基於二氧化矽的螢光納米顆粒的製作方法

2023-05-12 03:28:41 2

專利名稱：：基於二氧化矽的螢光納米顆粒的製作方法
技術領域：
：本發明總體涉及螢光納米顆粒(nanoparticles)，更具體而言，涉及小於30nm的二氧化矽基螢光納米顆粒，該螢光納米顆粒與有機染料共價連接。
背景技術：
：作為生物技術和信息應用，例如生物成像、傳感器技術、微陣列以及光計算的的指示劑和光子源，螢光納米顆粒的應用前景無可限量。這些應用需要尺寸受控的單分散發光納米顆粒，且所述納米顆粒可以特異性地與生物大分子結合或者排布在高階結構(higher-orderstructures)中。近幾年，出現了兩種通用方法用以合成高螢光性、水溶性納米顆粒，這些顆粒被用於一系列要求苛刻的生物和分析應用中。在第一種方法中，納米顆粒材料本身是螢光性的(例如半導體納米晶體或者金屬納米晶體)。在第二種方法中，螢光納米顆粒(的焚光性)源於有機染料分子的摻混。考慮到有機染料分子的豐富多樣性以及這些染料分子對它們所處環境的極度敏感性，後一種方法增加了開發多種具有精確受控螢光特性納米顆粒的可能性。基於St6ber等人的工作，已經合成了一系列不同大小、顏色和結構的、嵌有染料的二氧化矽納米顆粒。在此前所有的光物理性質報告中，與游離染料相比，均觀察到在二氧化矽顆粒內部共價結合的染料的(螢光)淬滅(bequenched)。然而，在聚(有機矽氧烷)微粒凝膠的情況下，可觀察到螢光效率有輕微增加。其中，所述凝膠內部染料通過非共價鍵連接並通過擴散被負載。對於其他材料，例如聚苯乙烯微粒凝膠，包埋染料的量子效率(quantumeffciency)等於或小於游離染料。螢光淬滅通常被歸因為向二氧化矽基質的顆粒內能量轉移或者非輻射衰減。這兩種(能量轉移)途徑可能受顆粒內的染料所處環境影響，這意味著對顆粒內結構的精確控制可以緩解淬滅，或者，甚至引起螢光增強。此外，仍然需要粒度小於30nm、與有機染料共價連接的高螢光性納米顆粒。
發明內容本發明涉及一類二氧化矽納米顆粒，在所述納米顆粒中，二氧化矽顆粒的內部結構對組份染料的輻射(radiative)性質具有明顯的、受控的影響。本發明提供一種螢光單分散二氧化矽納米顆粒，所述納米顆粒包括螢光團中心核(fluorophorecentercore)和二氧化珪殼體，其中，納米顆粒的輻射性質取決於核的化學性質(組成)(composition),以及二氧化矽殼體的存在。在本發明的一個方面，核-殼(core-shell)結構使螢光量子效率得以提高。本發明主要提供了染料分子的光物理性質的控制，所述染料分子被封裝在粒度小於或等於30rnn的二氧化矽顆粒內部。該控制通過改變二氧化矽化學性質(組成)以及納米級的顆粒結構實現，從而，與游離染料相比，產生了顯著的亮度提高。在本發明的另一個方面，核-殼結構提供了對於納米顆粒的光穩定性的控制能力。本發明提供的量子效率提高源於以下兩方面原因輻射率的提高，以及非輻射率的降低，後者的影響在各結構之間是最易變的。非輻射率的變化與顆粒內部染料旋轉遷移率(rotationalmobility)的差相關性良好。在本發明的一個實施方案中，螢光單分散納米顆粒包括核-殼結構，其中，所述核包括被二氧化矽殼體包裹的密實核(compactcore)。在本發明的另一個實施方案中，螢光單分散納米顆粒包括核-殼結構，其中，所述核包括被二氧化矽殼包裹的擴充核(expandedcore)。在本發明的又一個實施方案中，螢光單分散納米顆粒包括核-殼結構，其中，所述核包括被二氧化矽殼體包裹的，且被染料稀疏包埋其中的均質顆粒(homogenousparticle)。