可溶性脂連蛋白受體肽的檢測以及在診斷和治療中的用途的製作方法

2023-05-11 14:22:01

專利名稱：：可溶性脂連蛋白受體肽的檢測以及在診斷和治療中的用途的製作方法可溶性脂連蛋白受體肽的檢測以及在診斷和治療中的用途與相關申請的交叉參照本申請要求於2005年12月7日提交的美國臨時申請號60/748，305的利益。領域本發明涉及脂連蛋白受體的可溶性C-末端片段及其在病症的診斷和處理中的用途。
背景技術：
：帶有慢性炎症的肥胖具有巨大和增加的群體。這個群體明顯具有高心血管和糖尿病危險且經常發展具有胰島素抵抗的代謝症候群。近期已發現了脂連蛋白和其他脂肪因子(adipokines)作為控制葡萄糖代謝的脂肪細胞激素。脂肪細胞的類型和定位都很重要。肥胖產生將脂連蛋白分泌到血液內從而幫助肌細胞代謝脂肪和葡萄糖的另外脂肪細胞。某些超重患者變得胰島素抵抗。在這種情況下，脂肪細胞終止生產脂連蛋白。血液中的脂連蛋白水平在肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病的情況下減少。存在用於測量受試者中的脂連蛋白水平的方法以用於預測這些和其他疾病狀態。然而，脂連蛋白水平的測量已證明是弱疾病指示物。存在關於監控與異常脂肪細胞活性相關的疾病狀態的更佳方法的需要。本發明提供在這個和其他需要。概述本發明人已發現，脂連蛋白受體的C-末端片段是可溶的且可以在體液中檢測到。因此，本發明除了許多其他方面外提供了片段，檢測其的方法，使用其的方法和能夠與其結合的抗體。用於檢測得自受試者的生物流體樣品中脂連蛋白受體的斷裂的方法可以包括測定脂連蛋白受體的至少一種可溶性C-末端片段的存在或不存在的步驟。在某些實施方案中，測定生物樣品中C-末端片段的總5濃度。本文提供了用於檢測受試者中的脂連蛋白受體的表達水平的方法。這些方法可以包括測定生物流體樣品中脂連蛋白受體的至少一種c-末端片段的水平，和使c-末端片段的水平與脂連蛋白受體的表達水平關聯的步驟。在某些實施方案中，測定生物樣品中c-末端片段的總濃度。本文提供了用於檢測受試者中的脂連蛋白的表達水平的方法。這些方法可以包括測定生物流體樣品中脂連蛋白受體的至少一種c-末端片段的水平，和使c-末端片段的水平與脂連蛋白的表達水平關聯的步驟。在某些實施方案中，測定生物樣品中c-末端片段的總濃度。本發明包含了用於確定狀況的進展、狀況的發作即診斷、或治療的功效即個體對用特定藥物治療的應答性的方法。優選地，該狀況將是與脂連蛋白受體的異常斷裂模式相關的狀況。這些方法可以包括測定生物流體樣品中脂連蛋白受體的至少一種c-末端片段的水平，和使c-末端片段的水平與狀況的進展、狀況的發作、或治療的功效關聯的步驟。在某些實施方案中，測定生物樣品中c-末端片段的總濃度。在本發明的方法中，可以檢測脂連蛋白受體的一種或多種(即至少一種)可溶性C-末端片段。例如可以檢測AdipoRl和/或AdipoR2的片段1-22的任何組合。在某些實施方案中，可以檢測AdipoRl和/或AdipoR2的片段1-22並且通過其質量加以區別。因此，本發明提供了測定具有例如約1kDa-約3kDa的質量，包括例如約2kDa的質量(例如，由SEQIDNOS.3、12-22、25和34-44表示的片段)的片段，或具有約3.5kDa-約4.2kDa的質量，包括例如約3.9kDa的質量(例如，由SEQIDNOS.1、2、4-11、23、24和26-33表示的片段)的片段的水平的方法。這些大小的片段一般作為單體呈現。本發明還提供了檢測具有下述質量的片段的水平的方法，例如約2kDA-約6kDA的質量，包括例如約4kDa的質量，或約7kDa-約8.4kDa的質量，包括例如約7.8kDa的質量。這些大小的片段一般作為二聚體呈現。在本發明的方法中，當與載體蛋白質結合時，可以檢測脂連蛋白受體的一種或多種可溶性C-末端片l殳(例如，SEQIDNOS.1-44)。例如，當與載體蛋白質附著時，可以檢測AdipoRl和/或AdipoR2的片段l-22的任何組合。因此，在某些實施方案中，本發明提供了測定具有約4.5-6.9、7-8.2、9-11、13-15、17-19、27-29或30-34kDa的質量的片段的水平的方法。在某些實施方案中，載體蛋白質是脂連蛋白，包括脂連蛋白片段。在某些實施方案中，具有結合的脂連蛋白的組合脂連蛋白受體片段具有約3-5、4-8、7-11、13-17、22-26或28-32kDa的質量。本發明提供了檢測這些片段的方法。本發明還提供了與具有SEQIDNOs:1-44的序列的片段基本上等同的多肽和與這些片段對應的核酸序列。還包括了與本文提供的脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段特異性結合的抗體。本發明提供了用於確定具有本文所述任何病症的個體的治療策略的試劑盒，其包括用於檢測本文描述的至少一種片段的裝置；和任選地使用和試劑盒結果解釋的說明書。該試劑盒還可以包括例如用於從個體獲得生物樣品的裝置。舉例說明性實施方案的詳述I.前言本發明人已發現，脂連蛋白受體的C-末端片段是可溶的且可以在體液中檢測到。此外，本發明人已觀察到體液中脂連蛋白受體的某些可溶性片段的存在或不存在是疾病的預示，且體液中總可溶性脂連蛋白受體片段的水平即濃度是疾病的預示。應當理解本文描述的本發明不限於具體方法、試劑、化合物、組合物或生物系統，其當然可以改變。還應當理解本文使用的術語僅用於描述具體實施方案的目的，並且不意欲是限制性的。如說明書和附加權利要求中使用的，除非內容中另有明確說明，單數形式"一個(a)"、"一種(an)"和"該(the)"包括複數參照。因此，例如，提及"細胞，，包括2種或更多細胞的組合等。如本文所使用的，當提及可測量的值，如量、持續時間等時，術語"約，，意欲包含距離指定值±20%或±10%的變化，更優選地±5%，甚至更加優選地±1%,和再更優選地±0.1%，因為此類變化對於l丸行公開的方法是適當的。II.脂連蛋白受體及其片段脂連蛋白受體是首先由Yamauchi等人(Nature,2003,423(6941),762-9)描述的跨膜受體，並且具有幾種類型。已鑑定了3種脂連蛋白受體類型脂連蛋白受體1(也稱為AdipoRl)、脂連蛋白受體2(也稱為AdipoR2)和脂連蛋白受體3(也稱為AdipoR3)。脂連蛋白受體與脂連蛋白特異性結合且由其調節，所述脂連蛋白是在肌肉和肝的脂質和葡萄糖代謝中起重要作用的脂肪細胞衍生因子。人脂連蛋白受體1和2的核酸和胺基酸序列在公眾資料庫(例如，參見Genbank登記號NM—015999、AK222503、AK025085、AK222503、NM—024551、Q96A54和Q86V24)中可獲得並且在本文中提供。人脂連蛋白受體3的核酸和胺基酸序列在美國公開號20050032166中提供，所述專利整體引入本文作為參考。將理解如本文所使用的，術語脂連蛋白受體不僅包含具有本文描述的序列的脂連蛋白受體，還包括例如脂連蛋白受體的天然存在的截短形式、天然存在的變體形式(例如，可變剪接形式)、保守修飾的變體和天然存在的等位基因變體。"保守修飾的變體，，應用於胺基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，保守修飾的變體指編碼等同或基本上等同的胺基酸序列的那些核酸，或當核酸不編碼胺基酸序列時指基本上等同的序列。因為遺傳密碼的簡併性，大量功能上等同的核酸編碼任何給定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU全都編碼胺基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子指定的每個位置上，密碼子可以改變成所述的任何相應密碼子而不改變編碼的多肽。此種核酸變異是"沉默變異"，這是保守修飾的變異的一個種類。本文的編碼多肽的每個核酸序列還描述核酸的每個可能的沉默變異。技術人員將認識到核酸中的每個密碼子(除了AUG夕卜，其一般是用於甲疏氨酸的唯一密碼子，和除了TGG夕卜，其一般是用於色氨酸的唯一密碼子)可以進行修飾以產生功能上等同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每個沉默變異就表達產物而言，而不是就實際探針序列而言內含於每個所述序列。關於胺基酸序列，技術人員將認識到在編碼的序列中改變、添加或刪除單個胺基酸或小百分比胺基酸的針對核酸、肽、多肽或蛋白質序列的個別置換、缺失或添加是"保守修飾的變體"，當所述改變導致由化學上相似的胺基酸置換胺基酸時。提供功能上相似的胺基酸的保守置換表是本領域眾所周知的。此種保守修飾的變體是加上且不排除本發明的多態變體、物種間同源物和等位基因。下述8個組各自包含彼此為保守置換的胺基酸1)丙氨酸(A),甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D),穀氨酸(E);3)天冬醯胺(N),穀氨醯胺(Q);4)精氨酸(R)，賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I),亮氨酸(L),曱疏氨酸(M),纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y),色氨酸(W);7)絲氨酸(S),蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(參見，例如，Creighton,Proteins(1984))。特定核酸序列還暗示包含"剪接變體"。類似地，由核酸編碼的特定蛋白質暗示包含由那種核酸的剪接變體編碼的任何蛋白質。如名稱所暗示的，"剪接變體"是基因的可變剪接的產物。轉錄後，起始核酸轉錄物可以進行剪接，從而使得不同的(可變的)核酸剪接產物編碼不同多肽。用於生產剪接變體的機制可變化，但包括外顯子的可變剪接。應的任何產物，包括剪接產物-重組形式(括在這;定義中。'短語"脂連蛋白受體的可溶性C-末端片段，，指來自脂連蛋白受體的C末端的片段，所述片段從脂連蛋白受體脫落且在體液中是可溶的。多種體液可以用於實踐本發明的方法，包括例如血液、血清、血漿、尿、唾液、腹水等。脂連蛋白在本領域眾所周知的是作為由具有胰島素致敏、抗動脈粥樣硬化、和抗炎性質的脂肪細胞分泌的激素。脂連蛋白水平在某些狀況下減少，包括肥胖、胰島素抵抗和糖尿病。脂連蛋白的活性由其受體介導。脂連蛋白可以作為全長或作為較小的球狀片段存在。存在4個不同的脂連蛋白區域。第一個是使激素革巴向細胞外分泌的簡訊號序列，下一個是在物種間可變的小區域；第三個是與膠原蛋白質具有相似性的區域；且最後一個是球狀結構域。關於脂連蛋白預測的單體質量為26kDa，其範圍為約17-約33kDa。脂連蛋白的寡聚體形成依賴於由內部半胱氨酸殘基介導的二硫鍵形成。脂連蛋白在血漿中以廣泛範圍的多聚體複合物存在，並且經由其膠原結構域組合以產生3種主要寡聚形式低、中和高分子量形式。絲氨酸蛋白酶如彈性蛋白酶和胰蛋白酶具有用於切割脂連蛋白的多個位點。在約16kDa的平均分子量處的球狀脂連蛋白的釋放已知在患者中發生。其餘的非球狀脂連蛋白具有10kDA的平均分子量。經由胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶的脂連蛋白切割可以例如在胺基酸101處發生，從而導致產生16.5kDA的球狀脂連蛋白，或經由彈性蛋白酶(elestase)型絲氨酸蛋白酶在胺基酸108處切割從而導致產生15.8kDa的球狀脂連蛋白。在胺基酸88-108中存在多個潛在的切割位點，從而產生對於球狀脂連蛋白約17.8kDa-約9.7kDa的質量範圍。非球狀脂連蛋白的另外蛋白酶切割可以產生小至3kDa的片段。不希望被理論束縛，認為脂連蛋白受體的c-末端尾部用於捕獲全長脂連蛋白。結合被認為在脂連蛋白蛋白質的非球狀部分和脂連蛋白受體的脂連蛋白尾部結合結構域之間發生。在經由蛋白酶切割後，非球狀脂連蛋白被認為仍與脂連蛋白受體的c-末端區域結合。游離的球狀脂連蛋白被認為與受體上的另一個區域相互作用，以引起進一步的激活。在不存在非球狀脂連蛋白的情況下，認為不發生與c-末端的結合。本發明人已發現脂連蛋白受體的C-末端部分與受體斷開，並且存在於體液中。非球狀脂連蛋白的存在或水平可以影響脂連蛋白受體的c-末端的斷裂模式。本發明人已在體液中檢測到脂連蛋白受體1和2的片段。給定脂連蛋白受體是整合膜蛋白的事實，脂連蛋白受體可以在體液中檢測到且提供疾病狀態的可靠和實際指示物的觀察和結論是特別令人驚訝的。同樣令人驚訝的是某些片段傾向於在疾病中不存在，並且受體片段的總數目或濃度中的增加在疾病狀態中發生，已知脂連蛋白水平伴隨疾病減少。本發明尤其提供了AdipoRl的脂連蛋白受體片段1-22(SEQIDNOS:1-22)。AdipoRl的片段1具有34個胺基酸，對應於AdipoRl上的胺基酸361-375。胺基酸1-14是絲氨酸蛋白酶切割結構域；胺基酸15-22是adipoR2樣結構域；且胺基酸23-34是脂連蛋白結合結構域。AdipoRl的片|史1的序列是vlvvaaafvhfygvsnlqefrygleggctddtll(SEQIDNO:1)。這個片段可以在任何胺基酸處進一步斷裂，並且特別地在絲氨酸蛋白酶切割結構域、adipoRl樣結構域或脂連蛋白結合結構域內的任何胺基酸處。存在於體液中的某些關鍵片段是具有序列lvvaaafvhfygvsnlqefrygleggctddtll(SEQIDNO:2)的片段2和具有n、("ONGI03S)l，3S0，uyjj一SA3q、(.頂GI。3S),3So3g3兩jjsbiusA3iy、(:ONGI加S)I叩33so333!uyjjsbiusAgqjq、(乙￡:OMaiD3S)Pps3s。SSS!uijjjsbiusASiyq八、(i￡:OJMai63S)I叩33SoSS§!uijjj3bius八3iuqAj、(0￡:ONLai。