具有抗感染和抗腫瘤活性的潛在新細胞因子lyg1及其應用的製作方法

2023-05-08 06:44:21

專利名稱：具有抗感染和抗腫瘤活性的潛在新細胞因子lyg1及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的人類細胞因子及其應用，尤其涉及一種具有抗感染和抗腫瘤活性的潛在新細胞因子LYGl在抗炎症、抗感染性疾病、抗腫瘤和自身免疫疾病等方面的應用。
背景技術：
人體免疫系統歷經30億年的進化，形成複雜而精細的調控系統，在機體具有至關重要的作用。它對外能夠防禦病原微生物的入侵，對內則能清除衰老、病變和死亡的細胞，維持內環境的穩定。免疫系統通過固有免疫應答和適應性免疫應答完成上述功能。作為免疫細胞之間的交流語言，細胞因子對固有免疫應答和適應性免疫應答均具有重要的調控作用。 細胞因子是由機體各種細胞分泌的具有調控細胞生長分化、調節免疫功能和生理反應並參與病理反應的小分子蛋白質，通過與受體結合發揮作用。細胞因子主要包括白細胞介素(Interleukin, IL)、集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor, CSF)、幹擾素(Interferon, IFN)、腫瘤壞死因子(Tumor-Necrosis Factor, TNF)等，是免疫細胞之間的交流語言，對固有免疫應答和適應性免疫應答均具有重要調控作用。CD4+T細胞在適應性免疫應答中發揮關鍵作用，它能夠輔助B細胞產生抗體，輔助⑶8+T細胞殺傷靶細胞。根據分泌的細胞因子和功能的不同，⑶4+T細胞可以分為Thl，Th2，Thl7和Treg細胞，以及新發現的Th9和Th22細胞等。細胞因子在Th細胞的分化、活化和功能發揮中具有關鍵作用。首先，細胞因子能夠決定初始CD4+T細胞的分化方向，如IL-12、IL-4分別是決定Thl、Th2分化所必需的細胞因子。其次，細胞因子對已分化的Th細胞具有調控作用，IL-12與IL-18能夠以TCR非依賴的方式協同促進Thl細胞分泌IFN- Y。此夕卜，細胞因子還是Th細胞發揮作用的主要方式。Thl和Th2細胞是兩類非常重要的⑶4+T細胞亞群，兩者的平衡是免疫調節的重要方面。Thl細胞主要分泌IFN-Y、TNF-α等，通過細胞免疫應答在抗病毒、抗胞內病原體感染、抗腫瘤、遲髮型超敏反應中發揮重要功能，並參與類風溼性關節炎、糖尿病等自身免疫病的發生、發展；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等，參與抗寄生蟲感染和過敏反應，同時在異種移植物以及孕期胎兒的耐受方面起重要作用。深入研究Thl、Th2細胞的分化、生理和病理功能以及兩者之間平衡的調控機制具有重要的理論意義和潛在的應用價值。目前，利用基因工程技術生產的重組細胞因子、重組可溶性受體、中和性抗體在治療腫瘤、造血障礙、自身免疫性疾病等方面收到良好療效，成為新一代藥物。重組細胞因子作為藥物具有很多優越之處，如:細胞因子為人體自身成分，可調節機體的生理過程和提高免疫功能，很低劑量即可發揮作用，因而療效顯著，已成為某些疑難病症不可缺少的治療手段。目前已批准生產的細胞因子藥物包括IFN-α、^、Y，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2等。據不完全統計，目前國際上至少已有26個通過基因組藥物進入臨床研究，包括新的重組細胞因子、重組可溶性受體和中和性抗體等。同時，細胞因子或者細胞表面受體檢測也是判斷機體免疫功能和免疫細胞分化的指標，在許多疾病的診斷、病程觀察、療效判斷及細胞因子治療監測等方面具有重要價值。例如，IFN-γ及其重組蛋白已被用於治療過敏性疾病、治療諸如類風溼性關節炎和系統性硬皮病等自身免疫性疾病、治療細菌真菌感染疾病、治療病毒性感染疾病、抗寄生蟲感染、抗纖維化作用和治療腫瘤。

發明內容
