重組檞寄生凝集素(rML)的製作方法
2023-05-09 20:10:36
專利名稱：重組檞寄生凝集素(rML)的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼成熟後表現檞寄生凝集素二聚體生物活性的前蛋白原的核酸分子，含有上述核酸分子的載體，由上述載體轉化的宿主和由上述核酸分子編碼的多肽和/或多肽二聚體。本發明中所述的多肽和/或多肽二聚體具有廣泛的醫療應用價值。因此，本發明進一步涉及含有本發明中的多肽和/或多肽二聚體的藥物組合物和免疫毒素，以及含有本發明的核酸分子、本發明的多肽和/或多肽二聚體和/或可特異性地與本發明的核酸分子雜交的引物的診斷組合物。最後，本發明還涉及含有本發明的多肽和/或多肽二聚體的植物保護劑。
幾個世紀以來，檞寄生提取物一直用於醫療方面。自本世紀初以來，用檞寄生製品來治療癌症已獲得不同程度的成功[Bocci1993；Gabius等1993；GabiusGabius 1994；GangulyDas1994]。Hajto等人[1989，1990]表明所謂的檞寄生凝集素(Viscumins，VAA，歐寄生凝集素)特異性地介導了治療效果。除了細胞毒效應外，如今本領域正在討論其(非特異性的)免疫刺激作用，其積極效果用於腫瘤患者輔助性治療和調養。上述患者生活質量的提高很可能是內源性內啡肽分泌所引起的[Heiny和Beuth 1994]。大量的體外[Hajto等1990；Mannel等1991；Beuth等1993]和體內[Hajto，1986；Hajto等1989；Beuth等1991；Beuth等1992]研究以及臨床研究[Beuth等1992]報導了炎症細胞因子(TNF-α，IL-1，IL-6)釋放的增加以及免疫系統中細胞組分(TH細胞，NK細胞)的活化。
現在，認為檞寄生提取液的基本活性成份是一種分子量為60KDa可用生化方法從檞寄生提取液中分離得到的檞寄生凝集素蛋白[Franz等1977；Gabius等1992]。檞寄生凝集素蛋白含兩個由二硫鍵共價聯接的亞基，其A鏈可導致酶解核糖體失活[Endo等1988]，B鏈負責糖基的結合。現在認為，其生物活性主要是B鏈的凝集素活性[Hajto等1990]。
然而，對檞寄生凝集素(ML)結構與功能之間的關係了解得還不清楚。兩條單鏈及各自不同的生化和酶學活性對所觀察到的作用模式和/或醫療效果的貢獻至今仍不清楚。由於製品中汙染有其它的檞寄生植物組分，給結構和功能間的關係分析造成了困難[SteinBerg 1994]。有爭論說提取製品的活性可能依賴於製品中的不同組分，而這些組分又可能因宿主樹種類(比如說，蘋果樹，松樹，楊樹)的不同而不同[Hulsen等1986]。據說，粘毒素[Garcia-Olmedo等1983；Mendez等1990]和其它的檞寄生凝集素(如檞寄生凝集素2(ML-2)和檞寄生凝集素3(ML-3))，都具有相似的作用[Eifler等1994]。既使用生化方法(親和層析)高度純化的檞寄生凝集素製品也是非均一物質(圖8)。這種非均一性與不同鏈的可生化估價的活性、與在體內或體外激發的療效，以及蛋白質結構等方面都有關聯。對ML的A鏈和B鏈的糖基化作用的結構變異性以及序列上的變異性都有討論。Gabius等人和Dietrich等人顯示了ML-1的A1鏈和A2鏈的序列變異性。
為對檞寄生凝集素的療效作更細緻的分析，最好能得到結構單一的純的物質，而且對科學家而言，能得到大量純的檞寄生凝集素或其組份是非常重要的，這樣可以大批量地將其用作藥物組合物中的有效組份。但本領域中的現有技術還不足以實現這些目的。依本領域中的現有技術，從植物材料中分離組分，只能得到非均一的混合物。因為存在翻譯後加工過程，ML-1轉變為相應異構體ML-2和ML-3，從而導致了製品的非均一化，因此，檞寄生凝集素製品因發酵時間和分離方法的不同而含有不同含量的ML-1、ML-2和ML-3[Jggy等1995]。任一種上述的異構體都具有很大的微觀不均一性，圖8中顯示了通過等電聚焦法得到的ML-1的微觀不均一性。
本發明要解決的問題是，提供在數量上允許大規模應用的純檞寄生凝集素。此問題可由權利要求書中所述的特定實施方案來解決。
本發明涉及如下的核酸分子，其(a)編碼成熟後具檞寄生凝集素二聚體生物功能的前蛋白原，並具有圖4C所示的核苷酸序列；(b)編碼如(a)所述的前蛋白原的片段，此片段含有檞寄生凝集素二聚體的生物活性部分；(c)由於密碼子簡併而與(a)和(b)中所述核酸分子不同；或(d)在嚴緊條件下可與(a)、(b)或(c)中所述核酸分子雜交並編碼一種具有如(a)或(b)中所述的生物學功能和/或活性的多肽。
因為第一次提供了檞寄生凝集素的基因序列，所以可以根據所述序列得到重組的高度純化的個體單鏈(rMLA，rMLB)，它們可在體外重聚，從而形成在蛋白質化學、酶活性和結構上都是均一的rML全蛋白。這種重聚合的重組蛋白既無可變異性也無微觀不均一性，在一級結構和翻譯後修飾(糖基化，磷酸化)方面尤其如此。因此特別適合以全蛋白或鏈片段或以次級片段的形式用於治療。
