子用法一致，或者通過導入使得產生不同胺基酸序列(即本發明纖維素酶的變體)的核苷酸取代而獲得。
人們確信，SEQ ID NO1的DNA序列相應於可得自大腸桿菌DSM11203中質粒的DNA序列。
進行核苷酸取代時，優選胺基酸的變化影響較小，即是不會顯著影響蛋白質摺疊或酶促活性的保守性胺基酸取代，小片段刪除，通常是刪除1到約30個胺基酸；小段氨基或羧基末端延伸，例如一個氨基末端甲硫氨酸殘基，不超過大約20-25個殘基的小連接肽，或者有助於純化的小段延伸，如一段多組氨酸，抗原決定簇或結合結構域。
保守性取代的例子有鹼性胺基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性胺基酸(如穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸(如穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性胺基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)、芳香族胺基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小胺基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸)各組內的取代。核苷酸取代的綜述可見如Ford等，(1991)，蛋白質表達和純化，2，95-107。
對於本領域技術人員而言，很顯然，可以在對分子的功能比較重要的區域之外進行這些取代，仍能得到活性多肽。可以用本領域的已知技術，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參見例如Cunningham和Wells，(1989)，科學2441081-1085)，鑑定出對本發明克隆DNA序列所編碼多肽的活性必需的、因此最好不做取代的胺基酸。後一種技術中將突變引入分子內的每一個殘基處，檢測所得突變分子的生物學(即纖維素分解)活性，以便鑑定出對該分子活性比較重要的胺基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過分析晶體結構確定，如通過核磁共振分析、結晶學或光親和標記等技術確定(參見例如de Vos等，(1992)，科學255306-312；Smith等，(1992)，分子生物學雜誌224899-904；Wlodaver等，(1992)，FEBS快報30959-64)。
本發明DNA構建體的DNA序列所編碼的內切-β-1，4-葡聚糖酶可以包含一個作為所編碼之酶的整合部分的纖維素結合結構域(CBD)，或者可以向內切-β-1，4-葡聚糖酶中引入其他來源的CBD，形成酶雜合體。本文中，術語「纖維素結合結構域」應按「不溶性碳水化合物的酶解」，John N.Saddler和Michael H.Penner(編)，ACS研討會系列，No.618，1996中Peter Tomme等「纖維素結合結構域分類和特性」定義的理解。該定義將120多種纖維素結合結構域分成10族(I-X)，並表明CBD存在於多種酶中，如纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙醯酯酶和殼多糖酶。CBD還被發現存在於藻類，如紅藻Porphyra purpurea中，這是一種非水解性的多糖結合蛋白質，參見Tomme等，(出處同前)。但大多數CBD來自纖維素酶和木聚糖酶。CBD位於蛋白質的N和C末端或者在內部。酶雜合體是本領域已知的，參見如WO90/00609和W095/16782，可以通過下述製得，即將DNA構建體轉化至宿主細胞中，其中所述構建體含有至少一個編碼纖維素結合結構域的DNA片段，帶有或不帶有接頭而連接到編碼內切-β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列上，再培養宿主細胞以表達融合基因。酶雜合體可以用下列通式描述CBD-MR-X其中CBD是至少相應於纖維素結合結構域的胺基酸序列的N-末端或C-末端區域；MR是中間區域(接頭)，可以是一個鍵，或者是一個短連接基團，所述連接基團優選含有約2-100個碳原子，更優選2-40個碳原子；或者優選是約2-100個胺基酸，更優選是2-40個胺基酸；X是本發明DNA序列所編碼的多肽的N-末端或C-末端區域。
本發明的DNA序列可以用如Sambrook等((1989)，分子克隆實驗指南Cold Spring Harbor Lab.Cold Spring Harbor，NY)描述的標準方法，從大腸桿菌DSM11203菌株中克隆得到。
本發明的DNA序列也可以用包含下述的任何一般方法克隆得到，—在合適的載體中克隆來自預期產生所需內切-β-1，4-葡聚糖酶的任何生物體(例如激烈熱球菌)的DNA文庫，—用所述載體轉化合適的宿主細胞，—在合適的條件下培養宿主細胞，以表達由DNA文庫中的克隆編碼的任何目標酶，—通過測定這些克隆產生的酶的任何纖維素分解活性，篩選陽性克隆，以及—從這些克隆中分離編碼該酶的DNA。
或者，可以依照眾所周知的步驟，通過利用依據SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列製備的合成寡核苷酸探針，方便地從合適的來源(例如以下提到的任何一種生物體)克隆得到編碼本發明纖維素酶的DNA。
編碼內切-β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列的同源性利用SEQ ID NO1的DNA序列進行同源性分析。同源性分析顯示，最相關的DNA序列是編碼那不勒斯棲熱袍菌的內切-β-1，4-葡聚糖酶的一個基因(GenBank acc.No.U93354，Bok，J.D.和Eveleigh，D.E.Direct Submission to database Submitted(1997年3月13日)Biochemistry and Microbiology，Cook College，Rutgers University，Lipman Drive，New Brunswick，NJ08903，USA)，SEQ ID NO1所示的DNA序列與該基因有34％的同一性。
利用上述的同源性分析鑑定出的低同源性表明本發明的內切-β-1，4-葡聚糖酶與任何已知的內切-β-1，4-葡聚糖酶相距較遠。
上述提到的DNA序列同源性定義為兩個序列間的相同程度，表明第一個序列來自第二個序列的派生關係。可以利用本領域已知的電腦程式，如GCG程序包提供的GAP程序(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物學雜誌48443-453)合適地確定同源性。利用GCG程序包(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物學雜誌48443-453)提供的GAP程序，作如下設置，進行DNA序列比較GAP產生罰分為5.0，GAP延伸罰分為0.3。利用上述設置的GAP進行DNA序列比較，結果發現，本發明的DNA構建體中包含的DNA序列顯示與SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列優選至少40％相同，更優選至少45％、更優選至少50％、更優選至少60％、甚至更優選至少70％、特別是至少80％、尤其是至少95％相同。
雜交上面所提到的雜交是指在如下詳述的某些特定條件下，相似(部分)DNA序列與相應於可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的寡核苷酸探針能發生雜交。
用於確定核苷酸探針與同源DNA或RNA序列間雜交情況的適宜條件包括將含有待雜交的DNA片段或RNA的濾膜預先在5×SSC(標準檸檬酸鹽溶液)中浸泡10分鐘，在5×SSC(Sambrook等，1989)、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml變性的超聲處理鮭精DNA(Sambrook等，1989)溶液中對膜進行預雜交，然後在含有隨機引發(Feinberg A.P.和Vogelstein B(1983)分析生物化學1326-13)的32P-dCTP標記(比活＞1×109cpm/μg)探針的相同溶液中於大約45℃雜交12小時。再在2×SSC、0.5％SDS中洗滌膜30分鐘兩次，優選洗滌溫度至少55℃，更優選至少60℃，更優選至少65℃，還要更優選至少70℃，特別是至少75℃。