在本發明的再一個實施方案中，螢光單分散均質納米顆粒不被二氧化矽殼體包裹。本發明提供了一種製備具有密實核結構的螢光單分散納米顆粒的方法，該方法通過將一種螢光化合物和一種有機矽烷化合物混合形成染料前體，混合得到的染料前體與水溶液形成密實螢光核，再將得到的密實核與二氧化矽前體混合，在密實核上形成二氧化矽殼體，從而製得本發明螢光單分散納米顆粒。本發明也提供了一種製備具有擴充核(expandedcore)結構的螢光單分散納米顆粒的方法，該方法通過將一種螢光化合物和一種有機矽烷化合物混合製成染料前體，將得到的染料前體與二氧化矽前體共縮合(co-condense)形成擴充螢光核，再將得到的擴充核與二氧化矽前體混合，在擴充核上形成二氧化矽殼體，從而製得螢光單分散納米顆粒。本發明還提供了一種製備螢光單分散均質納米顆粒的方法，該方法通過將一種螢光化合物和一種有機矽烷化合物混合形成染料前體，並將得到的染料前體與二氧化矽前體共縮合製得均質螢光單分散納米顆粒。本發明的這些技術特徵，以及其他技術特徵，在本發明以下說明書中闡明。圖1A-C示出了不同的二氧化矽納米顆粒結構的示意圖，這些示意圖分指密實核-殼納米顆粒(1A)、擴充核-殼納米顆粒(1B)、以及均質納米顆粒(1C)。密實核-殼結構和擴充核-殼結構的二氧化矽殼體含有二氧化矽，但不含有任何染料分子。均質納米顆粒含有存在於基質中的二氧化矽和染料的混合物。圖2A-C示出了納米顆粒和合成中間體的焚光相關光語(fluorescencecorrelationspectroscopy)。圖2D-F示出了900nm處，激發值為1.2mW時密實核-殼結構、擴充核-殼結構以及均質結構合成階段的亮度(計數(counts)/顆粒/秒)值。圖3示出了穩態光語曲線。該曲線顯示出通過核-殼結構所實現的量子效率提高。圖3A-C示出了密實核-殼納米顆粒的吸收光譜和螢光光鐠(3A)，擴充核-殼納米顆粒的吸收光譜和螢光光譜(3B)，以及均質納米顆粒的吸收光鐠和萸光光譜(3C)。吸光值以光密度單位計。螢光光譜相對使用的有機染料TRITC進行標度。圖3D-F示出了密實核-殼納米顆粒(3D)、擴充核-殼納米顆粒(3E)和均質顆粒(3F)的吸收光譜與激發光謙的比較。圖4示出了隨時間消減(time-resolved)的納米顆粒的螢光(曲線)。圖4A示出了均質納米顆粒、擴充核-殼納米顆粒、密實核-殼納米顆粒以及TRITC染料歸一化的螢光衰減。圖4B示出了擴充核-殼納米顆粒、密實核-殼納米顆粒、均質納米顆粒以及TRITC染料的螢光各向異性(fluorescenceanisotropy)。圖4C示出了圖4B所示的納米顆粒曲線歸一化後的螢光各向異性(曲線)。螢光壽命(Tf)和旋轉壽命(e)的平均擬合值列於表ni中。具體實施例方式本發明螢光納米顆粒包括，一個含有一種螢光矽烷化合物的核，和核上的二氧化矽殼體。所述納米顆粒的核可以包括，例如一種活性螢光化合物與一種共反應性(co-reactive)有機矽烷化合物的反應產物，所述殼體可包括，例如可形成二氧化矽化合物的反應產物。該可形成二氧化矽化合物可產生，例如一層或多層二氧化矽，所述層數如l到20層，以及各種需要的殼體特徵，例如殼層厚度、殼厚度與核厚度或直徑的比、核的二氧化矽殼體表面覆蓋率、二氧化矽殼體的孔隙度和承載能力，以及類似的特徵(considerations)。螢光單分散核-殼納米顆粒的合成基於以下兩步法。第一步，使有才幾染料分子異石克氰酸四曱基若丹明(tetramethylrhodamineisothiocynateTRITC)與二氧化珪前體結合，並縮合形成富含染料(dye-rich)的核。