抗人pd-l1單克隆抗體製備及應用的製作方法

2023-05-08 03:54:46

專利名稱：：抗人pd-l1單克隆抗體製備及應用的製作方法抗人PD-L1單克隆抗體製備及應用發明的領域本發明涉及抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO，其製備方法以及這些單克隆抗體在抑制腫瘤相關的PD-L1誘導的特異性CTL的凋亡，以及在生產用於檢測胃癌組織中的PD-L1分子水平以進行胃癌預後的判斷的試劑盒中的應用。發明的背景已知有許多受體-配體相互作用都參與誘導、建立和調節抗原特異性免疫反應。為了有效地激活T細胞反應，通常至少需要兩個信號。其中除T細胞抗原受體(TCR)識別抗原提呈細胞(APC)上的MHC-抗原複合物以提供第一信號即抗原特異性信號外，還必須獲得T細胞與APC表達的共刺激分子相互作用後產生的非抗原特異性、非MHC限制性的第二信號。第二信號即為共刺激信號或協同刺激信號。如果僅有抗原特異性信號而缺失共刺激信號，T細胞將表現為無反應或免疫耐受狀態，甚至導致凋亡。可見，共刺激信號是T細胞克隆擴增、分化和發揮生物效應所必不可少的。因此可以認為，第一信號決定了T細胞活化的特異性，而第二信號則決定T細胞介導的免疫應答能否有效進行(NoelleRJ，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:6550，1992;AllenRCetal.，Science.259:990,1993)。近年來，分子生物學技術廣泛應用於免疫學研究，共刺激分子被不斷發現。根據其結構，這些共刺激分子可分為兩類一類是腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體(TNF/TNFR)超家族，包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-lBB/4-lBBL、OX40/PD-L1、RANK/RANKL和Fas/FasL等。另一類是免疫球蛋白超家族，如B7-CD28/CTLA4、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-GL50、CD2/LFA-3等(KorthauerUetal.，Nature,361:539，1993)。這些共刺激分子以受體和配體相互作用的方式傳導信號。受體和配體一般表達在不同的細胞表面，通常一個為持續性表達，一個是誘導性表達。在免疫應答的不同階段，這些分子以各自獨特而又相關聯的方式參與信號傳導，共同調控機體的免疫應答。人PD-L1是1999年克隆的分子量約30-35KD、由290個胺基酸組成的I型跨膜糖蛋白，為腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員之一。人PD-L1分子主要表達在靜止和活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(DCs)上，以及心、胎盤、血管上皮、肝臟、肺、腎和骨骼肌等非淋巴組織細胞表面。另外，PD-L1在肺癌、肝癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌及卵巢癌等癌組織細胞上均有表達，許多癌組織被誘導後還可使PD-L1的表達上調。但在許多情況下，正常組織須經誘導後才表達PD-L1。在T細胞的增殖活化過程中，當TCR和CD3處於最佳活化狀態時，藉助PD-1-PD-L1途徑(作為輔助信號)啟動PD-1胞漿區ITIM酪氨酸殘基的磷酸化，促使SHP-2磷酸酶與SHP-2的結合，導致SHP-2的活化，從而抑制T細胞(特別是一些先前活化的T細胞)的增殖，並在一定條件下拮抗CD28-B7-2途徑的作用。研究還進一步表明，PD-1-PD-L1途徑對CD8+T細胞的抑制作用比對CD4+T細胞的更加明顯，且此效應是IL-2劑量依賴性的。PD-1-PD-L1途徑在抑制抗原特異性T細胞活化增殖的同時，也影響很多Thl和Th2型細胞因子的分泌，例如該途徑可下調IL-2和IFN-y分泌。