用X-光膠片檢測在這些條件下與寡核苷酸探針雜交上的分子。
與胺基酸序列的同源性利用SEQ ID NO2的胺基酸序列進行同源性分析。同源性分析顯示，最相關的蛋白質是來自那不勒斯棲熱袍菌的內切-β-1，4-葡聚糖酶(Acc.No.U93354，Bok，J.D.和Eveleigh，D.E.Direct Submission todatabase Submitted(1997年3月13日)Biochemistry andMicrobiology，Cook College，Rutgers University，Lipman Drive，NewBrunswick，NJ08903，USA)，SEQ ID NO2所示的胺基酸序列與該蛋白質有39％相同。
利用SWISSPROT登錄號 P16630的胡蘿蔔軟腐歐文氏菌纖維素酶(屬於糖基水解酶第12家族)的蛋白質序列，以及上面提到的那不勒斯棲熱袍菌纖維素酶蛋白質序列和SEQ ID NO2(本發明)的蛋白質序列，進行疏水區分析。此分析顯示，具有SEQ ID NO2蛋白質序列的蛋白質以及那不勒斯棲熱袍菌纖維素酶屬於糖基水解酶的第12家族(Lemesle-Varloot L，Henrissat B，Gaboriaud C，Bissery V，Morgat A，和Mornon Jp，疏水區分析Biochimie 72(8)555-574，1990)。
利用上述同源性分析鑑定出的低同源性表明本發明的內切-β-1，4-葡聚糖酶與任何已知的內切-β-1，4-葡聚糖酶相距較遠。
上面提到的胺基酸序列同源性定義為兩個序列間的相同程度，表明第一個序列來自第二個序列的派生關係。可以利用本領域已知的電腦程式，如GCG程序包的FASTA程序，採用GCG程序包提供的下述設置評分矩陣(Scoring matrix)GenRunDatablosum50.cmp，變量因子(varible pamfactor)採用GAP產生罰分12，GAP延伸罰分2，從而合適地確定同源性(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物學雜誌48443-453)。利用具有上述設置的FASTA進行胺基酸序列比較，結果顯示，該胺基酸序列與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列或者由SEQ ID NO1的DNA序列中或可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分所編碼多肽的胺基酸序列，相同程度優選為至少45％，更優選至少50％，更優選至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，特別是至少95％。
免疫交叉反應性用於測定免疫交叉反應性的抗體可以利用提純的纖維素分解酶製備。更具體地說，可以參照N.Axelsen等，定量免疫電泳指南，Blackwell科學出版社，1973，23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，實用免疫化學，Blackwell科學出版社，1982(具體是27-31頁)所述的程序，通過免疫兔子(或其他嚙齒類動物)，得到針對本發明內切-β-1，4-葡聚糖酶的抗血清。純化的免疫球蛋白可以從抗血清獲得，例如通過鹽析((NH4)2SO4)，然後透析，並在如DEAE-Sephadex上進行離子交換層析。蛋白質的免疫化學鑑定可以利用Outcherlony雙向擴散分析(O.Ouchterlony，實驗免疫學手冊(D.M.Weir編)，Blackwell科學出版社，1967，655-706頁)，交叉免疫電泳(N.Axelsen等，出處同前，第3和4章)或火箭免疫電泳(N.Axelsen等，第2章)進行。
微生物來源以下使用的分類命名與Maidak等(1996)一致。
為了本發明目的，本文中與某個特定來源聯繫使用的術語「得自」或「可得自」，意指該酶是由或者可以由這個特定來源或插入了來自這個來源的基因的細胞產生。
目前預計本發明的纖維素酶可以得自古生物，特別是屬於Euryarchaeota門的菌株，優選屬於熱球菌亞門的菌株，特別是熱球菌屬的菌株，具體說是激烈熱球菌的一個菌株。
在一個優選實施方案中，本發明的纖維素酶得自激烈熱球菌DSM3638菌株。目前預計編碼本發明酶的同源酶的DNA序列可以得自其他古生物菌株，特別是屬於熱球菌屬的菌株。
能夠從中得到本發明纖維素酶的一株激烈熱球菌的分離培養物可以從德意志微生物保藏中心，以DSM3638公開得到。
另外，含有編碼本發明內切-β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列的質粒pSJ1678已被轉化到一個大腸桿菌菌株中，發明人依照布達佩斯條約國際承認用於專利程序的微生物保藏規定，於1996年10月11日將該菌株保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Federal Republic of Germany，保藏號DSM11203。
重組表達載體含有編碼本發明所述酶的DNA構建體的重組載體可以是能夠方便地進行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經常取決於它將要導入的宿主細胞。因此，載體可以是一種自主複製的載體，即以染色體外實體存在、複製獨立於染色體複製過程的載體，例如質粒。或者，載體可以是這樣一種類型，當它被導入宿主細胞中時，將會部分或全部整合到宿主細胞基因組中，並與其整合入的染色體一起複製。
載體優選是一種表達載體，其中編碼本發明酶的DNA序列可操縱地連接了該DNA轉錄所需的附加片段。一般來說，表達載體來源於質粒或病毒DNA，或者可以含有兩者的成分。術語「可操縱地連接」表明各片段的排列方式能使其功能與它們的預期用途一致，例如，使轉錄在啟動子內起始並持續在編碼酶的DNA序列內進行。
啟動子可以是在所選宿主細胞內顯示轉錄活性的任何DNA序列，並可以來自編碼宿主細胞同源或異源蛋白質的基因。
適用於細菌宿主細胞的啟動子的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖源澱粉酶基因的啟動子，地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因的啟動子，解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因的啟動子，枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶基因的啟動子，或者短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動子，或者噬菌體λPR或PL啟動子，或大腸桿菌lac，trp或tac啟動子。
在必要時，編碼本發明酶的DNA序列也可以可操縱地連接合適的終止子。
本發明的重組載體還可以再含有使載體能在所選宿主細胞中複製的DNA序列。
載體也可以含有一個選擇性標記，例如，一個其產物可補償宿主細胞缺陷的基因，或者編碼抗例如卡那黴素、氯黴素、紅黴素、四環素、壯觀黴素等抗生素的基因，或者編碼抗重金屬或除草劑的基因。
為了使本發明的酶進入宿主細胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供一個分泌信號序列(也稱為前導序列，前體序列或前序列)。分泌信號序列以正確閱讀框加接在編碼該酶的DNA序列上。分泌信號序列通常置於編碼酶的DNA序列的5』端。它可以是正常情況下就與該酶相關聯的或者可以來自編碼另一種分泌蛋白質的基因。
將編碼本發明酶的DNA序列、啟動子和任選的終止子和/或分泌信號序列分別連接，或者通過合適的PCR擴增方案組合這些序列，並將它們插入含有複製或整合必需信息的合適載體中的步驟，是本領域技術人員熟知的(參見例如，Sambrook等，出處同前)。
