鉤端螺旋體兩個疫苗候選的外膜蛋白的製作方法

2023-05-11 16:38:51

專利名稱：：鉤端螺旋體兩個疫苗候選的外膜蛋白的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物技術與醫學領域，具體涉及可作為候選疫苗的兩個鉤端螺旋體外膜蛋白。
背景技術：
：鉤端螺旋體是一種細長彎曲呈螺旋狀、運動活潑的單細胞原核微生物，屬於螺旋體目(Spirochaetals)鉤端螺旋體禾鬥(L印tospiraceae)鉤端螺旋體屬。致病性鉤端螺旋體所引起的鉤端螺旋病(Leptospirosis)是我國法定的乙類傳染病，也是在全球廣泛分布的威脅人類健康和畜牧業生產的常見人獸共患病。已經有77個國家和地區報告有此病的存在，每年發病數萬例。鉤端螺旋體病主要臨床表現是高熱、頭痛、寒戰、乏力、^^巴結腫大和明顯的肌肉疼痛。重者可並發肺出血、黃疸、腦膜腦炎和腎功能衰竭等。我國是世界上鉤端螺旋體病的高發地區之一。安全有效的疫苗是防治鉤端螺旋體病的最好方法。鉤端螺旋體疫苗的研究始於1916年日本Ido等首次試製鉤端螺旋體全菌體疫苗，先後經歷了傳統的全菌體疫苗、改良的濃縮疫苗和鉤端螺旋體外膜疫苗時期。無論是菌體疫苗還是純化的外膜疫苗，共同的缺點是免疫力不夠強久，需要每年在疫區進行免疫接種。同時現用的疫苗都具有一定的副作用，並且對不同血清型的鉤端螺旋體不能引起交叉免疫保護，這些缺點限制了鉤端螺旋體疫苗的應用。致病性鉤端螺旋體的免疫原性蛋白尤其是表面暴露蛋白質，因為最有可能與宿主的免疫系統接觸而產生抗體，有可能是有效的疫苗候選分子。因此鑑定那些在致病性鉤端螺旋體中表面暴露的保守蛋白質，從而能夠產生對不同血清型的鉤端螺旋體產生交叉免疫保護，成為鉤端螺旋體研究的重點。從1990年代以來，已經有許多鉤端螺旋體的表面蛋白質被鑑定出來，其中某些蛋白質在動物模型中顯示能引起保護性免疫反應。迄今為止已經鑑定出的鉤端螺旋體的疫苗候選抗原主要有OmpLl、LipL41、LipL32、LipL21、LigA和LigB等，雖有一些結果，但至今尚未完全解決此難題。
發明內容本發明的目的是提供兩個可以作為候選疫苗的鉤端螺旋體的外膜蛋白、及其片段、類似物、衍生物。本發明的另一目的是提供編碼這些蛋白的多核苷酸。本發明的另一目的是提供生產這些蛋白的方法以及蛋白和編碼序列的用途。在本發明的第一方面，提供分離出來的鉤端螺旋體的外膜蛋白，如SEQIDNO:1、3的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地不含信號肽序列。在本發明的第二方面，提供分離出來的編碼上述多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70%相同性(a)編碼上述鉤端螺旋體外膜蛋白的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQIDN0:1、3胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQIDNO:2、4的序列。在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化的宿主細胞。在本發明的第四方面，提供了製備鉤端螺旋體外膜蛋白多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達鉤端螺旋體外膜蛋白的條件下，培養上述被轉化的宿主細胞；(b)從培養物中分離出鉤端螺旋體外膜蛋白多肽。在本發明的第五方面，提供了與上述的鉤端螺旋體外膜多肽特異性結合的抗體。還提供了可用於檢測的核酸分子。在本發明的第六方面，提供了檢測樣品中是否存在外膜蛋白的方法，它包括將樣品與外膜蛋白的特異性抗體反應，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在外膜蛋白。在本發明的第七方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明的鉤端螺旋體外膜蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應,或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。在本發明的第八方面，提供了一種疫苗組合物，它含有安全有效量的本發明的鉤端螺旋體外膜多肽或其片段以及藥學上可接受的載體。本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1A及圖1B分別是本發明LA0957LA1495兩個基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果圖；圖2A及圖2B分別是是本發明LA0957LA1495兩個基因PQE31重組表達質粒的酶切鑑定結果圖；圖3A及圖3B分別是本發明LA0957LA1495兩個重組蛋白質的SDS-PAGE結果圖(1:uninducedrecombinantprotein;2:inducedrecombinantprotein;3:supernatantofrecombinantprotein;4:precipitationofrecombinantprotein;5:purifiedprotein;M:proteinmarker^圖4A及圖4B分別是本發明FACS檢測LA0957和LA1495的結果圖；圖5A及圖5B分別是Westemblot檢測疫苗候選抗原在15個血清群代表株中保守性的結果圖。具體實施方式本發明人經過廣泛而深入的研究，從鉤端螺旋體賴株中分離純化和鑑定了一類新的外膜蛋白質，該外膜蛋白可作為抗原用於疫苗的設計和製備。在此基礎上完成了本發明。在本發明中，術語"外膜蛋白"、"外膜多肽"或"鉤端螺旋體外膜蛋白"可互換使用，都指具有鉤端螺旋體外膜蛋白胺基酸序列(SEQIDN0:1、3)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的鉤端螺旋體外膜蛋白，以及含有或不含有信號肽的外膜蛋白。