提高植物ggt活性的方法以及提高ggt活性的植物及其製備方法

2023-05-08 02:03:41

專利名稱：：提高植物ggt活性的方法以及提高ggt活性的植物及其製備方法提高植物GGT活性的方法以及提高GGT活性的植物及其製備方法本申請為分案申請，原申請的申請日為2003年8月5曰，申請號為03824044.0(PCT/JP2003/009946),發明名稱為"提高植物GGT活性的方法以及提高GGT活性的植物及其製備方法"。
背景技術：
：本發明涉及一種穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶(GGT)活性提高的植物。本發明還涉及一種穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶(GGT)和/或編碼GGT的基因的利用方法。另外，本發明涉及提高植物和/或其種子中的胺基酸含量，尤其是提高選自絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、穀氨醯胺(Gin)、天冬醯胺(Asn)組成的組中的l種或l種以上的胺基酸含量的方法，以及胺基酸含量，尤其是選自絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、穀氨醯胺(Gin)、天冬醯胺(Asn)組成的組的l種或l種以上胺基酸的含量提高的植物，及該植物的製備方法。本發明進一步涉及將本發明的植物和/或種子用於製造食品或飼料，及含有這些植物和/或種子的食品或飼料。一般認為在消耗由RuBisco的加氧酶活性產生的乙醇酸的光合作用中，乙醇酸在過氧化物酶體中通過乙醇酸加氧酶轉化為乙醛酸，而乙醛酸通過至少2種乙醛酸氨基轉移酶進行代謝(Somerville:PNAS77:2684-2687，1980)。迄今為此，在過氧化物酶內起作用的乙醛酸氨基轉移酶基因還未被確定，但最近Liepman等報告了在擬南芥(Arabidopsisthaliana)的光合作用系統中起作用的定位於過氧化物酶體中的丙氨酸穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶(Plant丄25:487-498)，但仍不了解穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶的基因。而且，也未必弄得清此穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶活性對包含以植物的穀氨酸為主的各種胺基酸含量、總胺基酸含量的增減、光合作用能、逆境耐性在內的植物特性有什麼樣的作用，也沒有報導揭示通過對具有穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶活性的蛋白質或編碼它的基因進行操作，能改善植物的種種特性的可能性，尤其是實際提高植物體或種子中總胺基酸含量和/或特定胺基酸的含量的可能性。
發明內容本發明的目的在於提供一種提高穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶(GGT)活性的植物及該植物的製備方法，以及這類植物的種子。另外，本發明的目的還在於提供一種與在相同條件下栽培的同種野生植物相比，植物中的胺基酸含量，尤其是選自絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、穀氨醯胺(Gln)、天冬醯胺(Asn)組成的組中的l種或1種以上的胺基酸的含量提高的植物及該植物的製備方法、及該植物的種子。本發明的另一個目的在於提供一種GGT及其編碼基因的新型利用方法。更具體而言，本發明的目的在於提供一種利用GGT及其編碼基因提高植物中胺基酸含量的方法。本發明的目的在於提供一種含有植物和/或種子的祠料或食品，該植物和/或種子中的胺基酸含量，尤其是選自Ser、Arg、Gln、Asn組成的組的l種或l種以上的胺基酸的含量提高，以及此類植物和/或其種子在飼料或食品製造中的使用。本發明的進一步目的在於提供一種由上述胺基酸含量提高了的植物和/或種子中製備含有胺基酸，尤其是選自Ser、Arg、Gln、Asn組成的組的1種或1種以上的胺基酸的植物提取物的製備方法，以及上述胺基酸含量提高的植物和/或種子在製備胺基酸，尤其是選自Ser、Arg、Gln、Asn組成的組中的1種或l種以上的胺基酸中的用途。本發明的目的還在於提供本發明的植物和/或其種子在作為以胺基酸為出發原料生產其他物質的基礎或材料中的用途。本發明提供一種植物，其穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶(GGT)的活性與同種野生型植物相比較有所提高。本發明提供一種植物，其特徵為與同種野生型植物相比，具有GGT活性的基因的轉錄量增大。另外本發明提供一種以提高GGT活性為特徵的，提高植物中的胺基酸含量、尤其是提高植物中選自的絲氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺組成的組的1種或1種以上的胺基酸含量的方法。本發明還提供一種導入了基因構建體的轉化植物，其與在相同條件下栽培的同種天然植物或對應的非轉化植物相比GGT活性有所提高，所述的基因構建體是可以提高GGT基因表達的基因構建體，具體說來是可表達GGT基因的基因構建體和/或能提高具有內在GGT活性的基因的表達量的基因構建體。本發明還是一種提高植物的GGT活性的方法，其特徵為向植物中導入可以提高GGT基因表達的基因構建體，具體說來所述的基因構建體是表達GGT基因的基因構建體和/或可提高具有內在GGT活性基因的表達量的基因構建體。本發明還提供一種製備GGT活性提高的植物的方法，其特徵為通過使與同種野生型植物相比GGT活性提高的植物、或與對應的非轉化植物相比GGT活性提高的植物的種子發芽，或使上述植物或來自轉化植物細胞的植物體再生，或通過營養繁殖使上述植物或轉化植物進行繁殖。本發明中GGT活性特別是指在過氧化物酶體中的GGT活性。此處，本說明書中"非轉化植物"是指與導入使GGT基因表達提高的基因構建體的轉化植物相比，"未導入GGT基因表達提高了的基因構建體的植物"。此"未導入提高GGT基因的表達的基因構建體的植物，，中，除野生型植物以外，還包括導入使GGT基因表達提高的基因構建體以外的基因構建體的轉化植物。另外，"使GGT基因表達提高的基因構建體"包括能表達GGT基因的基因構建體，例如含有功能性連接到適當啟動子上的GGT基因的基因構建體以及可以提高GGT基因轉錄量的基因構建體，例如含有增強子的構建體。此處，本說明書中的"基因構建體"指以任意形態遺傳至子代的構建體，尤其指核酸分子，如果是含有基因的基因構建體，有時特別指"基因構建體"。因此，在"基因構建體，，中，除含有基因的核酸分子外，還包括含有轉錄活化元件、增強子等的核酸片段。更具體而言，本發明為一種植物，它含有與序列編號2或4中所述的胺基酸序列具有60%或60%以上同源性的胺基酸序列，並且與相同條件下栽培的同種野生型植物相比GGT活性提高。本發明尤其指一種植物，其中具有序列編號2或4所述的胺基酸序列的GGT活性，與相同條件下栽培的野生型植物相比GGT活性提高。另外，本發明為一種轉化植物，其中導入了含有可與序列編號1或3所述多聚核苷酸在嚴緊條件下雜交的核苷酸序列的基因構建體，與相同條件下栽培的對應的非轉化植物相比較，該轉化植物的GGT活性提高。另外，本發明特別為一種轉化植物，其中導入了含有序列編號1或3所述核苷酸序列的基因構建體，與相同條件下栽培的對應的非轉化植物相比較，該轉化植物的GGT活性提高。另外，本發明涉及提高植物和/或其種子中的胺基酸含量，尤其是選自Ser、Arg、Gln、Asn組成的組中的1種或1種以上的胺基酸含量提高的方法，所述方法包含通過導入能夠表達GGT的基因構建體，製備轉化植物的步驟，其中，與在相同條件下栽培的對應的非轉化植物相比，上述基因構建體可提高上述轉化植物中的GGT活性。