3S)Pps3Sog§§，uijjj9biusAgiy物e、(6Z;:OMCIIC)3S)I，ssoSSS，j3bius八3qjq八jB3、(s乙OJSiaib3S)IBp33SoS33，uijjj3biusAgqjqAjB3e、(乙乙OMdlb3S)I，3S0gSS，j9biusAgqjqA，§BAA、(9乙OMdlt)3S)I，3so3S3!iujjpbiusA3qjhajb3baaj:貨^$土彼^"1丘$、<;百動'￡教^&9(H:OMdl03S)l叩3ssoSgg!uyjjsbius[《WJi《"T動'￡貨^&9(￡:ONaiD3S)I卩PppSS司SAjsbiusf《*gvsnlqefrfmigggcseedal(SEQIDNO:36)、vsnlqefrfmigggcseedal(SEQIDNO:37)、nlqefrfmigggcseedal(SEQIDNO:38)、lqefrfmigggcseedal(SEQIDNO:39)、qefrfmigggcseedal(SEQIDNO:40)、efrfmigggcseedal(SEQIDNO:41)、frfmigggcseedal(SEQIDNO:42)、rfmigggcseedal(SEQIDNO:43)和fmigggcseedal(SEQIDNO:44)。在某些情況下，體內存在的脂連蛋白受體並不具有如本文所描述的確切序列，而作為天然存在的變體形式存在。例如，脂連蛋白受體可以置換其至少最高達5%或甚至最高達10%的胺基酸，而不喪失功能。因此，SEQIDNOS.1-44中的至少2個胺基酸可以用其他胺基酸進行置換。因此，本發明不僅包含AdipoRl和AdipoR2的片段1-22,而且還包含與本文描述的片段具有相當大同一性的片段。相當大同一性在本文中描述為與片段具有約75%或80%或更大的同一性。因此，片段可以與SEQIDNOS1-44具有約80%、約81°/。、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%或約98%。同一性百分比可以通過在比較窗上比較2個最佳比對的序列來測定，其中對於2個序列的最佳比較，與參考序列(其不包含添加或刪除)相比較，比較窗中的多肽序列的部分可以包含添加或刪除(即，缺口)。百分比通過下述進行計算測定在其上相同的胺基酸殘基存在於2個序列中的位置數目，以產生匹配位置的數目，用匹配位置的數目除以比較窗中的位置總數目，並且將結果乘以100以產生序列同一性百分比。同一性使用本領域已知的各種序列比較算法和程序中的任何一種進行估計。此種算法和程序包括但決不限於，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFAS丁A、CLUSTALW、FASTDB,其7>開內容整體引入作為參考。Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444-2448,1988;Altschul等人，J.Mol.Biol.，215:403410，1990;Thompson等人，NucleicAcidsRes.，22:4673-4680，1994;Higgins等人，Meth.Enzymol.,266:383402,1996;Altschul等人，NatureGenetics,3:266-272,1993;Brutlag等人，Comp.App.Biosci.，6:237-24,1990。術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可互換地用於指胺基酸殘基的聚合物。該術語應用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。如本文所使用的，術語"多核苷酸"意指長度為至少約IO個鹼基或鹼基對的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型核苷酸的修飾形式，並且意欲包括單鏈和雙鏈形式的DNA。本文描述的脂連蛋白受體片段可以通過片段的c末端附近存在的半胱氨酸胺基酸(SEQIDNO:1和16中的第28位)二聚化。因此，這些片段可以作為二聚體存在於體液中。SEQIDNOS:1-44中存在的幾個胺基酸是用於翻譯後修飾的潛在位點。例如，存在於片段中的甘氨酸(SEQIDNO:l和23中的第26位)是潛在的N-豆蔻醯化位點，精氨酸(SEQIDNO:1和23中的第21位)是潛在的N-聚糖位點，且絲氨酸(SEQIDNO:1和23中的第15位)是潛在的O-聚糖位點。因此，由於翻譯後修飾，片段可以具有另外的質量。本發明的一個方面提供了本文描述的片段。因此，本發明提供了與SEQIDNOS:1-44具有相當大同一性的分離的片段。分離的片段是已從生物來源中進行純化或已通過重組或合成方法進行製備的那些。實現這點的方法是本領域眾所周知的並且因此在本文中未描述。本發明的另一個方面是在生物流體樣品中檢測本文描述的片段。本發明人已發現脂連蛋白受體-跨膜受體的片段可以在生物流體樣品中通過測定生物流體中受體的c-末端區域的存在進行檢測。還已發現組織中脂連蛋白受體的表達水平可以通過下述進行測定測定生物流體樣品中脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段的水平，並比較至少一種C-末端片段的水平與對照樣品中相同片段的水平。還已發現受試者中脂連蛋白的表達水平可以通過下述進行測定測定生物流體樣品中脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段的水平，並比較至少一種C-末端片段的水平與對照樣品中相同片段的水平。脂連蛋白受體的片段可以在患病和非患病個體的體液中發現。然而，脂連蛋白的存在或水平可以影響脂連蛋白受體的c-末端的斷裂模式。受試者中脂連蛋白的水平和類型也可以影響受試者中存在的脂連蛋白受體的水平。本發明人已發現在具有正常水平的全長脂連蛋白的正常受試者(即，非患病)中，在生物流體中發現較大的脂連蛋白受體片段，即長度為25-34個胺基酸的片段(即，SEQIDNOS:1、2、4-11、23、24和/或26-33)。這些片段一般是未結合的。這些較大片段中的許多在患有脂連蛋白相關疾病的受試者中不存在或以明顯更低的水平存在(即，片段在患病患者中以非患病患者中的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100或低於1/100的水平存在)。未結合的片段意指不與栽體蛋白質即脂連蛋白結合的片段。本發明人已發現在患病受試者中，在生物流體中發現較小的脂連蛋白片段，即長度為約13-24個胺基酸的片段(即，SEQIDNOS:3、12-22、25和/或34-44)。這些片段可以是結合或未結合的。這些片段也在正常受試者中發現，但一般與患病受試者中的水平不同(即，片段在患病患者中以非患病患者中的1.5x、2x、2.5x、4x、5x、6x、7x、8x、9x或10x的水平存在)。本發明人已發現在正常和患病受試者中，觀察到與脂連蛋白結合的c-末端脂連蛋白受體片段。這些結合的受體片段可以是較大或較小的片段。在許多情況下，這些片段與無論是部分斷裂還是全長的脂連蛋白的非球狀部分結合。結合的脂連蛋白受體片段的水平在具有疾病的受試者中增加。因此，未結合和結合片段以及較小和較大片段的存在和/或水平可以用於確定個體中脂連蛋白和脂連蛋白受體的表達水平以及個體中的疾病狀態。m.脂連蛋白受體的可溶性c-末端片段的檢測本發明提供了用於測定體液中脂連蛋白受體的至少一種可溶性c-末端片段的存在或不存在和/或測定其水平的方法。短語"測定水平，，意指檢測樣品中分析物的存在或不存在，或以相對或絕對條件定量其量。相對量可以是例如高、中或低。絕對量可以反映測量的信號強度，或這種信號強度轉變成另一種定量形式，例如微克/ml。c-末端片段可以通過任何合適的方法進行檢測。可以應用的檢測範例包括例如，光學方法、電化學方法(伏安法和電流分析法技術)、原子力顯微術、和射頻法，例如多極共振分光術。光學方法包括例如比色測定，電子阻抗分光術，螢光、發光、化學發光、吸光度、反射比、透射比和雙折射或折光指數的共焦和非共焦顯微鏡術檢測(例如，表面等離子體共振、橢圓對稱法、共振鏡法、光柵耦合器波導法或幹涉分析法)。在某些優選實施方案中，表達水平，包括脂連蛋白受體的至少一種可溶性c-末端片段的存在或不存在通過免疫測定進行測定。技術人員應認識到在其最廣泛的背景中，"免疫測定"包括使測試樣品與一種或多種對耙特異的免疫相互作用(immunointeractive)分子以足以與其結合且檢測所述結合的時間和條件溫育。如本文所使用的，術語"靶"指探針設計為與之結合的分析物。在某些優選實施方案中，免疫相互作用分子將是抗體。用於使抗體與測試樣品溫育的條件依賴於測定中使用的形式、應用的檢測法以及測定中使用的抗體分子的類型和性質而變。技術人員將認識到常用的免疫測定形式中的任何一種，例如放射免疫測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫比濁法(tubimetric)、免疫濁度測定法(immunonephrometric)、磁性免疫粒子分離、免疫層析、免疫微觀流體、免疫離心、基於擴散的Ouchterlony、火箭凝膠免疫電泳或原位免疫測定可以容易地適合於該目的。免疫測定用於定量測試樣品中脂連蛋白受體的至少一種可溶性C-末端片段，特別是與非患病個體中可檢測的正常水平相比較，確定至少一種可溶性C-末端片段的水平是否改變。因此，此種免疫測定在確定患者是否可能具有疾病或疾病素因中特別有用。免疫測定還可以具有其他用途，例如在監控疾病進展或監控針對治療幹預的應答中的用要所述免疫測定用於其性能的診斷測定。僅作為例子，在某些實施方案中，將針對片段產生的抗體固定化在固體基質上以形成第一複合物，並且使來自患者的生物測試樣品與結合分子接觸。合適的溫育時間段後，足以允許抗體-第二複合物形成的時間段，隨後添加用能夠產生可檢測信號的報導分子標記的笫二抗體，並進行溫育，允許第三複合物形成的充足時間。將任何未反應的材料洗掉，並且通過觀察由報導分子產生的信號測定第三複合物的存15在。結果可以是通過可見信號的簡單觀察定性的，或可以通過與包含已知量半抗原的對照樣品相比較進行定量。這種測定的變化包括其中將樣品和標記的抗體同時加入結合抗體中的同時測定，或其中首先將標記的抗體和待片企測的樣品組合、溫育且隨後同時加入結合抗體中的反向測定。這些技術是本領域技術人員眾所周知的，並且變化的可能性將是顯而易見的。如本說明書中使用的，"報導分子，，意指通過其化學性質產生經分析可鑑定的信號的分子，所述信號允許檢測抗原-結合的抗體。檢測可以是定性或定量的。這種類型的測定中最常用的報導分子是有色膠乳顆粒、金屬顆粒、酶、螢光團或包含放射性核素的分子(即放射性同位素)。固體基質一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、硝化纖維素、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持體可以是條、盒、管、珠、盤或微量培養板、或適合於進行免疫測定的任何其他表面的形式。結合方法是本領域眾所周知的，並且一般由分子與不溶性載體的交聯共價結合或物理吸附組成。多種免疫測定形式，包括例如竟爭和非竟爭免疫測定形式、抗原捕獲測定和雙抗體夾心測定可以在本發明的方法中使用(Self和Cook，C匿腸^c/mo/.7:60-65(1996))。在抗原捕獲測定中，抗體與固相結合，並且添加樣品，從而使得可溶性脂連蛋白受體C末端片段抗原由抗體結合。抗體可以對一種或兩種或更多種可溶性C末端片段特異。通過洗滌去除未結合的蛋白質後，如需要，結合抗原的量可以4吏用例i口方文射寸生效'J定(Harlow和Lane，^w"力otZ/es爿Z^6on^or_yA^mwa/ColdSpringHarborLaboratory:NewYork,1988))進4亍定量。免疫測定可以在抗體過量的條件下進行，或作為抗原竟爭，以定量抗原的量，並因此測定可溶性脂連蛋白受體C末端片段的水平。酶聯免疫吸附測定(ELISAs)可以用於本發明的某些方法中。在酶免疫測定的情況下，酶一般藉助於戊二醛或高碘酸鹽與等二抗體綴合。然而，如將容易理解的，存在對於本領域技術人員可容易獲得的廣泛多樣的不同綴合技術。常用的酶尤其包括，例如辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶、(3-半乳糖苦酶和鹼性磷酸酶。與特定酶一起使用的底物一般選擇用於在通過相應的酶水解後產生可檢測的顏色變化。還可能使用例如產生螢光產物的焚光底物。酶例如辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)、p-半乳糖苷酶或脲酶，可以例如與抗脂連蛋白受體C-末端片段或第二抗體連接，以在本發明的方法中使用。辣根過氧化物酶檢測系統可以例如與顯色底物四甲基聯苯胺(TMB)—起使用，所述TMB在過氧化氫的存在下產生在450nm處可糹全測的可溶產物。其他方便的酶聯繫統包括例如鹼性磷酸酶檢測系統，其可以例如與顯色底物磷酸對硝基苯酯一起使用，以產生在405nm處可容易檢測的可溶產物。類似地，p-半乳糖苷酶檢測系統可以與例如顯色底物鄰-硝基苯-P-D-吡喃半乳糖糖苷(ONPG)—起使用，以產生在410nm處可抬"測的可溶產物，或脲酶檢測系統可以與例如底物如尿素-溴甲酚紫(SigmaImmunochemicals,St.Louis,Mo.)—起4吏用。有用的酶聯第一抗體和第二抗體可以得自許多商業來源，例如JacksonImmuno-Research(WestGrove,Pa.)。在某些實施方案中，可溶性C-末端片段可以使用化學發光檢測進行檢測且測量。例如，在某些實施方案中，脂連蛋白受體C-末端片段特異性抗體用於捕獲生物樣品中存在的片段，並且對特異性抗體特異且用化學發光標記進行標記的抗體用於檢測樣品中存在的片段。任何化學發光標記和檢測系統都可以用於本方法中。化學發光第二抗體可以在商業上從各種來源如Amersham獲得。檢測化學發光第二抗體的方法是本領域已知的並且在本文中不詳細討論。螢光檢測也可以在本發明的某些方法中用於檢測脂連蛋白受體片段。有用的螢光染料包括例如DAPI、螢光素、鑭系元素金屬、Hoechst33258、R-藻藍蛋白、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、羅丹明、德克薩斯紅和麗絲胺。焚光素或羅丹明標記的a2-MG-、HA-、TIMP-l-或YKL-40-特異性結合劑例如抗-a2-MG、抗-HA、抗-TIMP-l或抗-YKL-40抗體，或螢光素或羅丹明標記的第二抗體可以在本發明中使用。