如本文所用"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用"分離的外膜蛋白或多肽"是指外膜多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化外膜蛋白。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，但優選的是非糖基化的。本發明還包括鉤端螺旋體外膜蛋白，蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的天然鉤端螺旋體外膜蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。在本發明中，術語"鉤端螺旋體外膜多肽"指具有鉤端螺旋體外膜蛋白活性或免疫原性的SEQIDNO:1、3序列的多肽。該術語還包括具有與鉤端螺旋體外膜蛋白相同功能的、上述序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。該術語還包括鉤端螺旋體外膜蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與鉤端螺旋體外膜蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗鉤端螺旋體外膜多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含鉤端螺旋體外膜多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了鉤端螺旋體外膜多肽的可溶性片段。通常，該片段具有鉤端螺旋體外膜多肽序列的至少約IO個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。這些片段也可用作免疫原以誘導針對鉤端螺旋體的免疫應答反應。發明還提供鉤端螺旋體外膜蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然鉤端螺旋體外膜多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如P、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，"鉤端螺旋體外膜蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDNO:1、3的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。tableseeoriginaldocumentpage8本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。奉發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，"嚴格條件"是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如O.2XSSC，0.1%SDS，60°C:或(2)雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲醯胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42°。等或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與成熟的鉤端螺旋體外膜蛋白有相同的生物學功能和活性。本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼外膜蛋白的多聚核苷酸。本發明的鉤端螺旋體外膜核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的DNA文庫或按本領域技術人員己知的常規方法所制各的DNA文庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或外膜蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的外膜多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼鉤端螺旋體外膜多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，鉤端螺旋體外膜多核甘酸序列可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含鉤端螺旋體外膜編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨節青黴素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO的動物細胞等。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。重組的鉤端螺旋體外膜蛋白或多肽有多方面的用途，其中包括(但不限於)作為抗原用於製備疫苗。另一方面，本發明還包括對鉤端螺旋體外膜DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，"特異性"是指抗體能結合於鉤端螺旋體外膜基因產物或片段。較佳地，指那些能與鉤端螺旋體外膜基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的鉤端螺旋體外膜基因產物結合的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈或嵌合抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員己知的各種技術進行製備。