穩定的重組腺苷脫氨酶的製作方法

2023-05-10 15:11:51 2

專利名稱:穩定的重組腺苷脫氨酶的製作方法
技術領域：
本發明提供突變以增強穩定性的重組腺苷脫氨酶。
背景技術：
一段時間以來腺苷脫氨酶(ADA)已用於治療酶缺陷疾病，該疾病稱為重症聯合免疫缺陷疾病(SCID)或"泡泡男孩(Bubble boy)"疾病。超過15年以前，EnzonPharmaceuticals已製備治療性ADA,其以使用牛源ADA酶製備的PEG化的ADA的形式給予患者。
最近，正嘗試使用重組體來源的酶(recombinant source enzyme)(下文稱"rADA")代替牛來源酶。重組人("rhADA")和重組牛("rbADA")都被考慮作為純化的天然牛ADA的代替品。該rbADA和rhADA酶相比目前使用的天然純化的牛的酶有些不穩定。認為rhADA和rbADA以與半胱氨酸降解一致的方式降解:添加氧；二硫醇的形成；隨著pH增加降解增加；沉澱,尤其當pH增加且樣品濃縮時。在還原的狀態(reducedstate)，半胱氨酸包含反應性-SH基(巰基)，其為易於降解的形式。
有證據表明單一的、暴露的半胱氨酸可能是對於rbADA和rhADA兩者所觀察到的降解的原因。牛ADA(即，從牛 來源純化的天然牛ADA)具有與rhADA非常相似的結構:牛ADA和rhADA在基本序列的相同位置都具有相同數量的半胱氨酸。目前獲得的重組人和重組牛ADA包含降解劑(degradants)/雜質(二硫醇)，其與半胱氨酸反應性一致。天然牛ADA在結構上不同於重組牛ADA，因為天然牛ADA具有單摩爾的半胱氨酸與每摩爾ADA鍵合。天然牛ADA也對高pH穩定，表明與ADA鍵合的半胱氨酸的功能為保護基。
一個穩定重組人和/或重組牛ADA的方法是用氧化的穀胱甘肽，碘乙醯胺，碘乙酸，胱氨酸，其它二硫醇中的任一種及其混合物封端該活性Cys殘基(成熟rbADA和成熟rhADA兩者的Cys 74)。該方法在共同擁有的美國專利申請序列號11/738，012中闡述，名稱為，"Stabilized Proteins"，其內容以其整體在此引入作為參考。
儘管上述說法，但有利地是避免需要另外的通過修飾蛋白質結構而進行的封端步驟，從而提供在表達後立即具有的固有穩定性。美國專利號5，346，823描述了通過突變而進行的原核蛋白酶如枯草桿菌蛋白酶和中性蛋白酶的穩定化，其使用Ser和其它胺基酸殘基代替去穩定Cys殘基。然而，ADA中活性位點的突變分析顯示替換Cys殘基(Cys 262)導致具有活性顯著降低的酶，Bhaumik 等人 1993，The J.0f Biol Chem, 268.(8):5464_5470。因此，在本發明之前，並不知道通過用另一胺基酸殘基代替活性的和暴露的Cys殘基而穩定腺苷脫氨酶，同時保持最佳的可用酶活性。
因此，有利地是提供穩定的rbADA和rhADA，即，在儲存過程和對酶最佳PEG化有用的PH水平下的加工過程中沒有明顯降解。

發明內容
因此，本發明提供重組ADA，相對於野生型ADA酶，其任何可氧化的半胱氨酸殘基被不可氧化的(non-oxidizable)胺基酸殘基代替。該突變蛋白ADA包含不可氧化的胺基酸殘基，其為天然存在的L-胺基酸中的一種，例如，丙氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬醯胺、脯氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或現有技術已知的天然存在的L-胺基酸的變體和衍生物，例如，2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β -丙氨酸、β -氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4_ 二氨基丁酸、鎖鏈素、2，2』 -二氨基庚二酸、2，3_ 二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬醯胺、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-Ν-甲基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸等。任選地，避免蛋氨酸或色氨酸，因為這些是潛在可氧化的。
更優選地，該不可氧化的胺基酸殘基為絲氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種。最優選絲氨酸。在某些優選實施方案中，該可氧化的半胱氨酸位於成熟ADA蛋白的約74位。該重組ADA優選為重組牛ADA或重組人ADA，其例如，從根據SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的DNA分子翻譯，且其優選包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。當重組ADA為根據SEQ ID NO:1的重組牛ADA時,該ADA任選以多態性(polymorphism)表達,該多態性選自Gln代替Lys198 ;Ala代替Thr245 ;和Arg代替Gly351的一種或多種。
本發明還提供聚環氧烷-ADA綴合物(conjugate)，其中所述聚環氧烷優選為聚乙二醇。任選地，該聚乙二醇通過連接基化學物(l`inker chemistry)綴合至重組腺苷脫氨酶，該連接基化學物選自琥拍醯亞胺基碳酸酯(succinimidylcarbonate),噻唑燒硫酮,尿燒，琥珀醯亞胺基琥珀酸酯，和基於醯胺的連接基。優選琥珀醯亞胺基碳酸酯。該聚乙二醇優選與重組腺苷脫氨酶的Lys的ε氨基共價連接。
該聚乙二醇-ADA綴合物包含至少I個(即，I個或多個)與ε氨基連接的聚乙二醇鏈，優選至少5個(即，5個或更多)與ε氨基連接的聚乙二醇鏈，或更優選地，約11至約18個與ε氨基連接的聚乙二醇鏈，所述ε氨基為重組ADA的Lys殘基的ε氨基。
本發明綴合物的聚乙二醇的分子量為約2,000至約100，000kDa，或更優選約4，000 至約 45，OOOkDa0
