一種火焰蘭的雜交育種和無菌播種方法

2023-05-09 20:40:41 2

專利名稱：一種火焰蘭的雜交育種和無菌播種方法
技術領域：
本發明涉及植物的雜交育種方法，具體涉及一種火焰蘭的雜交育種和無菌播種方法。
背景技術：
火焰蘭屬(Reanathera)植物全世界約有21種，為附生或半附生植物，分布於東 南亞至喜馬拉雅地區，包括華南地區，我國原產3種，其中火焰蘭(Ren. Coccinea)產於廣 東，海南地區，植株高大生長健旺，雲南火焰蘭(Ren. imschootiana)和中華火焰蘭(Ren. sinica)產於雲南。火焰蘭生長健旺，花色豔麗，花數眾多，遠觀如火焰般絢麗，具有很高的 園藝應用價值和育種價值，是國際花卉市場上十分流行的高檔花卉，在世界上具有大量的 愛好者。而且由於其生長環境為熱帶、亞熱帶，適合在華南地區栽培，未來有希望在華南地 區建立其育種和生產基地，形成類似蝴蝶蘭、石斛蘭的產業。火焰蘭已成為世界上瀕危的植 物物種之一，所有野生種類均被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)附錄中而 被禁止貿易。火焰蘭雜交種比原生種花型花姿更為優美，生長勢和抗逆性強，在花色上比原生 種更為豔麗多彩，也能在國際市場上進行交易，現已成為世界火焰蘭產業的主流產品，但我 國火焰蘭的雜交育種工作還剛剛起步，火焰蘭產業具有廣闊的市場前景。火焰蘭雖具有很高的雜交親和性，但在與其他蘭科植物雜交時存在花期不遇問 題，同時由於花期不遇而無法進行一些遠緣雜交，此外已報導的其他植物的花粉低溫保存 時常發生黴變問題而導致花粉保存失敗。火焰蘭雜交種子由於其種胚發育不完全，自然狀 態下萌發率極低，需要無菌播種才能進行種苗生產。

發明內容
本發明的目的是提供一種火焰蘭的雜交育種的方法和萌發率高、成苗快、種苗品 質好的無菌播種的方法。本發明選擇具明顯特性、觀賞價值高的蘭科植物作為雜交母本，以火焰蘭作為父 本，進行雜交，授粉成功得到的果實在基本成熟而未開裂時，在種子萌發培養基上進行無菌 播種，種子萌發後再轉移到壯苗培養基上培養，形成的試管苗經過自然光照下煉苗10 20 天后出瓶栽培，成苗的移栽成活率可達90%以上，從而實現了本發明的目的。本發明的火焰蘭的雜交育種和無菌播種的方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)人工授粉以蘭科植物作為母本，以火焰蘭作為父本，採集父本的花粉授於 母本的柱頭上，並進行套袋處理，防止外來花粉的幹擾；(2)無菌播種當母本結出的雜交蒴果發育基本成熟而果實未開裂時，將該果 實搽抹乾淨，依次用體積分數為70 75%酒精溶液浸泡2 3分鐘後，置於質量分數為 0. 0. 2%的升汞溶液中消毒20 30分鐘，再用無菌水衝冼4 5次，吸乾果實表面 的水分，切開果實，將粉末狀種子接種到種子萌發培養基上培養，種子萌發先形成原球莖，隨後長成小苗，所述的種子萌發培養基為每升含花寶1號1 3. 0g，蛋白腖0. 5 2. 0g，椰 子汁100 150mL,蔗糖20 30g,瓊脂6 7g，活性炭0. 5 1. Og,肌醇80 120mg,甘氨 酸1. 5 2. 5mg,鹽酸硫胺素0. 05 0. 2mg,鹽酸吡哆醇0. 4 0. 8mg,煙酸0. 4 0. 8mg, 餘量為水，pH 5. 4 5. 