例如，純化的鉤端螺旋體外膜基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達鉤端螺旋體外膜蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。疫苗組合物本發明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或治療性的(即在感染後治療疾病)。這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脫氧核糖核酸)，通常與"藥學上可接受的載體"組合，這些載體包括本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、胺基酸聚合物、胺基酸共聚物、脂質凝集物(如油滴或脂質體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(佐劑)作用。另外，抗原或免疫原可以和細菌類毒素(如白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯。增強組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限於(l)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方(有或沒有其它特異性的免疫刺激劑，如胞壁醯肽(見下文)或細菌細胞壁成分)，例如，(a)MF59其含有5%鯊烯、0.5%的吐溫80和0.5%Span85(任選地含有不同量的MTP-PE(見下文)，雖然並不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))製成亞微米級顆粒；(b)SAF，其含有10%鯊烯、0.4%吐溫80、5%普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr^MDP(見下文)，微量流化成業微米級乳劑或渦流振蕩產生粒徑較大的乳劑，和(c)Ribi佐劑系統(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton,MT)，其含有2%鯊烯、0.2%吐溫80以及取自單磷醯脂A(MPL)、二黴菌酸海藻糖酯(TDM)、和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(Detox);(3)皂素佐劑，例如可採用stimulon(CambridgeBioscience,Worcester,MA)或從其產生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激性複合物)；(4)Freund完全佐劑(CFA)和Freund不完全佐劑(IFA);(5)細胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、幹擾素(如Y幹擾素)、巨噬細胞集落刺激因子(M"CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等(6)細菌ADP-核糖基化毒素(如霍亂毒素CT，百日咳毒素PT或大腸桿菌熱不穩定毒素LT)的脫毒變異體，尤其是LT-K63、LT-R72,CT_S109、PT-K9/G129;參見例如W093/13302和W092/19265;以及(7)作為免疫刺激劑來增強組合物效果的其它物質。如上所述，胞壁醯肽包括但不局限於，N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-乙醯-去胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(nor-MDP)、N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯氨醯基-L-丙氨酸-2-(r-2，-二棕櫚醯-sn-甘油-3-羥基磷醯氧)-乙胺(MTP-PE)等。包括免疫原性組合物在內的疫苗組合物(如可包括抗原，藥學上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質，如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝物質等可存在於這類運載體中。此外，包括免疫原性組合物在內的疫苗組合物可含有在藥學上可接受載體中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。更具體地，包括免疫原性組合物在內的疫苗，包含免疫學有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的組分。"免疫學有效量"指以單劑或連續劑一部分給予個體的量對治療或預防是有效的。該用量根據所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配製、治療醫師對醫療狀況的評估、及其它的相關因素而定。預計該用量將在相對較寬的範圍內，可通過常規實驗來確定。通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物製成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可製成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該製劑還可乳化或包封在脂質體中，在上述藥學上可接受的載體下增強佐劑效果。常規方法是從腸胃外(皮下或肌內)途徑通過注射給予免疫原性組合物。