本發明進一步提供純化本發明的重組腺苷脫氨酶的方法。例如，該重組腺苷脫氨酶優選通過離子交換色譜法(例如，Capto Q，DEAE和SP色譜法)純化，且SEQ ID NO:1的重組腺苷脫氨酶優選通過疏水作用色譜法純化。
本發明進一步提供在哺乳動物中治療ADA-介導的病症的方法，包括給藥有效量的本發明的重組ADA。所述ADA-介導的病症包括，例如，SCID、癌症等。
發明詳述
本發明提供穩定的重組腺苷脫氨酶。本發明的腺苷脫氨酶通過用可接受的可選胺基酸殘基替換當酶在溶液中時經受氧化過程的半胱氨酸殘基而提供，該可選胺基酸殘基保留酶的活性、電荷和三級結構同時去除分解不穩定性的來源。
A.定義
為了對本發明提供清楚的說明，多個術語如下進行定義。
術語"重組體"是指一種蛋白質，其使用在天然狀態不具有能表達蛋白質的DNA的內源性拷貝的細胞而產生。該細胞產生重組蛋白質，因為它們已通過引入合適分離的核酸序列而遺傳性改變。該術語還涉及細胞，或核酸，或載體(vector)，其已通過引入異源的(外源性或外來)核酸或將天然核酸改變成對於細胞而言非天然的形式而進行修飾，或該細胞是從如此修飾的細胞衍生而來。因此，例如，重組細胞表達天然(非重組)形式的細胞中沒發現的基因，表達天然形式中發現的基因的突變體，或表達原本異常表達、表達不充足或根本不表達的天然基因。
如本文所述，"核酸"或"核酸序列"涉及單或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另有限定，包括以與天然存在的核苷酸類似的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。除非另有所述，具體的核酸序列包括其互補序列。
與特定核酸有關的術語"編碼"，其包括涉及包含用於翻譯成特定蛋白質的信息的核酸。該信息通過使用密碼子而指定。
"宿主細胞"是一種細胞，其可支持表達載體的複製或表達。宿主細胞可為原核細胞如大腸桿菌，或真核細胞如酵母細胞，昆蟲細胞，兩棲動物細胞，或哺乳動物細胞。
如本文所述，"多肽"、"肽"和"蛋白質"可互換使用，且包括涉及胺基酸殘基的聚合物。
術語"殘基"或"胺基酸殘基"或"胺基酸"包括涉及摻入至蛋白質、多肽或肽(統稱為"肽")的胺基酸。該胺基酸可為天然存在的胺基酸，且除非另有限定，可包括天然胺基酸的已知類似物，其 可以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用。
"轉染"是指表達載體被宿主細胞吸收，無論任何編碼序列是否實際被表達。本領域技術人員已知多種轉染方法。例如，轉染在表達載體和高濃度的磷酸鈣的存在下，通過電穿孔，通過使用噬菌體或病毒表達載體以插入宿主細胞，通過機械插入核酸，甚至通過在未包裝的(unpackaged)核酸片段的存在下培養宿主細胞而完成。通常當操作感興趣的載體的任何指示在宿主細胞中出現時確認轉染成功。
"轉化"描述了將核酸引入至生物體中，使得核酸是可複製的，或者作為染色體外元件或通過整合進入宿主染色體。根據使用的宿主細胞，轉化使用適合具體宿主細胞的本領域已知的方法而完成。使用氯化I丐的I丐處理，如描述於Cohen, S.N.Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA),69:2110(1972)和Mandel 等人，J.Mol.Biol.53:154(1970)，通常用於原核生物或其它包封在細胞壁中的細胞(例如，許多細菌和/或植物細胞)。對於沒有這樣的細胞壁的哺乳動物細胞，優選 Graham, F.和 van der Eb, A.,Virology, 52:456-457 (1978)的憐酸鈣沉澱法。哺乳動物細胞宿主體系轉化的一般方面已描述於1983年8月16日授權的美國專利號4，399，216。引入到酵母的轉化通常根據Van Solingen, P.，等人，J.Bact.，130:946 (1977)和 Hsiao, C.L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 76:3829 (1979)的方法進行。然而，也可使用任何其他本領域已知的將核酸,例如，DNA，引入細胞的方法，如，例如，通過核注射，脂轉染，或通過原生質體融合。
如本文所述，關於核酸的術語"互補"是指當使用第一核酸分子作為模板複製該分子以形成新的第二核酸鏈時產生的相反鏈(使用Watson-Crick鹼基配對)。在本發明一個方面，當它們在嚴格條件下雜交或結合在一起時，認為兩個核酸分子是彼此互補的。
"可操作連接(Operablylinked)"是指組分(例如，調節區和可讀框)的並置(juxtaposition),使得可進行組分的正常功能。因此，"可操作連接"至控制序列的可讀框是指一種構型，其中所述編碼序列可在這些序列的控制下表達。
"控制序列"是指在具體宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所需的核酸序列。適於原核生物的控制序列，例如，包括啟動子，任選包括操縱基因序列(operatorsequence)，核糖體結合位點，以及可能的其它仍然了解很少的序列。已知例如真核細胞使用這些控制序列作為啟動子、聚腺苷酸化(polyadenylation)信號和增強子，僅舉數例。
"表達體系"或"表達載體"是指以可操作的連接含有所需的編碼序列和控制序列的核酸序列，以使得用這些序列轉化的宿主能產生編碼的蛋白質。為實現轉化，該表達體系可包含在載體上；然而，相關核酸分子可隨後也整合在宿主染色體中。
如本文所述，"細胞"、"細胞系"和"細胞培養物"可互換使用且所有這些名稱包括子代。因此，"轉化體"或"轉化細胞"包括原代主體細胞(primarysubject cell)和其來源的培養物，而不考慮轉移的次數。也應理解由於故意的或無意的突變，所有子代的基因組內含物可能不完全相同。包括與在原始轉化細胞中篩選時具有相同功能的突變體子代。可以使用不同的名稱，其從上下文看是清楚的。
