必特螺旋黴素及其在抗感染性疾病中的應用的製作方法
2023-05-08 12:09:36 1
專利名稱：必特螺旋黴素及其在抗感染性疾病中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種大環內酯類基因工程新抗生素，特別是4」-醯化螺旋黴素藥物組合物及其在抗感染性疾病中的應用。
背景技術：
大環內酯類抗生素在臨床上佔有重要地位，因其對革蘭氏陽性菌和支原體有很好的活性，對部分革蘭氏陰性菌也有作用，且對一些日趨流行的弓形體、軍團菌等難以控制的病原體有良好的抗菌活性和組織滲透性，口服吸收快，不良反應少，對肝、腎功能基本無影響，還有潛在的免疫調節作用，九十年代被認為在治療成人呼吸道感染上將會與β-內醯胺類藥物競爭。近年來，世界各國通過對十四元環紅黴素分子結構的化學改造研製新的衍生物已取得進展。目前對紅黴素的改造主要是採用化學半合成方法，如紅黴素經二步反應獲得羅紅黴素，四步反應獲得克拉黴素，五步反應獲得阿齊黴素等。改造後的紅黴素類抗生素在抗菌活性、血藥濃度、半衰期、酸穩定性及不良反應方面均有明顯的改善。但是，總的來說仍須通過發酵產物及化學半合成兩個環節進行製備，不僅在生產成本、三廢處理方面的問題需要解決，而且還有2.3-4.1％不良反應的報導。
16元環大環內酯類抗生素構效關係的研究顯示，碳黴糖4」位親酯醯基團對於分子向細胞的滲透有重要作用，採用基因工程技術在碳黴糖4」位接上長鏈醯基碳鏈，可以提高其親脂性並增強其體內活性。基於上述思路，本實驗室在國家「863」計劃專題項目「抗生素基因工程研究」(課題編號102-19-8)的支持下，自1990年開展了此項工作，成功地將碳黴素產生菌4」-異戊醯基轉移酶基因在螺旋黴素產生菌中進行了克隆表達，獲得了產生以異戊醯螺旋黴素為主成分的一株質粒型基因工程螺旋黴素鏈黴菌(Streptomyces spiramyceticus)p66B-F21(保藏編號CGMCC No.0304)，並申請了生技黴素製造方法專利(申請號97104440.6)；隨後，在維持4」-異戊醯基轉移酶基因整合狀態下，通過誘變、自然分離等手段，提高整合型原始菌株WSJ-1發酵產生必特螺旋黴素(原名生技黴素)的能力，獲得高產菌株WSJ-195(保藏編號CGMCC No.0801)，並於同年申請了整合型基因工程菌種專利(申請號02148771.5)。
必特螺旋黴素是以異戊醯螺旋黴素III、異戊醯螺旋黴素II、異戊醯螺旋黴素I三個組分為主的混合物，含有一定量的(異)丁醯、丙醯、乙醯螺旋黴素III及(異)丁醯、丙醯、乙醯螺旋黴素II，其化學結構及組分如下 異戊醯螺旋黴素(isv-)III R＝COCH2CH3R』＝COCH2CH(CH3)2異戊醯螺旋黴素IIR＝COCH3R』＝COCH2CH(CH3)2異戊醯螺旋黴素I R＝H R』＝COCH2CH(CH3)2異丁醯螺旋黴素(iBu-)III R＝COCH2CH3R』＝COCH(CH3)2異丁醯螺旋黴素IIR＝COCH3R』＝COCH(CH3)2丁醯螺旋黴素(Bu-)IIIR＝COCH2CH3R』＝COCH2CH2CH3丁醯螺旋黴素II R＝COCH3R』＝COCH2CH2CH3丙醯螺旋黴素(Pr-)IIIR＝COCH2CH3R』＝COCH2CH3丙醯螺旋黴素II R＝COCH3R』＝COCH2CH3乙醯螺旋黴素(Ac-)IIIR＝COCH2CH3R』＝COCH3乙醯螺旋黴素II R＝COCH3R』＝COCH3目前，必特螺旋黴素已經完成全部臨床前藥理試驗及I期臨床研究。為了確保臨床用藥的安全性和可靠性，提供一種組分穩定、質量可控的必特螺旋黴素製劑(藥物組合物)是十分必要的。
發明內容
本發明提供4」-醯化螺旋黴素在製藥中的應用。
本發明還提供一種以4」-醯化螺旋黴素為藥物活性成分的藥物組合物。