適合其它給藥方式的其它配方包括口服製劑。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結合其它免疫調節劑一起給予。作為以蛋白質為基礎的疫苗的一種替代方案是，還可以採用DNA疫苗接種。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人在《分子克隆實驗室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。一、基於生物信息學和基因晶片的基因組方法篩選鉤端螺旋體疫苗候選基因1、生物信息學分析預測鉤端螺旋體編碼表面暴露蛋白的基因2、比較基因組學雜交篩選出在中國流行的十個流行血清群鉤端螺旋體代表株中保守的基因3、轉錄組學分析鑑定鉤端螺旋體基因組中高表達基因經過上述3個方法，最後從鉤端螺旋體賴株基因組中篩選鑑定出226個疫苗候選基因。這226個疫苗候選基因表達的蛋白質不但是表面暴露蛋白，而且是在中國流行的大部分血清群的代表株中保守，並且具有較高的轉錄水平。(本部分內容已發表於BMCgenomics2006年第七巻)二、鉤端螺旋體兩個新的疫苗候選基因la0957，lal495的克隆表達和篩選鑑定表一基因基因長度(bp)引物_^_1623F:5'-catgcatgcACTCACGATGATTCAGC-3'outermembraneLA0957R:5'-ccaagcttGATTTATTTTTCGGAAGT-3'effluxprotein931F:5'-cgggatccAGTTTCGCCGGATCAGAT-3'putativeLA1495R:5，-ccaagcttTTMTTTTGTGTTTTTGTAGG-3，outermembraneprotein實施例1兩個新的疫苗候選基因la0957,lal495的克隆表達通過常規分子生物學方法克隆表達這兩個基因，表達載體為pQE31，表達菌為￡co力'M15。將測序成功的重組質粒轉化至感受態M15，Amp和Kan雙抗篩選陽性克隆後，加入LB液體培養基中，37"C250rpm擴增過夜。按1:100的接種量轉至LB培養液，37'C培養至OD約為0.60.8後，採用IPTG誘導蛋白表達。不同蛋白誘導溫度及IPTG濃度各不相同。超聲粉碎已表達蛋白的￡co力'M15細胞，分別收集沉澱和上清，10%15%SDS-PAGE和Westernblot鑑定。然後大量表達重組蛋白，並對重組蛋白進行純化，用BCA(bicinchoninicacid)法檢測蛋白濃度。la0957，lal495兩個基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析如圖1A及圖IB,PQE31重組表達質粒的酶切鑑定結果如圖2A及圖2B，LA0957LA1495兩個重組蛋白質的SDS-PAGE結果如圖3A及圖3B。實施例2重組蛋白質的免疫原性檢測首先用BALB/c小鼠製備上述2個重組蛋白質的多克隆抗體，檢測血清效價為1:32000，顯示有良好的免疫原性。Western-blot檢測重組蛋白的免疫反應性，顯示重組蛋白可與相應多抗血清反應，說明這兩個疫苗候選抗原具有良好的免疫反應性實施例3Westernblot檢測疫苗候選抗原在鉤端螺旋體賴株兔血清中的抗體方法是將2ug重組蛋白經SDS-PAGE後轉膜，用封閉液(1%脫脂奶粉-0.1%Tween20-PBS，pH7.4)封閉2小時，PBS-T液衝洗3次，每次10分鐘。用兔抗鉤端螺旋體血清稀釋作為一抗，稀釋倍數為1:50，1:100，1:200和1:400，反應3小時，PBS-T液洗三次，每次10分鐘。二抗為Goat-anti-RabbitIgGHRP(1:2000)，反應1小時後，PBS-T洗三次。化學發光底物顯色。檢測結果顯示，LA0957和LA1495的抗體存在於鉤端螺旋體全菌兔抗血清中。這2個鉤端螺旋體疫苗候選分子在感染鉤端螺旋體的動物體內有表達並能刺激機體產生相應抗體。實施例4FACS(流式細胞儀)檢測LA0957和LA1495為鉤端螺旋體表面暴露蛋白質方法鉤端螺旋體賴株培養至濃度為2X107ml，PBS緩衝液洗2次並調整濃度到3X107ml。取300tU鉤端螺旋體細胞懸液加入重組蛋白的BALB/c小鼠血清或者PBS免疫BALB/c小鼠所得抗血清(終濃度為1:50)，37。C孵育30分鐘，10000r/min離心10分鐘，PBS緩衝液洗2次，再加入6u1FITCanti-mouseIgG2a/2b，37'C避光孵育30分鐘，PBS洗滌2次，PBS重懸。FACS檢測螢光值，統計學軟體SPSS10.0分析結果。陰性對照為正常BALB/c小鼠血清，陽性對照為重組蛋白質LipL32及LipL41的BALB/c小鼠抗血清。每個樣本重複檢測45次。結果見圖4A及圖4B，其中灰色峰圖為正常小鼠血清與鉤端螺旋體細胞反應，以排除小鼠血清與鉤端螺旋體的非特異性結合。白色峰圖為特異性外膜蛋白抗血清或者PBS免疫BALB/c小鼠抗血清與鉤端螺旋體細胞的結合反應。這兩者的差異性表明特異性鉤端螺旋體蛋白質與鉤端螺旋體細胞的結合程度。SPSS10.0軟體進行兩個獨立樣本的非參數統計學統計(Kolmorov-Smirnovtest,K-Stest)，分析疫苗候選抗原免疫小鼠抗血清與正常小鼠血清螢光信號的平均值是否有統計學意義。結果顯示已知的暴露於外膜的蛋白LipL32和LipL41及疫苗候選抗原LA0957和LA1495的K-S檢驗代O.05，有統計學意義。說明疫苗候選抗原LA0957和LA1495是鉤端螺旋體的表面暴露蛋白質。實施例5WesternBlot檢測疫苗候選抗原在不同菌株中的保守性鉤端螺旋體菌體處理我國流行的鉤端螺旋體15個血清群代表株用EMJH培養基28"C振蕩培養，培養3天後10000rpm離心10分鐘，PBS洗滌2次，去除多餘的PBS後稱量溼重，按照100mg/ml加無菌雙蒸水，充分混勻，備用。