就本發明而言，術語"殘基"應理解是指化合物的部分，其涉及，例如，PEG、ADA、胺基酸，等，其在經歷被另一化合物取代的反應後保留。
就本發明而言，術語"聚合物殘基"例如，"PEG殘基"每個應理解為聚合物或PEG的部分，其在經歷與其它化合物、部分等反應後保留。
就本發明而言，本文使用的術語「烷基」是指飽和脂肪烴，包括直鏈，支鏈和環狀烷基。術語「燒基」還包括燒基-硫基-燒基，燒氧基燒基，環燒基燒基，雜環燒基和Cu燒基羰基烷基。優選地，該烷基具有I至12個碳。更優選地，其為約I至7個碳的低級烷基，還更優選約I至4個碳。該烷基可為取代的或未取代的。當為取代的時，該取代的基團優選包括齒素、氧基、置氣基、硝基、氰1基、燒基、燒氧基、燒基_硫基、燒基_硫基_燒基、燒氧基燒基、燒基氣基、二齒代甲基、輕基、疏基、輕基、氛基、燒基娃燒基、環燒基、環燒基燒基、雜環燒基、雜芳基、烯基、炔基、C1^烴基(hydrocarbonyl)、芳基和氨基。
就本發明而言，本文使用的術語「取代」是指添加選自以下的一個基團或用選自以下的一個基團替換官能團或化合物中包含的一個或多個原子:滷素、氧基、疊氮基、硝基、氰基、燒基、燒氧基、燒基_硫基、燒基_硫基_燒基、燒氧基燒基、燒基氣基、二齒代甲基、輕基、疏基、輕基、氰1基、燒基娃燒基、環燒基、環燒基燒基、雜環燒基、雜芳基、稀基、塊基、C^6烴基、芳基和氨基。
本文使用的術語「烯基」是指含至少一個碳-碳雙鍵的基團，包括直鏈、支鏈和環狀基團。優選地，該烯基具有約2至12個碳。更優選地，其為約2至7個碳的低級烯基，還更優選約2至4個碳。該烯基可為取代的或未取代的。當為取代的時，該取代的基團優選
包括齒素、氧基、置氣基、硝基、氰1基、燒基、燒氧基、燒基_硫基、燒基_硫基_燒基、燒氧基燒基、燒基氣基、二齒代甲基、輕基、疏基、輕基、氛基、燒基娃燒基、環燒基、環燒基燒基、雜環燒基、雜芳基、稀基、塊基、C1^燒基擬基燒基、芳基和氣基。[0039]本文使用的術語「炔基」是指含至少一個碳-碳三鍵的基團，包括直鏈、支鏈和環狀基團。優選地，該炔基具有約2至12個碳。更優選地，其為約2至7個碳的低級炔基，還更優選約2至4個碳。該炔基可為取代的或未取代的。當為取代的時，該取代的基團優
選包括齒素、氧基、置氣基、硝基、氰1基、燒基、燒氧基、燒基_硫基、燒基_硫基_燒基、燒氧基燒基、燒基氣基、二齒代甲基、輕基、疏基、輕基、氛基、燒基娃燒基、環燒基、環燒基燒基、雜環烷基、雜芳基、烯基、炔基、Cp6烴基、芳基和氨基。"炔基"的實例包括炔丙基、丙炔和
3-己炔。
就本發明而言，術語「芳基」是指包含至少一個芳環的芳香烴環體系。該芳環可任選與其它芳香烴環或非芳香烴環稠合或連接。芳基的實例包括，例如，苯基、萘基、1，2，3，
4-四氫萘和聯苯基。芳基的優選實例包括苯基和萘基。
就本發明而言，術語「環烷基」是指C3_8環烴。環烷基的實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基和環辛基。
就本發明而言，術語「環烯基」是指包含至少一個碳-碳雙鍵的C3_8環烴。環烯基的實例包括環戊烯基、環戊二烯基、環己烯基、1，3-環己二烯基、環庚烯基、環庚三烯基和環
辛烯基。
就本發明而目，術語「環燒基燒基」是指被C3_8環燒基取代的燒基。環燒基燒基的實例包括環丙基甲基和環戊基乙基。
就本發明而言，術語「烷氧基」是指通過氧橋連接至母體分子部分的指定碳原子數的燒基。燒氧基的實例包括， 例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。
就本發明而目，「燒基芳基」是指被燒基取代的芳基。
就本發明而目，「芳燒基」是指被芳基取代的燒基。
就本發明而目，術語「燒氧基燒基」是指被燒氧基取代的燒基。
就本發明而目，術語「燒基_硫基_燒基」是指燒基_S_燒基硫釀，例如甲基硫基甲基或甲基硫基乙基。
就本發明而言，術語「氨基」是指現有技術已知的從氨衍生的含氮基團，其通過用有機基團代替一個或多個氫基而得到。例如，術語「醯基氨基」和「烷基氨基」分別是指具有醯基和烷基取代基的特定的N-取代的有機基團。
就本發明而言，術語「烷基羰基」是指被烷基取代的羰基。
就本發明而言，術語「滷素』或「滷」是指氟、氯、溴和碘。
就本發明而言，術語「雜環烷基」是指包含至少一個選自氮、氧和硫的雜原子的非芳環體系。該雜環烷基環可任選與其它雜環烷基環和/或非芳香烴環稠合至或連接。優選雜環烷基具有3至7元。雜環烷基的實例包括，例如，哌嗪、嗎啉、哌啶、四氫呋喃、吡咯烷和吡唑。優選雜環烷基包括哌啶基、哌嗪基、嗎啉基和吡咯烷基。
就本發明而言，術語「雜芳基」是指包含至少一個選自氮、氧和硫的雜原子的芳環體系。該雜芳基環可與一個或多個雜芳基環、芳香或非芳香烴環或雜環烷基環稠合或連接。雜芳基的實例包括，例如、吡啶、呋喃、噻吩、5，6，7，8-四氫異喹啉和嘧啶。雜芳基的優選實例包括噻吩基、苯並噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡嗪基、嘧啶基、咪唑基、苯並咪唑基、呋喃基、苯並呋喃基、噻唑基、苯並噻唑基、異噁唑基、噁二唑基、異噻唑基、苯並異噻唑基、三唑基、四唑基、批咯基、噴哚基、吡唑基和苯並吡唑基。[0054]就本發明而言，術語「雜原子」是指氮、氧和硫。
在一些實施方案中，取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羥基烷基和疏基燒基；取代的稀基包括竣基稀基、氣基稀基、二稀基氣基、輕基稀基和疏基稀基；取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羥基炔基和巰基炔基；取代的環烷基包括基團如4-氯環己基；芳基包括基團如萘基；取代的芳基包括基團如3-溴苯基；芳烷基包括基團如甲苯基；雜烷基包括基團如乙基噻吩；取代的雜烷基包括基團如3-甲氧基-噻吩；烷氧基包括基團如甲氧基；且苯氧基包括基團如3-硝基苯氧基。滷素應理解為包括氟、氯、碘和溴。
就本發明而言，「正整數」應理解為包括等於或大於I的整數，且本領域技術人員應理解在合理的範圍內。