近年來的研究表明，PD-1-PD-L1信號通路可在介導抗腫瘤免疫應答和自身免疫性疾病的過程中發揮重要作用。許多攜帶自身抗體識別之抗原的非淋巴組織均可高表達PD-L(尤其時PD-L1)，同時PD-L又能誘導效應細胞(主要是T、B細胞)表面PD-1的表達上調，從而在多種自身免疫性疾病的炎症部位發揮PD-1/PD-L途徑的負性調控作用。將小鼠PD-1基因敲除後，導致心臟、腎臟等非淋巴組織與T、B細胞間的PD-1/PD-L途徑的缺失，使自身反應性CD8+T細胞更容易被活化並遷移到心和腎等靶組織，從而造成自身抗體產生和局部組織損傷。因此，PD-1/PD-L途徑作為一種負性調控方式，在外周耐受和自身免疫病的誘導中發揮重要作用。PD-L1在許多內皮來源的癌和腫瘤細胞上高表達，而PD-1/PD-L1途徑對CD8+T細胞的活化增殖又具有明顯的抑制作用，因此提示許多癌和腫瘤組織可能通過此途徑逃避CD8+T細胞(CTL)的殺傷作用，減弱機體抗腫瘤免疫應答。最近的動物體內試驗發現，腫瘤相關的PD-L1的表達為腫瘤免疫識別和免疫清除提供了內在的途徑，阻斷該通路可有效地提高CTL殺傷腫瘤細胞的效率。因此，抗PD-L1單克隆抗體將有可能成為臨床幹預自身免疫性疾病、移植排斥反應和腫瘤的理想診斷和治療劑。儘管有關PD-L1受體-配體結合對的T細胞剌激功能、PD-L1抗體的製備及它們的其他免疫學功能都是部分已知的，但如本發明的新的抗人PD-L1單克隆抗體及其相對比較簡單的製備方法卻未見報導。而且，本發明的抗人PD-L1單克隆抗體具有某些不同的生物學功能。發明目的本發明的一個目的是提供抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO。根據本發明的優選實施方案，所說的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10時分別由保藏編號為CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636的雜交瘤細胞系分泌的。本發明的另一個目的是提供製備如上限定的抗人PD-L1單克隆抗體的方法，該方法包括(1)用預製備的高表達人PD-L1分子的轉基因細胞株L929/PD-L1或者人乳腺癌細胞株MDA-MB-231作為免疫原免疫動物；(2)分離被免疫動物的脾淋巴細胞並在適於產生雜交瘤細胞的條件下與骨髓瘤細胞融合；(3)篩選並培養如上得到的雜交瘤細胞；(4)從細胞培養液或接種雜交瘤細胞的動物的腹水液中分離並純化所需的單克隆抗體。根據本發明的優選實施方案，其中產生抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10的雜交瘤細胞株的保藏編號分別是CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636。本發明的再一個目的是提供保藏編號分別為CGMCCNo.1636和CGMCCNo.1637的雜交瘤細胞系。本發明的再一個目的是提供如上限定的抗人PD-Ll單克隆抗體2H11和10E10在體外誘導細胞毒性T淋巴細胞活化增殖中的應用。本發明的再一個目的是提供如上限定的抗人PD-Ll單克隆抗體2H11和10E10在增強特異性CTL殺傷腫瘤細胞的效率中的應用。本發明的再一個目的是提供如上限定的抗人PD-Ll單克隆抗體2H11和IOEIO作為生物學檢測指標，在胃癌預後判斷和個體化治療中的應用。附圖簡要說明圖1顯示L929/PD-L1轉基因細胞的構建示意圖。圖2顯示以流式細胞術分析抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10對轉基因細胞上PD-Ll分子的識別。其中透明峰為陰性對照，一抗為小鼠IgG，二抗為螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。黑色峰顯示轉基因細胞與抗人PD-Ll單抗反應的結果，其中第一抗體分別是商品化抗人PD-Ll單抗MIHI(陽性對照)及本發明的抗人PD-Ll單抗2H11和IOEIO，第二抗體是螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。