WesternBlot檢測12XSDS-PAGE後轉膜，用封閉液(1%脫脂奶粉_0.1%Tween20-PBS，pH7.4)封閉2小時，PBS-T液衝洗3次，每次10分鐘。用重組蛋白的BALB/c小鼠血清l:1000稀釋作為一抗，反應3小時，PBS-T液洗三次，每次IO分鐘。二抗為Goat-anti-MouseIgGHRP(1:2000)，反應1小時，PBS-T次。化學發光底物顯色。結果如圖5A及圖5B,在疫苗候選抗原LA0957和LA1495在15株不同血清群代表株中均有表達，是保守的疫苗候選抗原。本發明應用逆向疫苗學的理論，通過生物信息學方法，並整合了比較基因組學雜交以及轉錄組學的結果，篩選出226個鉤端螺旋體疫苗候選基因。通過對LA0957和LA1495這2個疫苗候選基因進行進一步篩選和鑑定，顯示他們不但具有較好的免疫原性，在鉤端螺旋體賴株兔血清中存在抗體，FACS檢測證實均為鉤端螺旋體細胞的表面暴露蛋白質，而且在15個血清群的代表株中具有強保守性，是兩個新的鉤端螺旋體疫苗候選基因。序列表上海交通大學醫學院鉤端螺旋體兩個疫苗候選的外膜蛋白〈130〉4〈170〉Patentlnversion3.31557<212〉PRT<213〉Leptospirainterrogans(鉤端螺旋體)〈400〉1MetTyrTyrLysLysLysArgThrLeuGluLysPheLeuValPheGly151015ThrlieLeuLeuThrMetlieGinProThrTrpSerGluAsplieLeu202530ProGluGluThrValLeuGluGluAsnLysLysSerProValGluAsn354045LeuGlyAspSerLysLyslieLeuArgLeuThrLeuLysAspAlaVal505560AsnTyrValLeuGluLysAsnlieThrlieGinAsnAlaLysMetGlu6570758018TyrValLysAlaAspGlyGlyGluLeuLysAsnGluSerGinPheThr859095TrpAsnLeulieGlyGlylieThrValPheArgThrThrLeuProAla100105110AsnArgAsnAsnliePheAlaGlyThrLysGinSerGinAspLysLeu115120125SerValGlylieGluLysAsnPheArgThrGlyThrTyrAlaLysLeu130135140GluAlaSerThrThrArgPheAspThrSerAlaPheGluAsnProSer145150155160ThrThrProSerAsnLeuAlaAlaLeuAlalieProProLeuTyrThr165170175GlyAlaLeuThrlieThrLeuSerGinGlulieLeuLysTyrSerPhe180185190GlyLysThrGinLysGluArgGluAlalieLeuArgGinAsnThrVal195200205lieLysArgGluGluLeulieTyrValLeuSerGinLeuValAlaGin210215220ThrLeulieGinTyrTrpSerLeuAsnlieTyrAspSerAsnValLys225230235240ThrLeuGinAspLeuGluSerAsnThrArgAsnlieArgAspLeuThr245250255ValArgLysArgAsnLeuGlyLeuSerGluGlyPheGluValAsnLeu260265270TrpAsnSerlieLeuSerGinThrAlaGlyAsnLeuGluLysAlaLys275280285ValSerArgLysGluAlaGluArgAsnLeulieArglieLeuAsnAla290295300AspProSerSerLyslieGluGlyValThrAspLeuGinGluAsnVal305310315320ProLeuAspPheAsnValGluLysAspTyrlieTyrAlaLeuAspHis325330335ArgThrAspLeuLysAsnLeuArgLysGinArgGlulieAlaGluLeu340345350AsnLeuLyslieLysGluAlaGluAspMetPi;oSerLeuLysLeuSer355360365GlyAlaTyrSerThrArgGlyGinAsnlieValSerProGinGinAsn370375380LeuThrAspGlyAsnArgGlyValAlaSerPheLysTyrProGluAla385390395400TyrAlaAlaPheGinPheSerTyrProLeuTrpAspLysGlylieLys405410415AlaAsplieArgAsnAlaLysLeuAspValGinAsnLeuGluLysLys420425430GluAlaGluLeuLysLeuSerlieLysGluGluLeuGluAsnArgTyr435440445AlaAlalieValAlaAspLysAspliePheGluGlyAla'LysLysArg450455460LysGluGluAlaAsnLysPheTyrLysGlyLeuSerGluArgPheArg465470475480GinGlyArgPheThrAlaValAlaValLysAsnAlaLeuAspAsnVal485490495lieGinSerGluLeuGinValThrGinAlaLyslieGinLeuAsnlie500505510AsplieLeuArgTyrGluLeuAlaLysAsnHisliePheGluArgPhe515520525GlyValAsnValAsnAsplielieAspArgLeuMetLysMetValAsp530535540lieAlaGinSerLysSerSerThrGluThrSerGluLys545550555<210〉2〈211〉1674〈212〉DNA<213〉Leptospirainterrogans消端螺旋