因此，本發明的目的是提供一種潛在新細胞因子LYGl及其在抗炎症、抗感染性疾病、抗腫瘤和自身免疫疾病等方面的應用。針對上述目的，本發明的技術方案如下:一方面，本發明提供一種用於預防和/或治療免疫相關疾病的潛在新細胞因子LYGl (即成熟的和發揮功能的LYG1)，所述LYGl的序列為SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列。優選地，所述潛在新細胞因子LYGl為人類細胞因子LYGl或小鼠細胞因子LYGl。其中，所述LYGl的前體序列為N端未切除信號肽的胺基酸序列，所述信號肽的序列為SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列。另一方面，本發明提供一種抗上述LYGl的抗體。再一方面，本發明提供上述所述的潛在新細胞因子LYG1、或上述所述的抗體、或編碼上述所述的LYGl的核苷酸序列、或含有編碼上述所述的LYGl的核苷酸序列的載體、或由含有編碼上述所述的LYGl的核苷酸序列的載體導入或轉染到宿主有機體產生的重組蛋白在製備用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥物中的應用。優選地，所述治療免疫相關疾病的藥物為抗腫瘤藥物、抗炎症藥物、抗感染性疾病、治療過敏性疾病和/或治療自身免疫疾病的藥物。優選地，所述腫瘤為通過促進Thl細胞分化、促進細胞因子IFN-Y分泌和/或抑制補體調節蛋白⑶46、⑶55和⑶59表達來抑制和/或治療的腫瘤。更為優選地，所述腫瘤為黑色素瘤或對免疫治療敏感的腫瘤。優選地，所述炎症、感染性疾病、過敏性疾病和自身免疫疾病為通過促進Thl細胞分化、促進細胞因子IFN- Y分泌來抑制和/或治療的炎症、感染性疾病、過敏性疾病和自身免疫疾病。更為優選地，所述炎症為炎性腸病。又一方面，本發明提供上述所述的潛在新細胞因子LYG1、或上述所述的抗體、或編碼上述所述的LYGl的核苷酸序列、或含有編碼上述所述的LYGl的核苷酸序列的載體、或由含有編碼上述所述的LYGl的核苷酸序列的載體導入或轉染到宿主有機體產生的重組蛋白在製備用於促進Thl細胞分化、促進細胞因子IFN- Y分泌和/或抑制補體調節蛋白CD46、⑶55和⑶59表達的藥物中的應用。再一方面，本發明提供一種用於診斷免疫相關疾病的試劑盒，所述試劑盒包含上述所述的抗體和/或用於在PCR中 合成編碼上述所述的LYGl核苷酸序列的DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，所述抗體用於LYGl蛋白的定量檢測、相關疾病中的檢測和輔助診斷；所述引物用於LYGl基因表達的定量檢測。又一方面，本發明提供一種上述試劑盒在製備用於診斷免疫相關疾病的藥物中的應用。優選地，所述免疫相關疾病為腫瘤、炎症、感染性疾病、過敏性疾病和/或自身免疫疾病。更為優選地，所述免疫相關疾病為腫瘤或炎症。另一方面，本發明還一種用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包括上述所述的潛在新細胞因子LYG1、或上述所述的抗體、或編碼上述所述的LYGl的核苷酸序列、或含有編碼上述所述的LYGl的核苷酸序列的載體、或由含有編碼權利要求上述所述的LYGl的核苷酸序列的載體導入或轉染到宿主有機體產生的重組蛋白，以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。優選地，所述編碼權利要求1所述的LYGl的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述載體為pcDNA3.l/myC-His(-)B，所述宿主有機體為大腸桿菌、HEK293T或293-6E細胞，更為優選地，所述大腸桿菌為DH5 α。本研究採用免疫基因組學策略，利用分泌驗證、表達譜分析和系統性功能研究發現人類新基因LYGl編碼一個經典的分泌蛋白。