本發明所說的藥物組合物，是指含有安全及治療有效量的4」-醯化螺旋黴素和藥學上可接受的載體。
此處所用術語「安全及治療有效量」，是指能減輕或逆轉或治療人體或其它哺乳動物的疾病而且所服用的藥物或藥劑對哺乳動物的組織並無嚴重傷害的藥物、化合物、組合物、產品或藥劑的足夠用量。
此處所用術語「藥學上可接受的載體」，是指藥學領域常規的藥物載體，如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如澱粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；溼潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、和聚乙二醇等。此外，還可以在組合物中添加其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發明所說的4」-醯化螺旋黴素是以異戊醯螺旋黴素III、異戊醯螺旋黴素II、異戊醯螺旋黴素I三個組分為主的混合物，含有一定量的異丁醯螺旋黴素III、異丁醯螺旋黴素II、丁醯螺旋黴素III、丁醯螺旋黴素II、丙醯螺旋黴素III、丙醯螺旋黴素II、乙醯螺旋黴素III及乙醯螺旋黴素II。其中，異戊醯螺旋黴素總含量(I+II+III)應不低於50％；4」-醯化螺旋黴素的總含量應不低於80％。
本發明的組合物可任選使用安全及有效量的稀釋劑、崩解劑、潤滑劑、填充劑、粘合劑、溼潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、賦形劑或任何其它安全及有效量的本領域常用的藥物載體。
本發明的組合物以適合藥用的製劑形式存在，這些製劑形式是片劑、素片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、注射劑、粉針劑、凍乾粉針劑、無菌粉針劑等。
本領域技術人員通常知道用於治療所需的活性成分的量將隨各種因素而變化，包括所治療疾病的性質及患者的年齡和病情，最終由主治醫生來判斷。本發明所說的組合物以單位劑型給藥時，每個單位劑量形式中含有約25～600mg的必活性成分必特螺旋黴素，優選約為50～400mg，更優選約為100mg，將每日所需要的劑量以單一劑量或分劑量的形式給藥。
體內外藥效學試驗證明，本發明提供的組合物中其活性組分必特螺旋黴素具有較好的抗感染效果，不僅對革蘭氏陽性菌，尤其是耐紅黴素、耐β-內醯胺酶的金葡菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌有較好的抗菌活性，而且對部分陰性菌如卡他球菌、淋球菌、流感桿菌和部分軍團菌及厭氧菌也有效，尤其對肺炎支原體的活性顯著。
發明效果本發明在對高產菌株WSJ-195發酵液進行化學提取及純化過程中，採用HPLC定量分析手段檢測必特螺旋黴素的含量，確定了必特螺旋黴素中4」-醯化螺旋黴素各組分比例可控的提取工藝路線，為製備必特螺旋黴素原料藥及其載體組合物奠定了科學可靠的基礎。
實施範例下面所列實施例可以幫助本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例1必特螺旋黴素的製備從發酵液中製備必特螺旋黴素的方法，是在發酵液中加入1％硫酸鋁等助濾劑，過濾。濾液用NaOH調節pH至8.5-9.0，用乙酸丁酯提取發酵液中的必特螺旋黴素，丁酯提取液用無鹽水洗滌後，再用1/4體積的1％磷酸鹽(NaH2PO4)洗滌(1-3次)，HPLC檢測提取液中必特螺旋黴素各組分的比例，以確定用1％磷酸鹽(NaH2PO4)洗滌次數。HPLC檢測總異戊醯螺旋黴素含量不低於50％時，再用無鹽水洗一次，然後將必特螺旋黴素轉入pH2.0的0.7％NaH2PO4酸水，除去酸水中的乙酸丁酯，再轉入pH到8.5～9.0的鹼水中進行沉澱，乾燥，獲得必特螺旋黴素成品。必特螺旋黴素的詳細提取流程圖1。