本發明中所述的解寄生凝集素前蛋白原的「片段」可理解為作為檞寄生凝集素二聚體生物活性組分的任意片段，不局限於天然存在的片段。為明確起見必須指出本領域內的技術人員顯然會明白，這種檞寄生凝集素二聚體的生物活性組分，也可以是二聚體單鏈上的部分。所以，本發明也覆蓋了由圖4C所示序列衍生而來的單鏈或其片段。
本發明中，與「檞寄生凝集素組分」相連的術語「天然的」應理解為具如此特性的片段，或是檞寄生凝集素二聚體中的一條鏈，或是上述鏈中的天然片段。這些片段最好是具有生物活性的。
本發明中，術語生物活性「應理解為這些片段至少具有在說明書中所述的鏈或其二聚體的一種生物功能，或具有該單鏈或二聚體的任何其它生物功能。另外，「生物活性」還涉及藥理活性及免疫活性，利用重組ML蛋白還第一次允許通過實驗檢查ML蛋白的單一功能域或次級功能域的作用。重組的ML蛋白和重組的亞基/部分鏈是相應定義的單純物質製劑的基礎，這些製劑可用作抽提製劑和標準抽提物的替代物。
當傳統的克隆策略失敗後，克隆編碼檞寄生凝集素的基因，在令人吃驚的新克隆策略基礎上進行。
已知關於凝集素ML-1的一些蛋白質化學數據。除分子量和亞基結構已知外，Dietrich等人和Gabius等人[可參照DE 4221 836]分別獨立地描述了短N-端肽的胺基酸序列。由於A和/或B鏈的N-端肽的胺基酸組成和相關的高度簡併性，為篩選基因組文庫而從這些肽製備可檢出ML基因的簡併性足夠低的合成寡核苷酸是不可能的。對於在歐寄生多聚(A+)RNA基礎上建的cDNA文庫也是同樣的。
聚合酶鏈式反應允許擴增位於已知片段之間的DNA片段[Erlich等1988]。用一個從ML的A鏈N端起始的「有義」寡核苷酸和一個從ML的B鏈N端起始的「反義」寡核苷酸，如果ML基因無內含子可對此區間內的基因擴增(
圖1a)。但實際上，對B鏈N端序列的分析表明可設計的寡核苷酸組合的簡併程度太高，這種技術不可能成功地實現。原因主要是B鏈N端序列對寡核苷酸的構建來說是不利的，這就使得從已知序列的區域起始擴增ML基因是不可行的(圖1b)。
當探索用改良的PCR策略來克隆ML基因時，科學家們也試圖通過添加進一步的蛋白質數據來構建用於擴增的寡核苷酸，這些數據主要基於檞寄生凝集素與I類和II類的核糖體失活蛋白(RIP)的親緣關係[Stirpe等1992]，在(a)I型核糖體失活蛋白和蓖麻蛋白A鏈以及(b)相思豆毒蛋白B鏈的多種排列對比的基礎上，在總共八個區位上鑑定出了蓖麻蛋白保守區域。從這些序列出發，同時考慮相關種類的密碼子應用表，合成了共21個寡核苷酸，並以不同的組合用於200多個擴增實驗中。雖然，PCR的條件，包括復性溫度、Mg2+濃度及循環參數都有較大變動，但沒有一個實驗獲得了特異性擴增產物，
依照上述努力，無論篩選基因組文庫和cDNA文庫，還是運用PCR技術都得不到特異性的ML DNA序列。
因此，在構建擴增用的寡核苷酸的過程中有過許多新的嘗試，包括考慮相思豆毒蛋白和蓖麻蛋白的進一步的結構特性，以發現新的方法。
核糖體失活蛋白，尤指II型RIP蓖麻蛋白，與ML的酶學機理相似[Endo等1988a+1988b]，所以不能排除它們在一級結構和三級結構水平上也相似。從蓖麻蛋白的晶體結構出發[Katzin等1991；RutenberRobertus 1991；Weston等1994]，關於蓖麻蛋白A鏈的柔性研究發現位於保守區內的一個低活動度的Arg 180。另外，做了在活性中心區可能發生的胺基酸替換的分析，考慮到與底物相互作用，活性中心可能由於肽鏈「骨架」的立體構象而產生。這些實驗的結果與蓖麻蛋白A鏈和更多的I型核糖體失活蛋白的廣泛的序列排列對比有著密切的關係。
得出特定位置上的特定胺基酸殘基的概率數據，對這些序列比較的結果補充以結構數據。上述數據可用來預測某區域內大量的ML蛋白理論胺基酸序列，並在這些序列基礎上去構建相應的具有驚人低的密碼簡併性的寡核苷酸(RMLA2)(圖1C)。
儘管上述所有替代方法都已失敗，結合RMLA1(由MLA鏈N端胺基酸序列所衍生的簡併聚核苷酸)和上述實驗基礎上構建的「活性部位」寡聚核苷酸RMLA2，在限定的PCR參數下，從全基因組ML-DNA開始可獲得所需的片段。
該基因的序列信息由下述步驟補全用得自預克隆和測定a片段(圖3)而得到的MLA的部分基因序列的特異非簡併寡核苷酸引物，從RIPI和蓖麻蛋白/相思豆毒蛋白的序列排列對比得出的簡併性寡核苷酸，經另外的PCR擴增而得到。為構建簡併的B鏈寡核苷酸，應用了相思豆毒蛋白B鏈和蓖麻蛋白B鏈的序列對比，從而在B鏈區發現了一些高度保守區域。
為確定全蛋白5』和3』末端、 B鏈的部分片段和5』和3』末端的非翻譯區，從分離的檞寄生RNA通過逆轉錄合成了cDNA類似物，並用RACE技術[Frohman等1988]獲得了相應的基因片段。一旦得到許多重疊基因片段(圖3)可以從全基因組檞寄生DNA通過特異的PCR來獲得完整的A鏈和B鏈基因片段。在圖4a和圖4b中，對存在末端修飾的rMLA和rMLB基因序列分別作了描述。圖4C顯示了包含5』和3』非翻譯區以及內肽和信號肽編碼基因的全ML基因序列。
在本發明中的優選實施方案中，所述片段是如圖4a所示核酸序列編碼的檞寄生凝集素A鏈(MLA)。
在本發明的更優選實施方案的核酸分子是如圖4b所示核酸序列編碼的檞寄生凝集素B鏈(MLB)。
本發明的更優選實施方案涉及的核酸分子是一種DNA分子。