它在脂多糖(LPS)刺激的外周血單個核細胞(PBMC,Peripheral blood mononuclear cell)中、在LPS刺激的小鼠巨卩遼細胞中和炎性腸病病人的炎性腸組織中表達下調，在IL-1 β刺激的Α549細胞中表達上調，在PMA和LPS聯合刺激的THPl細胞中表達顯著上調，在單核細胞分化為樹突狀細胞後表達明顯上調。重組LYGl蛋白能夠下調前列腺癌細胞系DU145表面補體調節蛋白CD55和CD59在mRNA水平的表達，下調⑶46和⑶59在蛋白水平的表達。此外，重組LYGl蛋白還能夠促進小鼠Thl細胞的體外和體內分化，在小鼠DTH模型 中起保護性作用，促進IFN- Y的分泌，並能夠抑制小鼠黑色素瘤B16細胞腫瘤模型中腫瘤的生長。而Thl細胞主要分泌IFN- Y，通過細胞免疫應答在抗病毒、抗胞內病原體感染、抗腫瘤、遲髮型超敏反應中發揮重要功能，並參與類風溼性關節炎、糖尿病等自身免疫病的發生、發展。抑制補體調節蛋白的表達可以使補體系統發揮抗腫瘤作用。以上結果都提示，LYGl是一個潛在的新細胞因子，在炎症、感染性疾病、腫瘤、過敏性疾病、自身免疫病方面可能發揮重要作用，具有潛在的臨床應用價值。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:圖1為BFA抑制試驗，檢測LYGl的分泌途徑的結果，圖中pcDB為轉染了空載體pcDNA3.1/myc-His㈠B(以下縮寫為pcDB)的陰性對照組，LYGl為轉染了 pcDNA3.1/LYG1-my c-Hi s (-)B (以下縮寫為pcDB-LYGl-myc_his)的實驗組，其中抗肌動蛋白(抗-actin)為內參；圖2為純化LYGl蛋白並進行SDS-PAGE鑑定及N端測序的結果，圖A為SDS-PAGE檢測LYGl蛋白純度的試驗結果，圖中I為蛋白標記，2為還原的LYGl蛋白，3為非還原的LYGl蛋白；圖28為N端測序分析的試驗結果，圖2B-1為空白對照測序的結果；圖28_2為標準品的測序結果；圖2B-3 12分別為第一個胺基酸殘基至第10個胺基酸殘基測序結果；圖3為LYGl多克隆抗體的鑑定結果,用蛋白質印跡(Western blot)的方法檢測LYGl多克隆抗體對超表達pcDB及LYGl的293T培養上清中蛋白的識別能力，圖中，抗LYGl (ant1-LYGI)為LYGl蛋白免疫後的兔源血清(含LYGl多克隆抗體)，正常血清(normalserum)為免疫之前的兔源血清、抗myc (anti_myc)為陽性對照抗體、抗兔IgG (ant1-rabbitIgG)為直接孵育二抗檢測細胞裂解液，作為空白對照，pcDB為轉染了空載體pcDB的陰性對照組，LYGl為轉染了 pcDB-LYGl-myc-his的實驗組；圖4為LYGl (小鼠為Lygl)的表達譜分析試驗結果，圖4A表示LYGl在人正常各組織中廣譜表達，圖中I為腦，2為心臟，3為腎臟，4為肝臟，5為肺，6為胰腺，7為胎盤，8為骨骼肌，9為結腸，10為卵巢，11為前列腺，12為小腸，13為睪丸；圖4B表示LYGl在免疫系統中表達較高，圖中I為白細胞，2為骨髓，3為淋巴結，4為脾臟，5為胸腺，6為扁桃體，7為胎肝；圖4C表示Lygl在小鼠正常組織中胸腺，胃和大腦中較高水平表達，圖中I為胸腺，2為淋巴結,3為小腸,4為結腸,5為腦,6為腎臟,7為肺,8為脾臟,9為肝臟，10為心臟；圖4D表示LYGl在單核細胞分化為樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)的過程中表達上調，圖中I為PBMC，2為單核細胞，3為未成熟樹突狀細胞(imDC)，4為酵母多糖(Zymosan)刺激成熟的DC細胞(mDC-zymosan) 5為LPS刺激成熟的DC細胞(mDC-LPS)；圖4E表示Lygl在小鼠靜息及活化的Thl，Thl7和Treg細胞中的表達；圖4F表示實時定量PCR檢測LYGl在炎性腸病病人腸組織中表達下調，圖4G表示實時定量PCR檢測TNF- α表達水平，作為陽性對