圖3顯示2H11和10E10雜交瘤細胞株染色體的核型分析(xlOOO倍)。圖4顯示以流式細胞術分析10E10對活化的T、B細胞和成熟的DC上的PD-Ll分子的識別。A:顯示本發明的單克隆抗體對活化T細胞上PD-Ll分子的識別。透明峰為陰性對照細胞首先與小鼠IgG反應，然後加入二抗螢光素FITC標記的羊抗鼠IgG，最後加入螢光素PE標記的鼠抗人CD25直標單抗；黑色峰為B細胞分別與2株抗人PD-Ll單抗2H11和10E10反應後再加螢光素FITC標記的羊抗鼠IgG作用。B:顯示本發明的單克隆抗體對LPS活化的B細胞的識別。其中透明峰為陰性對照細胞首先與小鼠IgG反應，然後加入二抗螢光素FITC標記的羊抗鼠IgG，最後加入螢光素PE標記的鼠抗人CD69直標單抗；黑色峰為B細胞分別與2株抗人PD-Ll單抗2H11和10E10反應後再加螢光素FITC標記的羊抗鼠IgG作用。C:顯示本發明的單克隆抗體對成熟樹突狀細胞(DC)的識別。其中透明峰為陰性對照細胞首先與小鼠IgG反應，二抗為PE標記的抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin-PE);黑色峰為DC分別與生物素標記的本發明的兩株抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10反應後再加入Streptavidin-PE作用。圖5顯示以流式細胞術分析單克隆抗體2H11和10E10識別的抗原位點。上圖顯示2H11識別和10E10以及商品化抗體MIH1均不相同的位點。下圖顯示10E10識別和2H11不相同的位點，但是和MIH1幾乎完全相同的位點。圖6顯示Westernblot免疫印跡分析。第1道為小分量蛋白Marker,第2、5、8道為L929/PD-L1膜蛋白抽提物；第3、6、9道為L929/mock膜蛋白抽提物；第4、7、10道為MDA-MB-231膜蛋白抽提物。小鼠IgG作為陰性對照。抗體10E10和2H11均能識別L929/PD-L1和MDA-MB-231膜表面分子量為32KD的蛋白分子。圖7顯示以MTT法分析單抗10E10體外誘導T細胞增殖。其中縱坐標為OD值，橫坐標為不同反應組。A:為單克隆抗體CD3單獨刺激組。B:為1.25Ug/ml抗體刺激組。C:為2.5Ug/ml抗體刺激組。D:為5ug/ml抗體剌激組。E:為10Pg/ml抗體刺激組。其中系列一為鼠IgG對照組，系列二為10E10作用組。圖8顯示以凋亡檢測方法分析10E10和2H11對CTL殺傷腫瘤細胞的促進作用。其中使用MDA-MB-231和MDA-MBB-435/PD-L1作為靶細胞。A圖顯示MDA-MB-231和MDA-MBB-435/PD-LI表達的PD-L1分子對特異性CTL的誘導凋亡作用；B圖和C圖分別顯示抗體10E10和2H11對上述凋亡現象的阻斷作用。鼠IgG作為陰性對照，抗體的作用濃度為0-10ug/ml。圖9顯示以免疫組織化學方法使用單抗2H11和10E10檢測胃癌組織中PD-L1分子的表達，PD-L1與胃癌患者病理變化及生存率的相關性。
發明內容本發明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結合蛋白質或多肽，更具體地說，本發明涉及抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO，其製備方法以及這些單克隆抗體在體外誘導T細胞活化增殖中、增強特異性CTL殺傷高表達PD-L1分子的腫瘤細胞中，及其一種重要的生物學指標在胃癌預後判斷和個體化治療中的應用。本發明進一步涉及使用抗PD-L1單克隆抗體生產用於提高人或哺乳動物的免疫反應水平的藥物組合物。本說明書中所說的"PD-1"是指抗原活化的T細胞表面上表達的蛋白質；PD-1配體是指某些哺乳動物細胞上表達的可與PD-1受體特異結合的蛋白質。術語"抗PD-L1抗體"可以是PD-Ll特異性單克隆或多克隆抗體或它們的免疫學活性部分。