就本發明而言，術語「連接」應理解為包括共價(優選)或非共價連接一個基團至另一個基團上，即，由於化學反應的結果。
術語"有效量"和「足夠量」就本發明而言應是指達到所需效果或治療效果的量，該效果是本領域普通技術人員所理解的。
就本發明而言，術語「腺苷」應理解為包括核苷腺苷和脫氧腺苷。腺苷還包括以AMP、ADP、ATP、dAMP、dADP或dATP形式存在的腺苷和脫氧腺苷。
就本發明而言，「腺苷介導的病症」或「腺苷脫氨酶-響應性病症(responsivecondition) 」應以廣義理解,包括任何受益於給藥ADA或其活性部分(active fraction)的疾病、病症或障礙等，且不考慮給藥途徑。
就本發明而言，「腺苷介導的病症的治療」或「腺苷脫氨酶-響應性病症的治療」如SCID應理解為是指當與在沒有ADA治療的情況下觀察到的相比，該病症或疾病被避免、最小化或減輕。該治療的病症可通過例如，腺苷的減少而證實。
廣義上說，應認為腺苷介導的病症的成功治療在獲得所需臨床響應時發生。或者成功的治療可通過當與在沒有ADA治療的情況下觀察到的相比時，獲得至少20%或優選30%，更優選40%或更高(S卩，50%或80%)的腺苷減少而定義，包括本領域技術人員考慮的其它臨床指標。
而且，單數術語在說明書中的方便使用決不是為了限制。因此，例如，包含酶(anenzyme)的組合物是指一個或多個分子的該酶。還應理解本發明不限於本文公開的具體構型、方法步驟和材料，這些構型、方法步驟和材料可稍加修改。
還應理解本文使用的術語僅是用於描述具體實施方案的目的，不是為了限制，因為本發明的範圍將由所附權利要求
和其等價物而限定。
B.重組產生的ADA酶
為獲得重組ADA酶(包括由人或牛源基因表達的酶)的最初努力，揭露了之前在源自牛腸的天然ADA中未觀察到的儲存不穩定性。進行了 rhADA和rbADA的分解產物的研究，且證實兩種ADA酶以與半胱氨酸降解一致的方式降解。例如，向rhADA添加氧導致親水性比rhADA更大的化合物的形成，該化合物的質量比rhADA高16和32Da。此外，這導致二硫醇的形成(通過添加二硫蘇糖醇[「DTT」，將亞群的降解劑逆轉而指示)；隨著pH增加降解增加；沉澱，尤其是隨PH增加且樣品濃縮時，表明分子間二硫鍵形成產生不溶的聚集物。
我們已確定單一、暴露的半胱氨酸是觀察到的rhADA降解的原因。牛ADA(未降解的)具有與rhADA非常類似的結構:牛ADA和rhADA在基本序列的相同位置都具有相同數量的半胱氨酸。rbADA還包含與半胱氨酸反應性一致的降解劑/雜質(二硫醇)。天然牛ADA在結構上不同於rbADA:天然牛ADA具有單摩爾的半胱氨酸鍵合至每摩爾ADA，且天然牛ADA對高pH穩定，表明鍵合至ADA的半胱氨酸的功能為保護基。鍵合至天然牛ADA的半胱氨酸可通過用還原劑，如巰基乙醇或DTT處理而去除。不希望被任何理論或假說束縛，這表明半胱氨酸基團通過二硫鍵綴合至ADA，如下所示:
ADA-S-S-半胱氨酸
其中ADA的基本序列中的一個半胱氨酸鍵合至半胱氨酸分子。該二硫鍵接合的半胱氨酸對第一段所述的氧化降解途徑穩定。半胱氨酸殘基出現在人和牛的成熟ADA的74，152，153，168和261位。對X射線晶體學得到的牛ADA的3-維結構的觀察(Kinoshita等人，2005, Biochemistry,44: 10562-10569)表明在 74，152，153，168 和 261 位的半胱氨酸沒有機會接合形成分子內二硫鍵。已知結構幾何位阻通常阻止附近的半胱氨酸殘基接合形成二硫鍵，如出現在ADA的152和153位的那些。因此，所有半胱氨酸殘基可能為還原狀態，且因此是氧化降解反應的潛在候選位點。然而，可視觀察上述牛ADA的3-維結構表明，相比另外4個半胱氨酸，半胱氨酸74以更大的程度清楚地暴露於溶劑，而且，似乎另外4個半胱氨酸以能防止與溶劑化的反應物的顯著相互作用的程度埋藏在酶結構內(條件是蛋白質未變性)。單一反應性半胱氨酸殘基的存在將解釋天然牛腺苷脫氨酶的單衍生化(monoderivatization),其可能是由於翻譯後修飾的結果。
上述事實表明在74位的反應性半胱氨酸可能是在rhADA和rbADA中觀察到降解的原因，且封端半胱氨酸的反應性-S-H基團將防止rhADA或rbADA經歷對於那些重組酶觀察到的明顯的氧化降解途徑。進行以下實驗以確定是否是這種情況。在37°C將濃度為約0.6mg/mL的重組hADA與125mM碘乙醯胺(IAA)在pH 7.4的磷酸鈉緩衝液中反應16小時。開始反應幾分鐘內，通過有UV和質譜檢測的RP-HPLC的樣品分析顯示約70.9 %的rhADA被IAA單衍生化，且 17.2%在兩個位點衍生化。在孵育2和16小時後，色譜圖形沒有明顯變化，表明該衍生物對rhADA典型的氧化降解途徑是穩定的。製備rhADA的類似樣品(缺失IAA)，並類似地進行分析。在37°C和pH 7.4孵育16小時後，該rhADA蛋白降解至30%的程度(超過樣品最初的降解)。該結果與單個、主要暴露的半胱氨酸一致，該半胱氨酸可通過用碘乙醯胺封端而保護。這些實驗在共同擁有的美國專利申請序列號11/738,012中更詳細的描述，其名稱為，"Stabilized Proteins,"在此引入作為參考，如上引用。