宿主細胞導入宿主細胞的編碼本發明酶的DNA序列可以是該選定宿主細胞的同源或異源序列。如果是宿主細胞的同源序列，即是宿主細胞天然產生的，一般將它可操縱連接另外的啟動子序列，或者，如果可行，連接另外的分泌信號序列和/或終止子序列，而不處於其天然環境中。術語「同源」意指包括編碼所選宿主生物天然酶的DNA序列。術語「異源」意指包括天然情況下宿主細胞不表達的DNA序列。因此，該DNA序列可以來源於另一種生物體，或者可以是合成序列。
本發明DNA構建體或者重組載體被導入的宿主細胞可以是能夠生產所述酶的任何細胞，包括細菌、酵母、真菌和高等真核細胞。
經過培養能產生本發明酶的細菌宿主細胞的例子是革蘭氏陽性細菌，如芽孢桿菌屬的菌株，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇雲金芽孢桿菌；或鏈黴菌屬的菌株，如淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌；或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌。細菌的轉化可以通過原生質體轉化、電穿孔、接合或用感受態細胞依照已知方式進行(參見Sambrook等，出處同前)。
當在細菌如大腸桿菌中表達酶時，該酶可以保留在細胞質中，通常以不溶性顆粒存在(稱為包涵體)，或者可以被細菌分泌序列引導到壁膜間隙。前一種情況下，裂解細胞，收集顆粒並變性，隨後稀釋變性劑使酶重新摺疊。後一種情況下，通過在例如超聲破碎或滲透壓休克破碎細胞以釋放壁膜間隙成分後，再回收酶，即可以從壁膜間隙收集酶。
當在如芽孢桿菌或鏈黴菌菌株等革蘭氏陽性細菌中表達該酶時，酶可以保留在細胞質中，或者被細菌分泌序列引導到胞外培養基中。後一種情況下，酶可以按以下描述從培養基中回收出來。
所述酵母細胞可以是酵母屬的一個菌株，特別是釀酒酵母。真菌宿主細胞可以是麴黴屬、鐮孢屬或木黴屬的一個菌株。
生產纖維素分解酶的方法本發明提供了一種生產本發明的分離酶的方法，其中，在允許該酶產生的條件下，培養已轉化了編碼該酶的DNA序列的合適宿主細胞，並從培養物中回收得到的酶。
如本文中的定義，一種分離的多肽(例如酶)是基本不含其它多肽的多肽，例如經SDS-PAGE測定，至少約20％純，優選至少約40％純，更優選約60％純，甚至更優選約80％純，最優選約90％純，最最優選約95％純。
術語「分離多肽」也可稱為「純化多肽」。
當將含有編碼該酶的DNA序列的表達載體轉化到異源宿主細胞中時，就有可能異源重組生產本發明的酶。
由此，有可能製備出很純或單組分的纖維素分解組合物，其特徵在於不含同源雜質。
本文中，同源雜質是指來源於最初獲得本發明酶的同源細胞的任何雜質(例如本發明酶之外的其它多肽)。
本發明中，同源宿主細胞可以是激烈熱球菌的一個菌株。
用於培養轉化宿主細胞的培養基可以是適於所選宿主細胞生長的任何常規培養基。表達的纖維素分解酶可以方便地分泌到培養基中，並可以通過熟知的程序從中回收，包括通過離心或過濾將細胞從培養基中分離出來，用鹽(例如硫酸銨)沉澱培養基中的蛋白質成分，隨後進行如離子交換層析、親和層析等層析。
酶組合物更進一步，本發明涉及含有上述具纖維素分解活性的酶的酶組合物。
本發明的酶組合物除包含本發明的纖維素酶之外，還可以含有一或多種其它酶類，例如半纖維素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶，其他纖維素酶或內切-β-1，4-葡聚糖酶組分，殼多糖酶、脂肪酶、酯酶、果膠酶、角質酶、肌醇六磷酸酶、氧化還原酶、蛋白酶或澱粉酶。
酶組合物可以依照本領域已知方法製備，可以是液態或乾燥組合物形式。例如，酶組合物可以是顆粒或微粒形式。包含在組合物中的酶可以用本領域已知方法穩定化。
耐熱纖維素酶在許多工業和應用領域中都有潛在的用途。以下給出了本發明酶組合物的優選用途的例子。本發明酶組合物的劑量和它的其它使用條件可以依據本領域已知方法確定。
本發明的酶組合物可以用於下列目的中的至少一種。
用途本文中，術語「纖維素材料」意指由棉花、棉混紡紗或者天然或人工纖維素(如來源於含木聚糖之纖維素纖維，如來自紙漿)或其混合物製成的纖維、已縫製或未縫製的織物，包括針織物、機織物、粗斜紋布、紗線和毛巾布。混合物的例子是棉或人造絲/粘膠絲與一種或多種配對材料的混合物，所述配對材料例如是羊毛，合成纖維(如聚醯胺纖維，丙烯酸纖維，聚酯纖維，聚乙烯醇纖維，聚氯乙烯纖維，聚偏二氯乙烯纖維，聚氨基甲酸乙酯纖維，聚脲纖維，芳族聚醯胺纖維)，和含纖維素的纖維(如人造絲/粘膠絲，薴麻，大麻，亞麻/亞麻布，黃麻，醋酸纖維素纖維，lyocell)。
在紡織業中，纖維素酶被用來對棉花和其它纖維素材料進行處理，以達到對纖維進行表面處理的目的，從而使織物性質改變，例如起球傾向降低、除去了絨毛、織物更為柔軟、手感或視覺效果更好。特別是纖維素酶被用來產生粗斜紋布的「石洗」外觀。高溫下纖維素酶的使用有可能使粗斜紋布和非粗斜紋布棉/纖維素織物獲得新外觀。可以在織物的高溫處理中使用耐熱纖維素酶，這在以前是不太可能達到的；可以在80℃以上或在液體比率極低的蒸氣條件下進行纖維素酶洗滌，這樣有可能會得到新外觀。
紡織工業中，將纖維素材料例如棉纖維處理成適於製衣的材料的方法包括幾個步驟將纖維紡成紗線，將紗線編織成機織織物或針織織物以及後續的準備、染色和整理操作。機織織物是通過在一系列經線之間編織緯線來構造的；紗線可以是兩種不同的類型。針織織物是由一根連續長的紗線形成聯鎖線圈網而構造的。纖維素纖維也可以用於非機織織物。
準備工序使紡織品在染色操作中能夠產生合適的反應。準備工序中的各小步驟包括脫漿(對於機織產品)、精練和漂白。工業上也採用精練/漂白合併的一步加工法。儘管準備工序通常是在織物水平進行的；然而，也可以在纖維或紗線階段進行精練、漂白和染色操作。
對於平幅或繩狀的形式，處理過程可以通過處理液流間歇或連續地同織物接觸。連續操作通常使用飽和器，在這裡，以每份重量的織物大約等量的化學品，將化學品施加到織物上，接著是在其中將發生化學反應的加熱了的停留室。然後洗滌區為織物在下面的處理步驟做準備。間歇操作通常在一個處理浴中進行，在這裡織物與大約相當於其重量8-15倍的化學品浴進行接觸。經過一段時間的反應後，排出化學品，水洗織物並施加下一種化學品。不連續的浸軋-堆放回蘇工序包括一個飽和器，在此處，以每份重量的織物大約等重量的化學品浴，對織物進行處理，接著停留一段時間，其中對於冷浸軋-堆放回蘇工序，該停留時間可以進行一天或多天。
機織產品是紡織織物結構的主要形式。機織過程需要對經線「上漿」以使其免受摩擦。由於可得性和價錢，澱粉、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纖維素、蠟和丙烯酸系粘合劑是使用的上漿化學物的典型實例。漿料必須在機織過程之後作為製備機織產品的第一步除掉。將上了漿的繩狀或平幅形式的織物同含有退漿劑的處理液體接觸。使用的退漿劑取決於要除掉的漿料的類型。對於PVA漿料，常常採用熱水或者氧化型處理方法。對棉織物最通用的上漿劑是基於澱粉的上漿劑。因此最經常的是，機織棉織物通過熱水、水解澱粉的α-澱粉酶和溼潤劑或表面活性劑的混合物退漿。使纖維素材料在退漿化學品中保持足夠長的「持續階段」以完成退漿。持續階段取決於處理方案的類型和溫度，可以在15分鐘到2小時，或者有時候可達數日。通常，在飽和器浴中使用退漿化學物，該飽和器浴通常大約15℃到55℃。然後將織物放置在例如能提供足夠熱量、通常為大約50℃到100℃的J型箱之類設備中，以提高退漿劑的活性。在持續階段結束後，將化學品、包括除掉了的漿料從織物上洗掉。
為了確保有高白度或良好的可溼性以及染色性，漿料和使用的其他化學物必須完全去掉。通常認為，有效的退漿對於下面的準備工序-精練和漂白是至關重要的。
精練工序將棉中天然存在的大量非纖維素化合物去掉。除了天然的非纖維素雜質之外，精練可以去掉汙垢、汙漬以及製備過程中的殘留物，例如紡絲、絡筒或漿紗潤滑劑。精練工序使用氫氧化鈉或相關的苛性劑，例如碳酸鈉、氫氧化鉀或它們的混合物。通常，該工序中加入一種鹼性穩定的表面活性劑，以提高疏水性化合物的溶解性，和/或防止它們重新沉澱回織物上。該工序通常在80-100℃的高溫下，使用精練劑的強鹼性溶液例如pH13-14。由於化學品處理的非特異性性能，化學品不但處理雜質而且處理纖維素自身，導致織物強度或其他理想織物性能受到損害。纖維素織物的柔軟性是殘留的天然棉蠟的函數。高溫強鹼性精練方法的非特異性性能不能區別所需的天然棉潤滑劑和製備中加入的潤滑劑。並且，由於來自於這些方法的高鹼性廢水，常規的精練方法會產生環境問題。精練階段為織物在漂白中能達到最佳響應做準備。不恰當地精練了的織物將在後續的漂白階段中需要更高水平的漂白化學品。