昭.>、、、 圖5為LYGl (小鼠為Lygl)在構建的以下4種炎性因子刺激下炎症模型中的表達變化的試驗結果，圖A為LPS(10ng/mL)刺激的PBMC ；B為IL-1 β刺激的Α549細胞；C為PMA和LPS刺激的THPl細胞；D為LPS刺激的小鼠巨噬細胞，從以上細胞中提取mRNA，並製備cDNA文庫，以cDNA文庫為模板，檢測LYGl (小鼠為Lygl)的mRNA水平的表達情況。其中IL-6、IL-8、IL-1 β分別為對應的陽性對照；圖6為在前列腺癌細胞系DU145中加入重組人LYGl真核蛋白後用RT-PCR和流式檢測細胞膜表面CD46、CD55及CD59的mRNA水平和蛋白水平的表達變化情況，圖6A表示LYGl下調CD46及CD59的mRNA表達水平，其中IL-1 β為陽性對照，圖6Β表示LYGl下調⑶46及⑶59的蛋白表達水平，其中⑶59表達變化情況選用IFN- Y作為陽性對照；圖7為重組人LYGl真核蛋白在小鼠Thl細胞體外分化中的作用，圖7Α為用流式的方法檢測加入不同濃度重組人LYGl真核蛋白後Thl細胞(IFN-γ陽性比例來反應)百分比結果；圖7Β所示為用ELISA方法檢測加入不同濃度重組人LYGl真核蛋白後Thl細胞IFN-γ的分泌情況。其中IL-18為陽性對照；圖8為重組人LYGl真核蛋白在小鼠DTH模型中的作用，其中，圖8Α所示為mBSA激發後24小時小鼠足墊腫脹情況，圖8B為用ELISA的方法檢測小鼠血清中IFN-Y的水平，圖8C和圖8D為體外加入mBSA的小鼠LN細胞培養上清中IFN- Y和IL-17A的分泌情況(圖8B、8C、8D中橫坐標代表小鼠編號，例如PBS-1代表PBS組的第一隻小鼠)，圖8E為用流式的方法檢測體外加入mBSA的小鼠脾細胞培養72後的細胞比例情況，分別給出了 PBS和LYGl組代表性的兩隻的結果，圖中分析了 Thl (IFN- Y陽性比例)和Thl7細胞(IL-17A陽性比例)所佔⑶4+細胞的比例；圖9為重組人LYGl真核蛋白在小鼠黑色素瘤模型中的作用，用遊標卡尺量取腫瘤長徑(a)和短徑(b)，圖9A 為腫瘤大體觀；圖9B為腫瘤生長曲線(接種腫瘤後每組每天腫瘤體積平均值變化曲線)；圖9C為腫瘤重量(每組腫瘤重量的平均值)。
具體實施例方式在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。除非有另外註明，為了便於區別，在本說明書中(而非權利要求書中)用全部字母都大寫的LYGl表示人類LYGl，僅首字母大寫的Lygl表示小鼠Lygl，LYGl蛋白均為重組人LYGl真核蛋白。下面結合具體的製備實施例和應用實施例，並參照數據進一步詳細地描述本發明。這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。以下實施例中的人肺腺癌細胞系A549細胞、人單核細胞型淋巴瘤細胞系THPl細胞、人前列腺癌細胞系DU145均購自ATCC ;小鼠均為C57BL/6J小鼠(購於北京大學醫學部實驗動物科學部)。實施例1LYGl某閔的cDNA的克降通過生物信息學分析，發現UniGene:Hs.164589，其對應基因為LYGl (序列為SEQID NO:3:
權利要求
1.一種用於預防和/或治療免疫相關疾病的潛在新細胞因子LYG1，所述LYGl的序列為SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列，優選地，所述潛在新細胞因子LYGl為人類細胞因子LYGl或小鼠細胞因子LYGl。
2.一種抗權利要求1中的LYGl的抗體。