儘管封端對消除ADA中反應性半胱氨酸的氧化降解有效，但使用這種封端的酶需要增加製備步驟。因此，對通過用不同的胺基酸代替從編碼基因直接消除不穩定的Cys殘基進行了研究。合適的替換胺基酸是不進行相同類型氧化的胺基酸，且其不會破壞摺疊的ADA蛋白的三級結構，且在本發明的典型實施方案中，其經選擇從而在綴合物形成的過程中不會隨機綴合至活化的聚環氧烷(polyalkylene oxide) 0根據本發明，認為任何滿足該標準的現有技術已知的天然存在的胺基酸和/或非天然存在的胺基酸和/或其衍生物都適於代替可氧化的半胱氨酸。該胺基酸的示例性列表包括天然存在的L-胺基酸如:丙氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬醯胺、脯氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和酪氨酸。色氨酸和蛋氨酸相對容易氧化，在某些任選實施方案中，其為較不優選的。[0072]在宿主細胞中位點特異性摻入非天然胺基酸的重組蛋白質的製備方法已在文獻中有描述，例如，Liu 等人，2007，Nat.Methods 4(3):239_44，Xie 等人，2006 Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.7 (10):775_82，Ryu 等人，2006，Nat.Methods3 (4):263_65，Deiters 等人，2004, Bioorg.Med.Chem Lett.14(23):5743_5，Bogosian 等人，1989，J.Biol.Chem.264 (I):531-9，Tang 等人，2002，Biochemistry 41(34): 10635-45，Budisa 等人，1995，Eur.J.Biochem.230(2):788_96，和 Randhawa 等人，1994，Biochemistry，33 (14):4352_62。因此，替代胺基酸也可包括修飾的或較不典型的胺基酸，如:2_氨基己二酸、3-氨基己二酸、β -丙氨酸、β -氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4 二氨基丁酸、鎖鏈素、2，2』- 二氨基庚二酸、2，3_二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬醯胺、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-Ν-甲基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。
在重組ADA中任選代替半胱氨酸的更優選的天然存在的胺基酸，包括，例如，丙氨酸、絲氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸。最優選絲氨酸，且在下文示例。
因此，獲得表達野生型人和牛腺苷脫氨酶的DNA分子並進行密碼子優化以在大腸桿菌中表達，且還進行突變以表達在各個成熟蛋白的74位(翻譯的蛋白質的75位)各自含有Ser殘基代替天然存在的Cys殘基的突變蛋白rbADA和突變蛋白rhADA。這些分別% Ser74TbADA(SEQ ID NO:1)和 Ser74_rhADA(SEQ ID NO:3)。此外，應注意從牛腸分離的天然牛ADA也具有6個翻譯後從C-末端去除的殘基。本發明的Ser74-rbADA表達沒有所述6個C-末端殘基(作為突變蛋白)，或被翻譯後修飾以去除純化的天然牛ADA缺少的相同的C-末端殘基，這是本發明的任選特徵。
還應注意，從牛腸分離的天然牛ADA具有多態性:關於SEQ ID NO:5，牛ADA多態性包括，例如，穀氨醯胺在198位代替賴氨酸、丙氨酸在245位代替蘇氨酸；精氨酸在351位代替甘氨酸。因此認為本發明的重組74位突變蛋白牛ADA，還可在一個或多個所關注的位置或那些位置的類似位置具有其它 取代:Gln代替Lys198 ；Ala代替Thr245 ；Arg代替Gly351。
在本發明另一方面，本發明提供分離的DNAs，其編碼具有本文所述的氨基序列SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的突變蛋白ADA。其它用一種或多種取代而編碼突變蛋白ADA的DNAs:Gln代替Lys198 ;Ala代替Thr245 ;Arg代替Gly351也認為在本發明的範圍內。
合適的表達載體可分別從編碼rhADA或rbADA的基因組或cDNA製備，其任選在合適的可操作連接的誘導型啟動子的控制下。該DNA優選是為合適的宿主細胞優化的密碼子且通過任何現有技術已知的便利方法突變，例如，通過高效寡核苷酸-定向的誘變(OlsenDB和 Eckstein F，Proc Natl Acad SciUSA 87:1451_5 ;1990)，具有重疊長寡核苷酸的全基因合成(Vasantha N和Filpula D,Gene 76:53-60 ;1989) ,PCR介導的基因合成(JayaramanK 等人，Proc Natl Acad Sci USA 88:4084_88 ;1991)，或重疊延伸 PCR(Pogulis RJ 等人，Methods Mol Biol 57:167-76 ; 1996)。
通常，原核生物對於初始克隆DNA序列和構建本發明使用的載體是優選的。例如，大腸桿菌K12菌株MM 294(八10:號31，446)是特別有用的。可使用的其它微生物菌株，僅僅是作為實例，包括大腸桿菌菌株如大腸桿菌B和大腸桿菌X1776 (ATCC號31，537)。可使用上述菌株，以及，例如，大腸桿菌菌株W3110 (F-，λ -，原養型，ATCC號27，325)，Κ5772 (ATCC號53，635)，和SRlOl，芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，和其他腸桿菌科如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或粘質沙雷氏菌(Serratia marcesans)和各種假單胞菌屬菌種。
通常，含複製子和控制序列(其源自與宿主細胞相容的種類)的質粒載體與這些宿主關聯使用。常規質粒載體是優選用下述酶識別位點工程化的雙鏈環狀DNA分子，該酶識別位點適於插入外源性DNA序列，抗生素可選基因，用於在宿主細胞中自主繁殖的複製起點，和用於鑑別或選擇包含重組插入DNA的克隆的基因。適用於大腸桿菌的可用質粒載體包括，例如，ρΕΤ3,ρΕΤ9,ρΕΤ11 和延長的 pET 系列(由 Novagen Corporation編目),pBAD,trc, phoA, trp,和 Oi7kA3i7k 質粒。