漂白工序將天然棉色素脫色，並且去掉在軋花、梳棉或精練中沒有完全去掉的任何殘留天然木質棉雜質組分。目前使用的主要方法是鹼性過氧化氫漂白。許多情況下，尤其是不需要非常高的白度時，可以將漂白與精練結合起來。
預計可以將本發明的內切-β-1，4-葡聚糖酶或者內切β-1，4-葡聚糖酶製劑與其它一些酶活性結合起來，在大約90-100℃溫度下，大約pH7-9的環境中，進行精練處理步驟，這樣可代替或者補充高苛性劑的作用。
在工業清洗過程中，當要去除的雜物是纖維素類物質時，使用耐熱纖維素酶能夠使清洗過程更容易。實例是在食品/飼料工業中清洗超濾膜、管道等。
將耐熱纖維素酶與纖維素填充劑一起添加至熱擠壓塑料和聚合物材料中，會使這些材料在自然界有更高的可降解性。
木質纖維素材料構成了農業和林業廢物、以及在城市垃圾中佔主要的廢紙的一個大組成部分。這種廢物通常被燒掉，從能量角度來看，這是對資源的極大浪費。已經進行了大量工作，目的在於發展一種高效、經濟的方法，用於將這些生物質轉化為糖，而糖可用來發酵生產諸如乙醇，以作為燃料。推薦用於將木質纖維素轉化成糖的處理方法包括使用纖維素酶，但是所需的劑量極高，這樣，出於經濟考慮，在大規模工業生產中應用是不現實的。使用具有液化特性的耐熱纖維素酶令這種生物轉化過程更現實。高溫下的處理能打開許多植物材料的細胞壁結構，使纖維素更易受到酶的攻擊。
由各種穀物生產乙醇的工業化生產中，傳統的加工過程包括在大約80-100℃用α-澱粉酶進行液化。在這個步驟加入纖維素酶能提高可發酵糖的產量。纖維素的預液化也使得在隨後的加工中使用常規纖維素酶變得比較現實，因為此時水解速率比未預液化時要更高。
飼料生產中穀物、黑麥、大麥、玉米等的預消化是耐熱纖維素酶的另一個潛在用途，這樣是為了提高飼料在動物體內的消化性。
生產速溶咖啡時，咖啡的提取是在85-150℃下，在一套滲透柱中進行的。水由最濃縮的室逆流到剛裝入了新鮮咖啡的室。含有新鮮咖啡的室的操作溫度接近100℃。在這裡加入嗜熱纖維素酶將可提高柱性能，因為細胞壁結構被打開後，可溶物質更容易釋放。
象咖啡提取一樣，在從天然植物資源中提取油或香料/調味化合物的其它傳統高溫方法中加入纖維素酶能提高生產能力或產量。一個實例是提取棕櫚油或棕櫚果油，這就是一個水性高溫過程。
在石油工業的鑽油和通過聚合物驅油法提高油開採量(EOR)的過程中會使用一些水解膠狀纖維素衍生物(CMC、HEC、HPC和常規使用的其它纖維素衍生物)水溶液，本發明纖維素酶也可用於降解這種衍生物水溶液，即使其粘度降低。
材料和方法保藏微生物激烈熱球菌DSM3638，其含有本發明纖維素酶編碼DNA序列。
大腸桿菌DSM11203，其含有在克隆載體pSJ1678中包含本發明纖維素分解酶編碼DNA序列的質粒。
其它菌株大腸桿菌菌株大腸桿菌SJ2細胞(Diderichsen等，1990)製備用於電穿孔的細胞，使用BIO-RAD的Gene PulserTM基因脈衝電穿孔儀，依照廠商說明，進行轉化。
枯草芽孢桿菌A164。此菌株是枯草芽孢桿菌ATCC 6051a的一種衍生物，它是孢子形成缺陷型，並且apr和npr基因已被破壞。這兩個基因的破壞基本上按照Sonenshein等(1993)所述進行。感受態細胞的製備和轉化按照Yasbin等(1975)所述進行。
質粒pBluescript II KS-(Stratagene，U.S.A.)和pSJ1678(參見WO94/19454)。
pUB110描述於McKenzie等(1986)和McKenzie等(1987)中的一種質粒。
pMUTIN-4-MCS該質粒可得自Laboratoire de GenetiqueMicrobienne，Institut National de la Recherche Agronomique，78352Jouy en Josas-CEDEX，France。
普通分子生物學方法DNA操作和轉化採用標準的分子生物學方法(Sambrook等，1989；Ausubel，F.M.等，1995；Harwood，C.R.等，1990)進行。
DNA操作使用的酶依照廠商的說明使用。
編碼本發明纖維素分解酶的DNA序列的分離編碼本發明內切-β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列可以從保藏微生物大腸桿菌DSM11203中，通過用本領域已知方法(Sambrook等，1989)提取質粒DNA獲得。
內切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆基因組DNA製備激烈熱球菌DSM3638菌株在發酵罐內，用下述培養基，在90℃增殖14-24小時。
DSM3638菌株的培養基組成1.3g(NH4)2SO4，0.25g MgSO4·7H2O，30g NaCl，1.4g KH2PO4，50mg CaCl2，38mg FeSO4·7H2O，5μmol Na2SeO3·5H2O，10ml微量元素#，1g胰蛋白腖，1g酵母提取物，1g澱粉，1mg Resazurin，0.5g Cysteine·HCl，加水至1升。
#微量元素溶液0.1g MnCl2·4H2O，0.2g CoCl2·6H2O，0.1g NiCl2·6H2O，0.1gZnCl2，50mg CaCl2·2H2O，50mg CuSO4·2H2O，50mg Na2MoO4·2H2O，加水至1升。調節至pH6.2-6.5，充入N2/CO2(4∶1)氣體。
收穫細胞，用Pitcher等(1989)所述的方法分離基因組DNA。
基因組文庫的構建用限制酶Sau3A部分消化基因組DNA，經0.7％瓊脂糖凝膠電泳進行大小分級分離。電泳分離出2到7kb大小的片段，將它們轉到DEAE-纖維素膜上(Dretzen，G.等，1981)。
將分離的DNA片段連接到經BamHI消化的pSJ1678質粒DNA上，用連接反應混合物轉化大腸桿菌SJ2。
將細胞鋪在含有0.1％CMC(羧甲基纖維素鈉，Aqualon，France)和9μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板上，達到500-1000個菌落形成單位/板，37℃培養過夜。
通過活性鑑定陽性克隆培養後，將菌落影印到一套LB+CAM瓊脂平板上，繼續在37℃培養約20小時。向影印平板傾注於適當緩衝液pH7中的含有0.1％CMC、1％HSB瓊脂糖的頂層，65℃溫育約20小時。用0.1％剛果紅(Congo Red)(SIGMA，USA)水溶液染色，然後在2M NaCl中洗滌，鑑定出內切-β-1，4-葡聚糖酶陽性菌落。黃色環出現的位置即為內切-β-1，4-葡聚糖酶陽性克隆。
將來自酶陽性菌落的細胞在瓊脂板上塗開以形成單菌落，對每一個鑑定到的產內切-β-1，4-葡聚糖酶的菌落都挑選出一個產酶單菌落。
陽性克隆的鑑定從劃線平板得到內切-β-1，4-葡聚糖酶陽性克隆的單菌落，提取質粒。通過再轉化大腸桿菌SJ2證實表現型，並通過限制酶切鑑定質粒。
內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼DNA的測序利用Taq脫氧末端循環測序試劑盒(PerkinElmer，USA)，螢光標記的終止核苷酸以及適當的寡核苷酸作引物，藉助於引物步行法進行DNA測序，從而鑑定內切-β-1，4-葡聚糖酶基因。按照Devereux等(1984，核酸研究，12，387-395)所述進行序列數據分析。該序列相當於SEQ ID NO1所示DNA序列。
培養基TY和LB瓊脂(如Ausubel等，1995所述)。