8 ；自種子接種到種子萌發培養基上培養，一般30 90天種子萌發 形成原球莖，90 180天進一步形成小苗，種子萌發率60 90%，成苗率55 90% ；(3)壯苗培養將無菌播種獲得的小苗接種到壯苗培養基上培養，120 180天時 能形成健壯的植株，所述的壯苗培養基為每升含花寶1號1 3. 0g，蛋白腖0. 5 2. Og,萘 乙酸0.5 l.Omg、香蕉勻漿50 100g，椰子汁50 IOOmL,蔗糖15 20g，瓊脂6 7g， 活性炭0. 5 2. Og,肌醇80 120mg，甘氨酸1. 5 2. 5mg,鹽酸硫胺素0. 05 0. 2mg,鹽 酸吡哆醇0. 4 0. 8mg,煙酸0. 4 0. 8mg,餘量為水，pH 5. 4 5. 8 ；(4)試管苗移栽當小苗長成的植株5 8cm高時，將培養瓶轉移到自然光下煉 苗10 20天，然後將其取出，洗淨根部的培養基，移入蘭石木屑樹皮按體積比為2 3 1 2 1 2的混合基質中培養；常規管理，保持適當的通風和足夠的溼度，移栽的 成活率可達90%以上；上述步驟⑵和(3)中的培養條件為培養溫度M ^°C，光照度1500 20001x，光照12 16小時/天。在所述的人工授粉步驟，當母本和父本花期相同時，在母本花朵展開後2 4天， 取父本的花粉直接授於母本的柱頭上。在所述的人工授粉步驟，當母本和父本的花期不遇時，在父本火焰蘭的盛花期採 集花粉塊，採集時機選擇在火焰蘭花朵花瓣剛展開時，採集時間選擇在上午8 9時，採集 花粉置於無菌的塑料管中，密封置於4°C避光保存，當母本開花時，將低溫保存的父本花粉 在15 35°C的條件下解凍20 30min，再往放置花粉的塑料管中加入無菌水進行浸泡回 溼花粉20 30min，然後將有生活力的花粉授於母本柱頭上。按照上述方法進行火焰蘭的 花粉的保存，火焰蘭花粉的保存時間可達3 10個月。花粉生活力的測試可採用氯化三苯 四氮唑染色法測定花粉生活力，確認花粉有活力後將其授於母本的柱頭上。採用的上述潔 淨低溫保存的具有生活力的火焰蘭花粉、授粉前對花粉進行解凍和回溼處理等技術解決了 花粉保存時的黴變問題以及不同花期的品種和植株的雜交授粉阻礙，從而為火焰蘭新品種 選育打下基礎。所述的採集花粉置於無菌的塑料管中，密封置於4°C避光保存，優選，步驟為應 用無菌的牙籤輕輕挑掉花的藥帽，再用無菌牙籤將花粉塊粘連在牙籤尖上並迅速將花粉塊 放至潔淨無菌的Iml離心管中，每管放入1朵花的花粉塊，將放置了花粉塊的離心管再用一 無菌的玻璃瓶集中裝起來，並密封好，置於4°C避光保存。不同火焰蘭雜交種果實在授粉後的成熟期不同，但大部分火焰蘭雜交種子在授粉 後4個月時就能萌發，到5 6個月時達到萌發高峰，然後下降，但與蘭屬雜交的火焰蘭雜 種的果實發育成熟需要10 12個月時間。一般火焰蘭雜交種子最佳的萌發期是在果實發 育基本成熟而果實未開裂時。在步驟O)的無菌播種步驟，優選將種子萌發先形成的原球莖接種到分化培養基 上，使原球莖在分化培養基上形成小苗，所述的分化培養基是在種子萌發培養基的基礎上 每升添加6-卞基腺嘌呤5. Omg,培養條件為培養溫度M ，光照度1500 20001x，光照12 16小時/天。所述的母本蘭科植物優選為五唇蘭(Doritis pulcherrima)、小花萬代蘭 (Vandacoerulescens)或彩心建蘭(Cymbidium ensifolium)。步驟( 和C3)培養基中使用的花寶1號可從市場上購得。本發明具有雜交成功率高的特點，特別是對一些與火焰蘭雜交親本花期不遇的具 明顯特性、觀賞價值高的蘭科植物為雜交親本時十分有效。本發明採用獨特的培養基和培 養方法，使得火焰蘭雜交種子的萌發率高、成苗快、種苗品質好。本發明具有操作性強，育種 效率和應用價值高等優點。