實施例2必特螺旋黴素的HPLC定量測定方法使用島津LC-10A高效液相色譜儀，島津SPD-6A檢測器；色譜柱瑞典Kromasil C18柱，5μm，0.46×15cm；流動相乙腈-0.2mol/L磷酸銨-水(53∶20∶27)(pH＝7.0)，每100ml流動相加7滴四丁基氫氧化銨；檢測波長231nm，流速1.0ml/min。
必特螺旋黴素對本系統在8mg/ml-0.2mg/ml濃度範圍內，濃度和響應值成線性關係。最低檢測限達到1×10-4mg/ml。採用外標法，用標準品中的9個4」-醯化螺旋黴素總面積積分，計算每微克必特螺旋黴素的響應值，並將檢品中9個4」-醯化螺旋黴素的總面積積分，與標準品比較，計算檢品中必特螺旋黴素的含量。必特螺旋黴素標準品的HPLC圖譜如(圖2)所示。
實施例3必特螺旋黴素成品組分的HPLC檢測按實施例1提供的必特螺旋黴素提取流程及實施例2提供的HPLC定量檢測方法，對必特螺旋黴素發酵8批次發酵液進行提取，所獲產品各組分的HPLC檢測情況如表1所示。
表1 8罐枇必特螺旋黴素成品組分的HPLC檢測情況
實施例4藥物製劑的製備本發明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法製備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然後將其製成所需的劑型。
本發明的藥物組合物優選含有重量比為0.1～99.5％的活性成分，最優選含有重量比為0.5～95％的活性成分。
A、必特螺旋黴素素片 (按10000片計算)處方必特螺旋黴素原粉 1000g÷含水效價(u/mg)低取代羥丙基纖維素(5％) 92.5g羧甲基澱粉鈉(3％) 55.5g硬脂酸鎂(1％) 18.5g澱粉 總重-其它原輔料重量總重 1850g具體工藝步驟稱取適量澱粉，用水稀釋至15％濃度，加熱至糊狀，製成粘合劑；主料必特螺旋黴素、輔料澱粉、低取代羥丙基纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂分別過100目篩，按處方量，稱取所需主料和輔料；必特螺旋黴素、澱粉、低取代羥丙基纖維素充分混合均勻後，用15％澱粉濃度的澱粉糊製成軟材，14目篩制粒，50-60℃乾燥，水份控制在3-5％，14目篩整粒，加羧甲基澱粉鈉，硬脂酸鎂混合，測定顆粒含量；根據顆粒含量，計算片重，壓片(Φ9mm淺凹衝頭)，檢測片重差異；經檢驗合格後進行包裝。
B.必特螺旋黴素膠囊劑(按10000粒計算)處方必特螺旋黴素原粉 1000g÷含水效價(u/mg)澱粉(藥用) 1080g-必特螺旋黴素原粉重量藥用3號膠囊 10000粒液體石臘 50ml具體工藝步驟將主料必特螺旋黴素、輔料藥用澱粉按工藝配方量分別稱取後，裝入混和器充分混和後1.5-2小時；取樣檢測含量所得數據應和理論數據基本一致(每粒膠囊所裝重量約為0.105g)，將經檢驗合格的藥用3號膠囊及混和好的待裝原料按全自動膠囊機操作要求，分別填入裝料器進行填充，將填充好的膠囊進行差異檢驗(±10％以內，＜0.3g)，崩解時限檢查30分鐘內，將檢驗後符合要求的膠囊，放入打光機內加入液體石臘進行15-20分鐘的打光，然後取出進行成品包裝和檢驗。
C.必特螺旋黴素糖衣片(按10000片計算)處方參照實施例A。
具體工藝步驟按照實施例A方法操作，將檢驗合格後的片心放入糖衣鍋中，將配好的糖漿(濃度為65-70％)慢慢加入鍋內，然後將溫度升至40℃左右，加入適量滑石粉，鼓風乾燥25-30分鐘反覆幾次粉衣層包平後，再進行糖衣層15-20分鐘進行糖衣層包衣，待糖衣層包平後進行所需色調的包衣層包衣，將色漿調好後放入糖漿中攪勻倒入鍋內，每次約15-20分鐘，分別幾次攪拌均勻。