本發明還涉及總胺基酸含量提高的植物，尤其是選自Ser、Arg、Gln、Asn組成的組中的l種或l種以上的胺基酸含量提高的植物和/或其種子。本發明中的植物的GGT活性，與在相同條件下栽培的對應的野生型植物或非轉化植物相比，在對應組織中的GGT活性水平優選提高約1.2倍或1.2倍以上，更優選提高約3倍或3倍以上，尤其優選提高約5倍或5倍以上。圖1為高等植物中光呼吸途徑的模式圖。用箭頭表示穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶的催化反應。圖2為來源於擬南芥穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶的胺基酸序列的比較。同一的胺基酸位點以星號表示。圖3示出來源於擬南芥穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶的基因結構以及插入pBI101中的位點。外顯子以黑長方塊表示。用PCR反應對基因組區域5089bp進行擴增，使用基因組上的BamHI與引物上的HindIII位點克隆至pBI101(-GUS/-NOS-ter)中。4吏用此載體由土壤桿菌導入至GGT1基因破壞林(ggtl-l)中。圖4示出對照林與GGT1導入林生長的比較結果。對於在通常培養條件下培養2周的野生型非轉化體(對照)和GGT1導入林，各測定95個植林的(ggtl-l/GGTl)地上部分的重量並進行了比較。圖5為對導入了表達GGT1的構建體的轉化植物與野生型非轉化植物在GGT1mRNA水平上進行對比的圖表。圖6為導入了表達GGT1的構建體的轉化植物與野生型非轉化植物的GGT1酶活性水平的對比圖表。圖7示出對在PNS培養基上70jamolnT2s"的光照條件下發育2周的幼芽的胺基酸含量進行測定的結果。A:主要胺基酸含量(nmol/mgFW)，B:幼芽中的總胺基酸含量(nmol/mgFW)。圖8示出對以PNS作為肥料，在石棉上70iamoln^s"的光照條件下，栽培42天的植物體蓮座葉中的胺基酸含量進行測定的結果。A:主要胺基酸含量(nmol/mgFW),B:幼芽中的總胺基酸含量(腿ol/mgFW)。圖9表示在GGT1mRNA水平上，對在野生型植林中導入表達GGT1的構建體的轉化植物和野生型非轉化植物進行比較的圖表。圖10為向野生型植林導入了表達GGT1的構建體的的轉化植物與野生型非轉化植物的GGT酶活性(A)及HPR活性(B)的對比圖表。以野生型非轉化植物的各種酶活性為1。圖11示出對在PNS培養基上，在70lLimolm-2s"的光照條件下，生長2周的幼芽的絲氨酸含量進行測定的結果。圖12示出分別對向野生型植林導入了表達GGT1的構建體的轉化植物與野生型非轉化植物的GGT的mRNA水平、GGT酶活性水平、Ser含量進行對比的結果。所示了各種值的相關係數和回歸方程式。A:示出對應於GGT1mRNA相對量的GGT相對酶活性的圖表；B:示出對應於GGT1mRNA相對量的Ser含量圖表；C:對應於GGT相對酶活性的Ser含量的圖表。圖13示出在1/2MS培養基上，在70inmoln^s-1的光照條件下，使其生長2周的幼芽的胺基酸含量測定的結果。A:主要胺基酸含量，B:總胺基酸含量圖14示出從在連續光照及200iamolm-、"光照條件下，用改變的PNS肥料(將5mMKN03替換為2.5mMNH4N03)栽培的植物得到的種子中胺基酸含量(n=4)。分別用每單位新鮮重量的濃度nmol/mgFW表示主要胺基酸含量(A)、精氨酸含量(B)、總胺基酸含量(C)。圖15為在與圖14中同樣的條件下進行的另一個試驗的結果。其中n=2。分別用每單位新鮮重量的濃度nmol/mgFw表示主要胺基酸含量(A)、精氨酸含量(B)、總胺基酸含量(C)。圖16示出擬南芥的GGT與推測來源於水稻的GGT的蛋白質的胺基酸水平的同源性。GGT1:擬南芥GGT;Japonica—GGT:推測是Japonica種水稻的GGT的蛋白質；Indica—GGT:估計是Indica種水稻的GGT的蛋白質。同一的胺基酸位點以星號表示。圖17為對導入來源於擬南芥GGT基因的第一代轉化水稻，白天葉子中的胺基酸含量進行測定的結果。所述數值為對應於總胺基酸含量的相對值。胺基酸，選擇主要胺基酸中相對於總量的相對值為10%左右的胺基酸出示在圖中。實施發明的優選方案本發明的目的可以通過以下手段實現，即篩選和製備相對於同源野生型植物，穀氨酸乙醛酸轉移酶(GGT)活性提高的植物，或對於對應非轉代植物，GGT活性提高的轉化植物的方法。例如，本發明的目的可通過以下手段實現，即，將可^^編碼穀氨酸乙酪酸氨基轉移酶(GGT)的基因(GGT基因)表達提高的基因構建體導入到植物中，提高GGT基因的表達。此類基因構建體包含能表達GGT的基因構建體、能表達轉錄活化因子的基因構建體、具有提高轉錄活性功能的核酸片段等。在本發明中的一個實施方案中，將能表達GGT的基因構建體導入植物中，與在相同條件下栽培的對應的非轉化植物進行比較，選育編碼GGT的基因表達提高的轉化植物。在本發明中其他的實施方案中，可通過提高GGT基因的拷貝數提高GGT基因整體表達。在本發明其他的實施方案中，可通過表達，優選過表達轉錄活化因子來提高GGT基因的轉錄量，從而提高GGT活性。在本發明的另一個實施方案中，可通過導入含有具備轉錄活化功能的順式元件的增強子等，提高GGT基因的轉錄量，從而提高GGT的活性。此處，"穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶"為具有穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶活性，也就是具有催化乙醛酸+穀氨酸->甘氨酸+酮戊二酸的反應活性的蛋白質總稱(參照圖1)。尤其是，在此類蛋白質中，包括例如與序列編號2或4中所述胺基酸序列具有至少約60%或60%以上，優選為70%或70%以上，尤其優選為90%或90%以上的胺基酸序列同源性的蛋白質。此類同源性可以使用例如FASTA等本領域技術人員所熟知的程序和標準參數進行計算得到。例如，FASTAVer.2.0，3.0，3.2，3.3等與標準參數可由國立基因研究所生命情報.DDBJ研究中心(DDBJ/CIB)(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome畫j.html)獲得。同樣，"編碼GGT的基因，，或"GGT基因，，，也包括編碼具有穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶活性的蛋白質的任何基因。尤其是，在此類基因中，包括例如與序列編號1或3中所述的核苷酸序列優選具有70%或70°/。以上，更優選具有90%或90%以上同源性的核苷酸序列的基因。此類同源性可以使用例如前所述的FASTA等方法進行計算。具有此類同源性的核酸分子也可以是在嚴緊的條件下與具有序列編號1或3的核酸分子雜交的核酸分子。在此類基因編碼的蛋白質包括在序列編號2或4所述的胺基酸序列中添加、取代、缺失胺基酸後所得胺基酸序列的蛋白質。此處，"嚴緊條件，，指形成所謂特異性雜交，而不形成非特異性雜交的條件。此條件難以被明確量化，但例如，同源性高的DNA分子間，例如具有70%或70%以上的同源性的DNA分子間可進行雜交時，同源性低於該數值的DNA分子間不能進行雜交的條件，或通常的DNA雜交的洗滌條件為50。C，鹽濃度2xSSC,0.1%SDS，優選為lxSSC，0.1。/。SDS，更優選為優選為0.1xSSC,0.1V。SDS下進行雜交的條件。在此條件下雜交的基因中，也包含序列中間產生終止子的基因或活性中心變異缺失的基因，對於這些基因，可將其連接到市售的活性表達載體上，通過上述的GGT酶活性的方法進行測定，從而容易地除去。