在本發明中，「DNA分子」應理解為涉及基因組的DNA分子和cDNA分子或(半)合成的DNA分子。在了解了本發明的知識的情況下，本領域的技術人員，對製備這些不同DNA分子的方法是非常熟悉的。
在本發明中的更優實施方案中的核酸分子是一種RNA分子。
本發明還進一步涉及本發明中所述的任一種核酸分子的反義鏈的核酸分子。這樣的一個反義鏈例如可用於轉錄的阻遏，從而可用於植物中的表達和調控研究。
本發明亦涉及含有至少一種本發明的核酸分子的載體。
本發明的載體可以含有例如編碼整個檞寄生凝集素前蛋白原的本發明的單一核酸分子。假定所述載體是一表達載體，則前蛋白原可在合適的轉化宿主中被加工，並且單體可在體內或體外聚合以產生檞寄生凝集素二聚體。在另一實施方案中，本發明的載體僅用於本發明的核酸的增殖。
在優選實施方案中，本發明的載體既包含有一個編碼檞寄生凝集素A鏈或其片段的核酸分子，也包含有一個編碼B鏈或其片段的核酸分子。優選單體片段具有生物活性。
在另一優選的實施方案中，本發明的載體是一種表達載體。對本領域的技術人員而言，如何為不同的宿主細胞提供合適的表達載體是很清楚的。
根據本發明，從全基因組檞寄生DNA起始經特異性PCR產生編碼檞寄生凝集素A鏈的序列，並用於異源性表達。通過所用引物寡聚核苷酸的非互補區序列引入翻譯控制元件及限制性內切酶識別序列，使得在前檞寄生凝集素原基因以基因組形式存在的情況下，對檞寄生凝集素A鏈加以克隆和單獨表達成為可能。
編碼對應於酪氨酸1到酪氨酸17的rMLA的5』區序列[Dietrich等1992；Gabius等1992]，通過將兩個寡核苷酸雜交、克隆，再加入一翻譯起始密碼，而作為一合成的基因片段而得到。因此，該基因序列是已考慮到了大腸桿菌中高效表達基因的密碼子選擇而優化的，[Gribskov等1984]。通過特異性地將酪氨酸的密碼子從TAC換為TAT，在合成rMLA基因片段3』末端和通過PCR得到的rMLB基因片段5』端引入一個SspI的限制性酶切位點，從而在形成載體pML14-17時可將兩個rMLA基因片段融合(圖5)。編碼rMLA的序列為DNA測序所證實(圖4a)。為了在大腸桿菌中表達rMLA，從載體pML14-17中分離出基因序列，插入到表達載體pT7-7中，使之處於T7-RNA聚合酶啟動子和一個轉錄終止子的調控之下[StudierMoffart，1986]。用得到的表達載體pT7-MLA(圖5)轉化大腸桿菌表達菌株BL21。基因表達的誘導結果特徵性地表現為一條對應於非糖基化重組檞寄生凝集素A的蛋白條帶的出現，該蛋白相對分子量為25KDa，用一種特異的抗MLA的抗體進行蛋白印跡分析來分析和鑑定重組表達產物(圖7)。
為了檞寄生B鏈的異源表達，從歐寄生全基因組DNA經特異PCR擴增完整的、編碼MLB的序列。翻譯調控元件和限制性酶識別序列是通過所用寡核苷酸引物的非互補區引入的。將生成的0.8Kbp的PCR產物克隆到TA克隆載體pCRII後，通過插入表達載體pT7-7而置於轉錄調控因子控制之下，用得到的表達載體pT7-MLB轉化表達菌株大腸桿菌BL21。
rMLB編碼基因的完整性通過DNA測序來證實(圖4b)。在誘導基因表達兩小時後，用一特異的抗-MLB的抗體(TB33，Tonevitsky等1995)進行蛋白質印跡來檢測表達，出現了一相對分子量為31KDa的免疫反應蛋白，它對應於非糖基化的、重組檞寄生凝集素B鏈(圖7b)。對大腸桿菌細胞完全裂解後的細胞級分分析表明合成的rMLB鏈分成上清液中的可溶級分以及在大腸桿菌細胞裂解沉降物中的不溶性包涵體級分。在誘導4個小時後，對於總的產量而言，可溶的和不可溶的級分各50％(圖7b)。
本發明還進一步涉及由至少一種本發明的載體所轉化的宿主。
根據本領域內技術人員要求的目的不同，本發明中所述的宿主可以僅用來生產任一單體或兩單體的組合，優選的形式是聚合的二聚體。本發明的宿主可以是真核的或原核的細胞、一種轉基因植物或一種轉基因動物。
在優選方案中，本發明的宿主是哺乳動物細胞、植物細胞、細菌、真菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或轉基因植物。
在特別優選的實施方案中，本發明的宿主是大腸桿菌、麴黴屬細胞或灰翅夜蛾屬細胞，優選草地夜蛾。
本發明還進一步涉及本發明的核酸分子或載體所編碼和/或由本發明的宿主所生產的多肽。
本發明的多肽優選具有檞寄生凝集素A鏈或B鏈的生物學活性。然而在其它實施方案中，本發明中的多肽可以只表現部分生物學活性或完全沒有生物活性。
在本發明中，「部分生物學活性」應理解為與降低的活性和/或與全部的生物活性範疇內的幾種活性有關。本發明的多肽可以是表現上述活性的A或B鏈的片段。
關於rMLA、rMLB和rML全蛋白特性的檢測(I)相對分子量和結構用還原條件下的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳加銀或考馬斯亮藍蛋白染色技術或蛋白質印跡分析中的免疫染色來確定相對分子量。
令人驚訝的是發現重組的非糖基化的檞寄生凝集素A鏈(相對分子量25KDa)與天然的A1型和A2型(相對分子量分別為31KDa和29KDa)A鏈迥然不同。在相對分子量間的這個差異尤其讓人感到吃驚，因為在現有技術中都認為A鏈是非糖基化的。重組檞寄生B鏈(相對分子量31KDa)比糖基化的天然B鏈(36KDa)要輕得多(圖7)。