D.必特螺旋黴素幹糖漿 (按10000袋計算)處方必特螺旋黴素原粉 1250g÷含水效價(u/mg)檸檬酸(0.5％)(枸櫞酸) 15g蔗糖 總重-其它原輔料總重約 500g色素(薑黃素) 約1g具體工藝步驟必特螺旋黴素原粉，檸檬酸、蔗糖分別用高速氣流粉碎機粉碎成顆粒85％通過300目，15％通過180目，然後將粉碎後的細粉按處方量稱取後充分混和1-1.5小時，測其含量，計算裝量(理論裝量為每袋500mg)，然後將混合物料裝入袋裝機中，裝好鋁鉑紙，按分裝機操作要求分裝，裝量差異在±5％以內，裝好後進行檢驗合格後外包裝。
E.必特螺旋黴素腸溶片(按10000片計算)處方參照實施例A。
具體工藝步驟片心製備按實施例A操作，將符合要求的片心放入糖衣鍋中，用60-70％濃度的糖漿和滑石粉進行底衣層包衣三層，然後進行隔離層包衣，加入10％玉米盶酒精溶液，滾轉法10-15分鐘吹乾，再用苯二甲酸二乙酯、丙酮、鄰苯二甲酸醋酸纖維、酒精溶液，即腸溶液滴加入鍋內，滾轉法10-15分鐘吹乾2-3次。檢驗合格後，按實施例C進行糖衣包衣。
F.必特螺旋黴素胃溶片(按10000片計算)處方參照實施例A。
具體工藝步驟片心製備按實施例A操作，將符合要求的片心放入高效包衣機中，然後將符合標準的包衣粉(包括脂溶性和水溶性)按要求配製成包衣液，再將包衣液放入膠體磨粉碎、過濾待用。將裝好片心的高效包衣鍋預熱，轉速控制在5-10轉/分，溫度控制在45-60℃，用氣霧噴頭(＞300目)將包衣孔液噴入鍋內，然後乾燥25-35分鐘，反覆進行8-12次，直至包勻，晾乾檢驗合格後包裝。
G.必特螺旋黴素顆粒劑(按10000袋計算)處方必特螺旋黴素原粉 1250g÷含水效價(u/mg)糖粉 20000g糊精 9000g5％PVP-K30 適量具體工藝步驟必特螺旋黴素原粉、糖粉、糊精過120目篩，按處方量稱取必特螺旋黴素、糖粉、糊精混合均勻，將混合均勻的上述物料用5％PVP-K30膠漿製成軟材，搖擺式顆粒機制粒70℃乾燥、整粒，送檢合格後分裝。
實施例5體外抗菌活性A、抗肺炎支原體作用支原體(Mp)的培養用含葡萄糖G-PPLO(Difco公司)的培養基G-PPLO 3g，酵母浸出液0.5g，三蒸鎦水70ml，0.4％酚紅液1.0ml，高壓滅菌(121℃，15min)。在此培養基中加入兔血清20ml，酵母提取液10ml，50％葡萄糖液2ml，青黴素鈉鹽溶液(200,000單位/ml)0.5ml，調pH7.8。肺炎支原體採用標準株Mp-1(Mp-FH，ATCC-15531)，地方株(Mp-2，3，4)。將冷凍乾燥或冰凍保存的Mp株，用G-PPLO液體培養基傳二代，測定支原體濃度(≥108CFU/ml)。稱取必特螺旋黴素於容量瓶，加入無水乙醇充分溶解，再加三蒸水製成100微克/ml原液。採用試管二倍稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)，將必特螺旋黴素原液製成系列濃度藥液，每管1.8ml，每管加0.2ml菌量為2×106CFU/ml的Mp菌液，37℃溫箱培養，每日觀察記錄Mp生長情況，直至三周。以能抑制Mp生長的最低藥液濃度作為必特螺旋黴素抗肺炎支原體的MIC。結果見表2。
表2.抗肺炎支原體的最低抑菌濃度
B、抗菌作用試驗菌由臨床分離致病菌、質控菌和標準菌株。培養基為MH(Difco公司)。各試驗菌於2mlMH液中37℃培養18h，用MH液稀釋成106CFU/ml作為試驗菌液。採用二倍稀釋法稀釋藥液，加入106CFU/ml試驗菌液0.1ml，於37℃培養20h，觀察生長情況，確定必特螺旋黴素對各試驗菌的MIC(表3)。
表3.必特螺旋黴素對各試驗菌的MIC
實施例6體內抗感染效果A、抗肺炎支原體效果用肺炎支原體標準菌株Mp-FH，ATCC-15531感染金黃地鼠，感染量為Mp600萬菌量，感染後經口服必特螺旋黴素，每天一次，連續給藥12天，於感染後第14天處死動物，肺組織Mp培養，結果表明，用藥後肺組織Mp培養明顯呈陰性反應，並且必特螺旋黴素的抗肺炎支原體效應與劑量相關(表4)。