雜交條件(用於評價本發明DNA構建體的特性ii))確定核苷酸探針和同源DNA或RNA序列間雜交情況的合適檢測條件包括將含有要雜交的DNA片段或RNA的濾膜預先在5×SSC(標準檸檬酸鹽溶液)中浸泡10分鐘，濾膜在5×SSC溶液(Sambrook等，1989)、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和變性的超聲處理鮭精DNA100μg/ml(Sambrook等，1989)中預雜交，然後在含有隨機引發(Feinberg等(1983)A.P.和Vogelstein B)的32P-dCTP標記(比活＞1×109cpm/μg)探針的相同溶液中於約45℃雜交12小時。然後將膜在2×SSC、0.5％SDS中洗滌30分鐘兩次，洗滌溫度優選至少55℃，更優選至少60℃，更優選至少65℃，還要更優選至少70℃，特別是至少75℃。
用於雜交的核苷酸探針是可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中的內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分。
免疫交叉反應性用於檢測免疫交叉反應性的抗體可以利用純化的內切-β-1，4-葡聚糖酶製備。更具體地說，針對本發明內切-β-1，4-葡聚糖酶的抗血清可以通過免疫兔子(或其他嚙齒類動物)得到，步驟參照N.Axelsen等(1973)，或A.Johnstone等(1982)所述。純化的免疫球蛋白可以從抗血清獲得，例如通過鹽析((NH4)2SO4)，然後透析和如在DEAE-Sephadex中進行離子交換層析。蛋白質的免疫化學鑑定可以利用Outcherlony雙向擴散分析(Ouchterlony，1967)，交叉免疫電泳(N.Axelsen等，出處同前，第3和4章)或火箭免疫電泳(N.Axelsen等，第2章)進行。
構建表達載體下面對表達載體的構建過程進行描述。按類似方式構建實施例1中用於表達本發明內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼DNA序列的表達載體。
本說明書中包括了下述描述(斜體表示)，以闡述下文中進一步用於表達編碼本發明纖維素分解酶之DNA序列(即SEQ ID NO1)的表達載體的構建過程pMUTIN4MCS是一個大腸桿菌質粒，它帶有一個雜合啟動子SPAC(Yansura等(1984))和處於該啟動子轉錄調控下的lacZ基因。此外，該質粒含有在芽孢桿菌penP啟動子調控下的lacI基因。因此，在枯草芽孢桿菌中時，lacI將被表達，並結合SPAC啟動子-操縱子中的操縱子，這就會抑制下遊序列的轉錄。啟動子與Yansura等人所用的相同，但操縱子被修飾成了完善的迴文結構。正好位於啟動子-操縱子區下遊的一個HindIII位點使得可以通過插入另一個基因(如本發明的內切-β-1，4-葡聚糖酶基因)而破壞lacZ基因。這樣，內切葡聚糖酶的表達就處於SPAC啟動子-操縱子的調控下。
在E.coli質粒pMUTIN4MCS中，以HindIII-SacI片段形式克隆了一個核糖體結合位點(RBS)和帶有一個可用於克隆目的的SacII位點的信號肽。因此建立了如下核糖體結合位點和編碼信號肽的DNA序列HindIIIRBS5′-AAGCTTGTTACACATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAAACAACAAAAACGGCTTT-ACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCCG-NotI SacICGGCA GCGGCCGC GAGCTC-3′斜體書寫的是編碼芽孢桿菌屬之種信號肽的DNA序列，它與編碼蛋白質成熟部分的另一DNA序列融合時，能將該蛋白質引導到芽孢桿菌細胞外。
上述序列編碼pMUTIN4MCS的HindIII位點，其後緊跟枯草芽孢桿菌RBS和編碼芽孢桿菌信號肽的一段DNA序列，該DNA序列末端是一個人工引入的SacII位點，其後接著NotI和SacI限制酶切位點。通過電穿孔將質粒導入E.coli SJ2，鋪在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板上並在37℃培養細胞過夜，即在E.coli SJ2中引入了該質粒。得到的質粒命名為pMUTIN4-信號SacII-NotI。
耐熱內切-β-1，4-葡聚糖酶基因以SacII-EagI消化的PCR片段進行克隆。
用Boehringer Mannheim的HiFi Expand PCR試劑盒獲得該PCR片段，反應按照廠商建議進行。從質粒pDSM11201擴增該DNA片段。耐熱內切-β-1，4-葡聚糖酶基因起初是從網球菌DSM6262克隆來的，並作為包含帶有內切-β-1，4-葡聚糖酶基因的質粒的E.coli克隆(DSM11201)進行了保藏。所用的兩個PCR引物如下所示#305195′-CATTCTGCAGCCGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGC-3′#306375′-CATGACACGGCCGATTATTTAAGCTCAATATCAAAATTTGAG-3′該PCR片段和pMUTIN4-信號SacII-NotI用SacII-EagI消化，連接在一起，通過電穿孔、鋪在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板上、並在37℃培養細胞過夜，從而轉化E.coli SJ2。得到的SJ2中的質粒命名為pMB447A。
克隆融合了上述信號肽(在SacII-NotI/EagI位點)的內切-β-1，4-葡聚糖酶基因後，得到下面的在SPAC啟動子-操縱子轉錄調控下的開放閱讀框ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCCGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGCATTTATACTTAAAGCACCTTCCTCAGGCGATGTCACAACTAAAAATCTTCCTCTCACCTTAGAACTCAACTTTTGGAATATTGCAAACTATGAAGGAAATACATGGATGGCATTTTATAAAGAAGAAGATACTGTTGAATATTATGCCGACATAAAAAACATAGTACTTAAGGATAAAAATTCATGGGTACATGGATATCCTGAAGTCTACTATGGGTACAAACCATGGGCTGGCCATGGGAATTCCATTGAGAAATTAGCTCTTCCTAAAAAGGTATCAGAATTTCCAGACGTTCTCTTCAATCTAAAATACAACATATGGTACGAGAAGAATCTTCCTATAAATTTTGCTATGGAAACATGGATAACAAAAGAACCCTATCAGAAAACCGTTACTTCAGGGGATATAGAGATGATGGTATGGCTATATGCTAATAGACTTTCTCCTGCAGGGCGAAAGGTAGGAGAAGTAAAAATACCTATCATCCTAAACGGTAATCAAAAAGACATTATCTGGGAAGTATATCTTTCCCCTATGAGCTGGGACTACGTGGCCTATAAATCAAAAGAAAATATTCTTCAAGGACAGGTAAAAATACCAATAAATGAATTTTTGAAACACCTAAGAACAATTTTAGCCAACAATCCAAGTAGAATAACCCCAGAGAAATTTGATCAGATGTATGTGACAGTCTGGGAAATTGGAACAGAATTTGGCGATCCATATACTACTGAGGCAAAATTTGGATGGACTTTCTCAAATTTTGATATTGAGCTTAAATAA以及衍生的蛋白質MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAAAAQTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFWNIANYEGNTWMAFYKEEDTVEYYADIKNIVLKDKNSWVHGYPEVYYGYKPWAGHGNSIEKLALPKKVSEFPDVLFNLKYNIWYEKNLPINFAMETWITKEPYQKTVTSGDIEMMVWLYANRLSPAGRKVGEVKIPIILNGNQKDIIWEVYLSPMSWDYVAYKSKENILQGQVKIPINEFLKHLRTILANNPSRITPEKFDQMYVTVWEIGTEFGDPYTTEAKFGWTFSNFDIELK.