僅僅是作為實例，大腸桿菌通常使用由大腸桿菌菌種得到的質粒PBR322轉化(參見，例如，Bolivar等人，1977，Gene, 2:95)。pBR322包含氨苄青黴素和四環素抗性基因且因此提供鑑定轉化細胞的簡單方法。類似的，PUC質粒提供便利的克隆載體，其具有用於選擇和複製的DNA分子(Yanisch-Perron，等人，1985，Gene 33:103_119，其公開內容以其整體在此引入作為參考)。該PBR322質粒，或其它微生物質粒或噬菌體，也必須包含，或被修飾而包含啟動子，該啟動子可被微生物有機體用於表達其自己的編碼的蛋白質。
在重組DNA構建中最經常使用的那些啟動子包括內醯胺酶(青黴素酶)和乳糖啟動子體系(Chang 等人，1978Nature, 375:615 ；Itakura 等人，1977, Science, 198:1056 ；GoeddeI 等人，1979, Nature, 281:544)和色氨酸(trp)啟動子體系(Goeddel 等人，1980,Nucleic Acids Res.，8:4057 ；ΕΡ0申請公開號0036，776)。儘管最經常使用這些，但已發現和使用其它微生物啟動子，且關於它們的核苷酸序列的具體詳情已被公開，使得技術人員可將它們與本領域已知的載體，例如，質粒載體功能性連接。
僅僅是作為實例，大腸桿菌中的轉錄調節可用任何以下誘導型啟動子實現:lac，trp,phoA,araBAD,T7,trc,和λ P1和Pk啟動子的衍生物，以及本領域已知的其它誘導型啟動子(例如，Makrides, 1996, Microbiol.Rev.60:512_538，其公開內容以其整體在此引入作為參考)。
任選與載體相容的合適的誘導子條件包括，例如，阿拉伯糖，乳糖，或熱誘導，磷酸鹽限制(phosphate limitation),色氨酸限制(tryptophan limitation),僅舉數例。優選地，該誘導子元件為Lac操縱子，其可被異丙基硫代半乳糖苷("IPTG")誘導。
·[0084]合適的信號序列(信號肽)可源自pelB, fd pill或ompA。
合適的抗生素選擇標記是本領域熟知的且包括，例如，賦予氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素、利福平或四環素抗性的那些，等。
合適的複製起點序列包括以下質粒中所發現的那些:pUC19，pACYC177，pUBllO,pE194, pAMBl, pIJ702, pBR322, pBR327 和 pSClOl。
合適的終止序列包括,例如，曬菌體fd主要終止子(major terminator), ΤΦ和rrnBo
除了原核生物，還可使用真核微生物，如酵母培養物。釀酒酵母或普通的麵包酵母是真核微生物中最經常使用的，雖然通常也可使用多種其它菌株。為在酵母屬(Saccharomyces)中表達，通常使用質粒 YRp7,例如(Stinchcomb 等人，1979, Nature, 282:39 ；Kingsman 等人，1979, Gene, 7: 141 ；Tschemper 等人，1980, Gene, 10: 157)。該質粒已包含ixni基因，該衛I基因提供用於缺乏在色氨酸中生長能力的酵母的突變株的選擇標記，例如，ATCC 號 44,076 或 PEP4-1 (Jones，1977，Genetics，85:12)。然後作為酵母宿主細胞基因組特徵的Ixnl損傷的存在提供有效的環境用於通過在色氨酸不存在的情況下的生長來檢測轉化。
已顯示巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達體系實現獲得幾種蛋白質的高水平產生(Cregg，J.M.等人，1993，Bio/Technology 11:905_910，其公開以其整體在此引入作為參考)，且可用於表達ADA作為在巴斯德畢赤酵母的細胞質中的可溶蛋白質。
酵母載體中合適的啟動序列包括3-磷酸甘油酸激酶的啟動子(Hitzeman等人，J.1980, Biol.Chem.，255:2073)或其它糖酵解酶(Hess 等人，1968，J.Adv.Enzyme Reg.，7:149 !Holland等人，1978,Biochemistry, 17:4900),如烯醇化酶、甘油醒_3_磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。在構建合適的表達質粒中，與這些基因相關的終止序列也連接至序列的表達載體3'，該序列需要被表達以提供mRNA的聚腺苷酸化和轉錄終止。其它具有由生長條件控制的轉錄的其它優點的啟動子是以下的啟動子區域:乙醇脫氫酶2 (alcohol dehydrogenase 2)、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解性酶、和上述甘油醛-3-磷酸脫氫酶，以及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。任何含與酵母相容的啟動子、複製起點和終止序列的質粒載體都是適合的。
複製起點可通過構建載體以包括外源起點，如可源自SV40或其它病毒(例如，Polyoma, Adeno, VSV, BPV)來源的外源起點來提供,或可通過宿主細胞染色體複製機理而提供。如果載體整合入宿主細胞染色體中，後者通常是足夠的。其它有用的質粒元件可包括表達的編碼侶伴蛋白質、脯氨酸異構酶蛋白質或二硫鍵重排的(disulfide shuffling)蛋白質的基因。
`[0092]C.聚合綴合物(polymer conjugate)
在本發明另一方面，該突變蛋白ADA如Ser74-rbADA(SEQ ID NO:1)和Ser74ThADA(SEQ ID NO:3)蛋白質綴合至合適的聚合物以製備聚合綴合物。
在優選方面,該突變蛋白ADA多肽綴合至基本(substantially)非抗原性聚合物，優選聚環氧烷("ΡΑ0")。
該ADA-聚合綴合物通常相應於式(I):
(I) [R-NHJz-(ADA)
其中
(ADA)表示重組突變蛋白腺苷脫氨酶或其活性片段；
NH-為在用於連接至聚合物的突變蛋白ADA上的胺基酸的氨基；