本發明中，只要是與序列編號1或3的基因序列具有同源性的基因或與序列編號2或4的胺基酸序列具有同源性的蛋白均可以作為本發明的基因或蛋白質的等價物使用，例如包括來源於水稻的基因或蛋白質。作為此類例子把推測為日本水稻(Oo;zas""vay'"/jom'c")的GGT基因的核苷酸序列，及其所編碼的蛋白質的胺基酸序列分別記錄為序列編號34和35，同樣，把推測為印地佳稻(^"va的GGT基因的核苷酸序列，及其所編碼的蛋白質的胺基酸序列分別記錄為序列編號36和37。把來源於擬南芥的GGT1和上述來源於水稻的蛋白質在胺基酸水平上的同源性如圖16所示。圖16表明GGT1與對應於來源/fl/7o"/cfl、/wrf/c"種的GGT1蛋白質，在胺基酸水平上的同源性相當高。也可是來自其它供體的異源基因土。^、''5;'、土另外，所謂"與相同條件下栽培的對應的非轉化植物相比GGT活性提高的轉化植物"是指，與在相同條件下栽培的對應非轉化植物，即與前述轉化植物屬於相同種類並且沒有受GGT基因表達構建體轉化的植物的GGT活性相比，由存在於人們關注的轉化植物中的對應於非轉化植物本身所具有的GGT基因和存在於轉化用基因構建體上的GGT基因這兩者所產生的總的GGT活性均有提高。本說明書中已說明過所謂"非轉化植物"為與導入了能表達GGT基因構建體的轉化植物相比，指"未導入能表達GGT基因構建體的植物"。提高GGT活性還可在基因的轉錄水平、翻譯水平、翻譯後的修飾水平的任意水平上進行。例如可舉出通過導入能表達GGT的基因構建體，以及控制GGT的表達調節因子及翻譯調節因子，轉錄後調節因子等與調節GGT活性和/或轉錄量相關的上遊因子，以提高GGT的活性。更具體而言，例如尤其可通過導入表達GGT的基因構建體，或提高內在GGT基因的拷貝數，導入轉錄活化因子，導入具有使內在GGT基因轉錄活性提高的增強子等方法而得以實現。這些方法為本領域技術人員所熟知的方法。例如，眾所周知，如果在逆境誘導啟動子rd29A基因的啟動子的控制下，表達DREB1A基因，因應答逆境效應，DREB1A的耙基因的表達與野生型植物相比大幅度提高(NatureBiothechnology17，287-，1999)。另夕卜，還有為活化轉錄活性隨機插入增強子，可通過從其中篩選具有特徵性狀的個體確定靶基因的報導(PlantJ.，34，741-750，2003;PlantPhysiol"129，1544國1446，2002)。本發明的轉化植物的GGT活性，與在相同條件下栽培的對應非轉化植物相比，對應組織中的GGT活性水平優選提高約1.2倍或1.2倍以上，更優選提高約3倍或3倍以上，尤其優選提高約5倍或5倍以上。另外在mRNA水平方面，本發明的轉化植物的GGTmRNA水平與在相同條件下栽培的對應的非轉化植物相比，在對應組織中的GGTmRNA水平優選提高約2倍或2倍以上，更優選提高約5倍或5倍以上，最好提高至約30倍或30倍以上。本發明的植物以及通過本發明的方法得到的植物中，GGT活性與mRNA表現出很強的正相關關係。本說明書中，本發明也包括僅在植物體的一部分中GGT活性提高的植物，例如，只在含塊莖的莖、葉、花中GGT活性提高的植物及此類植物的製備方法。因此，只在植物體的一部分中發生總胺基酸量提高、或Ser、Arg、Gln、Asn中的至少1種或1種以上的胺基酸含量，尤其是Ser和/或Arg含量提高的情況也包括在本發明範圍內。本發明中GGT活性提高，優選在過氧化物酶體，尤其是光合作用組織的過氧化物酶體中進行。光合作用組織，只要是在通常培養或栽培條件下進行光合作用的組織即可，例如包括莖、葉、皮及其它。作為本發明的目的GGT基因可從各種植物體中取得。例如，GGT基因，可通過在資料庫中以穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶、或丙氨酸氨基轉移酶為關鍵詞進行檢索，得到其DNA鹼基序列信息。根據序列信息進行RT-PCR、5'-RACE、3，-RACE，可以獲得全長的cDNA。另外可根據已知的DNA序列信息使用適當的探針通過雜交從cDNA文庫中篩選出目的基因。此篩選中使用的探針可以根據GGT的胺基酸或鹼基序列進行製備。本發明中，如前所述應提高表達的GGT優選定位於過氧化物酶體、尤其是光合作用組織中的過氧化物酶體中。此類GGT在過氧化物酶體中的定位，可通過過氧化物酶體中定位蛋白質的特徵N末端附近的序列或C末端附近序列的存在進行推測。作為此類序列，例如作為N末端側序列有Arg-(Leu/Gln/Ile)-X5-His-Leu或與之類似的序列、作為C末端側序列有(Ser/Ala)-(Arg/Lys)-(Ue/Leu/Met)或與之類似的序列。另外，也可通過人工方法在具有GGT活性的蛋白質上附加上述過氧化物酶體中定位蛋白質的特徵N末端序列或C末端序列。另外，可在得到的GGT基因上融合GFP或GUS等報告基因，使其保持在過氧化物酶體中的定位性，並在細胞內表達，從而也可以通過觀察進行確認。另外，也可表達具有末端標記的GGT，使用特異性抗體確認其局部定位性。本發明中，為提高GGT基因表達的基因構建體，可採用本領域技術人員所熟知的方法進行製備。用於GGT基因表達的啟動子，只要是可在植物體內起作用的啟動子即可，如可以利用通過花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子(EMBOJ.6:3901-3907，1987)、玉米遍在蛋白啟動子(PlantMol.Biol"18:675-689,1992)、肌動蛋白啟動子、微管蛋白啟動子等驅動GGT的表達的基因構建體。尤其優選高表達的啟動子。作為終止子只要是能在植物細胞內起作用的即可，例如可以使用來源於CaMV的終止子和來源於氮氧化物合成酶基因(NOS)的終止子。另外，也可利用存在於植物基因組中的GGT表達單元。另外，關於包括設計和分離核酸構建體，並確定其序列方法的分子生物學手段，可以參照例如Sambrook等著，分子克隆實驗室指南(Molecularcloning-Laboratorymanual)，第2版，冷泉港實驗室出版it(ColdSpringHarborLaboratoryPress)之類的文獻。或者，為製備本發明中能使用的核酸構建體需要用以PCR法為主的基因擴增，關於此類手段可參照如F.M.Ausubeletalo.(eds)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.(1994)等。在上述實施方案中對可以使用的核酸構建體導入方法並無特別限制，可根據宿主適當的選擇本領域技術人員所熟知的植物細胞或植物體的基因導入法。例如可使用土壤桿菌的基因導入法、電轉法、或利用基因槍導入。利用土壤桿菌時，優選轉移的序列插入在左右的T-DNA邊界(border)序列之間。適當設計和構建基於這種T-DNA的轉化載體是本領域技術人員所熟知的。另外，使用含有此類核酸構建體的土壤桿菌感染特定植物時所需的條件也為本領域技術人員所熟知。關於此類技術以及條件，可參照例如秀潤社，細胞工程分冊《模式植物的實施驗報告水稻擬南芥編》(1996)等。對進行基因改變操作的植物種類並無特別限制，優選易於栽培及轉化並且在植物體中已確立了再生系統的植物種類。適用於本發明的植物除具有上述特性之外，更優選已確立大規模栽培技術的植物種類或具有較高食用價值的植物等。在這些植物中，除了作為模式的植物的擬南芥以外，還包含水稻、玉米、小麥、甜菜、木薯、菠菜、巻心菜、萵苣、生菜、芽菜、黃瓜、番茄、蠶豆、大豆、小豆、四季豆、豌豆等。這些植物可以為天然的品種，也可為基因已進行遺傳修飾的植物，例如為對植物來說可以是天然的GGT基因表達提高的植物。經遺傳修飾的植物，可從現有的文庫，例如從現有的基因強表達文庫中選擇。接下來，對已進行如上所述基因操作的植物細胞等進行轉化體篩選。此篩選，可通過例如以存在於用於轉化的核酸構建體上的標記基因表達為基礎進行。例如，當標記基因為抗藥性基因時，可通過在含有適當的濃度的抗生素或除草劑等的培養基上培養經修飾的植物細胞等或使經修飾的植物細胞等生長，以進行篩選。