為了能在枯草芽孢桿菌中增殖pMB447A，將該E.coli質粒與pUB110的衍生質粒(能在枯草芽孢桿菌中增殖的一種質粒)融合在pUB110的NciI位點用多接頭引入SacI和NotI位點，得到的插入片段有如下序列CCCGGGAGCTCGCGGCCGCCCCGG下劃線的是兩個NciI位點，其間是SacI和EagI(NotI)位點。
隨後用SacI和EagI消化該質粒，連接到經SacI和EagI消化過的pMB447A中，用連接產物轉化枯草芽孢桿菌A164。建立克隆，並在LBPG-10 Kana AZCL-HE-纖維素平板上過夜生長。第二天，將平板在70℃保溫5小時，藍色環的出現指示耐熱內切-β-1，4-葡聚糖酶的陽性表達。
分析從克隆MB505(DSM11903)分離得到的質粒DNA時，發現該質粒顯然發生了重組，產生的質粒小於預料中的12.5kb大小。因此，看來質粒丟失了E.coli質粒pMUTIN4-信號SacII-NotI的大部分，得到大小約為5.5kb的一個質粒。
所得質粒具有如下基本特點質粒DSM11903上編碼的內切-β-1，4-葡聚糖酶不需加入IPTG即可陽性表達，並且該質粒賦予對10μg/ml卡那黴素的抗性。在90℃進行CMCU檢測(測定內切-β-1，4-葡聚糖酶活性)1CMCU單位定義為，在下述標準條件(90℃下的CMC測定)下，每分鐘釋放相當於1mmol葡萄糖所需的酶量將酶在於0.1M巴比妥酸鈉緩衝液pH8.5中的0.75％CMC(7L，來自Hercules)溶液中保溫20分鐘。保溫後，使用PHBAH(SIGMA H-988253H7704(對羥基苯甲酸醯肼))測定還原性末端基團的增加量，並利用葡萄糖標準，計算每分鐘形成的相當於葡萄糖的末端基團(Lever，M.(1972)用於比色測定碳水化合物的一種新反應，分析生物化學，47卷，273-279頁)。對硝基苯基-β-D-纖維素二糖苷檢測一個PNPU單位定義為在標準檢測條件(參見下述)下，每分鐘從對硝基苯基-β-D-纖維素二糖苷(Sigma)釋放1mmol對硝基苯酚所需的酶量。
方法穩態動力學，直接在405nm檢測黃色產物對硝基苯酚。活性用吸光度的增加衡量，曲線的線性部分用於確定斜率(AU/sec)。活性的計算使用對硝基苯酚在磷酸鹽緩衝液pH7.5中的吸光度在1cm比色杯中的吸光度，在405nm處1mM為0.018(在420nm處為0.014)。
檢測條件475ml於0.1M磷酸鈉緩衝液(pH7.5)中的10mM對硝基苯基-β-D-纖維素二糖苷；25ml酶溶液步驟用恆溫控制在70℃的HP 8452A二極體組分光光度計，在1cm厚的0.75ml比色杯中進行測量。
測量300秒內在405nm處的吸光度，每20秒測一次。
以下非限制性實施例用於闡明本發明。
實施例1A.從激烈熱球菌DSM3638克隆內切-β-1，4-葡聚糖酶如「材料和方法」的描述，在大腸桿菌中構建並篩選來源於激烈熱球菌DSM3638的一個文庫。分離到的一個陽性轉化子是DSM11203，它帶有質粒pSJ1678，其中含有編碼本發明纖維素分解酶的DNA序列，即SEQ ID NO1。
B.從保藏的E.coli克隆DSM 11203中克隆激烈熱球菌內切-β-1，4-葡聚糖酶基因依據SEQ ID NO1 DNA序列，設計一套PCR引物。這些引物設計成能獲得編碼相應於本發明內切-β-1，4-葡聚糖酶最可能的成熟形式的DNA序列片段。以SacII-EagI片段的形式，將該片段克隆至上述載體pMB505內。
利用Expand High Fidelity PCR體系(#1732650，BoehringerMannheim，GmbH)，進行PCR。利用緩衝液2體系，以及四種dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)各200μM、0.75μl酶混合液和下述PCR引物各250nM進行反應#1058475＇-CAT CAT TCT GCA GCC GCG GCA ATA TAT TTT GTA GAA AAG TAT CATACC-3＇#1058715＇-GCA CAA GCT TGC GGC CGC TTA GGA AAT AAG AGG TCT ATC TAG-3＇在50μl體積內，利用得自大腸桿菌DSM 11203的質粒100-200ng，進行PCR反應。PCR反應在Landgraf熱循環儀(HansLandgraf，GmbH)內進行溫度循環。採用下述溫度循環方案*94℃ 60秒，1個循環；*(94℃ 15秒，60℃ 60秒，72℃ 60秒)10個循環；*(94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 60秒，在延伸步驟每循環增加20秒)20個循環；*72℃ 300秒，1個循環。
將從一種溫度轉換至另一溫度所用時間設置為1秒[對於此熱循環儀，這意味著是儘可能地快(大約10秒)]。
循環結束後，利用Qiagen PCR純化試劑盒，按照生產商說明(Qiagen，GmbH)，純化該50μl反應物。
純化後，用限制酶SacII和EagI切割該PCR片段和質粒pMB505(利用Qiagen的質粒製備試劑盒#27106，從枯草芽孢桿菌克隆DSM11903內獲得)。在染有溴乙錠的0.7％瓊脂糖凝膠上對已消化的DNA跑電泳，從凝膠上切下所需的DNA片段，利用Qiagen試劑盒#28706，按照生產商建議進行純化。
將DNA從純化柱上洗脫下來之後，在20μl的體積內，利用1單位Boehringer Mannheim(GmbH)的T4 DNA連接酶，在其合適緩衝液內，於16℃溫育連接混合物過夜，使部分PCR片段(大約100ng)和部分載體(大約400ng)連接起來。利用一半連接產物轉化枯草芽孢桿菌A164。轉化後，將細胞鋪在含有10μg/ml卡那黴素的LBPG-AZCL-HE纖維素平板上，於37℃培養過夜。選出單個菌落，在新鮮平板上劃線培養，並於37℃培養過夜。將數個克隆的單菌落在10mlTY中於37℃培養過夜，分離出質粒，並利用不同特異性的酶，通過限制酶消化法進行分析。
從過夜液體培養物中取40μl培養液，轉移到LBPG-AZCL-HE纖維素平板上所挖的孔內。然後將平板置於80℃溫育6小時，孔周圍出現清亮藍圈，表明在枯草芽孢桿菌內陽性表達了DSM 3638的激烈熱球菌內切-β-1，4-葡聚糖酶和來自DSM11203的亞克隆基因。
這樣的一個表達克隆被稱作MB544。在帶有2塊擋板的500ml搖瓶內，100ml BPX培養基中，於37℃、300rpm培養MB544 5天。利用此培養液純化表達得到的內切-β-1，4-葡聚糖酶。
培養基LB瓊脂(如Ausubel，F.M.等(編輯)「現代分子生物學手冊」，JohnWileySons，1995描述)。
LBPG是補充了0.5％葡萄糖和0.05M磷酸鉀(pH7.0)的LB瓊脂。
AZCL-HE-纖維素加入LBPG瓊脂至1％。AZCL-HE纖維素來自Megazyme，Australia。
BPX培養基描述於US5,695,976和相應的EP-B-0 506 780中。
實施例2表達的激烈熱球菌內切-β-1，4-葡聚糖酶克隆的純化和鑑定得到含有實施例1所述克隆的芽孢桿菌3600ml搖瓶培養液，用HCl將3200ml培養液調節到pH5.5，然後，在室溫並攪拌下，用150ml陽離子凝聚劑進行處理，再用300ml 0.1％陰離子凝聚劑溶液進行處理。利用Sorval RC 3B，在10,000rpm離心30分鐘，分離凝聚過的材料。利用Whatman F號玻璃濾器澄清上清液。得到總量3400ml，其活性為8CMCU/ml(在90℃、pH8.5時測得的活性)。
將液體上樣到已平衡於50mM乙酸鹽緩衝液(pH5.5)的3000mlDEAE A-50 Sephadex中。未結合的材料總共含有18000CMCU。
在截留分子量為10kDa的過濾器中，將未結合材料濃縮至1.4升。然後，將用乙酸銨調至1M的400ml液體2份上樣到已用1M乙酸銨緩衝液(pH6.5)平衡了的400ml Butyl Toyopearl柱中，用去離子水洗脫髮生結合的酶。總共得到17000 CMCU單位。
用甘油將4000 CMCU單位製成終濃度為40％，用於應用試驗。
B.鑑定本發明內切-β-1，4-葡聚糖酶在280nm的摩爾消光係數為84350，表觀分子量(MW)為34kDa，pI為4.8。
純內切-β-1，4-葡聚糖酶對對硝基苯基-β-D-纖維素二糖苷(Sigma)、CMC、HE纖維素(Megazyme)和酸溶脹的纖維素均有活性。內切-β-1，4-葡聚糖酶的溫度-活性關係在pH7.5的CMCU檢測中，將內切-β-1，4-葡聚糖酶在0.1M Mops緩衝液中，於不同溫度下保溫，保溫20分鐘後如上所述檢測活性。超過100℃的保溫沒有做，在該溫度得到的還原性糖量最高，用於計算低於該溫度時的相對活性。溫度 相對活性100℃96％90℃ 100％80℃ 65％70℃ 32％60℃ 13％pH-活性曲線在90℃的CMCU檢測中，將內切-β-1，4-葡聚糖酶用pH4.5到11的不同緩衝液保溫，保溫20分鐘後如上所述測定活性。