有用的螢光4元體可以在商業上寸列長口/人TagoImmunologicals(Burlingame,Calif.)獲得，如下文進一步描迷的。螢光化合物可以與抗體進行化學偶聯，而不改變其結合能力。當通過用特定波長的光照射激活時，螢光染料標記的抗體吸附光能，從而誘導分子中的激發性狀態，隨後為用光學顯微鏡可視覺檢測的特徵性顏色處的光發射。放射免疫測定(RIAs)也可以在本發明的某些方法中使用。此種測定是本領域眾所周知的。放射免疫測定可以例如用1251標記的第一抗體或第二抗體(Harlow和Lane，同上，1988)來進行。來自可才企測試劑的信號可以使用下述進行分析，例如分光光度計以檢測來自顯色底物的顏色；輻射計數器以檢測輻射，例如y計數器用於檢測1251;或螢光計以檢測在某一波長的光的存在下的螢光。當使用酶聯測定時，可溶性脂連蛋白受體片段的量的定量分析可以使用分光光度計例如EMAXMicroplateReader(MolecularDevices;MenloPark,Calif.)依照製造商的說明書來進行。本發明的測定可以是自動化的或如需要自動地進行，並且來自多重樣品的信號可以同時進行檢測。本發明的方法還包含基於毛細管電泳的免疫測定(CEIA)的使用，如需要所述CEIA可以是自動化的。免疫測定還可以與雷射誘導的螢光糹吉合4吏用，i口侈寸^口Schmalzing和Nashabeh,^7e"ro/7/zo^^;y18:2184-93(1997),k乂及Bao,丄C/^omafogr.6.Szo附edSc/.699:463-80(1997)中描述的。脂質體免疫測定，例如流動注射脂質體免疫測定和脂質體免疫傳感器，也可以根據本發明的某些方法用於檢測可溶性C末端脂連蛋白片段，或測定C末端脂連蛋白片段的水平(Rongen等人，丄/www"o/.A/"/zo<^204:105-133(1997))。夾心酶免疫測定也可以在本發明的某些方法中使用。在雙抗體夾心測定中，第一種抗體與固體支持體結合，並且允許抗原與第一抗體結合。可溶性C末端脂連蛋白片段的量可以通過測量與之結合的笫二抗體的量進行定量。定量蛋白質印跡也可以在本發明的方法中用於測定可溶性C末端脂連蛋白片段的水平。蛋白質印跡法可以通過眾所周知的方法如光密度掃描法進行定量。例如，蛋白質樣品可以在10%SDS-PAGELaemmli凝膠上進行電泳。第一鼠單克隆抗體與印跡反應，並且使用預備狹線印跡實驗證實抗體結合是線性的。山羊抗小鼠辣根過氧化物酶偶聯的抗體(BioRad)用作第二抗體，且信號檢測使用化學發光來進行，例:i口寸吏用Renaissance4匕學發光^式劑盒(NewEnglandNuclear;Boston,Mass.)根據製造商的說明書。印跡的放射自顯影圖使用光密度掃描儀(MolecularDynamics;Sunnyvale,Calif.)進4亍分析，並且對於陽性對照進行標準化。值例如報告為實際值與陽性對照(光密度測定指數)之間的比。此種方法是本領域眾所周知的，如例如在Parra等人，Kosc.28:669-675(1998)中描述的。脂連蛋白受體片段的水平也可以使用蛋白質微陣列進行測定。產生可以適合於檢測臨床樣品中的蛋白質水平的蛋白質微陣列的方法在本領域中得到描述(參見例如Xiao等人(2005)MolCellEndocrinol.;230(1-2):95-10;ProteinMicroa呵s(2004)MarkSchena(Ed)Jones&BartlettPublishers,Inc.)。美國專利公開2003/0153013描述了檢測蛋白質例如抗原或抗體的方法，其通過使抗體固定化在膜上的蛋白質微陣列中並且使微陣列與檢測蛋白質接觸，所述檢測蛋白質可以與蛋白質結合以形成蛋白質複合物。類似地，美國專利公開2004/0038428描述了構建蛋白質微陣列的方法。在某些優選實施方案中，樣品藉助於生物晶片進行分析。生物晶片一般包含固體基質，且具有捕獲試劑(也稱為吸附劑或親和試劑)與之附著的一般平面性表面。通常，生物晶片的表面包含多個可尋址位置，所述位置各自具有在其上結合的捕獲試劑。蛋白質生物晶片是適合於捕獲肽的生物晶片。許多蛋白質生物晶片在本領域中得到描述。這些包括例如由CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont,CA)、PackardBioscienceCompany(MeridenCT)、Zyomyx(Hayward,CA)、Phylos(Lexington,MA)和Biacore(Uppsala,瑞典)生產的蛋白質生物晶片。此種蛋白質生物晶片的例子在下述專利和公開的專利申請中得到描述美國專利號6,225,047;PCT國際公開號WO99/51773;美國專利號6,329,209,PCT國際公開號WO00/56934和美國專利號5,242,828，所述專利整體且為了所有目的引入本文作為參考。對於本文的用途，測定方法可以包括在固體基質上捕獲C-末端脂連蛋白受體片段。一般地它們將使用生物特異性捕獲試劑如抗體，且特別是免疫測定中使用的抗體進行捕獲。生物特異性捕獲試劑包括以例如至少10^M、1(T1M、lO"1M或l(T12M的親和力與粑分析物結合的那些分子。這些分子還可以用非特異性方法如層析材料進行捕獲。在本發明的某些實施方案中，脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段將通過質i普法進行檢測。質鐠儀的例子是飛行時間、扇形磁場、四極濾器、離子阱、離子迴旋共振、扇形靜電分析儀(electrostaticsectoranalyzer)及其混合。用於在本發明中使用的優選質譜技術是"表面增強雷射解吸和電離"或"SELDI"，如例如給予Hutchens和Yip的美國專利號5,719,060和6,225,047中描述的，所述專利各自整體且為了所有目的引入本文作為參考。這指解吸/電離氣相離子光謙測定法的方法(例如，雷射解吸/電離質譜法)，其中分析物捕獲在SELDI探針的表面上，所述SELDI探針接合質鐠儀的探針界面。一種形式的SELDI稱為"親和質鐠法"。這種形式涉及包含吸收劑表面的探針("親和質譜法探針")的使用。在這個背景中，"探針"指適合於接合探針界面且將分析物呈遞給電離能用於電離和引入質譜儀內的裝置。探針一般包括柔性或剛性的固體基質，其具有樣品呈遞表面，在所述表面上將分析物呈遞給電離能源。另一種形式的SELDI是表面增強淨解吸("SEND"),其涉及包含與探針表面附著的能量吸收分子的探針("SEND探針")的使用。短語"能量吸收分子，，(EAM)表示能夠從雷射解吸/電離源吸收能量，且其後促進與之接觸的分析物分子的解吸和電離的分子。EAM類別包括在MALDI中使用的分子，通常稱為"基體"，且由肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基-羥基肉桂酸(CHCA)和二羥基苯甲酸、阿魏酸和羥苯乙酮衍生物例示。在某些實施方案中，將能量吸收分子摻入線性或交聯聚合物內，例如聚甲基丙烯酸酯。例如，組合物可以是a-氰基-4-甲基丙烯醯氧肉桂酸和丙烯酸酯的共聚物。在另一個實施方案中，組合物是a-氰基-4-曱基丙烯醯氧肉桂酸、丙烯酸酯和曱基丙烯酸3-(三乙氧基)曱矽烷基丙酯的共聚物。在另一個實施方案中，組合物是a-氰基_4-曱基丙烯醯氧肉桂酸和十八基曱基丙烯酸酯的共聚物("C18SEND")。SEND在美國專利號6,124,137中進一步描述，所述專利整體且為了所有目的引入本文作為參考。"選擇性表面，，可以用於捕獲用於SELDI分析的片段。選擇性表面具有與表面附著的"吸附劑"，也稱為"結合部分"或"捕獲試劑"。"吸附劑"或"捕獲試劑，，或"結合部分，，可以是能夠結合分析物的任何材料。捕獲試劑可以直接與選擇性表面的基質附著，或基質可以是攜帶"反應部分"的"反應表面"，所述"反應部分"能夠與捕獲試劑結合，例如，通過20形成共價或配位共價鍵的反應。環氧化物和碳二咪唑是有用的反應部分，以共價結合多肽捕獲試劑例如抗體或細胞受體。次氮基乙酸和亞氨基二乙酸是有用的反應部分，其充當螯合劑以結合與包含組氨酸的肽非共價相互作用的金屬離子。在某些實施方案中，用於捕獲c-末端脂連蛋白受體片段的吸附劑包含生物特異性捕獲試劑。"生物特異性吸附劑，，指以至少IO力M、10-10m、ltr"m或lcr"m的親和力與分析物結合的吸附劑。優選的生物特異性捕獲試劑是抗體或其結合片段。這包括完整的免疫球蛋白以及本領域眾所周知的其變體和部分，例如Fab'片段、F(ab)，2片段和scFvTeknikringen30,floor6，Box70004,StockholmSE國10044,Sweden,美國專利號5,831，012;還參見SurfaceLogix，Inc.,50SoldiersFieldPlace,Brighton,MA02135和Hodneland,C.D等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.99:5048-5052)。本發明的片段可以捕獲在層析吸附劑上。"層析吸附劑，，指一般在層析中使用的吸附劑材料。層析吸附劑包括例如硝酸纖維素膜、離子交換材料、金屬螯合劑(例如次氮基乙酸或亞氨基二乙酸)、固定化金屬螯合物、疏水作用吸附劑、親水作用吸附劑、染料、簡單生物分子(例如，核苷酸、胺基酸、單糖和脂肪酸)和混合模式吸附劑(例如疏水性吸引/靜電排斥吸附劑)。在某些實施方案中，使具有吸附劑的基質與樣品例如患者血清接觸足以允許可能存在的靶分析物與吸附劑結合的時間段。溫育時間段後，洗滌基質以去除未結合的材料。可以使用任何合適的洗滌溶液；優選地，使用水溶液。分子保持結合的程度可以通過調整洗滌的嚴格性進行處理。洗滌溶液的洗脫特徵可以取決於例如pH、離子強度、疏水性、離液(chaotropism)程度、去汙劑強度和溫度。除非探針具有SEAC和SEND性質，隨後將能量吸收分子應用於具有結合的靶分析物的基質。與底物結合的生物分子可以在氣相離子分光計例如飛行時間質譜儀中進行檢測。耙分析物可以通過電離源如雷射進行電離，產生的離子通過離子光學裝置進行收集，並且隨後質量分析器分散且分析經過的離子。檢測器隨後將檢測到的離子的信息轉變成質荷比。耙分析物的檢測一般將包括信號強度的檢測。因此，可以測定粑分析物的數量和質量。在另一種質譜法中，靶分析物可以首先捕獲在具有層析性質的層析樹脂上，所述層析樹脂與靶分析物例如一種或多種抗體結合。在這個例子中，這可以包括免疫層析樹脂，其包含結合c-末端脂連蛋白受體片段的抗體。未結合的材料可以從樹脂洗掉。隨後靶分析物可以從樹脂洗脫。最後，洗脫的耙分析物可以通過MALDI或通過SELDI進行檢測。通過飛行時間質譜法分析分析物產生飛行時間譜。最終分析的飛行時間譜一般不表示針對樣品來自電離能的單脈衝的信號，而表示來自多次脈沖的信號總和。這減少了噪聲且增加了動態範圍。隨後對這種飛行時間數據實施數據處理。計算機進行分析。計算才l程y^分析數據以指:檢測到的J白質的數目:以及任選地信號強度和對於檢測到的每種耙分析物確定的分子量。數據分析可以包括確定靶分析物的信號強度且去除偏離預定統計學分布的數據的步驟。例如，觀察到的峰可以通過計算每個峰相對於某些參考的高度進行標準化。參考可以是由儀器和在等級中設定為零的化學藥品如能量吸收分子產生的背景噪聲。分析一般涉及鑑定表示來自分析物的信號的譜中的峰。峰選擇可以視覺上進行，但可以自動檢測峰的軟體是可獲得的。一般而言，這種軟體通過鑑定具有超過所選閾值的信噪比的信號且標記在峰信號的質心處峰的質量來起作用。在一種有用的應用中，比較許多質譜以筌定質譜的某些選擇百分比中存在的相同峰。這種軟體的一個版本使限定質量範圍內各種譜中出現的所有峰成簇，並對接近質量(M/Z)簇的中點的所有峰指定質量(M/Z)。用於分析數據的軟體可以包括將算法應用於信號分析的代碼，以確定信號是否表示對應於根據本發明的靶分析物的信號中的峰。該軟體還可以將關於觀察到的耙分析物峰的數據提交給分類樹或ANN分析，以確定是否存在指示心血管疾病狀態的耙分析物峰或耙分析物峰的組合。數據的分析可以"適合於"從樣品的質譜分析中直接或間接獲得的多種參數。這些參數包括但不限於，一個或多個峰的存在或不存在、峰或峰組的形狀、一個或多個峰的高度、一個或多個峰的高度的對數、和峰高度數據的其他算術操作。IV.抗體本發明進一步提供了與脂連蛋白受體的c-末端片段特異性結合的抗體。製備對選擇肽具有結合特異性的抗體的方法是本領域眾所周知的。例如，此種抗體可以通過下述進行選擇用靶分子免疫動物、產生抗體、且測試抗體以鑑定特定抗體是否與靶分子結合。可以選擇與耙分子結合的抗體。例如，人們可以產生針對這些分子的單克隆抗體。短語"特異性結合"指在其他生物製品的異質群體的存在下決定靶的存在的結合反應。因此，在指定的測定條件下，特異性結合區域優先與特定靶結合，並且不以顯著的量與測試樣品中存在的其他組分結合。在此種條件下與耙特異性結合可以要求就其對於特定靶的特異性選擇的結合部分。多種測定形式可以用於選擇與特定分析物特異性反應的結合區域。一般地特異性或選擇性反應將是至少是背景信號或噪聲的2倍並且更一般地為背景的超過10倍。術語"抗體"以最廣泛的含義使用並且特別地包含單克隆抗體，多克隆抗體，具有多表位特異性的抗體組合物，雙特異性抗體，雙抗體，嵌合、單鏈和人源化抗體，以及抗體片段(例如，Fab、F(ab，)2和Fv),只要它們顯示所需生物活性。抗體可以進行標記以用於在生物測定(例如，放射性同位素標記、螢光標記)中使用以幫助抗體的檢測。抗體可以進行標記/與報導分子綴合以用於在生物測定(例如，放射性同位素標記、焚光標記)中使用，以幫助檢測本文描述的片段。如本文所使用的，術語"單克隆抗體"指得自基本上同質的抗體群體的抗體，即構成群體的個別抗體是相同的，除了可以以較少量存在的可能天然存在的突變外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原部位。此外，與一般包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製劑形成對照，每種單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了其特異性外，單克隆抗體是有利的，因為它們通過雜交瘤培養進行合成，未被其他免疫球蛋白汙染。