本發明中，優選的是單克隆抗體，特別是小鼠抗人PD-Ll抗體。可以按照本領域已知的常規方法製備本發明的抗人PD-Ll單克隆抗體2H11和10E10(參見KohlerandMilrtein，Nature256:495-96,1975;HarlowandLane，Aatibodies,ALaboratory,ColdSpringHarborLaboritory，1988)。根據本發明的優選實施方案，最好使用被攜帶人PD-Ll基因的表達載體轉化的，並可在適當的培養條件下高效表達人PD-Ll多肽的重組體細胞作為製備本發明單克隆抗體的免疫原。因此，為了製備本發明的抗人PD-Ll單克隆抗體，首先構建高表達人PD-Ll的轉基因細胞(L929/PD-L1)。高表達人PD-Ll分子的轉基因細胞L929/PD-L1具有較強的免疫原性，並且所表達的抗原分子的空間構型能以自然狀態暴露於細胞膜表面，從而可更有效地激發機體的免疫反應。另外，由於L929細胞是鼠源性的成纖維細胞，其表面的其他分子具有相對較弱的抗原性，因此用該細胞作為免疫原將會減少非特異性抗體的產生，使單克隆抗體的篩選更為方便並大大提高陽性檢出率。為了製備L929/PD-L1細胞，可以按照本領域技術人員熟知的DNA操作技術(例如參見Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbour,1989)進行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表達載體的構建及擴增、核苷酸序列的分析與鑑定、細胞的轉化和培養。例如，首先，使用RT-PCR技術從活化的T細胞中擴增出人PD-Ll基因。將PD-Ll基因裝入逆轉錄載體pEGZ-Term，得到重組逆轉錄病毒載體pEGZ-Terai/PD-Ll。然後，使用重組逆轉錄病毒載體pEGZ-Term/PD-Ll與輔助病毒pHIT456和pHIT60—起共轉染293T細胞。48小時後，收集含病毒顆粒的293T細胞培養物上清並以其感染L929細胞(ATCCCat.No.CCL-1)，連續感染3天。最後，用含Zeocin的選擇培養基篩選，待抗性單克隆生長至足夠大，挑取單克隆集落進行擴大培養。按上述方法獲得的轉基因細胞的PD-L1表達率高達97%以上。可以按照本領域已知的常規方法(KohlerandMilstein，Nature265:495-497,1975)製備本發明的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO。簡單地說，用轉基因細胞L929/PD-L1或者乳腺癌細胞株MDA-MB-231免疫BALB/C小鼠。當被免疫動物的血清抗體水平達到峰值時，分離動物的脾細胞並製備單細胞懸液。必要時，可使用免疫吸附方法篩選脾細胞。例如，可以將脾細胞懸液加到PD-L1抗原蛋白質包被的平板或小孔內，表達PD-L1多肽特異性免疫球蛋白的B細胞即結合到平板上，而不能被其餘的懸液洗掉。然後可以收集所得到的B細胞或所有解離的脾細胞，並在適當的融合劑例如聚乙二醇的誘導下與骨髓瘤融合以形成雜交瘤，並在選擇性培養基例如HAT培養基中培養以篩選融合的雜交瘤細胞。然後，用流式細胞術、Western印跡法、免疫沉澱法等方法鑑定所需的陽性抗性細胞株。於體外(例如在組織培養瓶或多孔纖維反應器中)或體內(小鼠腹水中)培養所選擇的分泌抗人PD-L1抗體的雜交瘤，並從細胞培養液或小鼠腹水液中收集和純化所需的抗體。流式細胞儀分析結果顯示，本發明提供的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10均能不同程度地識別活化T、B細胞和成熟DC表面上表達的PD-L1分子。競爭抑制試驗結果進一步顯示，本發明的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10可識別不完全相同的抗原位點。因此，有可能利用2H11和10E10製備用於檢測可溶性人PD-L1的試劑盒。為了鑑定本發明的抗人PD-L1單克隆抗體的生物學功能，本發明首先進行體外活化T細胞試驗。