具體實施例方式以下是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例中使用的花寶1號(HYPONeX 1)為美國生產，臺灣臺和園藝企業股份有限 股份有限公司分裝產品。實施例1 五唇蘭(Doritis pulcherrima)禾口雲南火焰蘭(Renanthera imschootiana)的雜 交育種和種苗繁殖(1)人工授粉雲南火焰蘭於3月初開花，在其單花花瓣剛展開時採集花粉，於上 午8 9時應用已滅菌的牙籤輕輕挑掉花的藥帽，再用牙籤將花粉塊粘連在牙籤尖上並迅 速將花粉塊放至潔淨無菌的Iml EP管(離心管)內，每管放入1朵花的花粉塊，將放置了花 粉塊EP管再用一無菌的玻璃瓶集中裝起來並密封好，最後將裝滿花粉的玻璃瓶放置於4°C 條件下避光保存。火焰蘭花粉保存的時間達3個月後，當母本五唇蘭於當年6月初開花時， 對低溫保存的火焰蘭的花粉進行解凍和回溼處理，以恢復和提高花粉的生活力。先將低溫 保存的火焰蘭花粉的在室溫(35°C)條件下解凍20分鐘後，再往放置花粉塊的EP管內加幾 滴無菌水進行回溼處理20分鐘，最後採用氯化三苯四氮唑染色法測定花粉生活力，確定花 粉有活力，將其授於母本的柱頭上。授粉後摘除母本的唇瓣後套袋，約1星期後去袋，要掛 上標籤，標籤上具有父、母本名稱、雜交日期和授粉人等信息。注意觀察其發育情況，3個月 時統計授粉的成功率，結實率均達90%以上，等果實變成橙黃色，達到基本成熟而未開裂時 可採集進行無菌播種。(2)無菌播種將授粉後5個月的果實先用酒精棉花搽抹乾淨果實表面汙物，接著 用體積分數為70%酒精溶液浸泡2分鐘後，置於質量分數為0. 1 %的升汞溶液中消毒30分 鍾，無菌水漂洗5次後，用無菌濾紙吸乾果實表面的水分，切開果實，將粉末狀種胚接種到 種子萌發培養基上，消毒成功率95 %以上，20天時可見種子膨大轉綠，30天時種子萌發形 成原球莖，90天進一步形成小苗。種子萌發率90%，成苗率90%。種子萌發培養基為每升 含花寶1號2. Og,蛋白腖2. Og,椰子汁IOOmL,蔗糖20g,瓊脂6g，活性炭1. Og,肌醇80mg,甘 氨酸2. 5mg，鹽酸硫胺素0. 05mg，鹽酸吡哆醇0. 8mg，煙酸0. 4mg，餘量為水，pH 5. 8。(3)壯苗培養將無菌播種獲得的小苗接種到壯苗培養基上培養，120天時能形成 健壯的植株。所述的壯苗培養基為每升含花寶1號3. 0g，蛋白腖2. 0g，萘乙酸lmg、香蕉勻 漿80g，椰子汁50mL，蔗糖15g，瓊脂6g，活性炭2. Og,肌醇80mg，甘氨酸2. 5mg，鹽酸硫胺素 0. 05mg，鹽酸吡哆醇0. 8mg，煙酸0. 4mg，餘量為水，pH 5. 8。
(4)試管苗移栽當植株約5-8釐米高時，將培養瓶轉移到自然光下煉苗15天，然 後將其從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，移入蘭石木屑樹皮按體積比為2 :1:1 的混合基質中，常規管理，保持適當通風和足夠的溼度，移栽的成活率均可達95%以上。在步驟⑵和步驟(3)中的培養條件為培養溫度，光照度20001x，光照12小