修飾語"單克隆"指示抗體的特徵為得自基本上同質的抗體群體，並且不應被解釋為需要通過任何具體方法生產抗體。例如，依照本發明使用的單克隆抗體可以通過首先由Kohler等人，A^w^，256:495,1975描述的雜交瘤法進行製備，或可以通過重組DNA法(參見，例如，美國專利號4,816,567,Cabilly，等人)進行製備。"單克隆抗體"還可以由噬菌體抗體文庫進行分離，其中使用例如Clackson等人，624-628,1991;Marks等人,Mo/.編.,222:581-597,1991中描述的技術。本文的單克隆抗體特別地包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重和/或輕鏈的部分與衍生自特定物種或者屬於特定抗體種類或亞類的抗體中的相應序列等同或同源，而一條或多條鏈的其餘部分與衍生自另一個物種或者屬於另一個抗體種類或亞類的抗體中的相應序列等同或同源，以及此種抗體的片段，只要它們顯示所需生物活性(Cabilly等人，同上；Morrison等人，A^/.Jca丄KS.A,81:6851-6855,1984)。單克隆抗體可以通過本領域技術人員熟悉的各種技術來獲得。簡言之，來自用所需抗原免疫的動物的脾細胞通常通過與骨髓瘤細胞融合進行無限增殖化(參見，Kohler等人，五w丄/mm柳o/.,6:511-519,1976)。無限增殖化的可替代方法包括用EB病毒、癌基因或逆轉錄病毒、或本領域眾所周知的其他方法轉化。起於單一無限增殖化細胞由此:細胞生產^單克隆抗體的得^可以通過各種技術得到增強:包括注射入脊推動物宿主的腹膜腔內。可替代地，根據由Huse等人，Sc/wce,246:1275-1281,1989概述的一般規程，人們通過篩選來自人B細胞的DNA文庫，可以分離編碼單克隆抗體或其結合片段的DNA序列。可以收集單克隆抗體和多克隆血清且針對免疫測定中的免疫原蛋白質進行滴定，例如具有固定化在固體支持體上的免疫原的固相免疫測定。一般地，具有104或更大的滴度的多克隆抗血清可以就其針對使用竟爭性結合免疫測定的交叉反應性進行選擇和測試。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體通常將以至少約0.1mM的Kd結合，更通常地至少約1pM，優選地至少約0.1)^M或更佳，且最優選地0.01pM或更佳。"人源化"形式的非人(例如，鼠)抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab，、F(ab，)2或抗體的其他抗原結合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最低限度的序列。在極大程度上，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(CDR)的殘基由來自具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體受體)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基替換。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架區(FR)殘基由相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體和輸入CDR或構架序列中都未發現的殘基。進行這些修飾以進一步精製和最優化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、和一般地2個可變結構域中的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR區對應於非人免疫球蛋白的那些，且全部或基本上全部FR區是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體最佳地還將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少部分，一般地人免疫球蛋白的那種。關於進一步的細節，參見Jones等人，A^,we,321:522-525,1986;Reichmann等人，iVWwM,332:323-329,1988;Presta,Cwr.Qp.S/o/.,2:593-596,1992。人源化抗體包才舌PrimatizedTM抗體，其中抗體的抗原結合區書t生自通過用目的抗原免疫獼猴產生的抗體。包含本文描述的片段的部分的許多免疫原可以用於生產與片段特異性反應的抗體。例如，本發明的片段可以使用本領域已知的技術進行分離。重組蛋白質可以如上所述在真核或原核細胞中進行表達，並如上文一般描述的進行純化。重組蛋白質是用於生產單克隆或多克隆抗體的優選免疫原。可替代地，衍生自本文公開的序列且與載體蛋白質綴合的合成肽可以用作免疫原。天然存在的蛋白質也可以以純或不純的形式使用。隨後將產物注射入能夠生產抗體的動物內。可以產生單克隆或多克隆抗體，用於隨後在免疫測定中用於測量蛋白質。多克隆抗體的生產方法是本領域技術人員已知的。近交品系小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔用蛋白質進行免疫，其中使用標準佐劑例如弗氏佐劑和標準免疫規程。動物針對免疫原製劑的免疫應答通過獲取測試放血且測定對於p亞單位的反應性的滴度進行監控。當獲得針對免疫原的適當高滴度的抗體時，從動物中收集血液且製備抗血清。如需要，可以進行抗血清的進一步分級分離以富集對蛋白質反應的抗體(參見，Harlow&Lane,同上)。在進一步的實施方案中，抗體或抗體片^:可以從抗體噬菌體文庫進行分離，所述抗體噬菌體文庫使用McCafferty等人，？Va^"，348:552-554，1990;Clackson等人，7Wm^e,352:624-628，1991;Marks等人，丄Mo/.Ao/.，222:581-597,1991中描述的技術產生，所述參考文獻分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。隨後的出版物描述了通過鏈改組(Mark等人，Ao/7fec/mo/ogy,10:779-783,1992),以及組合感染和體內重組作為用於構建非常大噬菌體文庫的策略(Waterhouse等人，iVwc.」c,'A."仏，21:2265-2266,1993)來生產高親和力的(nM範圍)人抗體。因此，這些技術是用於分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行替代技術。在某些實施方案中，選擇抗體以區別C-末端脂連蛋白受體的一種片段與另一種，即選擇在相同測定條件下與一種形式但不與另一種特異性結合的抗體。因此，本發明提供了與具有SEQIDNO:l的脂連蛋白受體片段的表位特異性結合的抗體。在某些實施方案中，抗體將與脂連蛋白結合結構域外的SEQIDNO:l的區域特異性結合，即，抗體將與SEQIDNO:1的殘基1-22內的表位特異性結合。在某些實施方案中，抗體將與SEQIDNO:1的殘基1-14、2-14、2-14、3-14、4-14、5—14、6—14、7-14、8—14、9-14、10-14、14—22內，或殘基23-34內的表位特異性結合。在某些實施方案中，抗體將與SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22之一上存在的表位結合。在某些實施方案中，抗體將與脂連蛋白結合結構域外的SEQIDNO:1-12的區域特異性結合。本發明還提供了與具有SEQIDNO:23的脂連蛋白受體片段的表位特異性結合的抗體。在某些實施方案中，抗體將與脂連蛋白結合結構域外的SEQIDNO:23的區域特異性結合，即，抗體將與SEQIDNO:23的殘基1-22內的表位特異性結合。在某些實施方案中，抗體將與SEQIDNO:23的殘基1—14、2—14、2-14、3—14、4—14、5-14、6—14、7-14、8—14、9—14、10-14、14一22內，或23—34殘基內的表位特異性結合。在某些實施方案中，抗體將與SEQIDNO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44之一上存在的表位結合。在某些實施方案中，抗體將與脂連蛋白結合結構域外的SEQIDNO:23-44的區域特異性結合。V脂連蛋白受體片段與疾病狀態的關聯對於本文描迷的某些方法，至少一種可溶性脂連蛋白受體片段的水平在需要診斷或預後信息的不同患者樣品中進行測定以提供概況。特定樣品的概況基本上是樣品的狀態的"指紋，，。正常狀態可以區別於疾病狀態，且在疾病狀態內，可以確定不同的預後狀態(例如，好或差的長期存活期望)。診斷可以通過比較患者樣品與已知概況來進行或證實。通過評價在疾病進展期間不同時間的可溶性脂連蛋白受體片段的進展，可以確定疾病狀態以及可能的預後。診斷測試的原則是操作結果與特定臨床參數的關聯。該關聯必然涉及由臨床參數區別的2個或更多組之間的比較。臨床參數可以是例如疾病的存在或不存在、疾病危險、疾病病期、疾病嚴重性、疾病類別或對疾病治療的應答。因此，診斷醫生使用這種關聯以就臨床參數而言定性受試者的狀態。即，診斷醫生使用關於受試者的操作結果以就臨床參數而言分類或診斷受試者狀態，診斷/分類的可信度與測試中使用的病徵或症狀的分類或分離能力相關。本文描述的用於定性或定量可溶性脂連蛋白受體片段的方法提供了尤其可以與病理狀況、疾病素因、治療監控、危險分層相關的信息。本發明方法對於診斷狀況、評估某些藥物是否將具有所需作用和確定預後特別有用。本發明方法可以用於疾病的早期檢測以及用於治療規程的最優化。優選地狀況即疾病狀態將是與脂連蛋白受體的異常斷裂模式相關的狀況。對於本文的用途，"診斷狀況"指確定受試者是否具有患指定狀況的增加的可能性。用於診斷狀況的測試，例如本文描述的測定，在某些情況下可能不能獨立地診斷狀況，而是與其他測試組合用於診斷狀況。因此，"診斷狀況"意欲包括同樣幫助狀況診斷的任何方法。在某些實施方案中，本發明提供了用於監控患者中疾病狀態的進展的方法。該方法一般包括下述步驟提供來自患者的第一種生物樣品，優選地尿、血漿、血清和/或全血樣品，測量在第一個時間點上第一種生物樣品中的至少一種可溶性脂連蛋白受體片段，提供來自患者的第二種生物樣品，測量在第二個時間點上第二種生物樣品中的可溶性受體片段，以及基於脂連蛋白受體片段的量中的改變或基於與來自對照群體的測量的比較，確定患者中疾病狀態的進展。通過測量患者樣品中隨著時間過去的可溶性受體片段，臨床醫生將能夠確定疾病狀態是惡化還是改善。臨床醫生因此可以利用這些測量用於適當地修改治療。包括確定至少一種可溶性C-末端片段的水平的用於監控疾病狀態的進展的方法可以與其他測試組合以監控疾病狀態的進展。本發明人已發現具有脂肪細胞失調的受試者在血液中具有與正常受試者不同模式的脂連蛋白受體片段。本發明因此提供了確定受試者是否具有脂肪細胞失調的方法，其通過確定來自受試者的體液樣品中至少一種脂連蛋白受體片段的水平來實現。例如，為了確定受試者是否具有脂肪細胞失調，可以測定本文描述的片段的水平。在某些實施方案中，不存在或存在僅僅非常低水平的某些片段，即長度為25-34個胺基酸(即，SEQIDNOS:1、2、4-11、23、24和26-33)且一般未結合的片段，將指示具有脂肪細胞失調的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常的脂肪細胞平衡。在某些實施方案中，某些較小片段，即長度為13-24個胺基酸的未結合的片段(即，SEQIDNOS:3、12-22、25和34-44)的增加量的存在，將指示具有脂肪細胞失調的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常的脂肪細胞平衡。脂連蛋白受體片段的增加的總水平的存在，即脂連蛋白受體片段的總濃度將指示具有脂肪細胞失調的各自可能性。隨著脂連蛋白的血液水平降低，具有疾病的患者的百分比增加。在具有小於約4.0pg/mL的脂連蛋白的血液水平的患者中，診斷具有代謝症候群的患者的數目顯著增加，並且關於冠狀動脈疾病的危險同樣增加。例如，與具有超過4.0pg/mL的脂連蛋白的血液水平的受試者比較，具有小於或等於約4.0ng/mL的脂連蛋白的血液水平的受試者具有冠狀動脈疾病的機率增加(優勢比(oddsratio)對於男性和女性為大於3.0,或在男性中大於1.7和在女性中大於10)。術語脂連蛋28白指測量的總脂連蛋白，包括全長、球狀和非球狀部分的單體以及脂連蛋白的寡聚體。閾值可以對於能夠測量個別形式的具體測定進行調整。通過測量在不同時間點上得自受試者的生物流體樣品中這些片段的水平，可以確定脂肪細胞失調是改善還是惡化。類似地，通過測量治療幹預之前和之後這些片段的水平，可以確定治療是否有效。脂連蛋白是牽涉於許多疾病狀態的脂肪細胞，包括例如肥胖、胰島素抵抗、II型糖尿病、代謝症候群、血脂異常、心血管疾病和高血壓。對於本文的用途，與正常受試者比較，具有低脂連蛋白血症(hypoadiponectinemia)的受試者具有減少的血漿脂連蛋白濃度。具有低脂連蛋白血症的受試者可以使用本發明方法進行鑑定。本發明方法可以用於確定受試者中低脂連蛋白血症的發作、低脂連蛋白血症的進展和/或低脂連蛋白血症的治療功效。類似地，本發明方法可以用於確定受試者中特徵在於低脂連蛋白血症的狀況的發作、特徵在於低脂連蛋白血症的狀況的進展、和/或特徵在於低脂連蛋白血症的狀況的治療功效。例如，為了確定受試者是否具有低脂連蛋白血症，人們可以測定本文描述的片段的水平。在某些實施方案中，不存在或存在增加水平的某些片段，即長度為約13-24個胺基酸的一般未結合的片段(即，SEQIDNOS:3、12-22、25和/或34-44)，將指示具有低脂連蛋白血症的可能性增加。在某些實施方案中，某些較大片段，即長度為25-34個胺基酸的一般未結合的片段(即，SEQIDNOS:1、2、4-11、23、24和/或26-33)的減少量的存在，將指示具有低脂連蛋白血症的可能性增加。與載體蛋白質即脂連蛋白未結合或結合的總脂連蛋白受體片段的增加水平的存在，通常將指示具有低脂連蛋白血症的各自可能性。通過測量在不同時間點上取自受試者的生物流體樣品中這些片段的水平，可以確定低脂連蛋白血症是改善還是惡化。