第二步，添加矽膠單體以在螢光核材料周圍形成較密的二氧化矽網狀物，以提供對光穩定性有害的溶劑相互作用的屏蔽作用。首先形成富含染料的核使得引入多種螢光團成為可能，所述螢光團覆蓋整個紫外-可見吸收光譜和發射光譜譜段。通過染料填築(dyeplacement)合成不同核-殼結構，即，密實核、擴充核以及均質核-殼結構的過程中，使用的反應物的量始終保持相同，以產生精確的結構性能相關性。但導致形成核-殼結構的反應物反應順序是變化的。因此，就對顆粒的光物理性質有重要影響的二氧化矽基質密度和有機部分(organicmoiety)而言，各種結構中染料分子周圍的化學環境是不同的。為了合成密實核-殼納米顆粒，將染料前體加入到裝有適量氨、水和溶劑的反應容器中，反應過夜。染料前體可在無水條件下，通過使TRITC和3-氨基丙基三乙氧基矽烷以摩爾比1:50加成反應合成。富含染料的密實核合成完成後，隨後加入原矽酸四乙酯(tetraethylorthosilcateTEOS)以生長包裹核的二氧化珪殼體。通過使TEOS和前述染料前體共縮合併使混合物反應過夜，合成擴充核-殼納米顆粒。擴充核合成完成後，加入額外的TEOS以生長包裹核的二氧化矽殼體。通過同時共縮合所有反應物，即，染料前體和TEOS，並使混合物反應過夜，合成均質納米顆粒。圖2A-C所示的FCS曲線和單指數型擬合曲線示出了各種結構在水溶液中的單分散條件(monodispersityrequirment)。FCS曲線還提供了兩個獨立參數擴散係數和絕對濃度。擴散係數與流體動力學半徑直接相關，而絕對濃度使得顆粒亮度得以量化。每種納米顆粒以及它們各自的中間體的FCS曲線在圖2A-C中示出。如圖2A所示，密實核-殼結構的核的擴散係數(D-O.098pm7ms)大約是游離TRITC染料擴散係數(D-O.21pm7ms)的一半。完整的納米顆粒大約大十倍，如圖2A所示(D=0.014|im2/ms)。在圖2B中，游離TRITC染料、擴充核-殼結構和完整顆粒之間顯示出了類似的關係。在擴充核-殼結構中，核的擴散係數為0.075|_imVms，與之相對的游離染料TRITC的擴散係數是D-0.21|xm7ms。對於均質納米顆粒而言，沒有中間體核結構，圖2C示出了均質納米顆粒相應於游離TRITC染料的擴散係數(D=0.015|im7ms)。圖2D-E示出了各種結構的亮度和合成中間體。對於使用核中間體進行的合成，儘管核中可能存在多種染料，可核(的亮度)總是比游離染料(的亮度)暗。但完整的納米顆粒的亮度總是明顯高於游離染料和/或核中間體。而且，亮度隨結構不同而改變，儘管這些結構的顆粒大小相同且前體材料的絕對量相同。本發明的螢光納米顆粒包括一種有機染料TRITC，它在發光性質方面表現出提高量子效率的效果。當用初級能源照射本發明的螢光納米顆粒時，發生相應於用於納米顆粒的有機染料的帶隙(bandgap)的頻率的能量次級發射。每顆粒TRITC等價物(equivalent)的數目可通過FCS曲線和吸光度測定值的結合予以確定。其中，絕對濃度由FCS曲線確定，相關的吸光度針對溶液中的TRITC進行測量，如圖3A-C所示。圖3A-C中使用稀釋溶液(大約50nM)，以便對一個樣品進行FCS和吸光度兩項內容的測量。每顆粒TRITC等價物的數目列於表n中，所述數目使用514.5nm處消光係數42，105M^cnfi計算得到。類似地，如表n所示，所述納米顆粒螢光相對強度和納米顆粒吸收的相對強度產生相對於游離TRITC的量子效率提高。對於密實核-殼和擴充核-殼納米顆粒，每顆粒TRITC等價物的數目在8.6時不易區分。