時/天。實施例2 小花萬代蘭(Vanda coerulescens)禾口雲南火焰蘭(Renanthera imschootiana) 的雜交育種和種苗繁殖(1)人工授粉雲南火焰蘭於3月初開花，在其單花花瓣剛展開時採集花粉，於上 午8 9時應用已滅菌的牙籤輕輕挑掉花的藥帽，再用無菌牙籤將花粉塊粘連在牙籤尖上 並迅速將花粉塊放至潔淨無菌的ImlEP管內，每管放入1朵花的花粉塊，將放置了花粉塊EP 管再用一無菌的玻璃瓶集中裝起來並密封好，最後將裝滿花粉的玻璃瓶放置於4°C條件下 避光保存。火焰蘭花粉保存的時間達6個月後，當母本小花萬代蘭於當年9月初開花時，對 低溫保存的火焰蘭的花粉進行解凍和回溼處理，以恢復和提高花粉的生活力。先將低溫保 存的火焰蘭花粉的在室溫條件下(30°C )解凍25分鐘後再往放置花粉塊的EP管內加幾滴 無菌水進行回溼處理25分鐘，最後採用氯化三苯四氮唑染色法測定花粉生活力，確定花粉 有活力，將其授於母本的柱頭上。授粉後摘除母本的唇瓣後套袋，約1星期後去袋，要掛上 標籤，標籤上具有父、母本名稱、雜交日期和授粉人等信息。注意觀察其發育情況，3個月時 統計授粉的成功率，結實率均達80%以上，等果實變成橙黃色，基本成熟未開裂時可採集進 行無菌播種。(2)無菌播種將授粉後5個月的果實先用酒精棉花搽抹乾淨果實表面汙物，接著 用體積分數為75%酒精浸泡3分鐘後，置於質量分數為0. 2%的升汞溶液中消毒20分鐘， 無菌水漂洗4次後，用無菌濾紙吸乾果實表明的水分，切開果實，將粉末狀種胚接種到種子 萌發培養基上，消毒成功率達100%，30天時可見種子萌發，60天時種子萌發形成原球莖， 120天進一步形成小苗。種子萌發率80%，成苗率60%。種子萌發培養基為每升含花寶 1號3. Og,蛋白腖1. 5g，椰子汁150mL，蔗糖30g，瓊脂7g，活性炭0. 5g，肌醇120mg，甘氨酸 1. 5mg,鹽酸硫胺素0. 2mg,鹽酸吡哆醇0. 4mg,煙酸0. 8mg,餘量為水，pH 5. 4。(3)壯苗培養將無菌播種獲得的小苗接種到壯苗培養基上培養，150天時能形成 健壯的植株。所述的壯苗培養基為每升含花寶1號2. 0g，蛋白腖1. 5g，萘乙酸0. 5mg、香蕉 勻漿100g，椰子汁IOOmL,蔗糖20g，瓊脂7g，活性炭1. Og,肌醇120mg，甘氨酸1. 5mg,鹽酸硫 胺素0. 2mg,鹽酸吡哆醇0. 4mg,煙酸0. 8mg,餘量為水，pH 5. 4。(4)試管苗移栽當植株約5 8釐米高時，將培養瓶轉移到自然光下煉苗20 天，然後將其從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，移入蘭石木屑樹皮按體積比為 1:1: 1的混合基質中，常規管理，保持適當通風和足夠的溼度，移栽的成活率均可達 90%以上。步驟(2)和(3)的培養條件為培養溫度，光照度15001x，光照14小時/天。實施例3 彩心建蘭(Cymbidium ensifolium)和雲南火焰蘭(Renanthera imschootiana) 的雜交育種和種苗繁殖
(1)人工授粉雲南火焰蘭於3月初開花，在其單花花瓣剛展開時採集花粉，於上 午8 9時應用已滅菌的牙籤輕輕挑掉花的藥帽，再用無菌牙籤將花粉塊粘連在牙籤尖上 並迅速將花粉塊放至潔淨無菌的ImlEP管內，每管放入1朵花的花粉塊，將放置了花粉塊EP 管再用一無菌的玻璃瓶集中裝起來並密封好，最後將裝滿花粉的玻璃瓶放置於4°C條件下 避光保存。火焰蘭花粉保存的時間達9個月後，當母本彩心建蘭於當年12月初開花時，對 低溫保存的火焰蘭的花粉進行解凍和回溼處理，以恢復和提高花粉的生活力。先將低溫保 存的火焰蘭花粉，在室溫(15°C )條件下解凍30分鐘後，再往放置花粉塊的EP管內加幾滴 無菌水進行回溼處理30分鐘，最後採用氯化三苯四氮唑染色法測定花粉生活力，確定花粉 有活力，將其授於母本的柱頭上。