因糖基化和/或基因序列變化而在SDS-凝膠電泳中以寬條帶表現得清楚的天然ML蛋白的不均一性，並沒有在任何重組蛋白中發現。
重聚的rMLA/rMLB全蛋白(rML)的相對分子量加起來是56KDa，與之相比，天然的nML則要重一些，是65-67KDa。
(II)等電點的均一性與高度純化的天然檞寄生凝集素A鏈相比，rMLA被證明是等電點為6.8的均一蛋白質，前者可分為四種，各自的等電點為5.2，5.4，5.7和6.2(圖8)。
與高度純化的天然檞寄生凝集素B鏈相比，rMLB被證明是等電點為5.1的均一蛋白質，前者又可分為兩種，各自的等電點為7.1和7.3(圖8)。
因此，天然ML全蛋白有多種分子異構體和結合體的可能(圖8、底部)，而對重組檞寄生凝集素，在等電層析中存在唯一的遷移率，這揭出與天然蛋白種類的微觀不均一性相反，rML是均一的。
(III)rMLA的酶學活性在一種轉錄/翻譯聯合檢測中應用免疫親和純化的rMLA製品時，可以檢測到rMLA(從表達產物的可溶性組分分離的)和rMLA(從不可溶的「包涵體」組份分離得到的)的抑制翻譯活性。
相對於天然檞寄生凝集素A鏈，rMLA表現出一種不同的抑制特性，這表現在翻譯抑制的劑量依賴性和在網織細胞溶解產物中殘餘的非抑制性殘留翻譯活性方面(見圖9)。構成ML全蛋白毒性作用基礎的酶學特性，在重組的蛋白種類中顯著地減少了。
(IV)rMLB的糖基結合活性象在體外重聚合的rMLA/rMLB、rMLA/MLB和MLA/rMLB全蛋白一樣，從初級表達產物復性和重新氧化而產生的rMLB鏈具有糖基結合活性，這可通過結合糖基質脫唾液酸胎球蛋白或胎球蛋白酶聯凝集素反應(ELLA)來檢測。重組rMLB鏈的糖基結合專一性，可由在半乳糖、β-乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)和唾液酸(N-乙醯神經氨酸NANA)存在下的競爭性結合條件下的ELLA系統來測定和定量。令人吃驚的是競爭性結合的ELLA試驗顯示在nMLB和rMLB之間存在不同的糖基結合專一性。結合的親合力可以由系統特異性的IC50來表徵，即固定化脫唾液酸胎球蛋白-配體的蛋白被半乳糖(IC50nMLB4.5mM；IC50rMLB由於相互作用太小而無法測定)、β-乳糖(IC50nMLB4.9mM；IC50rMLB＞70mM)、N-乙醯半乳糖胺(IC50nMLB20.7mM；IC50rMLB109mM)或固定化胎球蛋白-配體的蛋白被唾液酸(IC50nMLB49.8mM；IC50rMLB47.1mM)半數最大置換時的濃度。
雖然被描述為半乳糖專一性凝集素的nMLB可以象預料的那樣被半乳糖或β-乳糖替換，但從大腸桿菌中重組得到的rMLB鏈，對於半乳糖不表現任何可檢測的相互作用，並僅對β-乳糖有弱的相互作用。重組體rMLB對於N-乙醯半乳糖胺和唾液酸具有明顯的親和力，相對於植物nMLB，驚人地表現為糖基結合專一性向N-乙醯半乳糖胺/唾液酸糖基專一性凝集素的本質轉變。對於rMLB和含rMLB的全蛋白的生物活性，這將導致配基、受體、或靶細胞的範圍有可能與植物檞寄生凝集素蛋白的不同或超出後者。
在優選的實施方案中，本發明的多肽至少具有一種化學或酶學修飾。
這種修飾將會改變、減弱或增強多肽的生物學活性(如果存在的話)。這樣的修飾可以，舉例來說，在翻譯和多肽分離後，或在本發明的多肽的化學或半合成製備過程中引入。本領域的技術人員可利用現有的方法將修飾引入，來改變檞寄生凝集素的藥理活性，優選提高該活性。
在另外一種優選實施方案中，本發明的多肽是一種融合蛋白，這種蛋白優選具有上述定義的生物活性。
本發明多肽的該實施方案中還優選改變檞寄生凝集素多肽對細胞水平的靶物質的藥理活性，優選提高這種活性。
本發明進一步涉及包含本發明的核酸分子編碼的兩個單體的具有檞寄生凝集素生物活性的多肽二聚體。
術語「檞寄生凝集素生物活性」應理解為包含任一種來自於檞寄生凝集素的全部生物學活性譜的生物學活性。這樣的活性，舉例來說，是檞寄生凝集素的藥理作用。
植物檞寄生1通過凋亡機制誘導了許多人源的或鼠源腫瘤細胞系的細胞溶解作用[Janssen 1993]。檞寄生凝集素1或B鏈自己可以誘導健康的人血供體的外周單核細胞釋放細胞因子[Hajto1990]。檞寄生凝集素1誘導癌症患者的中性粒細胞釋放超氧離子[Timoskenko 1993]。檞寄生凝集素1誘導健康人血供體的外周淋巴細胞表達白細胞介素2受體(CD25)的A鏈和/或HLA DQ抗原[Beuth，1992]。對小鼠施用檞寄生凝集素1以後，可以觀測到胸腺細胞的數量有所增加，在胸腺中細胞毒性T淋細胞(Lyt-2+)和輔助性T細胞(L3T4+)的數量以及腹膜中的巨噬細胞，特別是那些帶有活化標記MAC-3的巨噬細胞的數目，亦有所增加[Beuth，1994]。在試驗動物的胸腺中，L3T4/Lyt 2+兩種細胞間的相互聯繫得到增強。在進行了檞寄生凝集素1的治療之後，小鼠外周血的白細胞、淋巴細胞、單核細胞，特別是在細胞表面表達白介素2受體作為活化標誌的淋巴細胞和表達活化標誌MAC3的單核細胞的密度都有所上升[Beuth，1994]。在癌症患者的血液中，檞寄生凝集素增加了T-淋巴細胞(CD4+，CD8+)、自然殺傷細胞和B-淋巴細胞的密度[Beuth，1992]。