然而，相對於游離TRITC染料，擴充核-殼納米顆粒顯示了三倍的量子效率的提高，但密實核-殼僅顯示了相對於游離TRITC染料的兩倍的量子效率的提高，如圖3A、B及表n所示。用均質納米顆粒得到了最大的量子效率提高，其每顆粒TRITC等價物平均為2.3，如圖3C和表n所示。經納米顆粒化學組成和結構對於光物理性質進行控制的能力，使得開發下一代螢光探針以及在溶液中難以進行的螢光性研究成為可能。顆粒的螢光壽命表示在圖4A中。每種顆粒的壽命，包括游離TRITC都是多指數類型的，所述平均壽命值列於表m中。TRITC的壽命(Tf-2.lns)與其在水中(測得)的文獻值良好吻合。所述壽命依密實核-殼(1.8ns)到擴充核-殼(2.9ns)到均質顆粒(3.2ns)的順序增加(圖4A)。密實核-殼的壽命比游離染料小，儘管對該壽命的主要貢獻來自快組分(fastcomponent)(圖4A)。僅由該壽命數據，可能認為染料在密實核-殼顆粒中淬滅，但穩態測量結果表明並非如此。螢光壽命和量子效率結合起來，使得可以對輻射率和非輻射率常數進行唯一確定，其以歸一化和絕對形式(absoluteform)列於表m中。在不同結構中，輻射率的提高是恆定的，其比游離TRITC大2.2倍。然而，在不同結構中，非輻射率可從密實核-殼納米顆粒的較高非輻射率數值，變化至幾乎為其三分之一的均質顆粒非輻射率值。顆粒的旋轉各向異性也顯示為複雜的、多指數的行為(圖4B、C)，目前，我們將本發明限定於平均旋轉時間常數(表ni，e)。如期望的，顆粒內部染料的旋轉被二氧化矽基質阻礙，導致其旋轉時間比游離染料更長(圖4B)。事實上，與香豆素對照品(請注意，此時也存在游離TRITC的一些殘留的各向異性)相比，所述各向異性曲線在測量的時標(timescale)上不衰減到零。但無論如何，即使在納米顆粒的緊密包裹的核內部，仍然存在顯著的旋轉遷移率(rotationmobility)，。如果旋轉的時標太快，會導致30nm納米的納米顆粒無法完成整體的旋轉，但太慢又會由於能量轉移形成去極化。而且，曲線(r(6))的振幅(amplitude)接近雙光子各向異性(r(0)=0.57)的理論振幅，表明不存在通常與能量遷移相聯繫的的快速去極化。因此，各向異性的衰減很可能是由於二氧化矽基質內染料分子的旋轉受阻。每種結構的有標度的各向異性曲線如圖4C所示。密實核-殼納米顆粒具有最快、阻礙最小的旋轉(圖4C)，其次是擴充核-殼顆粒(圖4C)，最後是均質納米顆粒(圖4C)。該旋轉時間與非輻射率常數單調負相關(表in)，表明在二氧化矽納米顆粒中受限的遷移率是造成非輻射衰減抑制的原因。納米顆粒合成原料無水乙醇(Aldrich)、四氬呔喃(Aldrich)、氨水(Fluka，28%)、四乙氧基矽烷(Aldrich,98%)、3-氨基丙基三乙氧基矽烷(Aldrich，99。/o)、3-巰基丙基三乙氧基矽烷(Gelest,99%)、四曱基若丹明-5-(和-6-)-異硫氰酸酯'混合異構體'(TRITC)(MolecularProbes,88%)、AlexaFluor488C5Meleimide(MolecularProbes,97%)、AlexaFlour488羧酸和琥珀醯亞胺酯(MolecularProbes,>50%)。核(螢光種子)納米顆粒的通用製備方法用量筒量取水、氨水和溶劑。在IL錐形瓶內進行螢光種子顆粒的合成，用TEFL0^塗敷的磁性攪拌棒(stirbar)以大約600rpm的速度攪拌。向乙醇中加入去離子水和氨水溶液並攪拌。將溶於含425微摩爾APTS的乙醇或THF中的2mL活性染料前體加入反應容器中。根據所需結構，將得到的混合物在室溫下攪拌l到12小時，攪拌時將反應容器用鋁箔覆蓋使曝光最小化，以獲得螢光種子顆粒混合物。