緩衝液pH4.5、5.0和5.50.1M 乙酸鈉pH6.00.1M Na-MESpH6.5、7.0和7.50.1M Na-MOPSpH8.0和8.50.1M EPPSpH9.0、9.5、10.0、10.5和11.00.1M甘氨酸鈉測得pH5.0到9.5的間隔內相對活性高於50％。
實施例3在浸軋-蒸氣機系統中，用本發明內切-β-1，4-葡聚糖酶對棉針織物進行生物拋光實驗方法織物和溶液製備將漂白過的針織棉毛布測試織物#460(來自TestFabrics公司，Middlesex，NJ)剪成大約20×30cm的布片，在人工氣象室(相對溼度65±2％，溫度70±3°F/21+2℃)內調溼至少24小時。稱得所有布片均為11.8-12.6g。用緩衝液和酶製備溶液，使含有0,2CMCU/ml。將1.5g三(羥甲基)氨基甲烷溶於500ml去離子水中，並用HCl調節pH至pH8.9和7.3，製得緩衝液。採用按照實施例1和2製得的內切-β-1，4-葡聚糖酶(MB473，#9730)。
浸軋(padding)在Mathis浸軋-蒸汽機組(Werner Mathis USAInc.Concord，NC)內，利用酶溶液對布塊進行浸軋。利用浸軋之前和之後的織物重量計算纖維吸液率，得到纖維吸液率為100±5％。在每種pH溶液中對兩種布塊進行浸軋。每一pH下，纖維素酶的濃度為0和2CMCU/ml。
保溫將Mathis浸軋-蒸汽機組預熱至90℃，相對溼度(RH)為100％。用溶液浸軋後，人為將布塊掛在蒸汽機室內。打開浸軋-蒸汽機組的艙門會使溫度和相對溼度降低。然而，2分鐘內即可達到原來的溫度和相對溼度。所有布片處理相同時間-90分鐘。
漂洗從蒸汽機室內取出布片後，在去離子水中漂洗5分鐘。然後風乾，在人工氣象室平衡至少24小時後再用於評估。
評估依照ASTM D 4970-89，由起球指數測得抗起球性進行評估。採用Nu-Martindale Abrasion and Pilling Tester(James H.Heal Co.Ltd.，UK)。記錄125轉後的起球指數。與標準相片相比，將起球指數分成1～5級，1級表示嚴重起球，5級表示不起球。
按照ASTM D3786-87方法測量頂破強力損失。採用Mullenburst Tester(C型)(B.F.Perkins，Chicopee，MA)進行。
結果與結論測量起球指數2次，頂破強力至少7次。數據示於表1中。與在相同pH的無酶處理的對照相比，對經內切-β-1，4-葡聚糖酶處理過的所有布片均未檢測到統計學上顯著的強力損失。在pH7.3，經0和2CMCU/g織物處理過的布片，在125轉後的起球指數分別為3和4。在pH8.9，經0和2 CMCU/g織物處理過的布片，在125轉後的起球指數分別為2.5和4。這些結果顯示存在明顯差異。與經0CMCU/g織物處理過的織物相比，經內切-β-1，4-葡聚糖酶處理過的織物手感和外觀均要更好一些。
可以得出這樣一個結論在pH7.3至8.9，90℃的浸軋-蒸汽機組內，本發明的第12家族內切-β-1，4-葡聚糖酶顯示出良好的生物拋光效果，而織物強力損失很小。能夠提高起球指數的內切-β-1，4-葡聚糖酶的量可以少至2CMCU/g織物。也能夠獲得更好的外觀和織物手感效果。
表1
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序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK-2880(G)電話+45 44 44 88 88(H)傳真+45 44 49 32 56(ii)發明題目一種新型內切葡聚糖酶(iii)序列數2(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度960個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGAGCAAGA AAAAGTTCGT CATCGTATCT ATCTTAACAA TCCTTTTAGT ACAGGCAATA 60TATTTTGTAG AAAAGTATCA TACCTCTGAG GACAAGTCAA CTTCAAATAC CTCATCTACA 120CCACCCCAAA CAACACTTTC CACTACCAAG GTTCTCAAGA TTAGATACCC TGATGACGGT 180GAGTGGCCAG GAGCTCCTAT TGATAAGGAT GGTGATGGGA ACCCAGAATT CTACATTGAA 240ATAAACCTAT GGAACATTCT TAATGCTACT GGATTTGCTG AGATGACGTA CAATTTAACC 300AGCGGCGTCC TTCACTACGT CCAACAACTT GACAACATTG TCTTGAGGGA TAGAAGTAAT 360TGGGTGCATG GATACCCCGA AATATTCTAT GGAAACAAGC CATGGAATGC AAACTACGCA 420ACTGATGGCC CAATACCATT ACCCAGTAAA GTTTCAAACC TAACAGACTT CTATCTAACA 480ATCTCCTATA AACTTGAGCC CAAGAACGGC CTGCCAATTA ACTTCGCAAT AGAATCCTGG 540TTAACGAGAG AAGCTTGGAG AACAACAGGA ATTAACAGCG ATGAGCAAGA AGTAATGATA 600TGGATTTACT ATGACGGATT ACAACCGGCT GGCTCCAAAG TTAAGGAGAT TGTAGTCCCA 660ATAATAGTTA ACGGAACACC AGTAAATGCT ACATTTGAAG TATGGAAGGC AAACATTGGT 720TGGGAGTATG TTGCATTTAG AATAAAGACC CCAATCAAAG AGGGAACAGT GACAATTCCA 780TACGGAGCAT TTATAAGTGT TGCAGCCAAC ATTTCAAGCT TACCAAATTA CACAGAACTT 840TACTTAGAGG ACGTGGAGAT TGGAACTGAG TTTGGAACGC CAAGCACTAC CTCCGCCCAC 900CTAGAGTGGT GGATCACAAA CATAACACTA ACTCCTCTAG ATAGACCTCT TATTTCCTAA 960(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度319個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Lys Lys Lys Phe Val Ile Val Ser Ile Leu Thr Ile Leu Leu1 5 10 15Val Gln Ala Ile Tyr Phe Val Glu Lys Tyr His Thr Ser Glu Asp Lys20 25 30Ser Thr Ser Asn Thr Ser Ser Thr Pro Pro Gln Thr Thr Leu Ser Thr35 40 45Thr Lys Val Leu Lys Ile Arg Tyr Pro Asp Asp Gly Glu Trp Pro Gly50 55 60Ala Pro Ile Asp Lys Asp Gly Asp Gly Asn Pro Glu Phe Tyr Ile Glu65 70 75 80Ile Asn Leu Trp Asn Ile Leu Asn Ala Thr Gly Phe Ala Glu Met Thr85 90 95Tyr Asn Leu Thr Ser Gly Val Leu His Tyr Val Gln Gln Leu Asp Asn100 105 110Ile Val Leu Arg Asp Arg Ser Asn Trp Val His Gly Tyr Pro Glu Ile115 120 125Phe Tyr Gly Asn Lys Pro Trp Asn Ala Asn Tyr Ala Thr Asp Gly Pro130 135 140Ile Pro Leu Pro Ser Lys Val Ser Asn Leu Thr Asp Phe Tyr Leu Thr145 150 155 160Ile Ser Tyr Lys Leu Glu Pro Lys Asn Gly Leu Pro Ile Asn Phe Ala165 170 175Ile Glu Ser Trp Leu Thr Arg Glu Ala Trp Arg Thr Thr Gly Ile Asn180 185 190Ser Asp Glu Gln Glu Val Met Ile Trp Ile Tyr Tyr Asp Gly Leu Gln195 200 205Pro Ala Gly Ser Lys Val Lys Glu Ile Val Val Pro Ile Ile Val Asn210 215 220Gly Thr Pro Val Asn Ala Thr Phe Glu Val Trp Lys Ala Asn Ile Gly225 230 235 240Trp Glu Tyr Val Ala Phe Arg Ile Lys Thr Pro Ile Lys Glu Gly Thr245 250 255Val Thr Ile Pro Tyr Gly Ala Phe Ile Ser Val Ala Ala Asn Ile Ser260 265 270Ser Leu Pro Asn Tyr Thr Glu Leu Tyr Leu Glu Asp Val Glu Ile Gly275 280 285Thr Glu Phe Gly Thr Pro Ser Thr Thr Ser Ala His Leu Glu Trp Trp290 295 300Ile Thr Asn Ile Thr Leu Thr Pro Leu Asp Arg Pro Leu Ile Ser305 310 31權利要求