並且，當服用了檞寄生凝集素1之後，可檢測到乳腺癌患者血漿中內源性阿片遞質β-內啡肽的濃度增加[Heiny，1994]。可以進一步地斷定檞寄生凝集素1可提高外周自然殺傷細胞對於K-562腫瘤細胞的細胞毒作用，同時提高外周血中巨型粒淋巴細胞(LGL)的密度[Hajto，1989]。檞寄生凝集素1對於小鼠肉瘤細胞的抗腫瘤遷移作用也可檢測到[Beuth，1991]。
在另外一種實施方案中，本發明的多肽二聚體同天然檞寄生凝集素二聚體具有同樣範圍的生物學活性。
(V)重組檞寄生凝集素的生物學活性用在另外的體外步驟中重組合成的單鏈產生rML全蛋白，從摺疊好的可溶性鏈產生或在共摺疊步驟中從變性的rMLA和rMLB鏈產生。在此過程中，rMLB鏈優選在穀胱甘肽氧化還原系統存在下和在蛋白質二硫鍵異構酶部分存在下，與一摩爾過量的rMLA重新聚合。用N-乙醯半乳糖胺瓊脂糖或乳糖基瓊脂糖親和層析，從重聚合反應產物中分離純化對應於異二聚體的rML全蛋白，使之與游離的rMLA和rMLA二聚體分開。同法，製備rMLA/rMLB(即rML)和rMLA/nMLB異二聚體全蛋白。
細胞毒活性細胞毒活性作為重聚合的全蛋白生物活性的一個例子在人單核白細胞系(MOLT4)中檢測。觀測到B鏈(表面結合)和A鏈(核糖體酶解失活)在細胞毒反應中都起了作用。體外重聚合的rMLA/rMLB全蛋白以及體外重聚合的rMLA/nMLB全蛋白與兩批天然nML全蛋白相比較。重組的rMLA/rMLB和rMLA/nMLB全蛋白表現出較高的細胞毒特性，IC值為約10-30pg/ml(圖11)，這揭示了用重組鏈在體外重聚合的rML全蛋白具有完整的功能和生物學活性。令人驚訝的是，分離的rMLB單獨並沒有細胞毒活性，為了發揮細胞毒作用，B鏈必須與酶活性的A鏈可操作性地相連。所以，在此之前所討論的檞寄生凝集素B鏈製品的細胞毒活性，很可能是因為還有殘存的nML全蛋白。單鏈的重組生產第一次使得對檞寄生凝集素(兩個亞單位)的糖基結合活性和酶活性分別進行描述和研究成為可能。
凋亡的誘導重組的rML全蛋白的誘導凋亡的能力(作為檞寄生凝集素生物活性的例子)用單核細胞系U937證實。用70pg/ml作用於細胞24小時後，可以檢測到rML全蛋白誘導的凋亡(圖12)。檞寄生凝集素作用於MOLT-4細胞和外周血單核細胞(PBMC)的試驗表明在低劑量範圍誘導凋亡的作用是檞寄生凝集素細胞毒活性的基礎。由於細胞因子的誘導作用發生在低細胞毒作用的濃度範圍內(圖13，圖14)，它與誘導凋亡活性的相關性是有說服力的，同時，當處於大劑量範圍及較長時間孵育時，凋亡作用為壞死作用所掩蓋。以重組B鏈作用於敏感MOLT-4細胞時，不能檢測到作為凋亡作用結果的細胞毒作用。因此，低劑量範圍內的誘導凋亡的生物學活性，只能解釋為全蛋白的作用。
免疫刺激活性作為重組的檞寄生凝集素全蛋白生物活性的例子，通過對從健康的人血供體的單核細胞中誘導釋放腫瘤壞死因子α(TNF-α)和γ-幹擾素(r-IFN)，以及從人原代角質細胞和皮膚成纖細胞的(Skin2ZK1200)模型共培養物中誘導釋放白介素1α(IL-1α)和白介素6(IL-6)的檢測來測定免疫刺激作用。在PBMC模型中，3-48ng/ml濃度的重組rML全蛋白可誘導劑量依賴的TNF-α和IFN-γ的釋放；在skin2模型中，0.25-8ng/ml濃度的重組rML全蛋白可誘導劑量依賴的IL-1α和IL-6的釋放。
所有上面所提到的細胞因子都是人免疫系統中相關的刺激介質，尤其在特異性細胞免疫應答的活化中起重要的作用。
雖然本領域中至今為止的描述都認為，凝集素B鏈的活性是主要的免疫刺激活性[Hajto等1990]，然而，重組的rMLB鏈不能單獨誘導任一種以上所述的細胞因子的釋放。免疫刺激活性只能由功能性聯接的rML全蛋白在低的劑量範圍內獲得。這一驚人的發現表明植物rMLB鏈的免疫刺激製劑中依然含有痕量的nML全蛋白，而且被歸因於rMLB鏈的免疫刺激作用，也必須歸因於nML的殘存。曾經描述過的製備nMLB的方法至今為止不能實現全蛋白的大量分離，但本發明第一次使檞寄生凝集素的單鏈重組成為現實，從而使檢測和提供均一的檞寄生凝集素B鏈製劑成為可能。這也第一次使得能夠對A鏈和B鏈的生物活性分別加以描述和利用，並且第一次區分不同單鏈和功能性聯接的全蛋白的生物活性。
(VI)重組的檞寄生凝集素B鏈(rMLB)的生物活性檢測細胞表面蛋白CD69的誘導表達，作為免疫活性細胞的活化標誌。在T細胞、B細胞，特別是自然殺傷細胞(NK細胞)活化後，CD69是首先出現的細胞表面抗原之一。因為靜止期的淋巴細胞不表達細胞表面蛋白，CD69自然具有上述免疫活性細胞群活化標誌的功能。而且，已證明誘導表達的CD69表面蛋白，具有誘導NK(自然殺傷)細胞和TcRγ/δT細胞的細胞裂解活性的傳導功能[Moretta等1991]。利用抗-CD69 mAb的流式細胞計(FACS)來檢測濃度範圍為1-100ng/ml的單核細胞的活化，檢測在細胞表面是否有CD69表面抗原和CD-69陽性細胞的份額。鐘形的劑量依賴性曲線指出，rMLB鏈兩個配基結合位點介導細胞受體間的聯接是必要的。在上述實驗中，即使在rMLB的濃度高達100ng/ml的情況下，也無法證實rMLB在PBMC模式中有細胞毒作用。