或者，當標記基因為p-葡糖醛酸糖苷酶、螢光素酶基因等時，可以通過對其活性進行篩選以篩選出轉化體。以此確定的轉化體，例如，可由原生質體、愈傷組織、外植體等再生植物。對於用於此再生的宿主植物可利用本領域技術人員所熟知的方法。以此得到的植物體以通常的方法，即與非轉化體同樣的條件、或適合於各轉化體的條件下進行栽培即可，為確定含有本發明的核酸結構物的轉化植物，在根據上述標記基因進行篩選的基礎上，還可以利用各種分子生物學的手段。為研究GGT基因在基因組中的插入情況、確定插入位置、確認插入基因組中的拷貝數等，可以利用DNA雜交、PCR、RNA印跡及RT-PCR等方法。然後，可對所得的轉化植物的GGT蛋白質含量、GGT活性、及GGT的mRNA水平進行評定。例如蛋白質的量可通過蛋白質印跡等方法、mRNA水平可通過RNA印跡、定量RT-PCR等方法進4亍評定。而GGT活性可通過一般的方法(PlantPhysiol.99:1520-1525)進行測定。例如在測定光合作用組織中的GGT活性時，首先使用液氮將植物的葉等光合作用組織冷凍後進行粉碎，以適當的提取液，例如含有100mMTris-HCl(pH7.3)、10mMDDT的緩衝液懸浮，進行超濾，以前述的方法(PlantPhysiol.99:1520-1525)進行測定即可。在測定局部定位於過氧化物酶體內的GGT活性時，可根據一般方法(PlantPhysiol.43:705-713,J.Biol.Chem.243:5179-5184，PlantPhysiol.49:249-251),分離過氧化物酶體，以前述的方法進行測定即可。這些方法也都為本領域技術人員所熟知。本發明中，轉化植物的GGT活性相對於相同條件下栽培的對應非轉化植物，優選在對應組織中的GGT活性水平提高約1.2倍或1.2倍以上，更優選提高約3倍或3倍以上，特別優選提高約5倍或5倍以上。得到的植物，可對植物體內的胺基酸舍量進行評定。胺基酸含量，可通過例如破碎植物體或它的一部分，將提取液在普通的胺基酸分析裝置中進行檢測。例如，在由植物或其一部分構成的樣品中加入80%乙醇500jal，以細胞粉碎才幾MM300(QIAGEN)進行石皮碎後，在80。C下處理10分鐘以提取胺基酸。離心分離後，將減壓旋轉殘留的樣品溶解於0.02N的HC1中配製成分析樣品。使樣品通過0.22pm的濾膜以除去不純物，可使用胺基酸分析儀LS-8800(HITACHI)測定胺基酸的含量，進行胺基酸分析。相對於相同條件下生長的對照植物，植物體中的胺基酸含量,可以總胺基酸含量、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)中至少l種的含量，在特定組織，優選在光合作用組織、例如可以葉中的總胺基酸含量、Ser、Arg、Gln、Asn的1種以上的含量提高比例等作為指標進行量化，有時還根據情況進行統計學處理。其結果，對於任意一個1或1以上的指標，只要其提高在統計學上是有意義的，例如以5。/。作為有效標準，那麼對應於該結果即可以判斷與對照植物相比，總胺基酸量、或Ser、Arg、Gln、Asn含量的至少1或1以上具有有意義的提高。另外，GGT基因表達提高的植物，也有可能是從隨機插入增強子和T-DNA標記的植物文庫中獲得GGT活性提高的植物。另外，GGT基因表達提高的植物，也可不通過上述的直接分子生物學手段獲得。即，也可通過使已知的誘變劑作用，以上述特性作為指標，提高GGT基因的表達，篩選出GGT活性提高的植物。誘導植物變異的物質及誘導變異方法為本領域技術人員所熟知。作為誘變劑例如可利用EMS、曱基亞硝脲(methyl-nitrosourea)、Y_線、UV、離子束、X射線的照射等。通過本發明，可得到胺基酸含量提高，尤其是Ser、Arg、Gln、Asn中l種或l種以上胺基酸含量提高的植物。尤其通過本發明，可得到總胺基酸含量相對於相同條件下栽培的對應非轉化植物或野生型植物優選提高約1.5倍或1.5倍以上，更優選提高4倍或4倍以上的成熟植物。尤其對於Ser含量，通過本發明，與同種野生植物或對應的非轉化植物相比，可獲得約2倍或2倍以上，優選為3倍或3倍以上、尤其優選為20倍或20倍以上的提高。對於Arg、Gln、Asn含量也可獲得1.5倍或1.5倍以上，優選為3倍或3倍以上，最優選為5倍或5倍以上的提高。尤其對於Asn、Arg可獲得5倍或5倍以上的提高。另外，可通過只以硝酸鹽的形式施用氮肥栽培本發明的植物，可以特別提高Ser含量。另一方面也可通過摻入氨態氮肥，在提高Ser含量的基礎上同時提高Asn、Gln、Arg的含量。因此，也通過改變栽培條件、尤其是氮肥的性質，也可以控制本發明植物的胺基酸含量。要對這樣得到的胺基酸含量提高的植物進行鑑定，也可檢測其性質是否在遺傳上得到穩定地保持。為此在通常光照條件下栽培植物體並取得種子，可對其後代的性質以及分離進行分析。轉化體後代中是否存在導入核酸構建體、其位置、其表達等可使用與第一代轉化體類似的方法進行分析。不通過直接導入基因獲得本發明植物的情況下，可以同樣分析有無遺傳變異、其定位等。對於胺基酸含量提高的植物，根據序列是來源於整合到導入基因組中的核酸構建體的序列，還是被變異或破壞的基因，可能有雜合型或純合型的情況，根據需要可通過異體受精的方式獲得雜合體或純合體。來源於整合至基因組中的核酸構建體的序列根據孟德爾的遺傳法則在後代中進行分離。因此，為實現本發明的目的，從保持性狀穩定的觀點出發，優選使用純合型植物。本發明的植物可在通常栽培條件下進行栽培。本發明的植物，可通過由GGT活性提高的植物或上述胺基酸含量提高的植物的細胞和植物體的一部分再生植物體的方法進行製備和/或繁殖。例如，通過在MS基本培養基中加入適當的激素的培養基上培養本發明的植物細胞或組織，根據情況經過愈傷組織等細胞形成或胚胎形成階段，對具有本發明植物特性的植物進行再生。這種從植物細胞或植物的一部分再生植物體的技術為本領域技術人員所熟知。本發明的GGT活性提高的植物或上述胺基酸含量增大的植物可以通過種子進行繁殖時，從本發明植物上採取種子，優選採取雜合型種子，根據通常的方法，例如通過簡單播種於適當的土壤中，可得到具有上述特性的本發明的植物。製造本發明的種子時，尤其優選栽培純合體植物，回收其種子。純合體的篩選，可通過重複培育子代，直至所需表現型不分離為止，即，在所有後代中篩選顯示所需表現型的林進行純合體篩選。另外，還可通過PCR或DNA分析篩選純合體。本發明的種子，可按照有關植物體的前述方法，通過測定其胺基酸含量，與從相同條件下栽培的對應野生型植物得到的種子作比較，確認胺基酸含量、尤其是Ser、Arg、Gln、Asn中的至少1種的含量提高情況。另外，本發明的植物為可以進行營養繁殖時，可以從植物的一部分直接繁殖和/或使其繁殖為具有本發明特性的植物。此類繁殖方法為本領域技術人員所熟知(例如可參照講談社園藝大百科10栽培方法，1980)。營養繁殖方法中包括有如白薯或胡蘿蔔等使用塊根或塊莖的方法、插枝的方法、接枝的方法等，但並不局限於此。如此製備和/或繁殖的植物的特性，尤其是胺基酸含量可以按照上述的方法進行評價。本發明的植物及種子，可作為食品或食品材料，進行與對應的野生型植物相同的利用。因此，本發明的植物及種子，可直接或通過通常的烹調方法及加工方法作為食品進行利用，也可以作為飼料使用。為從本發明的、或通過本發明的方法使胺基酸含量、尤其是Ser、Arg、Gln、Asn的至少1種含量提高的植物中，得到含有這些胺基酸的植物提取物，可利用從植物中獲得含有胺基酸組分提取物的一般已知方法，尤其是為了提取含有Ser、Arg、Gln、Asn中的至少l種組份的方法。為從含有Ser、Arg、Gln、Asn的至少1種的提取物中對上述任意一種胺基酸進行純化，可以利用包括各種層析色譜的，本領域技術人員共知的多種方法。以下的實施例，所示以作為模式植物的擬南芥、及水稻為材料獲得本發明的植物的方法，以及得到的植物及種子的特性。如本領域技術人員所知，本發明的植物、其種子、及本發明的方法並不局限於擬南芥和水稻這些特定的植物種類。