類似地，通過測量治療幹預之前和之後這些片段的水平，可以確定治療是否有效。當胰島素引起脂肪細胞生產脂連蛋白時，導致正常胰島素敏感性。全長脂連蛋白聚集成多聚體，一般稱為LMW、MMW和HMW形式。脂連蛋白在肝中與脂連蛋白受體2且在肌肉中與脂連蛋白受體1相互作用，以終止葡萄糖生產且引起糖酵解和脂肪酸氧化。脂連蛋白受體l與稱為球狀脂連蛋白的脂連蛋白的切割形式反應，而脂連蛋白受體2與全長脂連蛋白反應。球狀脂連蛋白最近由其他人顯示通過血液彈性蛋白酶作用而形成。當脂肪細胞變成肥大且響應胰島素生產較少的脂連蛋白時，胰島素抵抗發生。在這種狀態下，細胞變得更多細胞凋亡，並且細胞分裂減慢。因此血漿脂連蛋白水平下降。胰島素水平在引起細胞釋放更多的脂連蛋白的努力中上升。然而，隨著胰島素抵抗惡化，產生更多的胰島素和更少的脂連蛋白。更少的脂連蛋白導致肌肉中更少的糖酵解和脂肪酸氧化且阻止肝葡萄糖生產終止。對於本文的用途，胰島素抵抗指個體中的體內胰島素的生物作用的減少，如通過來自血流的葡萄糖處置率評估的(例如，進入胰島素敏感組織內，例如肌肉、脂肪和肝)。糖尿病被定義為由於有缺陷的胰島素分泌和/或作用的慢性高血糖症。該疾病的2個主要分類是涉及通常經由自身免疫過程的胰(3細胞破壞的i型，和胰島素受損的生理學效力即胰島素抵抗的ii型。糖尿病通常首先經由高血糖症的證實進行診斷，其通過使用隨機或空腹血糖測定實現，或經由經口葡萄糖耐量測試進行診斷。葡萄糖耐量測試不測量胰島素抵抗。一旦糖尿病被診斷，關於胰島素和C-肽的測定就可以用於區別i型和n型糖尿病，並且在ii型糖尿病中，用於區別需要胰島素治療的那些與可以用飲食改變和鍛鍊模式進行處理的那些。區別需要胰島素治療的那些與可以用飲食改變和鍛鍊模式進行處理的可疑病例是困難的。胰島素是由胰|3細胞釋放的多肽激素，以通過促進葡萄糖的細胞攝取和抑制內源性葡萄糖而減少血糖水平。胰島素的直接前體是胰島素原(MW，9kDa)，由具有3個二硫鍵的86個胺基酸組成的單鏈多肽。蛋白酶剪切產生由下述組成的胰島素(MW,6kDa):在2條鏈中由2個二石危4建連接的51個胺基酸；和連接肽(C-肽；MW,3kDa),包含31個胺基酸的單條多肽鏈。等摩爾量的胰島素和C-肽隨後被分泌到循環內。由於C-肽長得多的半衰期，循環C-肽濃度為胰島素的濃度的約5-10倍。C-肽因此是身體的天然胰島素生產的測量並且可以在靜脈內的合成胰島素的存在下進行測量。用於測量胰島素抵抗的黃金標準是葡萄糖鉗法(M值)，以測量通過胰島素輸注率(IIR)調整以維持血糖水平的葡萄糖輸注率(GIR)。第二種常見測量法是空腹葡萄糖和胰島素(HOMA-IR)。已報導與脂連蛋白的血液水平關聯的M值(如通過葡萄糖鉗法測定的，黃金標準)顯示脂連蛋白可以是胰島素抵抗的指示劑。另外的關聯是通過脂連蛋白校正的空腹葡萄糖和胰島素血液水平的測量(FBSxFIRI/AND)(空腹血糖x空腹胰島素水平/脂連蛋白)。本發明方法可以用於鑑定具有胰島素抵抗的受試者。此外，本發明方法可以用於確定糖尿病受試者中胰島素抵抗的嚴重性且推薦合適的治療。例如，為了確定受試者是否具有胰島素抵抗，人們可以測定本文描述的片段的水平。在某些實施方案中，不存在或存在減少水平的某些片段，即長度為25-34個胺基酸且一般未結合的片段(即，SEQ1DNOS:1、2、4-11、23、24和/或26-33),將指示具有胰島素抵抗的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常狀態。在某些實施方案中，某些較小片段，即長度為13-24個胺基酸的未結合的片段(即，SEQIDNOS:3、12-22、25和/或34-44)的增加水平的存在，將指示具有胰島素抵抗的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常狀態。與載體蛋白質即脂連蛋白(結合或未結合)的脂連蛋白受體片段的總濃度中的增加，一般指示具有胰島素抵抗的可能性增加。通過測量在不同時間點上取自受試者的生物流體樣品中這些片段的水平，可以確定胰島素抵抗是改善還是惡化。類似地，通過測量治療幹預之前和之後這些片段的水平，可以確定治療是否有效。代謝症候群已與減少的血漿脂連蛋白水平相關，並且可以使用本發明的方法進行監控。代謝症候群也稱為X症候群是一簇危險因素，其應對超重和肥胖患者以及具有2型糖尿病的患者中過量的心血管疾病發病率負責。世界衛生組織和國家膽固醇教育計劃-成人治療患者(NationalCholesterolEducationProgram—AdultTreatmentPatent)(NCEP國ATPIII)已闡述了關於代謝症候群的診斷標準。對於在本發明中的用途，代i射症候群由如下提供的WHO診斷標準限定(DarwinDeen，j/wen'caw/^wzz7少屍/;w'"'朋，69(12)(2004)2875-2882)。表1根據WHO關於代謝症候群的診斷標準tableseeoriginaldocumentpage32*—腐4素減拔遽^2^潛^病^^篪葡萄潛f^#定。本發明人已發現體液中的可溶性脂連蛋白受體片段的水平是受試者中代謝症候群的指示劑。因此，本發明方法可以用於鑑定具有代謝症候群的受試者。這些方法可以與用於鑑定代謝症候群的其他診斷標準中的任何一種組合使用。例如，為了確定受試者是否具有代謝症候群，人們可以測定本文描述的片段的水平。在某些實施方案中，不存在或存在減少水平的某些片段，即長度為25-34個胺基酸(即，SEQIDNOS:1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未結合的片段，將指示具有代謝症候群的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常狀態。在某些實施方案中，某些較小片段，即長度為13-24個胺基酸的片段(即，SEQIDNOS:3、12-22、25和/或34-44)的增加量的存在，將指示具有代謝症候群的可能性增加。與載體蛋白質即脂連蛋白未結合或結合的脂連蛋白受體片段的總濃度中的增加，一般指示具有代謝症候群的可能性增加。急性冠狀血管症候群(ACS)已應用於起因於對心臟的局部缺血性損傷的一群冠狀血管病症。急性冠狀血管症候群被定義為通過血管造影照片評估超過60%的血管阻塞，伴隨或不伴隨心臟狀況。本發明人已發現體液中的可溶性脂連蛋白受體片段的水平是受試者中血管阻塞的指示劑。因此，本發明方法可以用於鑑定具有血管阻塞的受試者。這些方法可以與用於鑑定血管阻塞的其他診斷標準中的任何一種組合4吏用。例如，為了確定受試者是否具有血管阻塞，人們可以測定本文描述的片段的水平。在某些實施方案中，不存在或存在減少水平的某些片段，即長度為25-34個胺基酸(即，SEQIDNOS:1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未結合的片段，將指示具有血管阻塞的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常狀態。在某些實施方案中，某些較小片段，即長度為13-24個胺基酸的片段(即，SEQIDNOS:3、12-22、25和/或34-44)的增加量的存在，將指示具有血管阻塞的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常狀態。與載體蛋白質即脂連蛋白未結合或結合的脂連蛋白受體片段的總濃度中的增加，一般指示具有血管阻塞的可能性增加。心臟狀況也稱為心血管疾病狀況，一般意指起因於心血管機能不全的疾病，包括但不限於，冠心病(其進一步包括心肌梗死和心絞痛)或冠狀動脈疾病、中風、先天性心力衰竭和充血性心力衰竭、先天性心力衰竭和高血壓。冠心病還包括心肌梗死和心絞痛。心血管疾病一般特徵在於對心臟或其他靶器官受損的血液供應。"心力衰竭"指其中心臟不以代謝組織需求所需的速率泵血的心臟功能異常。心力衰竭可以由許多因素引起，包括局部缺血、先天性、風溼性或特發性形式。冠心病(CHD)由冠狀動脈的內壁增厚引起。這種增厚過程稱為動脈粥樣硬化，使血液可以流經的空間變窄，從而減少且有時完全切斷對心臟的氧和營養物供應。動脈粥樣硬化通常當人在血液中具有高水平的膽固醇時發生。在血液中循環的膽固醇和脂肪在動脈壁上積累。積累使動脈變窄，且可以減緩或阻塞血流。當血液中的膽固醇水平4艮高時，它將沉積在動脈壁上的機率極大。這個過程在大多數人中在兒童期和少年時開始，並且隨著他們長大而惡化。充血性心力衰竭或(CHF)是進行性病理狀態，其中心臟越來越不能供應足夠的心輸出量(隨著時間過去由心臟泵出的血量)以將含氧血遞送給外周組織。隨著CHF進展，結構和血流動力學損害發生。儘管這些損害具有多種表現，但一種特徵性症狀是心室肥大。CHF是許多各種心臟病症的共同最後結果。心肌梗死通常起因於冠狀動脈的動脈粥樣硬化，通常伴隨疊加的冠狀血管血栓形成。它可以分成2個主要類型透壁性梗死，其中心肌壞死涉及心室壁的全部厚度，和心內膜下(非透壁性)梗死，其中壞死涉及心內膜下、壁內心肌或二者，而不通過心室壁一直延伸至心外膜。心肌梗死已知引起血流動力學效應中的變化以及心臟受損和健康區帶結構中的改變。因此，例如，心肌梗死減少心臟的最大心輸出量和每博輸出量。還與心肌梗死相關的是在間隙中發生的DNA合成的刺激以及未受影響的心臟區域中的膠原形成中的增加。心絞痛("絞痛，，)是當心臟的某部分未接受到足夠血液時發生的胸中的復發性疼痛或不適。它是冠心病(CHD)的常見症狀，這在由於動脈粥樣硬化將血液帶到心臟的血管變得狹窄和阻塞時發生。例如，本發明人已發現體液中的可溶性脂連蛋白受體^t段的水平是受試者，特別是已患有動脈硬化的受試者是否可能發展或具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的指示物。因此，本發明方法可以用於鑑定具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的受試者。這些方法可以與用於鑑定這些狀況的其他診斷標準中的任何一種組合使用。例如，為了確定受試者是否具有或可能發展充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血，人們可以測定本文描述的片段的水平。在某些實施方案中，不存在或存在減少水平的某些片段，即長度為25-34個胺基酸(即，SEQIDNOS:1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未結合的片段，將指示具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常狀態。在某些實施方案中，某些較小片段，即長度為13-24個胺基酸的未結合的片段(即，SEQIDNOS:3、12-22、25和/或34-44)的增加量的存在，將指示具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常狀態。與載體蛋白質即脂連蛋白未結合或結合的脂連蛋白受體片段的總濃度中的增加，一般指示具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的可能性增加。類似地，本發明方法可以用於鑑定具有高血壓、肥胖、脂血症或炎症的受試者。這些方法可以與用於筌定這些狀況的其他診斷標準中的任何一種組合使用。在所有這些狀況中，在某些實施方案中，不存在或存在減少水平的某些片段，即長度為25」34個胺基酸(即，SEQIDNOS:1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未結合的片段，將指示具有狀況的可能性增加。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常狀態。在某些實施方案中，某些較小片段，即長度為13-24個胺基酸的未結合的片段(即，SEQIDNOS:3、12-22、24和/或34-44)的增加量的存在，將指示具有狀況。相反地，這些片段的正常水平的存在將指示正常狀態。與載體蛋白質即脂連蛋白未結合或結合的脂連蛋白受體片段的總濃度中的增加，一般指示具有狀況的可能性增力口。本發明提供了使用本文所述至少一種片段的特異性測量的診斷、預後和治療法。該方法包括首先提供脂連蛋白受體片段的測量且隨後使測量與疾病狀態關聯。通過使測量關聯，人們能夠定性就所研究中的具體臨床參數而言的受試者狀態。在優選實施方案中，測量通過如上所述的親和質譜法來進行。診斷測試正確預測狀態的能力通常測量為測定的靈敏性、測定的特異性或受試者工作特性("ROC")曲線下面積。靈敏性是由測試預測為陽性的真陽性百分比，而特異性是由測試預測為陰性的真陰性百分比。ROC曲線提供了作為1-特異性函數的測試的靈敏性。ROC曲線下面積越大，測試的預測值越有力。測試效用的其他有用的測量是陽性預測值和陰性預測值。陽性預測值是測試為陽性的實際陽性百分比。陰性預測值是測試為陰性的實際陰性百分比。本文描述的片段獨立地或組合的用於幫助確定疾病狀態。在某些實施方案中，首先，所選擇的生物標記即特定片段在受試者樣品中進行測量，其中使用本文描述的方法，例如捕獲在SELDI生物晶片上隨後通過質譜法檢測。隨後，測量與區別一種診斷參數和另一種，例如陽性胰島素抵抗參數與陰性胰島素抵抗參數的診斷量或截止進行比較。診斷量表示生物標記的測定量，高於或低於所述量則受試者分類為具有特定疾病。例如，如果與疾病狀態中正常的比較，片段上調，那麼高於診斷截止的測定量提供疾病的診斷。可替代地，如果生物標記在疾病中下調，那麼低於診斷截止的測定量提供疾病的診斷。如本領域眾所周知的，通過調整測定中使用的特定診斷截止，取決於診斷醫生的優先選擇，人們可以增加診斷測定的靈敏性或特異性。在某些實施方案中，特定片段的僅僅存在或不存在而不定量片段的量是有用的，並且可以與疾病即胰島素抵抗的大概診斷關聯。因此，受試者中這些標記各自檢測到的存在或不存在可以指示受試者具有患胰島素抵抗的較高可能性。在定性疾病狀態的方法的某些實施方案中，該方法進一步包括基於狀態管理受試者治療。此種管理描述了醫生或臨床醫生確定疾病狀態後的行為。例如，如果醫生進行了疾病的診斷，那麼隨後將是某一治療方案。例如，對於"i午多人，心血管心臟病用生活方式改變和藥療法進行管理。具有嚴重心血管心臟病的其他人可能需要手術。