實驗結果表明，本發明的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10均能阻PD-1/PD-L1結合，以劑量依賴方式誘導T淋巴細胞的增殖，並且能夠與抗人CD3激髮型單克隆抗體發揮協同作用。眾所周知，腫瘤發生是因細胞逃避免疫監視而發生惡性增殖的結果。免疫逃避機制是由於機體的腫瘤抗原特異性T細胞處於免疫耐受狀態。部分腫瘤細胞表面過表達的PD-L1分子與腫瘤特異性CTL上的受體相互作用從而誘導CTL發生凋亡，使得腫瘤細胞逃避了殺傷。在我們的試驗中，使用單抗2H11和10E10可以有效地阻斷此效應，大大提高CTL的殺傷作用，且具有劑量依賴性。因此，有可能利用本發明的激髮型抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10改變CTL在腫瘤細胞附近的狀態，並激發機體特異性抗腫瘤免疫反應，以清除和控制腫瘤。雖然造血系統和非造血系統腫瘤細胞均表達PD-L1(Dong.H.，Zhu.G.etal.NatureMed.1999)，但腫瘤細胞的表達強度明顯高於正常細胞(YoshikoIwai，MasayoshiIshidaetal.PNAS2002)。我們應用本發明的單克隆抗體2H11和10E10檢測了100例的胃癌患者的組織標本，結果顯示，PD-L1的表達與患者年齡、性別、腫瘤部位、組織類型無關，而與腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、胃癌患者預後密切相關。我們的實驗數據顯示，生存期5年的胃癌患者(25.5%)。將腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移、PD-L1的表達等納入相關因素變量分析，提示PD-L1的表達是影響胃癌生存期的獨立因素。因此，利用本發明可有效地檢測胃癌組織中的PD-L1分子的表達，用以作為胃癌預後的判斷和作為個體化治療選擇的生物學指標。同時，推測PD-L1抗體有可能作為一種胃癌治療劑被用於臨床。以下藉助非限制性實施例舉例詳細描述本發明。本領域技術人員可以在不背離本發明的基本精神和原則前提下，改變或改動本說明書中描述的某些技術內容或技術環節。但人們可以理解到，這些平行的改變或改動均將包括在本發明的待批權利要求範圍之內。實施例1:抗人PD-L1單克隆抗體的製備本實施例描述抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10的製備方法。(1)轉基因細胞L929/PD-L1和L929/mock的建立(a)人PD-L1基因的克隆使用TRIZOL試劑(Gibco,BRL)抽提活化T細胞的總RNA。按照逆轉錄試劑盒(MBI，美國)使用說明書推薦的方法，將mRNA逆轉錄成cDNA。取5plcDNA為模板，使用正鏈引物進行PCR擴增(94。C變性30秒，55。C退火30秒，72'C延伸1分鐘，30個循環後72。C延伸5分鐘)。純化後，在T4DNA連接酶作用下使PCR產物與pMD18-T載體連接過夜。用所得連接產物轉化感受態細菌ToplO,並對篩選的陽性克隆進行PCR和酶切鑑定以及DNA測序。結果顯示，所獲得的cDNA序列與GenBank中註冊的人PD-L1cDNA序列完全一致。(b)重組逆轉錄病毒載體的構建分別用核酸內切酶Pstl和EcoRI消化測序正確的pMD18-T/PD-Ll質粒和逆轉錄病毒載體pEGZ-Term(37°C，4小時)。回收含目的基因的片段，並用連接產物轉化感受態細菌。用上述方法鑑定證實後，將所獲得的重組逆轉錄病毒載體定名為pEGZ-Term/PD-Ll。(c)穩定表達人PD-Ll的L929轉基因細胞的構建:按照圖1所示的流程，首先以試劑盒(Iiwitrogen，美國)操作手冊推薦的脂質體法，用重組逆轉錄病毒載體pEGZ-Term/PD-Ll和輔助病毒pHIT456與pHIT60(現代免疫學，2004，24(2):99-103)(體積比2:1:1)共轉染6孔板中60-70%匯合生長成片的293T細胞。48小時後收集含病毒顆粒的293T培養上清，以其感染L929細胞。