在氮氣保護下將四氫呋喃(THF)和無水乙醇(Et0H)蒸出。然後，將有機染料從大約-2(TC的存儲溫度移入室溫，然後置於手套箱中。核(螢光種子)顆粒上二氧化矽殼體的通用製備方法二氧化矽殼包覆和生長步驟在上述螢光種子顆粒反應混合物中進行，向上述混合物中規則地加入溶劑，例如乙醇、曱醇或異丙醇，以防止在加入二氧化矽形成單體四乙氧基矽烷(TEOS)時溶液離子強度的劇烈變化。這一方法阻止了合成過程中的顆粒聚集，所述聚集會使顆粒尺寸分布變寬。螢光納米顆豐立的表徵得到的螢光納米顆粒的顆粒尺寸和顆粒尺寸分布通過電子顯微鏡(SEM)和螢光相干光譜(FCS)進行表徵。螢光相關光鐠所有FCS測量都使用基於雙光子激發的、定製的FCS顯微鏡進行。儀器由脈寬為100fs、重複頻率為80MHz的摻鈦藍寶石振蕩器組成，所述振蕩器由氬離子雷射器(SpectraPhysics,PaloAlto，CA)振動(p,ed)。光束用與ZeissAxiovert35反向顯微鏡耦合的Bio-RadMRC600共焦掃描盒(Hercules,CA)定位。用Zeiss63xC-Apochromat水浸物鏡(N.A.-1.2)聚焦激發光，並且收集發射也是通過相同的物鏡。螢光用雙色670DCLP從激發(光)中分離，並且通過HQ575/150發射濾光器到GaAsP光子計數PMT。得到的光電流與ALV6010多t自相關器數字自相關。自相關函數G(t)定義為其中F(t)是在延時t時的體積(volume)獲得的螢光值。括號表示系綜平均，且^F(r)^F(r)-。擬合函數是用於單組分、三維擴散的標準函數其中與w分別是雙光子焦點體積(two-photofocalvolume)橫向和軸向尺寸；N是焦點體積內擴散種類(species)數；D是擴散G(一2係數。所有FCS測量在900nm激發波長下進行。在此波長時，確定橫向尺寸為O.248微米，軸向尺寸為0.640微米。濃度標定由若丹明綠的標準樣品確定為1.43nM/顆粒(即N=1對應1.43nM)。光漂白-對於光漂白實驗，持續照亮在路徑長度為3mm的石英比色管(Starna)內的3(^L樣品。激發為來自功率為5W、光點大小為1.5cm的氬雷射器的514nm線雷射(laserline)。樣品製備為激發波長為514nm時具有相似的吸收度。通過HQ605/90發射濾光器，於垂直於激發的角度收集螢光，並且通過雙鹼(bialkali)PMT(HC125-02，Hamamatsu)記錄。以下實施例僅用於說明目的而非限制本發明。實施例1表I納米顆粒和納米顆粒核的流體動力學半徑formulaseeoriginaldocumentpage12在2lx:時計算得到的流體動力學半徑列於表i中。每種納米顆粒曲線與單一擴散係數擬合，並且流體動力學尺寸在測量誤差(r=15,17nm)範圍內相等。對於核中間體，擴充核(r=2.9nm)稍大於密實核(r=2.2nm)。實施例2formulaseeoriginaldocumentpage12自相關的振幅提供了擴散種類(species)數，並且平均計數率是從光學定義(opticallydefined)焦點體積收集的光子的度量。由此數據，可以得到各擴散種類的每分子計數率，其為探針亮度的直接度量。相對於游離染料的顆粒亮度的總提高值等於納米顆粒內TRITC等價物的數目與染料的相對量子效率提高值，即表n所示亮度因子的乘積。然而，考慮到對TRITC等價物測定的不確定性，有必要進行附加的、獨立的亮度度量以作比較，例如由FCS(表n，計數/顆粒)測得的每顆粒計數。