(Z)為正整數,優選約I至約80,更優選約5至約80,還更優選約11至約18 ;且
R包括基本非抗原性聚合物殘基，其以可釋放或不可釋放的形式連接至ADA。
在更優選的方面，該聚合物包括聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG可為直鏈、支鏈或多臂的PEG。通常，聚乙二醇具有下式:
-O- (CH2CH2O)n-
其中(η)為正整數，優選約10至約2，300，更優選約40至約2，300。聚合物的平均分子量為約2，OOO至約100，OOODa0更優選地，該聚合物的平均分子量為約4，OOODa至約45，OOODa，還更優選地，4，OOODa至約20，OOODa0最優選地，該PEG為約5，000道爾頓。其它分子量也在考慮範圍內以滿足技術人員的需要。
或者本發明的聚乙二醇(PEG)殘基部分可由以下結構表示:
-Y11-(CH2CH2O) ^CH2CH2Y1 r,
-Y11-(CH2CH2O) n-CH2C ( = Y12) -Y11-,
-Y11-C ( = Y12)-(CH2)all-Y13-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y13-(CH2) an-C( = Y12)-Y11-,
-Y11- (CR11R12) al2-Y13- (CH2) bll-0_ (CH2CH2O) n_ (CH2) bll_Y13- (CR11R12) al2_Yn_，
-Y11-(CH2CH2O)n-CH2CH2-,
-Y11-(CH2CH2O) n-CH2C ( = Y12)-，
-C ( = Y12)- (CR11R12) al2-Y13- (CH2) bll-0- (CH2CH2O) n_ (CH2) bll_Y13- (CR11R12) al2-，
其中:
Y11 和 Y13 獨立地為 0，S，SO, SO2, NR13 或鍵；
Y12 為 0，S，或 NR14 ;
R11-M獨立地選自龜*、C^6燒基、C2_6稀基、C2_6塊基、C3_19支鏈燒基、C3_8環燒基、C^6取代的烷基、C2_6取代的烯基、c2_6取代的炔基、c3_8取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、C1^6雜烷基、取代的CV6雜烷基、C1^6烷氧基、芳基氧基、C1^6雜烷氧基、雜芳基氧基、c2_6烷醯基、芳基羰基、c2_6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、c2_6烷醯基氧基、芳基羰基氧基、C2_6取代的燒酸基、取代的芳基擬基、C2_6取代的燒酸基氧基、取代的芳基氧基擬基、C2-Q取代的燒酸基氧基和取代的芳基擬基氧基；
(all), (al2)和(bll)獨立地為O或正整數，優選0_6，且更優選0，I或2 ;和
(η)為約10至約2300的整數。
作為實例，該PEG可以以下述非限制性方式起作用:
-C ( = Y14)-C ( = Y14) -Y- (CH2) m- (CH2CH2O) n_，
-C ( = Y14) -NR11- (CH2) m_ (CH2CH2O) n_，
-CR15R16- (CH2) ffl- (CH2CH2O) n_
其中
Rn、R15和R16獨立地選自HXh烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、雜烷基、取代的雜烷基和取代的Cu烷基；
(m)為O或為正整數，且優選I或2 ;
Y14 為 O 或 Sj
(η)表示聚合度。
在這些方面，該聚合物(R基)包括封端基團，即，在聚合物的末端的基團。該封端基團可選自以下的任一種:nh2、OH、SH、CO2H, C16烷基，優選甲基，這些基團是本領域技術人員所理解的。
在另一方面，該綴合物的聚合物部分可以是為ADA提供多個連接點中的一個。或者多個PEG可連接至ADA。[0132]PEG化的ADA的藥代動力學和其它特性可通過控制PEG分子量、連接基化學物(linker chemistry)和PEG鏈與酶的比例按需要調節以用於所需的臨床應用。
在這些方面，該ADA可以以可釋放或不可釋放的形式通過本領域已知的多種連接基連接至非抗原性聚合物。
該可釋放聚合物體系可基於苄基消除或三甲基鎖內酯化(locklactonization)。可釋放聚合物體系的活化的聚合物連接基可根據共同授讓的美國專利號6，180,095,6，720，306，5，965，119，6，624，142和6，303，569而製備，其內容在此引入作為參考。或者該ADA聚合綴合物使用某些N-二(羥乙基)甘氨酸(bicine)聚合物殘基製備，如描述於共同授讓的美國專利號7，122，189和7,087, 229和美國專利申請號10/557，522,11/502, 108和11/011,818的那些，在此引入作為參考。其它考慮的可釋放聚合物體系也描述於PCT/US07/78600，其內容在此引入作為參考。
本文考慮的可釋放或不可釋放ADA聚合綴合物的示例性實例描述於美國專利申請號60/913，039，其內容在此引入作為參考。
聚合物綴合優選為PEG化反應，這些反應對於本領域技術人員是已知的。簡言之，突變蛋白rbADA或rhADA與活化的聚合物反應以形成ADA-聚合綴合物。在這點上,可使用多種活化的或官能化的(functionalized)聚乙二醇,包括描述於例如共同授讓的美國專利號5，122，614，5，324，844，5，612，460和5，808，096 (琥珀醯亞胺基碳酸酯_活化的聚乙二醇(SC-PEG)和相關活化的PEG' S)，美國專利號5，349，001 (環狀亞胺硫酮(cyclicimide thione)活化的PEG' s)，美國專利號5，650，234，和其它本領域技術人員已知的那些。上述每個的公開內容在此引入作為參考。還參見從Nektar/Shearwater Polymers得到的活化的聚合物。本領域技術人員可使用多種活化形式的用於連接的聚合物，而沒有過多的實驗。