另外，根據本說明書公開的內容，如本領域技術人員所知，GGT基因在轉化植物的製備中可作為標記基因使用。例如，為賦予對特異抑制GGT的物質的耐受性、賦予逆境耐性等目的，可利用GGT基因，用於在此類抑制物質的存在下或壓力下的轉化植物的篩選。實施例所有植物的栽培均在以下條件下進行在平板上使用以下成分作為用於培養的基本培養基含1%(w/v)蔗糖、0.05%(w/v)MES(2-(N-嗎啉)乙磺酸)、的PNS(Mol.Gen.Genet.204:430-434)或MS(PhysiolPlant15:473-479)無機鹽類和0.8(w/v)瓊脂。如果在石棉(rockwool)上進行栽培，則只使用PNS無機鹽作為營養源。另外，以已經取得的擬南芥GGT缺失林作為模式植物用於轉化試驗。GGT缺失林的獲得方法在參考例1及2中示出。參考例1.擬南芥的GGT缺失抹的獲得(1)製備用於篩選GGT缺失林的引物GGT基因，由於它也是AlaAT基因因此根據擬南齊的丙氨酸氨基轉移酶(AlaAT)基因信息獲得GGT基因。根據網際網路上公開的AlaAT基因數據(GenBank)，預測AlaAT(GGT)拷貝數及序列以製備引物。以丙氨酸氨基轉移酶及擬南芥為關鍵詞進行數據檢索，得知至少在基因組上存在4個拷貝、預想為GGT基因的基因。各基因的GenBank登錄號為AC005292(F26F24.16)、AC011663(F5A18.24)、AC016529(T10D10.20)、AC026479(T13M22.3)。各基因分別被命名為GGT1、GGT2、GGT3及GGT4，把各cDNA核苷酸序列記為序列編號1、3、5及7，把預想的胺基酸序列分別記為序列編號2、4、6及8。相對於GGT1的GGT2、GGT3、GGT4的同源性如下面表1所示。預想的各胺基酸的比較如圖2所示。表1.GGT1和GGT2、GGT3、GGT4各自間的同源性(％)tableseeoriginaldocumentpage17根據對EST信息進行研究的結果，可以推測4拷貝中GGT1的表達量最高。於是以GGT1序列為基礎，製備用於篩選基因破壞抹的PCR引物(表2)。這些引物，根據KazusaDNA研究所提供的系統進行設計。表2.用於篩選基因破壞株的PCR引物complextableseeoriginaldocumentpage18*序列採用通常的表示方法，即以5，->3，方向。(3)GGT破壞林的分離利用KazusaDNA研究所提供的系統，對基因破壞擬南芥文庫進行有關GGT的篩選。篩選按照植物細胞工程學系列14《植物基因組研究報告書》(秀潤社)2-4-c中所述的順序進行操作。l次篩選使用(AAT1U/AAT1L)作為基因側的引物，在標記引物中分別在各對應的池中分別使用(00L/02L/03L/04L/05L/06L/00R/02R/03R/04R/05R/06R)。使用的標記引物與各池之間的關係在表3中表示。表3.標記引物與各池之間的關係formulaseeoriginaldocumentpage19聚合酶使用EX-taq(TAKARA)。反應液的組成為20Ji1中約含38.4ng(約100pgx384)模板DNA、10pmol標記引物、10pmol基因引物、2pll0x緩衝液、5nmoldNTP、0.5UEx畫taq。PCR循環以94X345秒、52XM5秒、72'C3分鐘為一個循環，進行35次循環。將10jalPCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離。觀察經EtBr染色擴增的DNA片段。將此凝膠在變性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中浸泡20分鐘進行變性後，在中和液(0.5MTris-HCl(pH8.0)，1.5MNaCl)中浸泡20分鐘，使用20xSSC(3MNaCl，0.3M檸檬酸鈉)印跡至膜-HybondN十(AmershamPharmaciaBiotech)上。印跡後,以UV交聯使DNA固定在膜上。使用AlkPhos-DirectDNAdetectionkit(AmershamPharmaciaBiotech)按照附帶的說明書進行雜交和檢測。雜交在65X:下進行。使用AAT1U/AAT1L為探針，以基因組DNA作為模板進行PCR，使用GFXPCRDNA和GelBand純化試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech)純化其擴增片段。第1次篩選中，以從384個獨立的標記插入種系(line)中提取的基因組DNA混合物為1池(pool),對54個池(384x54=20736種系)進行PCR。對擴增產物進行DNA雜交分析以確認目的產物被擴增。對第1次篩選中得到的顯示陽性結果的池P0035進行第2次篩選。用於第2次篩選的PCR的引物組合為，第1次篩選中得到的顯示陽性結果的AAT1U/00L和AAT1L/00L。第2次篩選的結果表明，GGT1已插入到單一的林系8046中。(4)標記插入位置的確定以從確定的標記插入種系提取的DNA為模板，以2組引物組合(AATU/00L，AAT1L/00L)進行PCR,擴增的片段,皮克隆至pGEMT-easyvector(Promega)。使用DNA測序儀ABIPRISMTM377DNAsequencer(PERKINELMER)確定序列。標記伴隨第6外顯子上16bp的缺失而被插入，顯然通過標記的插入由176-GGTLV-180被取代為176-AIQL(end)-180。參考例2.GGT缺失純合體抹的獲得(1)純合體的篩選把確定插入標記的種系的T2種子播種到含有10mg/l的潮黴素的MS培養基上。3周後移植至石棉上從Rossetto葉的約5mm四方形的樣品中提取DNA。提取方法採用Li的方法(Plant丄8:457-463)。為確定純合體，使用夾著標記的引物(AAT1U/AAT1L2)進行PCR。PCR以變性94C30秒，退火57。C30秒，延伸72*C60秒的條件進行30次循環。對照使用野生型的基因組DNA為模板。PCR產物的一部分用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離。在35個種系中存在11個純合體種系。(2)GGT表達的檢測對於得到的純合體種系，使用其子代，通過RT-PCR確認是否引起基因損壞。將來源於純合體的種子在含有10mg/，的潮黴素的MS培養基上播種，確認所有的個體均顯示耐受性。使用ISOGEN(日本基因)從播種後2周的幼小植物提取全部RNA。DNase處理後使用superscriptII(GIBCO)從寡聚dT引物上進行逆轉錄，以合成的單鏈cDNA為模板，使用夾著標記的引物(AAT1RTU/AAT1RTL)進行PCR。PCR以變性94°C30秒，退火57C30秒，延伸72°C60秒的條件進行28次循環。使用EF1-oc(EFU/EFL)為對照。PCR產物的一部分使用1%瓊脂糖通過電泳進行分離。插入標記的種系中未檢測到GGT1的完整mRNA。根據此結果分析表明，將此插入標記抹命名為ggtl-l。此ggtl-l在通常的光照強度下生長受到明顯抑制，但在弱光照下(約30jLimo1nT2s")與非轉化植物相比其生長並無大的差異。另外，以下述方法測定GGT活性的結果表明，ggtl-l中GGT活性顯著降低。因此，使用ggtl-l作為用於提高GGT活性的實驗材料。實施例1.GGT活性提高的轉化植物的製備(1)表達GGT基因的基因構建體的導入5089bp的GGT1的基因組區域以PCR法進行擴增。上遊引物使用(5'國CAATAACAATGCAAAGTTAAGATTCGGATC-3，序列編號28)，下遊引物使用(5，-GCTTCTTCTCAACCATCGTCACC國3，序列編號29)。把編碼GGT1的核酸序列和GGT的胺基酸序列如序列編號1及2所示，導入基因的結構如圖3所示。