授粉後摘除母本的唇瓣後套袋，約1星期後去袋，要掛上 標籤，標籤上具有父、母本名稱、雜交日期和授粉人等信息。注意觀察其發育情況，3個月時 統計授粉的成功率，結實率達30 %，等果實變成橙黃色，基本成熟未開裂時可採集進行無菌 播種。(2)無菌播種將授粉後12個月的果實先用酒精棉花搽抹乾淨果實表面汙物，接 著用體積分數為70%酒精浸泡2. 5分鐘後，置於質量分數為0. 2%的升汞溶液中消毒25分 鍾，無菌水漂洗5次後，用無菌濾紙吸乾果實表面的水，切開果實，將粉末狀種胚接種到種 子萌發培養基上，消毒成功率達100%，90天時可見種子萌發，120天時種子萌發形成根狀 莖，將根狀莖接種培養於分化培養基中，60天可分化形成小苗。種子萌發率60 %，成苗率 55%。種子萌發培養基每升含花寶1號lg，蛋白腖0. 5g，椰子汁120mL，蔗糖25g，瓊脂6. 5g， 活性炭0. 7g，肌醇lOOmg，甘氨酸ang，鹽酸硫胺素0. Img,鹽酸吡哆醇0. 5mg,煙酸0. 5mg,餘 量為水，PH 5. 6。分化培養基為在種子萌發培養基的基礎上每升添加6-卞基腺嘌呤5. Omg0(3)壯苗培養將根狀莖分化獲得的小苗接種到壯苗培養基上培養，150天時能形 成健壯的植株。所述的壯苗培養基為每升含花寶1號1. 0g，蛋白腖0. 5g，萘乙酸0. 7mg、香 蕉勻漿50g，椰子汁75mL，蔗糖18g，瓊脂6. 5g，活性炭0. 5g，肌醇lOOmg，甘氨酸ang，鹽酸硫 胺素0. lmg，鹽酸吡哆醇0. 5mg，煙酸0. 5mg，餘量為水，pH 5.6。(4)試管苗移栽當植株約5 8釐米高時，將培養瓶轉移到自然光下煉苗10 天，然後將其從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，移入蘭石木屑樹皮按體積比為 3:1: 2的混合基質中，常規管理，保持適當通風和足夠的溼度，移栽的成活率均可達 95%以上。步驟(2)在種子萌發培養基和分化培養基中培養以及步驟( 的培養條件為培養 溫度^°C，光照度18001X，光照16小時/天。
權利要求
1.一種火焰蘭的雜交育種和無菌播種的方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)人工授粉以蘭科植物作為母本，以火焰蘭作為父本，採集父本的花粉授於母本 的柱頭上，並進行套袋處理；(2)無菌播種當母本結出的雜交蒴果發育基本成熟而果實未開裂時，將該果實搽抹 乾淨，依次用體積分數為70 75%酒精溶液浸泡2 3分鐘後，置於質量分數為0. 0. 2%的升汞溶液中消毒20 30分鐘，再用無菌水衝冼4 5次，吸乾果實表面的水分，切 開果實，將粉末狀種子接種到種子萌發培養基上培養，種子萌發先形成原球莖，隨後長成小 苗，所述的種子萌發培養基為每升含花寶1號1 3. 0g，蛋白腖0. 5 2. 0g，椰子汁100 150mL，蔗糖20 30g，瓊脂6 7g，活性炭0. 5 1. Og,肌醇80 120mg，甘氨酸1. 5 2. 5mg，鹽酸硫胺素0. 05 0. 2mg,鹽酸吡哆醇0. 4 0. 8mg,煙酸0. 4 0. 8mg,餘量為水， pH 5. 4 5. 8 ；(3)壯苗培養將無菌播種獲得的小苗接種到壯苗培養基上培養，所述的壯苗培養基 為每升含花寶1號1 3. 0g，蛋白腖0. 5 2. 0g，萘乙酸0. 