加入polybrene至終濃度為8ng/ml，繼續37。C感染6小時。再加入含10%胎牛血清(FCS)的1640培養基(2ml/孔，隔天換液)。重複感染3次後收集細胞，將l:6稀釋的細胞培養物置於含Zeocin(Invitrogen，500pg/ml)的選擇培養基中篩選培養2周。待抗性細胞克隆生長至足夠大，挑取單克隆菌落進行擴大培養。同時製備用作陰性對照的轉基因細胞L929/mock。流式細胞儀檢測顯示，L929/PD-L1細胞膜上人PD-L1蛋白的表達率約為99%。(2)抗人PD-U單克隆抗體的製備使用如上得到的高表達PD-L1分子的轉基因細胞(L929/PD-L1)作為免疫原，三次免疫接種Balb/c小鼠(10々500nl/只)(間隔3周)。末次免疫後第四天，取小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞株進行細胞融合(共20塊96孔板)。以高表達PD-L1分子的L929/PD-L1為陽性對照及表達PD-L1分子的L929/mock為陰性對照，用間接免疫螢光法對雜交瘤培養物上清進行初步篩選、蛋白鑑定及Ig亞類鑑定(參見圖2)。陽性克隆經3次有限稀釋後，證明克隆的陽性率達到約95%。經復篩及亞克隆後獲得穩定地分泌特異性鼠抗人PD-L1的雜交瘤細胞株，並分別被命名為2H11。使用天然高表達PD-L1分子的乳腺癌細胞株MDA-MB-231作為免疫原，以同樣的方法獲得了另一株細胞株IOEIO。這些雜交瘤細胞經體外持續傳代(40代以上)後，仍能穩定地分泌特異性抗體。對雜交瘤細胞株2H11和10E10的染色體分析顯示，這三株雜交瘤細胞的染色體數目為80-110(參見圖3)。(3)抗人PD-U單克隆抗體的生產與特性鑑定(a)採用本室建立的腹水體內誘生方法生產單克隆抗體。取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔內注入Pristane(0.5ml/只)。一周後腹腔內接種雜交瘤細胞(1X10V只)，同時再次腹腔內注射Pristane與福氏不完全佐劑的等體積混合物(0.2ml/只)。5-IO天后收穫腹水，並離心取上清於-8CTC保存。(b)腹水型單抗的純化和定量。腹水液經去除纖維蛋白和鹽析處理後，以蛋白G親和柱層析法純化。收集蛋白峰流出液，對磷酸鹽緩衝液(PBS)透析後用751紫外分光光度計測定抗體蛋白濃度為0.8~10mg/ml。間接免疫螢光法分析，純化後單抗的效價為1:1000以上。(c)Ig亞類鑑定。採用試紙快速測定(Argen公司)法，鑑定Ig亞類，結果顯示2H11和10E10均為小鼠IgGl型。(d)抗體識別抗原位點的競爭性抑制試驗。在L929/PD-L1細胞(5xl05/管)懸液內分別加入單克隆抗體(每管2ng)，4'C孵育45分鐘。洗細胞後，依次加入生物素標記的單抗和Streptavidine-PE，並分別4。C孵育30分鐘。再次洗滌後用流式細胞儀分析，同時設陽性和陰性對照。如圖5所示，單抗2H11部分阻斷單抗10E10與L929/PD-L1細胞上PD-L1分子的結合。由此表明，2H11和10E10識別不同的PD-L1抗原位點。(f)本發明單克隆抗體的Western印跡鑑定。抽提L929/PD-L1細胞膜蛋白，用5%脫脂奶粉4'C封閉過夜。翌日加入純化的抗體室溫孵育1小時。用TBST溶液洗去未結合的抗體，加入AP標記的二抗，30分鐘。孵育後加入底物顯色。如圖6所示，L929/PD-L1細胞均能與PD-L1蛋白特異性結合，形成陽性條帶。表明這兩株單抗均具有識別PD-L1分子的良好特異性。實施例2:抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10體外誘導T細胞活化和增殖本實施例描述以SH-TdR摻入法檢測單克隆抗體2H11和10E10體外誘導T細胞活化和增殖作用。(1)T細胞製備取正常志願者外周血100ml(得自蘇州紅十字血站)，分離(Ficoll)得到單個核細胞。洗細胞後，用含10%小牛血清的RPMI1640培養基稀釋至3x106/1111。