如本領域技術人員所理解，這些綴合反應通常在合適的緩衝液中使用幾倍摩爾過量的活化的PEG而進行。一 些優選用直鏈PEG(如上述SC-PEG)製備的綴合物每個ADA酶可包含平均約10至約80個PEG鏈。因此，可使用幾百倍摩爾過量，例如，200-1000倍。用於支鏈PEG和連接至酶的PEG的摩爾過量將是較低的，且可使用本文所述的描述它們的專利和專利申請中描述的技術而確定。
在這些方面，該聚環氧烷通過連接基化學物綴合至蛋白質，該連接基化學物包括，例如，琥珀醯亞胺基碳酸酯、噻唑烷硫酮、尿烷和基於醯胺的連接基。該聚環氧烷優選共價連接至ADA上的Lys的ε氨基，雖然其它共價連接的位點是本領域已知的。該ADA聚合綴合物可包括至少5個聚乙二醇鏈連接至酶上的Lys的ε氨基,但也可包括約11_18個PEG鏈連接至酶上的Lys的ε氨基。
儘管ADA每個酶分子通過賴氨酸連接綴合約11至約18個PEG分子，但可改變PEG與ADA的比例以修改組合的綴合物的物理和動力學特性以適合任何具體臨床情形。
從上述可明顯地是本發明的其它方面包括使用任何可商購的或報導的活化的PEG或類似聚合物綴合ADA酶或其片段，以提供本文所述的治療方法中使用的綴合物。參見，例如，Nektar Advanced Pegylation 目錄，2004 (Nektar, San Carlos, California),以其整體在此引入作為參考.[0141]活化的PEGs可包括直鏈、支鏈的或U-PEG衍生物如描述於美國專利號5，681，567，5，756，593,5, 643，575,5, 919，455,6, 113，906,6, 566，506,6, 153，655,6, 395，266 和6，638，499,6, 251，382和6，824，766的那些(也在此引入作為參考)。該聚合物的非限制
性實例相應於具有以下結構的聚合物體系(i)-(vii):
權利要求
1.組腺苷脫氨酶，其中以野生型腺苷脫氨酶表達的可氧化的胺基酸殘基被不可氧化的胺基酸殘基代替，其中所述可氧化的胺基酸殘基為74位的半胱氨酸，所述不可氧化的胺基酸殘基為絲氨酸。
2.權利要求
1的重組腺苷脫氨酶，其為重組牛腺苷脫氨酶。
3.權利要求
2的重組腺苷脫氨酶，其從根據SEQID NO:2的DNA分子翻譯。
4.權利要求
2的重組腺苷脫氨酶，其包含SEQID NO:1或具有選自以下的胺基酸取代的 SEQ ID NO:1:Gln 代替 Lys198; Ala 代替 Thr245; Arg 代替 Gly351,及其組合。
5.環氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述腺苷脫氨酶為權利要求
1的重組腺苷脫氨酶。
6.權利要求
5的聚環氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚環氧烷為聚乙二醇。
7.權利要求
6的聚環氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇通過選自以下的連接基綴合至重組腺苷脫氨酶:琥珀醯亞胺基碳酸酯、噻唑烷硫酮、尿烷和基於醯胺的連接基。
8.權利要求
6的聚環氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇與重組腺苷脫氨酶的Lys的ε氨基共價連接。
9.權利要求
6的聚環氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述重組腺苷脫氨酶包含一個或多個聚乙二醇鏈，所述聚乙二醇鏈與重組腺苷脫氨酶的一個或多個Lys殘基的ε氨基連接。
10.權利要求
6的聚環氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述重組腺苷脫氨酶包含約11至約18個聚乙二醇鏈，所述聚乙二醇鏈與重組腺苷脫氨酶的一個或多個Lys殘基的ε氨基連接。
11.權利要求
6的聚環氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇通過琥珀醯亞胺基碳酸酯連接基綴合至重組腺苷脫氨酶。
12.權利要求
6的聚環氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇的分子量為約2，000 至約 100，000。
13.權利要求
6的聚環氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇的分子量為約4，000 至約 45，000。
14.權利要求
6的聚乙二醇-腺苷脫氨酶綴合物，其中每個聚乙二醇鏈重約5，000道爾頓。
15.權利要求
1-14中任一項的重組腺苷脫氨酶在製備用於在哺乳動物中治療腺苷脫氨酶-介導的病症的藥物中的用途。
16.權利要求
15的用途，其中所述腺苷脫氨酶-介導的病症為嚴重聯合免疫疾病。
17.化權利要求
5的重組腺苷脫氨酶的方法，包括通過離子交換色譜法純化該蛋白質。
18.化包含SEQID NO:1的權利要求
5的重組腺苷脫氨酶的方法，包括通過疏水作用色譜法純化蛋白質。
19.過權利要求
17的方法製備的重組腺苷脫氨酶。
20.過權利要求
18的方法製備的重組腺苷脫氨酶。
21.離的DNA，其編碼具有胺基酸序列SEQID NO:1或具有選自以下的胺基酸取代的SEQ ID NO:1的重組腺苷脫氨酶:Gln 代替 Lys198; Ala 代替 Thr245; Arg 代替 Gly351,及其組合。
專利摘要
本發明公開了一種突變蛋白重組腺苷脫氨酶，其具有的任何可氧化的半胱氨酸殘基被不可氧化的胺基酸殘基所替代。本發明還公開了穩定的重組腺苷脫氨酶、聚合綴合物和使用它們治療的方法。
文檔編號C12Q1/68GKCN101688244 B發布類型授權 專利申請號CN 200880021124
公開日2013年5月8日 申請日期2008年4月18日
發明者戴維·R·菲爾普拉, 史蒂芬·K·揚斯特 申請人:希格馬託罕見疾病公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (1),