無論如何，一旦心血管心臟病發展，它就需要終身管理。可替代地，無冠心病狀態或其他心血管疾病狀態的診斷隨後可能無治療。如果診斷測試給出關於冠心病狀態的非結論性結果，那麼可能需要進一步的測試。儘管個別生物標記是有用的診斷標記，但已發現生物標記的組合可以提供比單獨的單一標記更大的特定狀態的預測值。特別地，樣品中多個標記的測可以增加真陽性和真陰性i貪斷的百分比，且減少，￡陽性或假陰性診斷的百分比。因此，在某些實施方案中，本發明方法涉及檢測本文描述的多種片段。因此，在一個方面，本發明提供了用於發現脂連蛋白受體片段的模式的方法，所述模式與目的臨床參數關聯。在某些實施方案中，本發明提供了用於測量對治療的應答的方法，其包括下述步驟提供第一種生物樣品，優選地尿和/或血漿樣品，測量在第一個時間點上第一種生物樣品中的至少一種可溶性脂連蛋白受體片段的量，提供來自患者的第二種生物樣品，測量在第二個時間點上第二種生物樣品中的片段，以及基於片段的量中的改變或基於與對照群體的比較，確定患者中的應答。受試者可以是陽性應答者、弱應答者或無應答者。對於本文的用途，陽性應答者是對治療積極響應的受試者，即經歷狀況的成功改善的受試者，包括任何客觀或主觀參數例如消除；減輕；症狀的減小或使得狀況對於患者更可耐受；減緩退化或衰退速度；使得退化的終點較不虛弱；或改善受試者的身體或精神良好狀態。陽性應答者是其中在臨床觀點下治療上有利的作用超過生物活性試劑的任何毒性或有害副作用的應答者。無應答者是不響應治療或不響應至滿意水平的受試者。弱應答者是響應治療但不在陽性應答者水平的受試者。在某些實施方案中，其中疾病狀態是胰島素抵抗或與胰島素抵抗相關的另一種狀況，如糖尿病或代謝症候群，治療性處理一般包括施用有效量的一種或多種胰島素致敏藥物的步驟。胰島素致敏藥物是本領域已知的，並且包括例如PPAR激動劑如噻唑烷二酮(也稱為TZD);或PPAR/y不全激動劑，也稱為選擇性PPARy調節劑(SPPARM's)、PPARa-y雙重不全激動劑(選擇性PPARa-y雙重選擇性調節劑)和PPAR全激動劑(pan-agonist)。具有TZD結構的PPARy激動劑包括吡格列酮、羅格列酮、環格列酮、達格列酮(darglitazone)、恩格列酮、巴格列酮(balaglitazone)、isaglitazone、曲格列酮、萘格列酮(netoglitazone)、MCC-555和BRL-49653。其中某些具有TZD結構的其他PPARy激動劑包括CLX-0921、5-BTZD、GW-0207、LG國100641、LY-300512、麗畫2344、LY818、GW-677954、GW-7282和T-131。PPARa/y雙重激動劑顯示出a和y激動作用且可以用於治療2型糖尿病和減少脂質。PPARa激動劑包括KRP-297(MK-0767)、莫格列他(muraglitazar)(BMS-298585)、法格列酮(farglitazar)、羅格裡扎(ragaglitazar)、替賽格列他(tesaglitazar)(AZ畫242)、JT畫501、GW畫2570、GI畫262579、CLX-0940、GW-1536、GW1929、GW2433、L-796449、LR陽90、SB-219994、LY-578、LY畫4655608、LSN-862、37LY-510929和LY-929。本文描述的方法可以用於確定患者是否可能是用任何藥物的治療的應答者，所述任何藥物用於治療2型糖尿病或胰島素抵抗，包括例如雙胍(例如，二甲雙胍)；磺醯脲；除磺醯脲外的另一個化學藥品種類的胰島素促分泌素，例如氯茴苯酸；胰島素(其可以配製用於皮下或肌內注射、或用於避免注射需要的製劑中，例如經口、口腔含化或經鼻)；DP-IV抑制劑;PTP-1B抑制劑;GLP-1類似物;糖原磷酸化酶抑制劑；胰高血糖素受體拮抗劑；羥基固醇脫氫酶(HSD-1)抑制劑；葡糖激酶活化劑；或TZD或非TZDPPARy激動劑；或其任何治療組合。本文描述的方法可以用於確定患者是否可能是用任何藥物的治療的應答者，所述任何藥物用於治療還具有2型糖尿病或胰島素抵抗的肥胖患者中的肥胖，包括例如ibutramine、奧利司他、苯丁胺、Mc4rI激動劑、大麻素受體1(CB-1)拮抗劑/逆激動劑、33腎上腺素能受體激動劑；或TZD或非TZDPPARy激動劑；或其任何治療組合。本文描述的方法可以用於確定患者是否可能是用任何藥物的治療的應答者，所述任何藥物用於減少總膽固醇或LDL-膽固醇和/或增加HDL-膽固醇，包括例如HMG-CoA還原酶抑制劑(洛伐他汀、辛伐他汀、羅伐他汀(rosuvastatin)、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、rivastatin、匹伐他汀(pitavastatin)、ZD-4522及其他stating;尼克酸；膽固醇吸收抑制劑(依澤替米貝(ezetimibe));CETP抑制劑(託徹普(torcetrapib));PPARa激動劑(非諾貝特、吉非貝齊、氯貝丁酯、或苯扎貝特)；ACAT抑制劑(阿伐麥布(avasimibe));抗氧化劑(丙丁酚)；或膽汁酸多價螯合劑(消膽胺)，或TZD或非TZDPPARy激動劑；或其任何治療組合。在某些實施方案中，脂連蛋白受體片段的水平在治療開始前和隨後治療已進行後進行測定，所述治療的時間長度足夠片段的水平或模式中的變化反映患者是否將響應治療。治療已進行後，可能是治療的應答者的患者將具有增加水平的某些片段，即長度為25-34個胺基酸(即，SEQIDNOS:1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未結合的片段，和減少量的某些較小片段，即長度為13-24個胺基酸的片段(即，SEQIDNOS:3、12—22、24和/或34-44)。在某些實施方案中，差異將在治療開始後4周內觀察到，優選地在治療開始後2周內，且最優選地在治療開始後1周內。VI.另外的生物標記在某些實施方案中，與得自單獨的脂連蛋白受體片段的測量的那種相比較，將一種或多種另外的標記的評估組合以增加分析的預測值。例如，關於疾病狀態的一種或多種標記可以連同脂連蛋白受體片段一起測量以增強所述方法的預測值，所述疾病狀態即脂肪細胞失調、胰島素抵抗、糖尿病、代謝症候群、急性冠狀血管症候群(即，血管阻塞)、心血管心臟病、中風、先天性心力衰竭、充血性心力衰竭、高血壓、絞痛、心肌梗死、局部缺血、動脈粥樣硬化、肥胖、脂血症或炎症。可以與本發明方法組合使用的生物標記包括例如脂肪細胞因子，例如脂連蛋白、瘦蛋白、內臟脂肪素(visfatin)、klotho、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、DDPIV、抵抗素、生長素釋放肽、AMP-激活性蛋白激酶(AMPK)、Sirtl、PPAR激動劑、ARNT(芳香烴受體核易位體)、HIF1B、C-肽、Foxa2、胰島素或葡萄糖，包括其片段、肽和變體，和/或炎症標記，例如RBF-4、C-反應蛋白(CRP)、抵抗素、MCP-1、IL-6、TNF-a、IL-ip、PAI-1、尿抑胰酶素、自身免疫因子、針對穀氨酸的自身抗體、胰島細胞自身抗體、胰島素自身抗體、針對IL-2的自身抗體、針對IA-2的自身抗體、腸降血糖素、以及其他自身免疫因子及其片段、肽或變體。本文描迷的方法可以與任何其他測試組合使用，所迷任何其他測試將幫助疾病的i貪斷、疾病進展的確定、或疾病的治療功效的確定。在某些實施方案中，脂連蛋白水平還將在受試者中進行測量。測量脂連蛋白和使脂連蛋白水平與疾病狀態關聯的方法是本領域已知的，參見例如，美國專利號6，461,821,美國公開號US20050054005和US20050048565,以及國際公開號WO2004086040、WO2005046734、WO2005038457和WO2004022596,所述專利各自整體且為了所有目的引入本文作為參考。對於本文的用途，術語脂連蛋白包括其具有脂連蛋白活性的變體。在某些實施方案中，總脂連蛋白的量、低分子量的量、高分子量脂連蛋白的量或這些數目之間的比將與本發明的方法組合使用。因此，本發明方法可以包括下述步驟測量來自受試者的生物樣品中的脂連蛋白(總脂連蛋白、高分子量脂連蛋白、低分子量脂連蛋白、或其他形式的脂連蛋白，包括其片段和變體)的水平，並且使量與疾病狀態的存在、與疾病的進展、或治療的功效關聯。減少量的脂連蛋白指示疾病以及高分子量脂連蛋白與總或低分子量脂連蛋白的較小比。在某些實施方案中，痩蛋白水平將在受試者中進行測量。測量瘦蛋白包括其變體和使瘦蛋白水平與疾病狀態關聯的方法是本領域已知的。(參見例如,Gorden和Gavrilova,CurrentOpinoninPharmacology,(2003)3:655-659,所述參考文獻整體且為了所有目的引入本文作為參考)。在某些實施方案中，可以測量腦鈉肽(BNP)水平以幫助血管阻塞和心血管疾病的診斷或進展。測量BNP水平和使它們與疾病狀態關聯的方法是本領域已知的。參見，例如，FrankPeacock,ClevelandClinicJournalofMedicine(2002)，69(3)243-251,所述參考文獻整體且為了所有目的引入本文作為參考。本發明方法可以用於鑑定具有炎症和特徵在於過量炎症的某些疾病的受試者。這些方法可以與確定受試者中的炎症水平的已知方法組合使用。在某些實施方案中，尿抑胰酶素和/或烏司他丁(uristatin)水平將在受試者中進行測量。尿抑胰酶素表示間-a-胰蛋白酶抑制劑蛋白質的抑制性輕鏈。它是蛋白酶抑制劑，已知在具有炎性疾病的患者的尿中升高且被視為急性期蛋白質。對於本文的用途，術語尿抑胰酶素包括其具有尿抑胰酶素活性的變體。烏司他丁是存在於尿中的胰蛋白酶抑制劑，其在具有細菌或病毒感染的大多數患者以及具有炎性病症的許多患者中增加。測量尿抑胰酶素或烏司他丁包括其變體，和使尿抑胰酶素或烏司他丁水平與疾病狀態關聯的方法是本領域已知的。烏司他丁是存在於尿中的胰蛋白酶抑制劑，其在具有細菌或病毒感染的大多數患者以及具有炎性病症的許多患者中增加。(Pugia和Lott,Clin.ChemLabMed200543(1):1-16,國際公開號WO200504022,所述參考文獻各自整體且為了所有目的引入本文作為參考)。在某些實施方案中，C反應蛋白水平將在受試者中進行測量。測量c反應蛋白包括其變體，和使c反應蛋白水平與疾病狀態關聯的方法是本領域已知的。例如c反應蛋白在急性炎症或感染的發作期間存在於血清中。約1mg/dL的CRP水平對於CRP通常視為是高的，並且大多數感染和炎症導致超過10mg/dL的CRP水平。對於本文的用途，術語C反應蛋白包括其具有C反應蛋白活性的變體。(Pugia和Lott，Clin.ChemLabMed200543(1):1-16,所述參考文獻整體且為了所有目的引入本文作為參考)。在某些實施方案中，白細胞計數可以與本文描述的方法組合進行。測量白細胞和使白細胞水平與疾病狀態關聯的方法是本領域已知的。白細胞(WBC)計數，或血液中的白細胞的測量是可靠和廣泛使用的標記，其反映遍及身體的炎症。WBC計數還與其他慢性狀況關聯，包括心血管疾病、高血壓和糖尿病。在某些實施方案中，空腹葡萄糖、葡萄糖耐量測量和/或胰島素和胰高血糖素刺激的C-肽水平將在受試者中進行測量。測量胰島素和C-肽包括其變體，和使胰島素和C-肽水平與疾病狀態關聯的方法是本領域已知的。例如，超過約1.8ng/mL的胰高血糖素刺激的C-肽水平已報導鑑定可以無需胰島素治療進行管理的2型糖尿病患者。一般地，3.0ng/mL用作指示高胰島素血症或胰島素抵抗的上限。相比之下，小於約0.5ng/mL的水平據報導鑑定由於血內胰島素不足需要胰島素治療的1型患者。關於正常成人的正常參考範圍為0.5-2ng/mL。在其中一種或多種標記與脂連蛋白受體片段組合使用以增加分析的預測值的實施方案中，另外的標記的水平可以在來自受試者的相同生物樣品或可以是相同類型或不同類型的另一種生物樣品中進行測量。例如，脂連蛋白受體片段的水平可以在血漿樣品中進行測量，而另外的標記的水平可以在血漿的相同樣品、血漿的不同樣品、或來自受試者的血清或尿樣品中進行測量。VII.另外的疾病狀態脂連蛋白涉及身體內的許多過程和途徑。因此，脂連蛋白受體片段的斷裂模式的檢測可以用於確定許多疾病狀態的發作、監控其進展和/或確定其藥物治療的功效。特別地，可溶性脂連蛋白受體片段的檢測可以與其他診斷方法和工具組合使用，用於確定許多疾病狀態的發作、監控其進展和/或確定其藥物治療的功效。特別地，可溶性脂連蛋白受體片段的檢測可與血管生成、致動脈粥樣化和細胞的巨噬細胞轉化相關。脂連蛋白受體1通過與由脂肪酸激活的LXR核受體結合得到上調，且LXR受體對於巨噬細胞轉化是必需的。脂連蛋白受體l表達也已顯示在單核細胞轉化期間增加。因此，引起身體組織的炎症且隨後產生急性或慢性炎症狀況的炎性疾病，即由免疫系統或組織的細胞或非細胞介質觸發的疾病，可以使用本發明方法進行檢測和監控。此種疾病的例子包括例如I-IV型超敏反應，例如肺的超敏反應疾病包括哞喘，特應性疾病，變應性(allegic)鼻炎或結膜炎，眼瞼的血管性水腫，遺傳性血管性水腫(agioedema),抗受體超敏反應和自身免疫疾病，Hashimoto氏甲狀腺炎，全身性紅斑狼疳，Goodpasture氏症候群，天皰痴，重症月幾無力，Grave氏和Raynaud氏疾病，類風溼性關節炎，牛皮辨，Crohn氏病，硬皮病，混合型結締組織病，多肌炎，肉樣瘤病，尿道感染，IgA腎病，腎小球腎炎，急性或慢性宿主移植物反應。癌症也可以使用本發明方法進行檢測和監控。癌症指許多疾病中的任何一種，所述疾病的特徵在於不受控制的、異常的細胞增殖，受影響的細胞局部或通過血流和淋巴系統擴散至身體的其他部分(即轉移)的能力，以及許多特徵性結構和/或分子特徵中的任何一種。術語癌症包括但不限於，女性生殖器官癌症，包括但不限於，卯巢癌、子宮頸癌和子宮癌；肺癌；乳腺癌；腎細胞癌；何杰金氏淋巴瘤；非何杰金氏淋巴瘤；生殖泌尿系統癌症包括但不限於，腎癌，前列腺癌，膀胱癌和尿道癌；頭和頸癌；肝癌；胃腸系統癌症包括但不限於，胃癌，食管癌，小腸癌或結腸癌；膽分支癌症；胰癌；男性生殖系統癌症包括^旦不限於，睪丸癌；妊娠性滋養層細胞病；內分泌系統癌症包括但不限於，甲狀腺癌，曱狀旁腺癌，腎上腺癌，類癌瘤，胰島素瘤和PNET腫瘤；肉瘤，包括但不限於，Ewing氏肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤，平滑肌肉瘤和橫紋肌肉瘤；間皮瘤；皮膚癌症；黑素瘤；中樞神經系統癌症；兒壽牛癌症；和造血系統癌症包括j旦不限於，所有形式的白血病，骨髓異常增生症候群、骨髓增生病和多發性骨髓瘤。