在優選實施方案中，本發明的多肽二聚體包含至少一種經化學或酶學修飾的本發明多肽單體，或一種本發明的融合蛋白。
既可以通過修飾來提高效力，也可以通過去除某些特性(例如，B鏈的糖基結合活性或A鏈的糖苷酶活性)以消除可能的副作用，從而產加可能的治療用途。也可用具修飾特性的多肽來作為闡明反應機制的工具。對某些特定的治療來說，需要降低多肽的免疫原性和抗原性，和/或優化它們的藥代動力學特性，而這可能通過特異性地替換單個胺基酸而做到。
本發明進一步涉及可特異性地結合本發明的多肽和/或多肽二聚體的抗體或其片段或其衍生物，因而上述物質不能識別天然檞寄生凝集素或其單鏈。優選本發明的抗體只結合在天然檞寄生凝集素上因糖基化而被掩蓋的抗原決定族上。抗體可以是單克隆的、多克隆的或(半)合成的抗體。片段可以是例如，Fab』、F(ab)2或Fv片段。抗體衍生物是本領域內從所周知的。
本發明進一步涉及製備本發明的多肽和多肽二聚體的方法，在該方法中，在合適的條件下培養本發明的宿主，並分離獲得的多肽或多肽二聚體。
本領域的技術人員對於培養和分離宿主的合適條件是熟悉的。舉例來說，本發明的多肽和多肽二聚體，可用合適的表達體系排到宿主之外，從而可從培養基中收集。另一方面，多肽和多肽二聚體也可以留在細胞內，並從中分離。下面，我們將討論本發明方法的另一優選實施方案為分離rMLA，先裂解用合適的表達載體轉化的大腸桿菌細胞，細胞碎片中的可溶和不可溶級分通過離心來分開。對於細胞裂解物的分析表明因表達條件和表達持續時間的不同，重組的檞寄生凝集素A鏈在可溶級分中累積為5-50％，在不可溶蛋白凝集體(包涵體)中是50-95％。
可溶和不可溶蛋白的同時出現表明，若rMLA蛋白的重摺疊或復性是可行的，則至少存在兩種分離rMLA的方法。凝聚成「包涵體」的rMLA在清洗沉澱除去大腸桿菌蛋白[Babbitt等1990]之後，在變性條件下溶解，並在90倍稀釋的摺疊緩衝液中(50mMTris-HCl，2mM DTT，1mM EDTA，pH8.0)進行重摺疊。
通過這種處理方法，可以得到在圖9中所描述的可溶性摺疊的蛋白種類，和復性的原變性不溶的rMLA種類一樣，具有全部的酶學活性。復性的rMLA可與可溶性rMLA一樣，利用特異性的抗-MLA的抗體TA5的免疫親和層析來分離[Tonevitsky等1995]。
rMLB以可溶形式和不可溶的「包涵體」形式存在，說明有兩種分離重組的檞寄生凝集素B的方法。
為從強還原的大腸桿菌細胞基質環境中分離可溶性的rMLB鏈，應在含還原態和氧化態的穀胱甘肽的氧化還原體系存在下進行孵育，以建立鏈內二硫橋，並在β-乳糖配體存在下孵育，以穩定活性的摺疊產物。從摺疊反應體系中通過親和層析在乳糖基瓊脂糖或N-乙醯半乳糖胺瓊脂糖凝膠柱上一步選擇性分離和/或純化可結合糖基的活性rMLB鏈。
為從大腸桿菌細胞沉澱中分離以「包涵體」形式存在於不可溶表達產物級分中的rMLB，對全細胞裂解物進行清洗以除去大腸桿菌蛋白[Babbitt等1990]，並在變性和還原條件下溶解。在含還原態和氧化態穀胱甘肽的氧化還原體系和配體β-乳糖存在下稀釋來進行復性。在N-乙醯胖乳糖胺基或乳糖基瓊脂糖上親和層析，從復性反應體系中選擇性地分離純化可結合糖基的活性rMLB鏈。
本發明還進一步涉及含本發明的多肽或多肽二聚體和/或本發明將在後面描述的免疫毒素和必要時藥物可接受載體的藥物組合物。
本發明的多肽、其聚合物或修飾物，類似於已知的天然檞寄生凝集素的藥理特性，在癌症或感染的治療中具有廣泛的應用。
免疫刺激作用可用於腫瘤的治療，通過直接和/或間接刺激機體自身的免疫防禦體系，使之更有效地抑制腫瘤生長和可能的轉移。對於感染，尤其是病毒感染，也是同樣的機理。
本發明的多肽可與其它的免疫刺激劑聯合使用，例如幹擾素，細胞因子或集落刺激因子，以獲得協同效果，或降低組合製劑的必需劑量以減小副作用。
通過與細胞生長抑制劑或放射性治療結合，可減弱或去除白細胞減少症/骨髓抑制負作用，因而可以減少因傳統治療方式帶來的免疫系統的削弱。
具糖苷酶活性的多肽的直接細胞毒作用導致腫瘤細胞凋亡，因而也可用於治療目的。如果本發明的多肽與合適的抗體偶聯，該原理特別可用於免疫毒素的應用上。因此，本發明進一步涉及含至少一種本發明的多肽或多肽二聚體的免疫毒素。例如，具有活性的A鏈或全蛋白，可用蛋白質化學的方法，與抗體或抗體片段偶聯。本領域的技術人員熟知這樣的偶聯方法，相應的偶聯物在許多方面非常有用[Vitetta，1993]。或者，可以表達相應構建的融合蛋白，使其含有如來自抗體的抗原結合區域和除此之外的本發明多肽的細胞毒性片段。
若腫瘤細胞同其它細胞的結合被阻止的話，也就防止了轉移的形成。本發明多肽可利用凝集素的競爭性結合防止腫瘤細胞的這種結合。
本發明還進一步涉及與本發明的核酸分子或其互補鏈特異性地雜交的引物或/和引物對。
本發明還進一步涉及診斷組合物，其至少含有a)本發明的核酸分子，b)可特異地與本發明的核酸分子或其互補鏈雜交的引物或引物對；和/或c)本發明的多肽和/或本發明的多肽二聚體。