1.一種有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶製劑，它在高於90℃的溫度下有最佳活性。
2.權利要求1的製劑，其中所述酶製劑可得自屬於古生物的一個菌株，或是它的內源物。
3.權利要求1或2的製劑，其中所述酶製劑可得自Euryarchaeota門的一個菌株，或是它的內源物。
4.權利要求3的製劑，其中所述菌株屬於熱球菌亞門。
5.權利要求4的製劑，其中所述菌株屬於熱球菌屬，優選屬於激烈熱球菌，特別是屬於激烈熱球菌DSM3638。
6.權利要求1至5中任何一項的製劑，它在約pH4-11有活性，優選在大約pH5.5-10有活性。
7.權利要求1至6中任何一項的製劑，其基本上由一種酶組成，所述酶有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性，且屬於糖基水解酶第12家族。
8.一種DNA構建體，它含有編碼有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性的一種酶的一段DNA序列，該酶最佳活性在90℃以上，優選在95℃以上，更優選在100℃以上，所述DNA序列含有a)相應於SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列，或者b)相應於SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列的相似物，該相似物i)與相應於SEQ ID NO1 DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列同源，優選至少40％同源，或ii)與相應於SEQ ID NO1 DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列可雜交，或者iii)編碼一種多肽，該多肽與SEQ ID NO2所示的多肽或者由一種DNA序列編碼的多肽同源，優選至少45％同源，所述DNA序列包含相應於SEQ ID NO1 DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列，或者iv)編碼一種多肽，該多肽與針對純化的內切-β-1，4-葡聚糖酶產生的抗體具有免疫反應性，所述內切-β-1，4-葡聚糖酶是由相應於SEQ IDNO1的DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列編碼的。
9.權利要求8的DNA構建體，其中所述DNA序列分離自一種古生物，或者是在一種古生物的DNA文庫基礎上產生的。
10.權利要求9的DNA構建體，其中的DNA序列分離自一個菌株，或者是在一個菌株的DNA文庫基礎上產生的，該菌株屬於Euryarchaeota門，優選屬於熱球菌亞門，更優選屬於熱球菌屬，甚至更優選屬於激烈熱球菌種，尤其是激烈熱球菌DSM3638。
11.權利要求8-10中任何一項的DNA構建體，其中所述DNA序列分離自大腸桿菌DSM11203。
12.權利要求8-11中任何一項的DNA構建體，其中還含有編碼纖維素結合結構域(CBD)的DNA序列。
13.權利要求12的DNA構建體，其中還含有編碼纖維素結合結構域(CBD)的DNA序列，該纖維素結合結構域和由該DNA構建體之DNA序列所編碼的酶的酶核心(催化活性結構域)被可操縱地連接在一起。
14.一種含有權利要求8-13中任何一項的DNA構建體的重組表達載體。
15.一種含有權利要求8-13中任何一項的DNA構建體或權利要求14的重組表達載體的細胞。
16.權利要求15的細胞，它是原核細胞，特別是細菌細胞；或者是真核細胞，特別是絲狀真菌細胞；或者是編碼具有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性之酶的DNA序列最初來源的內源細胞。
17.權利要求16的細胞，其中所述細菌細胞屬於芽孢桿菌的一個菌株，優選屬於枯草芽孢桿菌或者遲緩芽孢桿菌的一個菌株；所述真菌細胞屬於選自麴黴屬各種和鐮孢屬各種的一個菌株。
18.權利要求16的細胞，其中所述細胞屬於熱球菌屬的一個菌株，優選激烈熱球菌DSM3638。
19.權利要求15的細胞，其中所述細胞屬於酵母屬的一個菌株，優選釀酒酵母的一個菌株。
20.產生有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性、且最佳活性在90℃以上、優選95℃以上、更優選100℃以上的一種酶的方法，該方法包括在允許該酶產生的條件下培養權利要求15-19中任何一項所述細胞，並從培養物中回收該酶。
21.一種有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性的分離酶，其中該酶i)不含同源雜質，並且ii)是依照權利要求20的方法產生的。
22.一種有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性、且最佳活性在90℃以上、優選95℃以上、更優選100℃以上的酶，該酶a)由權利要求8-13中任何一項的DNA構建體編碼，或b)通過權利要求20的方法產生，或c)是激烈熱球菌DSM3638產生的一種多肽，可以由SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分編碼，或d)與針對純化的內切-β-1，4-葡聚糖酶產生的抗體有免疫反應性，該純化的內切-β-1，4-葡聚糖酶由相應於SEQ ID NO1 DNA序列或者可得自大腸桿菌DSM11203內質粒的DNA序列中內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼部分的DNA序列所編碼。
23.權利要求21或者22的酶，其屬於糖基水解酶第12家族。
24.一種富含權利要求21-23中任何一項的酶的酶製劑。
25.權利要求1-7和24中任何一項的製劑，其中還含有選自下述的一或多種酶甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果膠乙醯酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶、果膠酸鹽裂解酶、果膠甲酯酶、內切-β-1，4-葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、澱粉酶、角質酶、過氧化物酶、漆酶、纖維素二糖水解酶和轉穀氨醯胺酶。
26.大腸桿菌DSM11203菌株基本純的分離的生物學培養物。
27.權利要求21-23中任何一項的酶或者權利要求1-7、24和25中任何一項的酶製劑在紡織業中，用於改善纖維素纖維或織物品性，或者提供粗斜紋布的石洗外觀；或者用於纖維素纖維加工業；或者用於工業清潔工序；或者用於熱擠壓聚合物材料；或者用於將生物質轉化成糖；或者用於生產醇；或者用於預消化例如飼料生產中所用的穀物；或者用於生產速溶咖啡或相似提取過程；或者在油業中用於降解鑽油或通過聚合物驅油法提高油開採量中所用水解膠狀纖維素衍生物水溶液中的用途。
全文摘要
在至少90℃的溫度下具有內切－β－1,4－葡聚糖酶最佳酶活性的一種酶製劑可得自屬於古生物的一個菌株,或者是其內源物,如克隆自激烈熱球菌DSM3638、並且可由SEQ ID NO:1 DNA序列編碼的一種內切－β－1,4－葡聚糖酶。
文檔編號C12N9/42GK1246149SQ9880218
公開日2000年3月1日 申請日期1998年1月30日 優先權日1997年1月31日
發明者L·N·安德森, M·E·布約恩瓦德, M·舒萊恩 申請人:諾沃挪第克公司