VIII.試劑盒對於在上文描述或建議的應用中的用途，本發明還提供了試劑盒。此種試劑盒可以例如包含區室化的載體裝置，以接受在緊密限制中的一種或多種容器裝置，如條、盒、微觀流體晶片、小瓶、管等，容器裝置各自包含在方法中使用的分開元件之一。例如，容器裝置之一可以包含是或可以可檢測地標記的探針。此種探針可以是對可溶性c-末端受體片段特異的抗體或多核苷酸。此外，試劑盒可以包括說明材料，所述說明材料包含用於實踐本發明的方法的指導(即，規程)。儘管說明材料一般包含書面或印刷材料，但它們並不限於此種。本發明預期了能夠存儲此種說明書且將它們傳達給最終用戶的任何介質。此種介質包括但不限於，電子儲存介質(例如，磁碟、磁帶、盒式存儲器、晶片等)、光學介質(例如，CDROM)等。此種介質可以包括提供此種說明材料的網際網路站點的地址。試劑盒還可以包含例如用於從個體獲得生物樣品的裝置。用於從個體獲得生物樣品的裝置是本領域眾所周知的，例如導管、注射器等，並且在本文中不詳細討論。用於執行本發明的具體方面的下述示例性實施方案僅為了舉例說明性目的而提供，並且不意欲以任何方式限制本發明的範圍。實施例實施例1-糖尿病個體中C-末端片段的檢測116個患者通過醫療史進行評估。50個沒有糖尿病史，或根據WHO定義代謝危險因素(脂質、高血壓、肥胖)未診斷為代謝症候群。69個具有1型或2型糖尿病史。胰島素抵抗在所有患者中通過葡萄糖測量、c-肽和血紅蛋白Alc進一步進行評估。脂連蛋白、c-肽、胰島素和HMW脂連蛋白使用商業ELISA試劑盒進行測量。HbAlc通過DCA2000+儀器(Bayer)和葡萄糖通過YSI進行測量。下述AdipoRlELISA測定用於測量無論是結合還是未結合的所有C-末端片段。關於C-末端片段AdipoRl的ELISA測定的材料包括樣麼量滴定板(CostarPN3690,高結合)，Tris緩衝鹽水(TBS)(Pierce產品號28376),脂連蛋白受體1(AdipoRl)肽(肽16-34)(PhoenixPharmaceuticals,Inc.,產品號001-44),溶於TBS的SuperBlock(Pierce產品號37535),TBS/TW-包含0.05%Tween20的Tris緩沖鹽水(Tween20-Pierce產品號-P8341),兔抗AdipoRl抗體(PhoenixPharmaceuticals,Inc.,產品號G-001-44),ALP-山羊抗兔IgG(Sigma產品號A3687),1-StepPNPP(Pierce產品號37621)和2NNaOH。試劑如下進行製備。如所示的AdipoRl肽(PhoenixPharmaceuticals,Inc.,產品號001-44)的貯存液通過將100ug肽溶解於包含0.1%TFA的lOOuL60%乙腈中進行製備。用nanopure水將這種1.0mg/mL溶液進一步稀釋到10mL,從而得到10ug/mL貯存液。將這種溶液進行等分試樣，500uL/小^f瓦於-7(TC進行冷凍貯存。溶於TBS的0.10ug/mLAdipoRl肽用於包被板且通過下述進行製備將溶於TBS(上文A)的lOOuL10ug/mLAdipoRl肽加入9900uLTBS中，且充分混合。如所示的兔抗AdipoRl(PhoenixPharmaceuticals,Inc.,產品號G-001-44)的貯存液通過將200uG抗體溶解於200uLnanopure水中進行製備。這產生1.0mg/mL抗體溶液。等分試樣成50uL等分試樣且於國70。C冷凍!^存。溶於SuperBlocker的6.0ug/mL兔抗AdipoRl溶液通過下述進4t製備將18.0uL原液抗AdipoRl加入2982uLSuperBlocker中，且充分混合。溶於SuperBlocker(用於5倍稀釋血漿樣品；對於其他稀度改變濃度)的3.75ug/mL兔抗AdipoRl溶液通過下述進行製備將56.25uL原液抗AdipoRl(C)加入15，000uLSuperBlocker中,且充分混合。ALP-山羊抗兔IgG的1/2000稀釋物通過下述進行製備將7.5uLALP-山羊抗兔IgG(Sigma，產品號A3687)加入15.0mLSuperblocker內，且充分混合。校準器(calibrator)的製備使用溶於包含3.0ug/mL兔抗AdipoRl的superblocker中的AdipoRl肽來進行，以達到5.0、2.5、1.25、6.25、0.312、0.156、0.078牙口0ug/mL的AdipoRl月太濃度。用於AdipoRlELISA測定的方法通過下述來完成用50uL/孔溶於TBS的O.lOug/mLAdipoRl肽包被微量滴定板，且貯存於4。C最低限度72小時，從水箱中取出包被的微量滴定板，並且倒空板且用200uL/孑LTBS洗滌3次。這隨後為向每個孔中加入150uLSuperBlock緩衝液(PiercePN37535)且使板於25。C振蕩30分鐘。將板倒空且用TBS/TW洗滌5次。這隨後為添加包含5000、2500、1250、625、312、156、78和0ng/mLAdipoR1肽的製備的校準器或用阻斷劑緩衝液5倍稀釋的樣品。所有樣品和校準器均包含3.0ug/mL兔抗AdipoRl。樣品或校準器以50uL/孔添加且在水箱中於5。C溫育過夜。這隨後為將板倒空且用TBS/TW洗滌5次。在ELISATemplate中向所有孔中以50uL/孔添加溶於SuperBlocker的1/2000稀度的ALP-山羊抗兔IgG。這於25。C在JitterbugShaker上以振蕩器設定#2溫育2小時。將板倒空且用TBS/TW洗滌5次。向每個孔中加入50uL1-StepPNPP(PiercePN37621)。板於25。C在JitterbugShaker上溫育30分鐘。向每個孔中加入25uL2NNaOH以終止酶反應。在405nm處讀數之前允許板靜置至少5分鐘。進行校準器數據與標準曲線的擬合和未知量的計算(單相指數式衰減通常給出最佳擬合)以計算樣品中的值。脂連蛋白伴隨2型糖尿病減少。脂連蛋白伴隨1型糖尿病不改變。與2型相比較，脂連蛋白在正常對照和1型患者中更高(參見表2)。脂連蛋白伴隨HbAlc減少且隨後增加。所有差異是小的且在低於1.4的T值不是非常顯著(概率3.8,概率〉99.9%顯著性)(參見表4)。令人驚訝的是，AdipoRl伴隨1型糖尿病增加，從而指出受體也與1型關聯。這些患者還將預期患有脂肪細胞失調，但也具有卩細胞喪失。AdipoRl伴隨更高的HbAlc比脂連蛋白增加更多。總之，AdipoRl比脂連蛋白和HMW比更靈每丈。AdipoRl和脂連蛋白在數學關係中的組合在預測糖尿病病理學方面比單獨的脂連蛋白更佳。AdipoRl和c-肽在數學關聯中的組合在預測糖尿病病理學方面也比單獨的C-肽更佳,tableseeoriginaldocumentpage46表4.可溶性AdipoRltableseeoriginaldocumentpage47實施例2-在具有代謝症候群以及其他心血管和冠狀血管疾病的個體中C-末端片段的檢測另一組188個患者通過各種診斷測試和血管造影照片就心血管狀況和危險進行充分表徵。無代謝症候群、糖尿病、急性冠狀血管症候群(ACS)、AMI或CHF的那些視為正常(n=113)。來自188個的組的患者置於關於代謝症候群、炎症標記、ACS、AMI和CHF、高血壓、肥胖、脂血症、炎性應答和抗炎應答的受影響組內。急性冠狀血管症候群被定義為通過血管造影照片評估阻塞>60%,伴隨或不伴隨急性心臟狀況。代謝症候群通過胰島素抵抗或通過WHO定義超過2種代謝危險因素進行限定。胰島素抵抗通過診斷和糖尿病藥療法進行評估。代謝危險因素包括高血壓、脂血症和肥胖。肥胖通過體重指數(BMI)進行評估。高血壓通過血壓或藥療法進行評估。脂血症通過脂質比或脂質降低藥療法進行評估。炎症通過白細胞計數或CRP進行評估。抗炎狀態通過關於血液和尿中的尿胰蛋白酶抑制劑的免疫測定(尿抑胰酶素和烏司他丁免疫測定測量)進行評估。所有患者通過醫療史和藥療法進行另外評估且因而表徵到受影響組內。脂連蛋白和HMW脂連蛋白使用商業ELISA試劑盒進行測量。心臟標記使用Centaur儀器(Bayer)進行測量。實施例1中描述的AdipoRlELISA測定用於測量無論是結合還是未結合的所有C-末端片段。脂連蛋白伴隨ASC和代謝症候群減少，但值的顯著性小於對於99.9%可靠(certain)預期的(參見表5)。脂連蛋白伴隨CHF和MI增加，這將幹擾評估。脂連蛋白與炎症狀態並不非常相關。血清中的可溶性AdipoRl的總水平伴隨ASC和代謝症候群增加，且值的顯著性高度顯著(99.9%可靠)且比對於脂連蛋白觀察到的那種顯著得多(參見表6)。令人驚訝的是，隨著狀況變得更急性並且隨著炎性和抗炎應答增加，AdipoRl增力o。AdipoRl進一步預示代謝症候群。可溶性AdipoRl也在尿和血漿中發現與代謝症候群關聯。表5.脂連蛋白tableseeoriginaldocumentpage48(1)包括具有AMI和CHF的患者(2)顯著性為99.9%prob或0.01雙尾，當T值〉3.8時表6.可溶性AdipoRltableseeoriginaldocumentpage49包括AMI和CHF〉2.4為約99%prob或0.01雙尾，〉3.8為約99.9%prob或0.001雙尾實施例3-闡述生物化學途徑當胰島素引起脂肪細胞生產脂連蛋白時，導致正常胰島素敏感性。全長脂連蛋白聚集成多聚體，一般稱為LMW、MMW和HMW形式。脂連蛋白在肝中與脂連蛋白受體2且在肌肉中與脂連蛋白受體1相互作用，以終止葡萄糖生產且引起糖酵解和脂肪酸氧化。脂連蛋白受體l與稱為球狀脂連蛋白的脂連蛋白的切割形式反應，而脂連蛋白受體2與全長脂連蛋白反應。球狀脂連蛋白最近由其他人顯示通過血液彈性蛋白酶作用而形成。當脂肪細胞變成肥大且響應胰島素生產較少的脂連蛋白時，胰島素抵抗發生。在這種狀態下，細胞變得更多細胞凋亡，並且細胞分裂減慢。因此血漿脂連蛋白水平下降。胰島素水平在引起細胞釋放更多的脂連蛋白的努力中上升。然而，隨著胰島素抵抗惡化，產生更多的胰島素和更少的脂連蛋白。更少的脂連蛋白導致肌肉中更少的糖酵解和脂肪酸氧化且阻止肝葡萄糖生產終止。證實炎症彈性蛋白酶和白細胞在糖尿病患者中明顯升高。文獻綜述承認人造胰島素和天然胰島素在糖尿病中增加白細胞。隨著彈性蛋白酶在炎症中增加，產生更高百分比的球狀脂連蛋白。多聚體的缺乏造成對肝更少的作用。證實抗炎蛋白酶抑制劑(Uri和Bik)在糖尿病中明顯升高。這些抑制劑由彈性蛋白酶形成，並且最近在我們的細胞模型中顯示在正常細胞系中誘導肥大性細胞凋亡。彈性蛋白酶暴露後的受體片段被提議為用於在患者樣品中形成可溶性片段的機制。這使用親和質譜法進行測試，其中使用針對AdipoRlC末端的多克隆抗體和患者樣品。AdipoRl通過質語證實在血液中具有34、28-29、19-18、15-13、9.5-9.0、7.9、6.6、6.5、5.2、4.0—3.8和1-2kDa的質量。這個數據證實1)AdipoRl片段在患者和對照中發現，2)AdipoRl片段形成二聚體(dimmers),和3)AdipoRl片段與脂連蛋白結合。最後一點通過用針對脂連蛋白的多克隆抗體重複親和質譜法得到證明。在胰島素抵抗期間多聚體脂連蛋白的缺乏進一步提議為患者和正常之間的斷裂模式中的差異的可能原因。事實上3.9和7.8質量形式的消失在糖尿病中發生，但在所有正常中都存在。在下文數據中，所有5個患者都缺乏這些質量，並且所有5個正常都具有3901和7814Da質量(參見圖解數據)。因此，不同的質量被認為是由於蛋白酶剪切位點的暴露，當存在用於結合的多聚體的可用性時。實施例4-單克隆抗體的製備BALB/c小鼠用100ng/小鼠的合成AdipoRl肽免疫原組合物進行免疫。l個月後，從每隻小鼠獲得眼睛放血，並且通過ELISA針對免疫原進行滴定以評估免疫應答。顯示出最佳應答的小鼠通過用免疫原100ng/小鼠的注射進行加強。4天後，處死小鼠並且根據Kohler和Milstein,Nature256:495(1975)的方法將其脾用於融合。使用PEG(聚乙二醇)溶液將脾細胞與SP2-0Agl4骨髓瘤細胞融合，其中脾細胞與骨髓瘤細胞的比為5:1,並且使用50%PEG/HAT生長培養基鋪平板到96孔板內。於37。C溫育7-10天後，通過每3-4天補料就生長監控融合培養物，其中利用HAT(次黃噪呤、氨基蝶呤和胸苷)選擇法，隨後與HAT生長培養基一起傳代培養。2-3周後，具有雜交瘤集落生長的孔通過ELISA進行測試，以確定哪些生長物產生針對肽的抗體免疫應答。96孔板培養物用烏司他丁肽以lug/mL包被的板進行測試。於2-8。C過夜包被板後，所有板均進行洗滌和封閉。隨後在室溫下應用100iul/孔細胞培養物上清液1小時。洗滌板後，以100uL/孔應用1:2000稀度的山羊抗小鼠IgG辣根過氧化物酶1小時。板再洗塗一次，隨後為OPD(鄰苯二胺二鹽酸化物)底物且在SpectraMax板閱讀器上在490nm處讀數。將產生陽性應答的集落轉移至24孔板用於進一步擴增，且再次測試以證實陽性結果。測試陽性的集落在6孔板中在含有10%胎牛血清(FBS)的Iscove氏改良的Dulbecco氏培養基(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium)(IMDM)中進一步擴增。擴增後，將集落冷凍於-7(TC且隨後轉移至液氮用於長期貯存。基於使用純化的肽的ELISA結果，各種克隆在IMDM、10%FBS中進一步擴增且進行冷凍。實施例5-用SELDI表徵單克隆抗體測量患者樣品中的特異性adipoRl片段的方法使用單克隆抗體來進行，並且兔多克隆抗體用可溶性AdipoR標準和患者的血漿在晶片表面上進行測試。結合通過表面增強雷射解吸/電離(SELDI)分析在SELDIPBSII飛行時間質譜儀(Ciphergen,Fremont,California)上進行評估，以測定關於與抗體結合的蛋白質的質荷比(m/z)。來自患者的10個血漿樣品進一步進行測試5個患者對於糖尿病是陽性的；5個患者對於糖尿病是陰性的。結合在2種類型的表面(PS20和RS100)上使用標準溫育程序進行測量。