將擴增片段克隆至除去GUS/NOS-ter的二元載體(binary-vector)pBIlOl的飾dIH和5ri附HI位點，由土壤桿菌介導導入至擬南芥的GGT1基因破壞林(ggtl-l)。把得到的轉化體在PNS培養基上播種後，在70jimolnT2s"的光照條件下使其生長2周，測定幼小植物地上部分的重量時，完全彌補了由基因破壞引起的生長抑制作用，而且與野生型相比促進了生長(圖4)。(2)GGT基因表達的確認導入基因的表達通過定量PCR進行確認。在含50mg/l卡那黴素的1/2MS培養基上播種，選擇所有個體均顯示耐受性的種系作為RNA提供源。使用RNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)從在PNS培養基上以30jamo1irT2s"的光照條件下繁殖2周長出的幼芽的地上部分中提取總RNA。DNase處理後使用superscriptII(GIBCO)從oligodT引物上進行逆轉錄，以合成的單鏈cDNA為模板，使用定量PCR用引物(5-TTCTTCTTCTGAACGACTATTGTG國3，序歹J編號30，及5，-GAATAGGGCAAAGAGAAAGAGTG-3，序列編號31)進行PCR。使用(5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG國3，序列編號32及5，-GGTGCAACGACCTTAATCTTCAT-3，序列編號33)作為ACTIN2的定量PCR用引物。定量PCR使用ABIPRISM7700，反應條件以50X:2分鐘，95°C10分鐘為一個循環，接著以95"C15秒，60'C60秒為循環進行40次循環。分別進行3次獨立的RNA提取實驗，根據ACTIN2的表達量對GGT1的表達量進行標準化處理。GGT1的表達量的定量結果在圖5中顯示。基因導入種系中表達量提高了2倍左右。實施例2.GGT活性提高的轉化植物的特性評價(1)GGT酶活性的測定為了測定酶活性，從在PNS培養基上播種2周、30Mmolm-2s"的光照條件下長出的幼芽的地上部分提取蛋白質。將新鮮質量約200mg的植物體以液氮冷凍，使用研缽和藥杵破碎組織。加入lml提取用緩衝液[lOOmMTris-HCl(pH7.3)，lOmMDTT]，以15，000rpm進行10分鐘離心分離，除去不溶物。進一步重複3次相同的操作。脫鹽處理使用超濾膜UFV5BGC00(微孔，Millipore)進行。將進行10，000rpm進行約45分鐘離心分離的提取液0.5ml濃縮至10倍。用提取緩衝液稀釋至10倍，進行3次相同的操作。使用Proteinassaykit(Bio-Rad)測定蛋白質濃度。加入含10%甘油的提取用緩衝液使粗提取液的最終濃度達到lmg/ml，作為粗提取液。GGT(Glu+glyoxylate->Gly+ccKG)的活性通過與由NAD+GDH(EC1.4.1.3)引起的NADH的氧化反應結合，根據340nm下的OD變化進行測定。反應中，相對於0.6ml反應液[lOOmMTris畫HCl(pH7.3)，lOOmMGlu，0.11mM吡噴醛5-磷酸，0.18mMNADH，15mM乙醛酸，500U/1GDH(G2501)]使用50jag粗提取液。使用HPR的活性作為對照。HPR的活性通過NADH氧化引起的340nm下的OD變化進行測定。反應中，相對於0.6m，反應液[lOOmMTris-HCl(pH7.3)，5mM羥基丙酮酸及0.18mMNADH]使用50[ig粗提取液。GGT和HPR活性在圖6中示出。可以看出，與對應的非轉化植物相比，GGT基因導入種系中的GGT活性約為2倍。(2)胺基酸分析為測定游離的胺基酸，在PNS培養基上播種後、於70jamo1nT2s"的光照條件下生長2周的幼體植物地上部分，及以PNS為營養源的在石棉上栽培6周的植物的Rossetto葉中提取胺基酸。以液氮冷凍新鮮質量約為100mg的植物體，保存於-80匸。在冷凍的樣品中加入80%乙醇500jil，用細胞破碎機MM300(QIAGEN)進行破碎後，在80匸下處理10分鐘提取胺基酸。以15，000rpm進行10分鐘離心分離後取上清，在沉澱中加入80r的80%乙醇500|il，充分攪拌後再次於80匸處理10分鐘。以15，000rpm進行10分鐘離心分離後取上清作為胺基酸提取液。對lml胺基酸提取液進行減壓旋轉，完全除去乙醇及水分。溶於500lil的水和等量的二乙醚中，對離心分離後的下層進行減壓旋轉。在殘留的樣品中加入0.02NHC1使最終濃度達到10M1/mgFW，旋轉後進行離心分離回收上清。通過0.22jum的濾膜除去不純物作為分析用樣品。使用胺基酸分析儀LS-8800(HITACHI)進行胺基酸分析。總胺基酸含量和主要胺基酸的含量(nmol/mgFW)在圖7和8中示出。分析的結果為GGT1過量表達種系中絲氨酸含量明顯提高，在石棉上生長的植物中總的胺基酸含量、精氨酸含量也有提高。(3)氮含量分析測定在PNS培養基上播種後、70jumolnT2s"的光照條件下生長2周長出的幼體植物地上部分的氮含量。測定使用住友化學分析中心制的SUMIGRAPHNC-1000進行測定。測定的結果為，如表4所示GGT過量表達種系中每單位乾重的總氮含量有所提高。表4.相對乾燥質量的總氮的比例(％)tableseeoriginaldocumentpage24實施例3GGT活性更進一步提高的轉化植物的製備為了製作GGT活性進一步提高的植物，在野生型植林中導入表達GGT基因的基因構建體，進行特性評價。另外，把GGT1基因破壞林(ggtl-l)中導入GGT表達構建體得到的GGT1基因導入抹記錄為(ggtl-1/GGT1)，把在野生型植抹中導入GGT表達構建體得到的GGT1基因導入林記錄為(WT/GGT1)表示。(1)GGT基因表達用基因構建體的導入使用和實施例1(1)中所示的方法同樣的方法將GGT1基因導入至野生型植林(Col-0)。(2)GGT基因表達的確認導入基因的表達使用實施例1(2)所述的方法進行確認。使用在PNS培養基上栽培2周的野生林、2林系(ggtl-1/GGT1)、及7林系(WT/GGT1)作為RNA的提供源。GGT1表達量的定量結果在圖9中示出。在基因導入種系中表達量提高了5~30倍。實施例4進一步提高GGT活性的轉化植物的特性評價(1)GGT酶活性測定使用實施例2(1)所述的方法進行酶活性測定。GGT活性及作為對照的HPR活性在圖10中示出。與野生型相比GGT基因導入種系中GGT活性約為2~6倍。(2)胺基酸分析使用實施例2(2)所述的方法進行游離胺基酸含量的測定。在圖11中示出在PNS培養基上生長的，實施例3(2)及4(1)中GGT表達量與酶活性被測定的林系中的絲氨酸含量(nmol/mgFW)。另外，合計40系統的測定結果在表5中示出。表達量、酶活性、絲氨酸含量的關係在圖12中示出。在1/2MS培養基上生長的植物的主要胺基酸含量和總胺基酸含量在圖13中示出。種子中的胺基酸含量在圖14及圖15中示出。分析結果為在GGT1過表達種系中絲氨酸含量最多提高了20倍。對表達量、酶活性、絲氨酸含量進行比較時，分別顯示出有意義的相關性。表5.Ser含量tableseeoriginaldocumentpage25表5.續tableseeoriginaldocumentpage26另外在1/2MS培養基上生長時，與野生型對照相比，No4抹中除絲氨酸以外天冬醯胺提高5倍左右，穀氨醯胺提高3倍左右，精氨酸提高5倍左右，總胺基酸提高4倍左右。另外，GGT1過量表達林在氮源只由硝酸態構成的PNS培養基上栽培時Ser含量明顯提高，在含氨態氮的1/2MS培養基上栽培時除了Ser含量提高以外，天冬醯胺、穀氨醯胺、精氨酸提高了3~5倍左右。種子中的胺基酸在連續光照及200nmo1nT2s"的光照條件下，使用在改變的PNS肥料(5mMKN03被取代為NH4N03)上栽培的植物體得到的種子進行測定。ggtl-l/GGTl4-7林與野生型比較，可以看到天冬醯胺、天冬氨酸、穀氨醯胺、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸的積蓄提高。