包含引物和/或引物對的本發明的診斷組合物，可用來篩選有機體中存在的凝集素基因，以發現例如一個有可能編碼藥理學上有意義的凝集素的凝集素基因。包含在本發明診斷組合物中的本發明的核酸分子，可以通過例如蛋白質印跡或DNA印跡的方法來篩選有機體中存在的凝集素基因。通過改變雜交條件的嚴緊度，可篩選相關的凝集素基因。多肽(二聚體)可以例如用來生產抗體或抗血清，這些抗體和抗血清可用本身已知的方法來檢測多種有機體中的特異性的(檞寄生)凝集素。
最後，本發明涉及含有本發明多肽和/或本發明多肽二聚體的植物保護劑。本發明的多肽、及其聚合體和修飾體，可用作與討論到的植物檞寄生凝集素功能相關的植物保護劑。討論檞寄生凝集素的抗病毒防護功能是因為它的毒性特性是防止植物被吃掉的防護措施，還因為它對膜的通透性和組成起作用的特性。
圖示圖1初級擴增寡核苷酸的構建圖2初級歐寄生ML擴增產物圖3得到ML基因的克隆策略圖4rMLA和rMLB以及全ML基因序列在表達載體中的插入序列圖5rMLA表達載體的構建圖示圖6rMLB表達載體的構建圖示圖7rMLA、rMLB的表達及免疫檢測圖8與天然ML比較rMLA和rMLB的IEF聚焦層析圖9rMLA(RIP)的酶學活性圖10rMLB的糖基結合特性圖11rML對MOLT4的細胞毒作用圖12rML對凋亡的誘導圖13在PBMC模型中，重組檞寄生凝集素的免疫刺激作用圖14在skin2模型中，重組檞寄生凝集素的免疫刺激作用圖15在PBMC中細胞表面標誌CD69的誘導。
下列實施例用於說明本發明實施例1初級擴增寡核苷酸的構建檞寄生凝集素(ML)屬於核糖體失活蛋白家族[Stirpe等1992]，該家族在多類植物中廣泛存在。根據亞基的活性，ML劃歸核糖體失活蛋白中的第II類[Endo等，1988a]。
然而，顯而易見的篩選歐寄生cDNA文庫和基因組文庫的方法，完全不適合發現ML的基因序列。儘管用了多種DNA探針，在由歐寄生poly A+RNA而來的基因文庫中，沒有篩選鑑定出一個特異的ML克隆。在假定ML基因序列中不含內含子的基礎上，採用了一種PCR策略。由於rMLA和rMLB的N端胺基酸序列都已知道[Dietrich等1992，Gabius等1992]，用已知肽鏈衍生出簡併的擴增寡核苷酸，並用於擴增MLA的編碼區似乎是可行的(圖1a)。儘管從MLA鏈的N端可衍生出低簡併性的有用寡核苷酸(RMLA1圖1b)，但從MLB鏈的N端卻不能構建一個相應的有效的特異寡核苷酸(RMLB1、RMLB2、RMLB3，圖1b)。
因此，只好採用另一種策略，通過包含相關蛋白數據，有可能從未知的ML序列區衍生出擴增寡核苷酸。對I型和II型核糖體失活蛋白的序列分析表明，在某些保守區中有高度的序列一致性。圖1c解釋了對於蓖麻蛋白的活性中心，I型和II型的RIP有高度的親緣性。有人討論到序列基元MISEAARF中的E177和R180在酶學機制中起作用[Kim 1992；Lord等1994]。結論是至少這兩個殘基應出現在ML序列中。對個別殘基存在的進一步闡述使得成功構建了擴增寡核苷酸RMLA2，對具有低密碼子簡併性的殘基給予了特別注意。此寡核苷酸的序列如圖1c所示。實施例2ML基因特異性DNA片段的製備根據Baur等人的方法，從新鮮的歐寄生葉子中分離高分子量的基因組DNA(宿主樹是威爾遜楊)。對於PCR製備ML基因特異性DNA片段，在每個擴增反應中用了100ng的基因組DNA。擴增反應的總體積為50μl，含PCR緩衝液(10mMTris-HCl，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.25mM dNTP，pH8.3)，78pmol RMLA1引物和50pmol(反應2)或100pmol(反應1)的RMLA2引物。PCR是用Taq DNA聚合酶(BoehringerMannheim)在Biometra溫度循環器中進行的。PCR參數為90℃變性1分鐘；50℃復性1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環。用5％聚丙烯醯胺凝膠電泳加溴化乙錠染色分析擴增產物(圖2)。在反應2中得到的特異性擴增產物(大約500bp)經凝膠洗脫後，克隆到TA載體中。實施例3克隆策略在實施例1中描述了初次PCR所用的擴增寡核苷酸的衍生過程(圖1a)，實施例2中描述了歐寄生ML基因的初級基因片段(以下稱為「a」)的製備(圖2)。從克隆的「a」片段序列起始，在假定ML基因無內含子的前提下，可以衍生出序列特異的5』寡核苷酸。此寡核苷酸允許「b」、「c」「d」和「e」片段得以擴增。儘管「c」的3』端寡核苷酸也從「a」的DNA序列中衍生而來，然而構建擴增基因片段「b」、「d」、「e」和「g」的簡併的3』引物，不得不通過分析I型(「b」)和II型(「d」，「e」，「g」)的RIP蛋白的同源區來進行。又一次用蛋白家族內的序列比較，來推出單個殘基(特別注意了那些在密碼子使用上具有低的密碼簡併性的殘基)的存在。特別用已知的蓖麻蛋白和相思豆毒蛋白的cDNA及衍生的蛋白質序列，構建了大約50個ML特異的寡核苷酸組合。圖3隻顯示了能克隆出特異擴增產物並用於進一步分析的那些。從其它的寡核苷酸組合出發，就得不到ML特異性的擴增產物。關於基因片段「f」(編碼MLA鏈)和「g」(編碼MLB鏈)的製備將分別在實施例5和實施例6中詳細描述。