關於每種質量測量的信號與背景噪聲進行比較，以獲得信噪比(S/N)。只接受具有超過10的S/N比的質量。SELDI程序如下將3微升50mmol/LNaHC03(pH8.0)加入蛋白質晶片上的每個斑點，且用板(即，生物處理器)進行覆蓋以形成樣品孔，隨後向每個斑點中添加1jliL抗體(lmg/mL)且伴隨振蕩在溼度受控室中在室溫下溫育2小時。來自每個斑點的溶液在那時用5pL洗滌緩沖液(磷酸緩沖鹽水(PBS)+0.5%Triton去汙劑)洗滌2次。未結合的位點用5pL2mg/mLBSA(牛血清清蛋白)或1mol/L乙醇胺進行封閉。在室溫下溫育後，棄去BSA或乙醇胺，並且斑點用5pL洗滌緩衝液(PBS+0.5%Triton)洗滌2次。向每個斑點中加入5pLPBS且將晶片置於生物處理器內。向每個孔中加入另外IO^iLPBS以及IOnL待測試的樣品(或PBS作為對照)，隨後使密封的孔於4。C振蕩18小時。孔隨後用洗滌緩沖液和PBS進行洗滌，且再次在室溫下振蕩2分鐘。孔用300pL由芥子酸飽和的去離子水漂洗2次；這在與抗體結合的蛋白質的質子化期間充當能量吸收分子。後者與晶片表面附著。包含抗體結合的樣品的晶片就結合質量進行分析，其中根據製造商的說明書使用SELDI質譜儀。實施例6-糖尿病患者中的可溶性C-末端片段表6顯示關於5個正常患者7812的脂連蛋白受體片段質量的檢測和不含相同質量的5個糖尿病患者的多重測定的結果。對於3901的質量發現類似的分離。這2種質量存在於正常受試者中，但在具有本文提供的疾病條件的受試者中不存在或以極低水平即減少的水平存在。表6.在7812和3901道爾頓處的SELDI結果患者狀況患者數目具有在3901處的具有在7812處的質量質量的患者數目的患者數目糖尿病500非糖尿病555表7顯示關於5個正常和糖尿病患者具有4.5-6.9、7-8.2、9-11、13-15、17-19、27-29或30-34的質量的脂連蛋白受體片段的檢測和不含相同質量的5個糖尿病患者的多重測定結果。表7.在4.5-6.9、7-8.2、9-11、13-15、17-19、27-29或30-34KDa道爾頓處的SELDI結果tableseeoriginaldocumentpage53實施例7-絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶在炎症期間增加，並且包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽釋放酶、纖溶酶、補體D、凝血酶以及因子IXa、Xa、XIa和XIIa。全部具有切割Arg-Xaa或Lys-Xaa的類胰蛋白酶基本親和力。由免疫細胞釋放的另外的胰蛋白酶(rrypsin)家族絲氨酸蛋白酶包括彈性蛋白酶、粒酶(A、B、H、M)、類胰蛋白酶2和肥大細胞蛋白酶l。關鍵的彈性蛋白酶同源物包括組織蛋白酶G、蛋白酶3、天青殺素(azurocidin)和mycolobastin具有Val-Xaa>Ala-Xaa切割親和力。粒酶A和K具有類胰蛋白酶切割親和力。粒酶B具有用於Asp-Xaa的天冬裂酶切割親和力。粒酶M具有用於Met-Xaa或Leu-Xaa的甲硫氨酸裂解酶(metase)切割親和力。粒酶H和肥大細胞蛋白酶1具有用於切割Phe-Xaa、Tyr-Xaa或Trp-Xaa的糜蛋白酶切割親和力。關於脂連蛋白和脂連蛋白受體片段的斷裂模式的分析使用胰蛋白酶和彈性蛋白酶作為示例性炎症蛋白酶進行測定。長度為29-34個胺基酸的片,殳(即，SEQIDNOS:1、2、4-11、16、17和/或19_26)預測經由彈性蛋白酶切割。長度為20-25個胺基酸的片段(即，SEQIDNOS:3、12-15、18和/或27-30)預測經由一般胰蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶或粒酶切割。實施例8-設定靈敏性與特異性樣品分成正常和異常的。結果對於全體進行收集，並且觀察到的adipoRl值針對指定的adipoRl閾值進行判斷。閾值是低於其的所有結果均視為正常和高於其的結果視為陽性的值。閾值從低數目到高數目變化，並且結果的預測值使用發現的真陽性、假陽性、真陰性和假陰性數目進行計算。對於測試的每個閾值計算靈敏性(TP/TP+FP)和特異性(TN/TN+FN)。具有最高靈敏性與特異性的閾值給出最佳預測值。(100%將是理想的)。實施例9-脂連蛋白受體片段閾值下述是使用實施例1顯示的患者和方法設定閾值的例子。在下表中，高於其的AdipoRl結果視為陽性的閾值從15到21ug/mL變化。在這個例子中，較高的值視為陽性。真陰性或正確鑑定的無診斷的糖尿病的患者數目連同假陽性、假陰性和真陽性數目一起進行計算。理想地，測定將無假陽性或100%的特異性，和無假陰性或100%靈敏性。如從數據中可見的，閾值15對於靈敏性更佳，而閾值21對於特異性更佳。閾值和範圍取決於檢測的片段和使用的分析法。在這個例子中，總測定範圍為5-30ug/mL或約6X。因此，濃度單位和範圍隨檢測的片段和使用的分析法(SELDI對ELISA)而變化。例如，對於在實施例6和表7中測試的片段，正常和糖尿病之間的差異通常為100X。如預期的，關於1種特異性片段的濃度小於所有片段的濃度。使用的樣品類型，無論是尿、血漿還是血清同樣影響片段的濃度。尿和血清具有為血漿的約1/10的片段濃度。一旦選擇了測定和片段，閾值就進行調整以最好地達到所需的臨床一致，其中使用顯示的方法。tableseeoriginaldocumentpage5569個糖尿病中的25個是1型。分析物同樣就對於1型糖尿病是陽性的能力進行比較。25個1型糖尿病中只有4個具有異常低的脂連蛋白。C-肽使用2個閾值，1個用於異常低的和1個用於異常高的水平。異常低的c-肽指出缺乏胰島素，和如預期的，25個1型糖尿病中的23個具有異常低的c-肽。1型糖尿病也通常具有AdipoRl片段。少數1型糖尿病具有異常高的c-肽。這些分析物檢測不同的患者。這可能由病理學中的差異進行解釋，因為每種分析物測量失調的不同部分。例如，認為影響c-肽的胰島素的缺乏是由於胰島細胞，而脂連蛋白的缺乏是由於脂肪細胞不能生產激素。這個例子中adipoRl片段的存在被認為是由於肌細胞因過度使用而脫落受體。這個數據證實分析物共同的組合可以比單獨的任何一種更好。在下表中，最簡單的關係通過考慮陽性的實驗對象組中的任何一個進行測試，以意指結果是異常的。因此所有分析物必須是陰性的以被視為正常結果。如上所述，閾值進行調整以達到最佳結果。表10tableseeoriginaldocumentpage56對於c-肽、脂連蛋白和adipoRl的組合使用獲得最高數目的真陽性。對於c-肽和adipoRl的組合使用或通過使用c-肽、脂連蛋白和adipoRl獲得最高數目的真陰性。在2種情況下，真陰性數目與adipoRl可比較。實施例11-CAD患者的血漿中的可溶性脂連蛋白受體1水平下述是使用另外的且與AdipoRl結果相關的生物標記以改善心血管病症的預測的例子。使用實施例2中顯示的心血管病症和正常患者以及方法。影響患者是通過血管造影照片或通過符合代謝症候群定義的高危險性具有ACS的那些。具有預先存在的心血管狀況例如AMI和CHF的患者被排除，因為診斷可能已通過Tnl或BNP測定或其他診斷評估來進行。脂連蛋白受體1可溶性C-末端片段如實施例1中所示通過ELISA進行測量。結果與血管阻塞程度良好關聯(表11)。心血管病症的危險也通過關於促炎和抗炎應答以及脂連蛋白的另外標記進行評估。關於促炎和抗炎應答的分析物與adiporl進行比較。異常的AdipoR結果比脂連蛋白、烏司他丁、尿抑胰酶素、WBC或CRP更可能存在於具有血管阻塞的患者中。更高的靈敏性支持脂連蛋白受體1對於由於動脈粥樣硬化的血管阻塞的診斷關聯。表11脂連蛋白受體1可溶性片段關於動脈粥樣硬化的靈敏性tableseeoriginaldocumentpage57促炎和抗炎應答以及脂肪細胞標記的實驗對象組的使用就其檢測心血管病症的能力進行比4交。對於尿抑胰酶素、烏司他丁、CRP、WBC、脂連蛋白和adipoRl的組合使用獲得最高數目的真陽性。對於脂連蛋白和adipoRl的組合使用獲得最高數目的真陰性。每種所述範圍包括範圍的所有組合和亞組合，以及其中包含的具體數字。本說明書中引用的所有出版物和專利申請整體且為了所有目的引入本文作為參考，如同每個單個出版物或專利申請特別且個別指出為了所有目的引入作為參考一樣。儘管為了清楚理解的目的已經由舉例說明和實施例相當詳細地描述了前述發明，但根據本發明的教導對於本領域普通技術人員將顯而易見的是，可以在不背離附加權利要求的精神或範圍的情況下，對其進行某些改變和修改。權利要求1.一種用於檢測受試者中的脂連蛋白受體的斷裂的方法，其包括測定得自所述受試者的生物流體樣品中所述脂連蛋白受體的至少一種可溶性C-末端片段的存在或不存在的步驟。2.權利要求1的方法，其中所述至少一種C-末端片段與載體蛋白質結合。3.權利要求2的方法，其中所述載體蛋白質是脂連蛋白。4.權利要求1的方法，其中所述脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段通過抗體進行檢測。5.權利要求2的方法，其中與載體蛋白質結合的所述至少一種C-末端片段通過抗體進行檢測。6.權利要求1的方法，其中測定所述生物流體中所述脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段的存在的步驟包括使所述樣品與對所述脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段特異的結合劑接觸。7.權利要求6的方法，其中所述結合劑包含抗體。8.權利要求7的方法，其中所述抗體用報導分子進行標記。9.權利要求6的方法，其中測定所迷生物流體中所述脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段的存在的步驟進一步包括使所述樣品與對所述第一種結合劑特異的第二種結合劑接觸。10.權利要求9的方法，其中所述第二種結合劑是抗體。11.權利要求10的方法，其中所述第二種結合劑用報導分子進行標記。12.權利要求2的方法，其中測定所述生物流體中所述脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段的存在的步驟包括使所述樣品與對載體蛋白質特異的結合劑接觸，所述載體蛋白質與所述至少一種脂連蛋白受體片段結合，且所述方法進一步包括測定所述載體蛋白質是否與所述至少一種脂連蛋白受體片段結合的步驟。13.權利要求l的方法，其中所述體液是血漿或全血。14.權利要求1的方法，其中所述體液是尿。15.—種檢測受試者中的脂連蛋白受體的表達水平的方法，其包括測定生物流體樣品中所述脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段的水平，和使所述至少一種C-末端片段的水平與所述脂連蛋白受體的表達水平關聯的步驟。16.—種檢測受試者中的脂連蛋白的表達水平的方法，其包括測定生物流體樣品中脂連蛋白受體的至少一種C-末端片段的水平，和使所述至少一種C-末端片段的水平與所述脂連蛋白的表達水平關聯的步驟。17.—種用於確定特徵在於受試者中的脂肪細胞失調的狀況的進展、狀況的發作、或狀況的治療功效的方法，其包括測定得自所述受試者的體液樣品中存在的脂連蛋白受體的至少一種可溶性C-末端片段的水平，和使所述水平與所述狀況的進展、所述狀況的發作、或所述狀況的治療功效關聯。18.權利要求17的方法，其中所述至少一種可溶性C-末端片段與載體蛋白質結合。19.權利要求17的方法，其中所述至少一種可溶性C-末端片段是未結合的。20.權利要求17的方法，其進一步包括測定得自所述受試者的生物樣品中的脂連蛋白水平，和使所述脂連蛋白水平與所述狀況的進展、所述狀況的發作、或所述狀況的治療功效關聯。21.權利要求17的方法，其進一步包括測定得自所述受試者的生物樣品中的尿抑胰酶素水平，和使所述尿抑胰酶素水平與所述狀況的進展、所述狀況的發作、或所述狀況的治療功效關聯。22.權利要求17的方法，其進一步包括測定得自所述受試者的生物樣品中的C-反應蛋白水平，和使所述C-反應蛋白水平與所述狀況的進展、所述狀況的發作、或所述狀況的治療功效關聯。23.權利要求17的方法，其進一步包括測定得自所述受試者的生物樣品中的白細胞水平，和使所述白細胞水平與所述狀況的進展、所述狀況的發作、或所述狀況的治療功效關聯。24.權利要求17的方法，其進一步包括測定得自所述受試者的生物樣品中的c-肽水平，和使所述c-肽水平與所述狀況的進展、所述狀況的發作、或所述狀況的治療功效關聯。25.權利要求17的方法，其中所述方法用於確定特徵在於脂肪細胞失調的狀況的發作。26.權利要求17的方法，其中所述方法用於確定特徵在於脂肪細胞失調的狀況的進展。27.權利要求17的方法，其中所述方法用於確定特徵在於脂肪細胞失調的狀況的治療功效。28.權利要求27的方法，其中所述治療是施用PPARy激動劑。29.權利要求17的方法，其中所述狀況是代謝症候群。30.權利要求17的方法，其中所述狀況是血管阻塞。31.權利要求17的方法，其中所述狀況是I型糖尿病或II型糖尿病。32.權利要求17的方法，其中所述狀況是動脈硬化。33.權利要求17的方法，其中所述狀況是心血管疾病。34.權利要求33的方法，其中所述心血管疾病是充血性心力衰竭、急性心肌梗死、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化或局部缺血。35.權利要求17的方法，其中所述狀況是胰島素抵抗。36.—種用於確定具有動脈硬化的受試者是否可能發展心血管疾病的方法，其包括測定得自所述受試者的生物流體樣品中存在的所述脂連蛋白受體的至少一種可溶性C-末端片段的水平，和使所述水平與發展心血管疾病的可能性關聯。37.權利要求36的方法，其中所述心血管疾病是充血性心力衰竭、急性心肌梗死或局部缺血。全文摘要本發明涉及脂連蛋白受體的可溶性C-末端片段及其在病症的診斷和管理中的用途。文檔編號A61K39/395GK101454024SQ200680052424公開日2009年6月10日申請日期2006年12月4日優先權日2005年12月7日發明者M·J·普吉亞申請人:西門子醫療保健診斷公司