5 1. Omg、香蕉勻漿50 100g, 椰子汁50 IOOmL,蔗糖15 20g,瓊脂6 7g，活性炭0. 5 2. Og,肌醇80 120mg,甘 氨酸1. 5 2. 5mg,鹽酸硫胺素0. 05 0. 2mg,鹽酸吡哆醇0. 4 0. 8mg,煙酸0. 4 0. 8mg, 餘量為水，PH 5. 4 5. 8 ；(4)試管苗移栽當小苗長成的植株5 8cm高時，將培養瓶轉移到自然光下煉苗 10 20天，然後將其取出，洗淨根部的培養基，移入蘭石木屑樹皮按體積比為2 31 21 2的混合基質中培養；上述步驟( 和(3)中的培養條件為培養溫度M ^°C，光照度1500 20001x，光 照12 16小時/天。
2.根據權利要求1所述的火焰蘭的雜交育種和無菌播種的方法，其特徵在於，在所述 的人工授粉步驟，當母本和父本花期相同時，在母本花朵展開後2 4天，取父本的花粉直 接授於母本的柱頭上。
3.根據權利要求1所述的火焰蘭的雜交育種和無菌播種的方法，其特徵在於，在所述 的人工授粉步驟，當母本和父本的花期不遇時，在父本火焰蘭的盛花期採集花粉塊，採集時 機選擇在火焰蘭花朵花瓣剛展開時，採集時間選擇在上午8 9時，採集花粉置於無菌的塑 料管中，密封置於4°C避光保存，當母本開花時，將低溫保存的父本花粉在15 35°C的條件 下解凍20 30min，再往放置花粉的塑料管中加入無菌水進行浸泡回溼花粉20 30min， 然後將有生活力的花粉授於母本柱頭上。
4.根據權利要求3所述的火焰蘭的雜交育種和無菌播種的方法，其特徵在於，所述的 採集花粉置於無菌的塑料管中，密封置於4°C避光保存，步驟為應用無菌的牙籤輕輕挑掉 花的藥帽，再用無菌牙籤將花粉塊粘連在牙籤尖上並迅速將花粉塊放至潔淨無菌的Iml離 心管中，每管放入1朵花的花粉塊，將放置了花粉塊的離心管再用一無菌的玻璃瓶集中裝 起來，並密封好，置於4°C避光保存。
5.根據權利要求1所述的火焰蘭的雜交育種和無菌播種的方法，其特徵在於，在步驟 (2)的無菌播種步驟，將種子萌發先形成的原球莖接種到分化培養基上，使原球莖在分化培 養基上形成小苗，所述的分化培養基是在種子萌發培養基的基礎上每升添加6-卞基腺嘌 呤5. Omg,培養條件為溫度M ，光照度1500 20001x，光照12 16小時/天。
6.根據權利要求1所述的火焰蘭的雜交育種和無菌播種的方法，其特徵在於，所述的 母本蘭科植物為五唇蘭(Doritis pulcherrima)、小花萬代蘭(Vanda coerulescens)或 彩心建蘭(Cymbidium ensifolium)。
全文摘要
本發明公開了一種火焰蘭的無菌播種和雜交育種的方法。它是選擇具明顯特性、觀賞價值高的蘭科植物作為雜交母本，以火焰蘭作為父本，進行雜交，授粉成功得到的果實在基本成熟而未開裂時，在種子萌發培養基上進行無菌播種，種子萌發後再轉移到壯苗培養基上培養，形成的試管苗經過自然光照下煉苗10～20天後出瓶栽培，成苗的移栽成活率可達90％以上。本發明具有雜交成功率高的特點，特別是對一些與火焰蘭雜交親本花期不遇的具明顯特性、觀賞價值高的蘭科植物為雜交親本時十分有效。本發明採用獨特的培養基和培養方法，使得火焰蘭雜交種子的萌發率高、成苗快、種苗品質好。本發明具有操作性強，育種效率和應用價值高等優點。
文檔編號A01G31/02GK102144536SQ20111005682
公開日2011年8月10日 申請日期2011年3月9日 優先權日2011年3月9日
發明者吳坤林, 唐源江, 張建霞, 曾宋君, 段俊, 陳之林 申請人:中國科學院華南植物園