然後將細胞加入6孔培養板(2ml/孔)中培養2小時(5%C02，37。C)。輕輕吸出懸浮細胞，即得到PBMC。然後按照常規綿羊紅細胞結合法分離得到T細胞(純度>90%)。(2)體外誘導T細胞增殖用激髮型抗CD3單克隆抗體(0.5pg/ml)包被96孔板(4X:過夜)。次日，向小孔內加入純化的T細胞並分為5組(A)為單克隆抗體CD3(0.5pg/ml)單獨刺激組；(B)為L25yg/ml單克隆抗體2H11或IOEIO刺激組;(C)為2.5ug/ml單克隆抗體2H11或IOEIO刺激組。D:為5ug/ml單克隆抗體2H11或10E10刺激組。E:為10yg/ml單克隆抗體2H11或10E10刺激組。每組各設相應劑量的鼠IgG同型對照組。刺激3天後以SH-TdR摻入法檢測T細胞增殖情況。由圖7所示的數據可以看出，本發明的兩株單克隆抗體均能以劑量依賴方式明顯誘導T細胞活化和增殖。實施例3:抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10促進特異性CTL體外殺傷乳腺癌細胞本實施例描述分別以流式細胞術檢測單克隆抗體2mi和IOEIO對CTL體外殺傷腫瘤靶細胞(乳腺癌細胞)的增強作用。(1)特異性CTL的製備取正常志願者外周血200ml(得自蘇州紅十字血站)，分離得到單個核細胞。洗細胞後，用含1(m小牛血清(FCS)的RPMI1640培養基將細胞稀釋至3xl06/ml，並置於6孔培養板(2ml/孔)中培養2小時(5%C02，37。C)。然後輕輕吸出懸浮細胞，在培養板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)和10%FCS的RPMI1640培養基繼續培養，3天換液一次，第6天加入經絲裂黴素處理的MDA-MB-231細胞和MDA-MB-435細胞。兩天後，取出負載抗原的DC與分離自同一外周血的T細胞共培養，3天後收穫被激活的特異性CTL。(2)CTL殺傷腫瘤細胞取如上製備的CTL和經絲裂黴素處理的MDA-MB-231細胞及MDA-MB-435細胞，按50:1加入96孔板小孔中共培養。同時向小孔內加入濃度分別為1.25ug/ml、2.5yg/ml、5ug/ml、10ng/ml的單克隆抗體2H11和IOEIO。各組設相應濃度的小鼠IgG同型作為對照。培養3天後，經AnexinV和PI染色檢測凋亡細胞。如圖8所示，MDA-MB-231作用組，在加入不同濃度抗體後，均不同程度地降低了CTL的凋亡率，而MDA-MB-435組則無明顯變化。結果表明，抗體2H11和IOEIO可以加強CTL對腫瘤細胞的殺傷。實施例4:以抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO作為胃癌預後判斷療效觀察的生物學指標本實施例描述以單克隆抗體2H11和IOEIO水平作為生物學指標，用免疫組化方法進行胃癌預後判斷和療效監測。同時，描述使用本發明的單克隆抗體製備的用於胃癌預後判斷和療效監測的試劑盒。(1)標本來源102例標本取自1998-1999年間收住的胃癌手術患者。所有患者術前均未接受化療或放療。(2)免疫染色及評估使用己知的ElivisionTMplus免疫組化染色將待檢標本的石蠟切片脫蠟和水化後，用PBS(pH7.4)衝洗三次，每次3分鐘。取一定量pH6.0檸檬酸鹽緩衝液於燒杯中加熱脫蠟，冷卻至室溫後，依次用蒸餾水和PBS各衝洗兩次，每次3分鐘。每張切片加1滴或50^3%H202，室溫下孵育IO分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶。切片用PBS衝洗三次(每次3分鐘)後滴加第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4'C過夜。再用PBS衝洗三次後，每張切片加50nl聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20分鐘和PBS衝洗3次後，再滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(試劑B)，室溫下孵育30分鐘。