亮度因子與由Fcs(表n，比較最後兩列)得到的獨立亮度值相似，且在兩種方法中，不同結構的亮度趨勢相同。亮度因子始終高估用FCS測得的值，可能是由於染料等價物確定中的誤差。總的來說，量子效率的提高可能是由於輻射率(t)的增加、非輻射率(t)的減小或由於兩種原因並存。這些因素的相對貢獻與螢光壽命)和量子效率(0)以下列關係相關實施例3表m二氧化矽納米顆粒的時間分辨參數tableseeoriginaldocumentpage13所有前述出版物、專利和專利文獻通過引用方式納入本申請，如同通過引用單獨納入本申請一樣。雖然通過引用多種具體和優選的實施方案和技術對本發明進行描述，但是，應該理解的是，可對其做多種變化和改進而仍處於本發明的主旨和範圍之內。權利要求1.一種螢光單分散納米顆粒，包括有機核和二氧化矽殼，其中核-殼的化學性質、組成及結構提供與游離染料和核相比增強的光物理性能。2.權利要求1的螢光單分散納米顆粒，其特徵在於，所述增強的光物理性能包括增強的亮度、螢光量子效率、光穩定性或其組合。3.權利要求1的螢光單分散納米顆粒，其特徵在於，所述核包括被二氧化矽殼體包裹的密實核。4.權利要求1的螢光單分散納米顆粒，其特徵在於，所述核包括被二氧化矽殼體包裹的擴充核。5.權利要求1的螢光單分散納米顆粒，其特徵在於，所述核包括被二氧化矽殼包裹的、染料稀疏地包埋其中的均質顆粒。6.權利要求5的螢光單分散納米顆粒，其特徵在於，所述均質顆粒不被二氧化矽殼包裹。7.權利要求1的螢光納米顆粒，其特徵在於，所述密實核具有小於2.5nm的半徑。8.權利要求1的螢光納米顆粒，其特徵在於，所述擴充核具有大於2.5nm的半徑。9.權利要求1的螢光納米顆粒，其特徵在於，所述核-殼化學性質、組成以及結構提供控制納米顆粒的光穩定性的能力。10.—種製備具有密實核結構的螢光單分散納米顆粒的方法，包括將一種螢光化合物和一種有機矽烷化合物混合製得染料前體；將得到的染料前體與水溶液混合製得密實螢光核；以及將得到的密實核與二氧化矽前體混合在密實核上製得二氧化矽殼體，以提供螢光單分散納米顆粒。11.一種製備具有擴充核結構的螢光單分散納米顆粒的方法，包括將一種螢光化合物和一種有機矽烷化合物混合製得染料前體；將得到的染料前體與二氧化矽前體共縮合製得擴充螢光核；以及將得到的擴充核與二氧化矽前體混合形成擴充核上的二氧化矽殼體，以提供螢光單分散納米顆粒。12.—種製備螢光單分散均質納米顆粒的方法，包括將一種螢光化合物和一種有機矽烷化合物混合製得染料前體；以及，將得到的染料前體與二氧化矽共縮合製得均質螢光單分散納米顆粒。13.權利要求12的方法，其特徵在於，得到的均質納米顆粒與二氧化矽共縮合在均質納米顆粒上形成二氧化矽殼體，以提供螢光單分散納米顆豐立。全文摘要本發明總體涉及螢光納米顆粒，更具體而言，涉及小於30nm的基於二氧化矽的螢光納米顆粒，該螢光納米顆粒具有共價連接的有機染料。本發明提供一種包括螢光團中心核和二氧化矽殼體的螢光單分散二氧化矽納米顆粒，其中納米顆粒的輻射性能取決於核的化學性質(組成)和二氧化矽殼體的存在。在本發明的一方面，核-殼結構使螢光量子效率得到了提高。本發明總體提供了對封裝在大小為30nm及30nm以下的二氧化矽顆粒內的染料分子的光物理性能的控制。該控制通過改變二氧化矽的化學性質和以納米尺度改變顆粒結構而實現，與游離染料相比導致亮度大大提高。文檔編號G01N33/50GK101387639SQ200810170588公開日2009年3月18日申請日期2003年11月26日優先權日2002年11月26日發明者D·R·拉森,H·奧,U·威斯納,W·W·韋布申請人:康乃爾研究基金會有限公司