而且總胺基酸含量也提高。實施例5西紅柿馬鈴薯的GGT轉化體的製備(1)西紅柿轉化體的製備使用70%乙醇(30秒)、2%次氯酸鈉(15分鐘)對西紅柿(栽培品種，Minitomato(林)福花園種苗)的種子進行表面滅菌後，接種於不含植物激素的MS瓊脂培養基上，在16小時日照，25'C下培養l周。從得到的無菌幼小植物上切取子葉，接種於添加了2mg/l玉米素和0.1mg/l吲咮醋酸的MS瓊脂培養基(使用再分化培養基，9cm皿)中，以相同條件培養2天。將含有構建基因的土壤桿菌(EHA101)在YEP培養基(表-3)上培養一晚，以用於感染。把培養2天的子葉收集到滅菌的玻璃皿中，加入土壤桿菌液，使其感染。使用滅菌的濾紙將多餘的土壤桿菌液從子葉上去除，另外，為防止土壤桿菌的急劇增殖，上述使用的玻璃皿培養基中鋪上滅菌濾紙，其上面放置徑感染的子葉，進行24小時共同培養。然後，將子葉轉移至含50mg/l卡那黴素、500mg/l頭孢噻肟(夕5"7才，7)的MS再分化培養基(篩選培養基)，進行轉化體的篩選。將再分化的新芽轉移至新的篩選培養基中進行再篩選。切取綠色旺盛生長的新芽的莖的部分，轉移至不含植物激素的MS培養基(生根培養基，試管中)。將生根的再分化植物連續移植至土壤中進行適應性栽培。表6.YEP培養基組成tableseeoriginaldocumentpage27(2)馬鈴薯轉化體的製備通過莖尖培養獲得馬鈴薯(土豆)的無菌植物，通過莖尖傳代增加材料。在加入2%蔗糖的MS液體培養基(10ml)中放入莖尖，誘導生根。生根後，添加含有16%蔗糖的MS液體培養基10ml，於暗處進行培養，誘導微小塊莖。將6~8周後的微小塊莖切成片狀，去皮後，使用於28匸培養一晚的導入了實施例1(1)所述的基因構建體的土壤桿菌(導入了實施例1(1)所述的基因構建體)進行感染。置於鋪有滅菌濾紙的MS瓊脂培養基(MS培養基，2.0mg/1玉米素，0.1mg/l吲哚醋酸，0.3%yA，4卜)上，在25C，16小時日照的條件下共同培養2天。然後轉移至篩選培養基(MS培養基，2.0mg/1玉米素，0.1mg/I吲咮醋酸，0.3%y/k，4卜，50mg/，卡那黴素，500mg/l頭孢噻肟},在相同條件下培養。l周后轉移至新的篩選培養基中，將再分化的新芽轉移至不含植物激素的篩選培養基中，誘導生根。使用導入實施例l(1)所述的基因構建體的土壤桿菌進行感染，在含有50mg/l卡那黴素的培養基上進行篩選。實施例6.水稻的GGT轉化體的製備(1)導入擬南芥GGT1水稻轉化體的製作擬南芥GGT1的cDNA區域以PCR法進行擴增。上遊引物使用(5，畫GCGGATCCATGGCTCTCAAGGCATTAGACT-3，:序列編號38),下遊引物4吏用(5，隱GCCGAGCTCTCACATTTTCGAATAA-3":序列編號39)。下劃線表示的限制性酶切位點(BamHI，Sacl)使擴增的片段連接至CAB啟動子(PlantCellPhysiol42138-，2001)的下遊，取代二元載體pIG121HM的35S啟動子+GUS區域。由土壤桿菌介導導入水稻(品種年夕)。使用鳥山等的方法進行轉化(模式植物的實驗報告P93-1996秀潤社)。把在含土壤桿菌的篩選培養基上顯示耐受性的個體移植至盆土中後，以葉為樣品進行RNA提取，用於胺基酸分析。(2)GTT1基因表達的確認對於將耐藥性作為指標篩選出的20林，以RT-PCR對導入的基因表達進行確認。使用RNeasyPlantMiniKh(QIAGEN)提取總RNA。經DNase處理後，使用superscriptII(GIBCO)從oligodT引物進行逆轉錄，以合成的單鏈cDNA為模板，使用PCR用引物(5，-TGAAAGCAAGGGGATTCTTG陽3，序列編號40，及5，-GACGTTTTTGCAGCTGTTGA-3，序列編號41)進行PCR。進行反應的條件為95X:i5秒，60C60秒為一個循環，進行40次循環。檢查的20林轉化種系中，可以確認GGT1的DNA片段擴增，由此表明導入基因的表達。(3)導入GGT1基因的水稻的胺基酸含量游離胺基酸的測定使用實施例2(2)所述的方法進行。在轉化體中，與非轉化體比較顯示Ser含量的有意義提高(圖17)。序列編號9-33，38-41:PCR引物通過本發明可通過一種穀氨酸乙醛酸氨基轉移酶(GGT)的新型利用方法改進植物特性。通過本發明可以提供GGT活性提高的植物。更具體而言，通過本發明可提供一種在GGT活性水平上，優選提高到約1.2或1.2倍以上、更優選提高到約3或3倍以上、尤其優選提高到約5或5倍以上的植物。另外通過本發明還可提供一種提高植物和/或其種子的胺基酸含量，尤其是提高Ser、Arg、Gln、Asn中的至少一種胺基酸含量的方法、胺基酸含量，尤其是Ser、Arg、Gln、Asn中的至少一種的含量提高的植物和/或種子、這些植物和/或種子在飼料製造中的使用、及含有穀氨酸含量提高的植物和/或種子的飼料。另外，通過本發明可容易的獲得含有大量Ser、Arg、Gln、Asn中的一種或一種以上胺基酸的植物提取物。而且，還揭示了植物中的穀氨醯胺、穀氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸含量和賴氨酸含量變化存在很強的相關關係(PlantCell15,845-853,2003)，因此，通過穀氨醯胺和/或天冬醯胺含量提高的本發明的植物或此類植物的製備方法，可以提供賴氨酸含量提高的植物。序列表<no〉味之素株式會社提高植物GGT活性的方法以及提高GGT活性的植物及其製備方法《丄30>OP04356<15〉JP2002-232562<151〉2002-08-09〈150〉P2003-1944312003—07—0941Patentlnversion3.11446DNAArabidopsist,haJ.iana<220〉<222〉CDS(1).(1443)1atggetetcMetAlaLeu1aaggcattagactacgat,actct:gaatgaaaacgtcaagl—.ysAlaLeuAspTyrAspThrL,euAsnGluAsnValLys5101548肌gLystgtCElgCysGintatTyr20gecAlaValagaArgggtgaacttGlyGluLeu25tatTyretcLeucgaArggettctAlaSer30gagGlu96ctgLeucgiga肌GinLys35gasGluggcGly肌ggttattttcValliePhe40ThraaxAsngttValgggGly45sacAsncctPro144catHisgetttaAlaLeu50ggaGlyC8gGinLysccaPro55ttgLeuacatttThrPhecctProcgcArgcagGin60gtgValgttValgcgAla192cttLeu65tgccasCysGingetAlaccgProtttPhe70etaLeuetaLeugat,gaxAspAspCC8Pro75aatgttAsnValggnGlyatgMetetaLeu24080tttccagetgatgetattgcaagagetaaacattat,ctttecttgactPheProAlaAspAla,lieAlaArgAlaLysHisTyrI.euSerLeuThr288859095teaggcggt.U,aggtget,Uicagtgatt,caagaggcctt.ccaggagttSerGlyGlyLeuGlyAlaTyrSc:rAspSerArgGlyl—,euProGlyVal100105110336agga,aagaggttgetgagttcattcaaeggcgtgatgggtatccaagtArgLysGluValAlaGluPhelieGinArgArgAspGlyTyrProSer115120125384AspPro1:30gaaetcatetttGluLeuliePheetcLeu135actThrgatAspgg3GlygetAlaageSer140ggtGlygtgVal3tgMet432caaatettgaattgtgttatacgcggtaatggagatgggattetagttGinT]eLeuAsnCysVallieArgGlyAsnGlyAspGlylieLeuVal145150155160480ccggttccacagtatccactttacteagetaccatateactgttaggtProValProGinTyrProLeuTyrSerAlaThrlieSerLeuLeuGly165170175528ggta,ctcttgttcctta,cta.tcttgatgagtctg朋，a.actggggacttGlyThrLeuValProTyrTyrL,euAspGluSerGluAsnTrpGlyLeu:180185190576gatgttgetaaccttcgacaatecgttgetcaggetcgttctc肌gggAspValAlaAsnLeuArgGinSerValAlaGinAlaArgSerGinGly195200205624lieThr210gtfiagggc3atgValArgAlaMetgtgVal215atelieattliesaxAsncctProgggGlyAsn220ccaProactThrggcGly672cagtgtct.3agegsaget肌cataagagagatattgaagttctgttatGinCysL,euSerGluAlaAsnlieArgGlulieLeuLysPheCysTyr225230235240720aacgagaaactggttcttctgggagacgaggtttatcagcagaacataAsnGluLysLeuValLeuLeuGlyAspGluValTyrGinGinAsnlie245250255768taccaggatgagcgt,ccctttateagetecaagaaggtt:ttgat:.ggaaTyrGinAspGluArgProPhelieSerSerl-ysLysValLeuMetGlu260265270816atgggttegccgttcageaaggaagttcagcttgtatcttttcacacaMetGlySerProPheSerLysGluValGinLeuValSerPheHisThr275280285864gtctctaaaggatattggggtgaatgtggacagcgaggtggatactttValSerLysGlyTyrTrpGlyGluCysGlyGinArgGlyGlyTyrPhe912290295300gagatgaccaacetccctccaagggttgttgaggagatatacaaggtt960GluMetThrAsnLeuProProArgValValGluG]uTieTyrLysVal305310315320gcateaAlaSera,ttgecetca.gcAlal,euSer325cctProAsngtcValtxtgcgSerAla330ca_a.Gin3tCliettta,tgggtMetGly335]008ttgatgLeuMetgttValaatcctAsnPro340CCElPro卿LyscctProggaGlygiacAsp345attlieteaSertatTyrgacAspcagGin350ttcPhe1056geccgtAlaArgg肌Glu355ageasgSerl,ysgggGlyattliecttLeugasGlu360tctScrttgl,euagaArgfiga,Arg3gaArg365gC3Ala8ggArg1104etcatgLeuMet370Thrgatgg3AspGlyt,tcPheAsn375SertgcCysLysaacAsngt.cValgtgVal380tgcCysaatAsnttcPhe1152ThrGlu385ggtGlygcaatgAlaMettatTyr390tegSerUtPhecctProC&3GinatalieeggArg395ttaLeuccaProThrggaGly4001200getetcAlaLeuGingetgcaAla,Ala405Lysc肌GingetAlaGlyl-ysVal410cca.ProgacAspgttValttcPhetacTyr4151248tgtetcCysLeuaagetcttagaaLeuLeuGlu420gecAlaacaThrGlyatelie425tecSerac3Thrgta,ValcctProggctctGlySer4301296ggatttGlyPheggaGly435Cagg3￡lGinl」ysGluggtGlygtgValttcPhe440catHisctgLeuaggArgThrThratectglieLeu4451344ccagcaProAla450g肌Glug3tg￡lg3tgAspGluMetccgPro455gsgateGlulieatgMetgatAspageSerttcaagPheLys460aagttcLysPhe1392g￡lCAsnAsp465gagGluttcatgsetPheMetThr470cagta^tgeitGinTyrAsp肌tAsnerneAsntttggttatPheGlyTyrtegaaaSerL,ys4754801440atgtgaMet14462481PRT<213〉Arabidopsisthali肌a<40〉2MetAlaLeuLysAlaLeuAspTyrAspThrLeuAsnGluAsnValLys151015LysCysGinTyrAlaValArgGlyGluL,euTyrIjCUArgAlaScrG.lu202530LeuGinLysGluGlyLysLysValliePheThrAsnValGlyAsnPro354045HisAlaLeuGlyGinLysProLeuThrPheProArgGinValValAla505560LeuCysGinAlaProPheLeuLeuAspAspProAsnValGlyMetLeu65707580PheProAlaAspAlalieAlaArgAlaLysHisTyrLeuSerLeuThr859095SerGlyGlyLeuGlyAlaTyrSerAspSerArgGlyLeuProGlyVal100105110ArgLysGluValAlaGluPhelieGinArgArgAspGlyTyrProSer115120125AspProGluUuliePheI」euThrAspGlyAlaSerLysGlyValMet130135140GinlieLeuAsnCysVallieArgGlyAsnGlyAspGlylieLeuVal145150155160ProValProGinTyrProLeuTyrSerAlaTh:rlieSerLeuLeuGly〗65170175GlyThrL,euValProTyrTyrLeuAspGluSerGluAsnTrpGlyLeu180185190AspValAlaAsnLeuArgGinSerValAlaGinAlaArgSerGinGly195200205lieThrValArgAlaMetVallielieAsnProGlyAsnProThrGly210215220G]nCys匕euSerGluAlaAsnTieArgG]uTic匕uLysPheCysTyr2252302:35240AsnGluLysLeuValLeuLeuGlyAspGluValTyrGinGinAsnlie245250255TyrGinAspGluArgProPhelieSerSerLysLysValLeuMetGlu260265270MetGlySerProPhe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