體)〈400〉2atgtattacaaaaagaaaaggacattagaaaaatttctcgttttcggaaccattctactc60acgatgattcagcctacttggagtgaggacatacttccggaagaaactgttttagaagag120aataaaaaatctcccgttgaaaatttaggtgactccaaaaaaatattgagactgacttta180aaagacgcagtcaattatgttcttgagaagaatattacaatccaaaacgctaaaatggaa240tatgtaaaagcggacggtggagaacttaaaaacgaatcccaatttacttggaatctaatc300ggtggaattaccgttttcaggacaactctccctgccaatagaaataacatctttgccgga360accaaacaaagccaagataaattaagcgtcggaattgagaaaaattttegaaccggaacg420tatgcaaaattagaagcaagtactactcgttttgatacgagcgctttcgaaaacccgtcc480acaactccttccaacttagcggcgcttgcaattcctcctttatatacaggcgctttgacc540a/tcactttaagccaggaaatcttaaagtatagttttggaaaaactcagaaagaBagagaa600gccattttaagacaaaatactgtaatcaaaagagaagaattgatttatgtactttcgcag660cttgtagcacaaacattgattcaatattggagtttaaatatctacgactcgaacgtaaaa720acgctgcaagatttagaatccaatactagaaacatcagagatttgaccgttagaaaacga780aacttagggctttcggaaggttttgaagtcaatctatggaattctattctttctcaaaca840gcaggtaatttagaaaaagctaaagtgtctcgtaaagaagcagaaagaaatttaattcgg900attttaaacgcggatccttcttctaaaatcgaaggtgttactgatcttcaagaaaacgtt960cctttagattttaacgtggaaaaggattatatctacgcacttgatcatagaaccgatcta1020aaaaatcttcgcaaacaaagggaaatcgcagaattaaatcttaagatcaaagaagcagaa1080gacatgccttctttaaaactttcaggggcctattctacaagaggacaaaatattgtttct1140cctcaacaaaatctcacggatggaaatagaggagtcgcctcttttaaatatccggaagca1200tacgcggcttttcaattttcttatcctctttgggataaagggatcaaggcagatattcga1260aacgcaaaattagacgtacagaatctagaaaaaaaagaagctgagttaaaactttccatc1320aaagaagaattagaaaatcgttatgctgccatcgttgccgataaagatattttcgaaggt1380gctaaaaaaagaaaggaagaagcaaataaattctacaaaggtctttctgaacgttttcgt1440cagggaagatttaccgcggtcgcggttaaaaacgccttagacaacgtaattcaatctgaa1500ttacaagttacccaggcaaaaattcaactgaacatagacattcttcgttatgaattggca1560aaaaatcatatcttcgaaaggttcggcgtgaacgtaaatgacatcatcgatcgactgatg1620aagatggtggatattgcacaatccaaatcttctacggaaacttccgaaaaataa〈210〉3〈211〉331〈212〉PRT〈213〉Leptospirainterrogans(鉤端螺旋體)〈400〉3MetLeuSerLyslieGinThrlieLeulieVallielieLeuValPhe1674151015GlyGluLeuLeuTrpAlaValSerProAspGinlieAsnLeuGlylie202530LeulieGlyGluAsnLysThrAsnLeuLysPhelieAsnlieCysVal354045SerAsnLeuAlaProlieLeuGluProThrAsnSerAspThrSerPro505560ProAsnAsnThrLysValGluAlaGlyAsnThrThrThrGluValGly65707580AspLysValGluLeuPheLysLysLeuGlyAlaLeuProSerTyrlie859095SerLeuLysLysAlaAsnGinPheAspPheAsnGlyAsnMetLeuTyr100105110PheGinSerAsnTyrSerLeuSerPheLysAsnLeuArgGlyAlaGin115120125GlyGluMetLysAspLeuTyrGinAlaThrHisGluGinTyrLeuGin130135140AsnSerArglieLeuLeuGluTyrAlaSerProLeulieValArgSer145150155160AsnAspLyslieAlaGinHisLeuLeuArgLeuGlyPheArgAspLeu165170175LysSerSerGluAspHisPheThrlieAlaTyrAsnSerAlaProTyr180185190GinPheArgTyrLysLeuLeuLeuHisGlyGluGlylieLyslieAla195