3.根據權利要求1所述的潛在新細胞因子LYG1、或權利要求2所述的抗體、或編碼權利要求I所述的LYGl的核苷酸序列、或含有編碼權利要求1所述的LYGl的核苷酸序列的載體、或由含有編碼權利要求1所述的LYGl的核苷酸序列的載體導入或轉染到宿主有機體產生的重組蛋白在製備用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述治療免疫相關疾病的藥物為抗腫瘤藥物、抗炎症藥物、抗感染性疾病、治療過敏性疾病和/或治療自身免疫疾病的藥物。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述腫瘤為通過促進Thl細胞分化、促進細胞因子IFN- Y分泌和/或抑制補體調節蛋白CD46、CD55和CD59表達來抑制和/或治療的腫瘤，更為優選地，所述腫瘤為黑色素瘤或對免疫治療敏感的腫瘤； 或所述炎症、感染性疾病、過敏性疾病和自身免疫疾病為通過促進Thl細胞分化、促進細胞因子IFN- Y分泌來抑制和·/或治療的炎症、感染性疾病、過敏性疾病和自身免疫疾病，更為優選地，所述炎症為炎性腸病。
6.根據權利要求1所述的潛在新細胞因子LYG1、或權利要求2所述的抗體、或編碼權利要求I所述的LYGl的核苷酸序列、或含有編碼權利要求1所述的LYGl的核苷酸序列的載體、或由含有編碼權利要求1所述的LYGl的核苷酸序列的載體導入或轉染到宿主有機體產生的重組蛋白在製備用於促進Thl細胞分化、促進細胞因子IFN- Y分泌和/或抑制補體調節蛋白⑶46、⑶55和⑶59表達的藥物中的應用。
7.一種用於診斷免疫相關疾病的試劑盒，所述試劑盒包含權利要求2所述的抗體和/或用於在PCR中合成編碼權利要求1所述的LYGl核苷酸序列的DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，所述抗體用於LYGl蛋白的定量檢測、相關疾病中的檢測和輔助診斷；所述引物用於LYGl基因表達的定量檢測。
8.根據權利要求7所述的試劑盒在製備用於診斷免疫相關疾病的藥物中的應用，優選地，所述免疫相關疾病為腫瘤、炎症、感染性疾病、過敏性疾病和/或自身免疫疾病，更為優選地，所述免疫相關疾病為炎症。
9.一種用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包括權利要求I所述的潛在新細胞因子LYGl、或權利要求2所述的抗體、或編碼權利要求1所述的LYGl的核苷酸序列、或含有編碼權利要求1所述的LYGl的核苷酸序列的載體、或由含有編碼權利要求I所述的LYGl的核苷酸序列的載體導入或轉染到宿主有機體產生的重組蛋白，以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。
10.根據權利要求3至6或9中任一項所述的應用，其特徵在於，所述編碼權利要求1所述的LYGl的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述載體為pcDNA3.1/myC-His(-)B，所述宿主有機體為大腸桿菌、HEK293T、或293-6E細胞，優選地，所述大腸桿菌為DH5 α。
全文摘要
本發明提供一種具有抗感染和抗腫瘤活性的潛在新細胞因子LYG1及其應用，所述LYG1(即成熟的和發揮功能的潛在新細胞因子LYG1)的序列為SEQ ID NO1所示的胺基酸序列，所述應用為LYG1在製備用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥物及試劑盒中的應用，所述治療免疫相關疾病的藥物為抗腫瘤藥物、抗炎症藥物、抗感染性疾病、治療過敏性疾病和/或治療自身免疫疾病的藥物，說明潛在新細胞因子LYG1在腫瘤、感染性疾病、炎症、過敏性疾病和自身免疫病方面可能發揮重要作用，具有潛在的臨床價值。
文檔編號A61P37/08GK103073632SQ201110329289
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者韓文玲, 馬大龍, 張巖飛, 付偉偉, 王平章, 劉繪繪, 潘文, 李婷, 王文彥, 石太平 申請人:北京大學