表4.必特螺旋黴素的抗肺炎支原體效應
-Mp培養陰性，±Mp培養可疑，+Mp培養陽性B、體內抗菌作用試驗菌於2mlMH培養液37℃培養18h，用5％胃膜素稀釋菌液，使小鼠感染100％致死菌數作為感染菌液。每隻小鼠注射0.5ml致死菌量，感染後分別在0.5-6h每隻小鼠不同劑量灌胃給藥0.2ml，每個劑量動物數為10隻，觀察動物死亡數，分別計算必特螺旋黴素對感染動物後的半數保護劑量(EDED)。結果見表5。
表5.必特螺旋黴素對小鼠感染的保護效應
圖1-必特螺旋黴素提取流程圖2-必特螺旋黴素標準品的HPLC圖譜其中①-異戊醯螺旋黴素III②-異戊醯螺旋黴素II③-異戊醯螺旋黴素I④-異丁醯螺旋黴素III⑤-異丁醯螺旋黴素II⑥-丙醯螺旋黴素III⑦-丙醯螺旋黴素II⑧-乙醯螺旋黴素III⑨-乙醯螺旋黴素II⑩-螺旋黴素III
權利要求
1.一種藥物組合物，其特徵在於所說組合物含有治療有效量的活性成分必特螺旋黴素和藥學上可接受的載體。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於治療有效量的必特螺旋黴素是以異戊醯螺旋黴素III、II、I三個組分為主的混合物，含有一定量的(異)丁醯螺旋黴素III、II，丁醯螺旋黴素III、II，丙醯螺旋黴素III、II和乙醯螺旋黴素III、II，其中，異戊醯螺旋黴素總含量(I+II+III)應不低於50％，4」-醯化螺旋黴素的總含量應不低於80％。
3.根據權利要求1或2所述的藥物組合物，其特徵在於該組合物以適合藥用的製劑形式存在，這些製劑形式是片劑、素片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、胃溶片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、顆粒劑、幹糖漿劑、注射劑、粉針劑、凍乾粉針劑和無菌粉針劑。
4.根據權利要求1～3中任一項的藥物組合物，其中必特螺旋黴素的用量優選為每單位劑型約25～600mg。
5.根據權利要求4所述的藥物組合物，其中必特螺旋黴素的用量更優選為每單位劑型約50～400mg。
6.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中必特螺旋黴素的用量最優選為每單位劑型100mg。
7.一種藥物組合物的製備方法，其特徵是將必特螺旋黴素的乙酸丁酯提取液用無鹽水洗滌後，需要利用HPLC檢測提取液中必特螺旋黴素各組分的比例，以確定用1％磷酸鹽(NaH2PO4)洗滌次數，當其中總異戊醯螺旋黴素含量不低於50％時，再用無鹽水洗一次，然後進行沉澱，乾燥，獲得必特螺旋黴素成品。
8.必特螺旋黴素藥物組合物在製備抗感染藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及必特螺旋黴素藥物組合物及其在抗感染性疾病中的應用，所說組合物中的活性成分異戊醯螺旋黴素(I+II+III)總含量不低於50％，4」－醯化螺旋黴素的總含量不低於80％，與藥學上可接受的一種或多種載體組成的組合物，經體內外藥效學試驗證明，不僅對多數G
文檔編號A61P31/00GK1554355SQ200310122420
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月23日 優先權日2003年12月23日
發明者王以光, 金文藻, 佟祖銘, 慈家元, 楊生武 申請人:瀋陽同聯集團有限公司, 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所, 北京首科集團公司