200205ArgArgAlaArgLysPheAlaLeuLeuAlaMetlieAlaSerLysThr210215220ProThrGluAspLysProGluTyrGinPheValAsnLeuAspAspMet225230235240ArgAlaAlaValGluLysGluThrlieThrAspTyrGluLysValArg245250255AsnThrLeulieAsnTyrlieAspAsnAspLeuLeuGinArgLyslie260265270ValProProGlyGluAlaLysAspLysProlieAsplieLeuGlulie275280285HisAspAspAsnTyrGlylielieThrSerGlyArglieSerMetMet290295300AspMetSerAsnGluGlulieLysThrSerAspAlalieGinLysGlu305310315320ThrLeuProProlieProThrLysThrGinAsn32533025〈210〉4〈211〉996〈212〉DNA<213〉L印tospirainterrogans消端螺旋體)〈400〉4atgctttctaaaattcaaaccatactaatcgtaattatattagttttcggggaactgctt60tgggcggtttcgccggatcagatcaacttaggaattttgattggggagaataaaaccaat120cttaaattcatcaatatatgtgtgagtaacctggctccaattttggagcccacaaattcg180gatacaagcccgcctaataacactaaggtggaggcgggtaatacaactactgaagttggg240gacaaagtagagttatttaaaaaattaggtgcacttccttcttacattagtttgaaaaag300gcaaatcaatttgatttt犯tggaaatatgttgtattttcagagtaattatagcctttcc360tttaaaaatttaagaggggcgcaaggggagatgaaagatctttatcaggcgactcacgaa420caatatcttcaaaattctagaatacttttggaatatgcttctcctttaattgtaagaagt480aatgataagattgcacaacatctacttcgtttaggctttagggatctgaaaagttctgaa540gatcattttacaatcgcatataactccgctccttatcaatttcgttataaacttctttta600cacggggaaggtatcaaaattgcaagaagagccagaaaatttgctcttttagctatgatcGGOgcatcaaaaactccaaccgaggataaaccggaatatcaatttgtaaatttagatgatatg720ag3gctgcagt3g3犯3ggaaactatcaccgattacgaasaggtgaga犯t3Ctttg3tc780aattatattgataatgatttgctccaaagaaaaatcgtaccacccggagaagccaaagat840aaaccgatcgatattcttgaaatacacgacgacaattacggtattatcacttcgggaaga900atttctatgatggatatgagcaacgaagaaattaaaacaagtgatgcgattcaaaaagaa%026acgttaccgccaattcctacaaaaacacaaaattaa99權利要求1.一種分離的鉤端螺旋體外膜蛋白多肽，其特徵在於，它包含具有選自SEQIDNo1、3的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。2.如權利要求l所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQIDNo:1、3的胺基酸序列的多肽。3.—種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70%相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQIDNo:1、3所示胺基酸序列的多肽。5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組(a)具有SEQIDNo:2、4中的序列。6.—種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。7.—種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體。8.—種鉤端螺旋體外膜蛋白多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達鉤端螺旋體外膜蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞(b)從培養物中分離出鉤端螺旋體外膜蛋白多肽。9.一種能與權利要求1所述的鉤端螺旋體外膜蛋白特異性結合的抗體。10.—種疫苗組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽和藥學上可接受的載體。全文摘要本發明提供了可作為候選疫苗的兩個鉤端螺旋體外膜蛋白，編碼外膜蛋白的多核苷酸和經重組技術產生這類外膜蛋白的方法。外膜蛋白是一種有用的製備疫苗的免疫原。本發明還公開了這類蛋白及其編碼序列用於製備疫苗的用途。文檔編號C07K14/195GK101328211SQ20071004222公開日2008年12月24日申請日期2007年6月19日優先權日2007年6月19日發明者平何,馮春燕,朱泳璋,楊宏亮,瑋林,秦金紅,賴衛強,蔚趙,郭曉奎,陳春燕申請人:上海交通大學醫學院