用PBS衝洗並加100nl新鮮配製的DBA顯色液後，於顯微鏡下觀察3~10分鐘。陽性為顯棕黃顏色的顆粒。蒸餾水衝洗後，用蘇木素復染。切片子用乙醇脫水乾燥和二甲苯透明，然後用中性樹膠封片。結果判斷以腫瘤細胞質明顯著色為陽性。胃癌組織中PD-L1明顯著色的陽性細胞少於20%為表達陰性，大於20%為表達陽性。(3)用SPSS10.0統計軟體迸行數據分析統計學上，以X"檢驗法對PD-L1表達陽性及陰性組的組間比較。採用多變量Logisticregression法分析預後和諸因素的關係。結果如表1所示。表1:胃癌的預後情況與胃癌患者癌細胞PD-L1表達水平的關係tableseeoriginaldocumentpage15由表1所示的數據可以看出，胃癌組織的細胞膜和細胞漿均顯示有PD-L1分子的陽性表達，陽性率達42.2%。而且，數據分析顯示，生存期大於5年與生存期小於2年的胃癌患者癌組織細胞中PD-L1分子的表達有顯著差異:生存期小於2年的患者PD-L1分子在胃癌組織中的表達陽性率(58.8%)顯著高於生存期大於5年的胃癌患者(25.5%)。統計學分析提示PD-L1分子在胃癌細胞的表達與胃癌患者的預後密切相關。因此，可使用單抗10E10盒2H11製備免疫組織化學試劑盒，應用於臨床胃癌組織的檢測。雜交瘤樣品保藏鑑於陽性雜交瘤特別是以高產率產生本發明單克隆抗體的雜交瘤篩選的偶然機遇性，也是作為對本說明書文字描述部分的補充，本申請人已在中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)保藏了分別產生本發明的單克隆抗體2H11和10E1的兩個雜交瘤細胞株，它們的保藏編號分別為CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636。權利要求1、抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10，特徵在於所說的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10是分別由保藏編號為CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636的雜交瘤細胞株分泌的。2、根據權利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體，特徵在於這些抗體是抗可溶性人PD-L1的單克隆抗體。3、根據權利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體，其中產生抗人B7-H3單克隆抗體2H11和10E10的雜交瘤細胞株的保藏編號分別為CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636。4、根據權利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10在體外誘導T細胞活化增殖中的應用。5、根據權利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO在增強特異性CTL殺傷高表達PD-L1分子的腫瘤細胞中的應用。6、根據權利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體2Hl:l和10E10作為生物學檢測指標,在胃癌預後判斷和個體化治療中的應用。全文摘要本發明涉及抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10，其製備方法以及這些單克隆抗體在抑制腫瘤相關的PD-L1誘導的特異性CTL的凋亡，以及檢測胃癌組織中的PD-L1分子作為胃癌預後的判斷的生物學指標中的應用。文檔編號G01N33/577GK101104640SQ20061008830公開日2008年1月16日申請日期2006年7月10日優先權日2006年7月10日發明者靜孫,張學光,徐寬楓申請人:蘇州大學