為了分析ML基因的翻譯區和非翻譯區序列的5』和3』區，建立了5』和3』RACE的條件[Frohman等1988]，這些條件導致產生了片段「h」「i」和「j」。利用RACE-PCR對片段「j」的擴增是製備全MLB基因片段的一種替代方法。RACE反應是用cDNA進行的，cDNA是從檞寄生(宿主樹為威爾遜楊)的葉子中分離出的歐寄生總RNA經逆轉錄得到的。實施例4rMLA和rMLB的DNA序列和翻譯產物表達載體pT7-MLA和pT7-MLB插入片段的測序是用多種ML-特異性寡聚核苷酸(圖4a，b)採用「引物步移」策略(檢測兩條鏈的完全重疊的序列)的標準方法測定的。底下劃線的序列區域是指為了克隆進表達載體pT7的限制性酶切位點。這兩個基因片段都依照如實施例5和6中所述表達載體的構建方案做了修飾。圖4c顯示了從上述片段衍生而來的全部的ML基因序列。它包括了5』和3』非翻譯區以及內肽和信號肽編碼區。實施例5表達載體pT7-MLA的構建為了進行外源表達，從全基因組檞寄生DNA用特異性PCR製備編碼檞寄生凝集素A鏈的序列，並經末端修飾過。通過所用的引物的非互補區域加入翻譯調控元件以及限制性酶切位點，從而允許在前檞寄生凝集素原基因組的基礎上克隆和單獨表達檞寄生凝集素A鏈。
圖5b顯示了通過PCR製備MLA的編碼基因片段。為了擴增編碼MLA的基因序列，在總體積為50μl中用了200ng的歐寄生基因組DNA、1.5mM(反應1)或2.5mM(反應2)氯化鎂、PML16和PML17引物寡核苷酸各40pmol和PCR緩衝液(10mMTris-HCl，50mM KCl，0.25mM每種dNTP，pH8.3)。PCR是用Taq多聚酶(1.5U/反應，Baehringer Mannheim)進行的，總共30個循環，具體的溫度要求為94℃變性1分鐘，52℃復性1分鐘，72℃延伸1.5分鐘。擴增產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來分析(圖5b)並經凝膠洗脫以用於TA載體克隆。
編碼rMLA相應於胺基酸殘基酪氨酸1到酪氨酸17[Dietrich等，1992，Gabius等，1992]的5』區序列，是通過將兩個寡核苷酸雜交並克隆再加上一個起始密碼子作為一個合成基因片段而獲得的。這樣，基因序列是對於如所描述的在大腸桿菌中高效表達基因的密碼子選擇優化了的[Gribskov等，1984]。在合成的rMLA基因片段的3』端以及經PCR獲得的rMLA基因片段的5』端引入一個SspI的限、制性位點而得到的。該位點的引入是通過將酪氨酸的密碼子由TAC特異地變為TAT而實現的。該位點允許兩個rMLA基因片段在獲得載體PML14-17時融合(圖5)。
所產生的編碼rMLA的全長序列通過DNA測序得到證實(圖4)。為了獲得rMLA在大腸桿菌中的表達，將基因序列從載體PML14-17中分離出來，並通過插入到表達載體pT7-7中將該序列置於T7-RNA聚合酶啟動子和一個轉錄終止子的控制之下。所得的表達載體pT7-MLA(圖5)被用於轉化大腸桿菌菌株BL-21。實施例6表達載體pT7-MLB的構建為了檞寄生凝集素B鏈的外源表達，將編碼MLB的完整序列通過特定的PCR從歐寄生全基因組DNA中擴增，並經所用的寡聚核苷酸引物的非互補區引入翻譯調控元件以及限制性酶切位點。
圖6b顯示了通過PCR製備完全編碼rMLB的整個基因片段的過程。編碼rMLB的DNA片段的擴增是在總體積為50μl的PCR緩衝液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl20.25mM每種dNTP，pH8.3)中進行的，其中還加有200ng的歐寄生基因組DNA和50pmol的RML25寡核苷酸引物以及30pmol(反應1)和10pmol(反應2)的RML26寡核苷酸引物。PCR是用Taq多聚酶(1.5U/反應，Boehringer Mannheim)進行的，共30個循環，94℃變性1分鐘，52℃復性1分鐘，72℃延伸1.5分鐘。PCR產物用1％的瓊脂糖凝膠和溴化乙錠染色來檢測。PCR的結果產物為0.8kbp，通過凝膠洗脫分離，用於TA載體的克隆。編碼rMLB的基因片段通過插入表達載體pT7-7而置於轉錄調控元件的調控之下，並用所得到的表達載體pT7-MLB對大腸桿菌表達菌株BL21進行轉化。PCR產生的、編碼rMLB的全序列的完整性由DNA測序來證實(圖4b)。實施例7rMLA和rMLB的表達、免疫學分析、重摺疊和體外重聚合(I)rMLA在大腸桿菌中的表達為表達重組檞寄生凝集素A鏈，在裝有1升LBAMP培養基的容量2升的溝狀組織搖瓶中，接種5ml靜置培養的大腸桿菌BL21/pT7-MLA菌株的預培養物，在37℃條件下進行搖床培養。利用578nm的濁度測定觀測生長。當細胞密度達到了OD578≈0.9-1.0時，通過加入0.5mM IPIG誘導基因表達。誘導後兩個小時，通過5000rpm在GS-3離心機上4℃離心20分鐘獲得菌體沉澱，而棄去培養基，從而收穫得菌體。從1升的培養體積分離到3-4g(溼重)的細胞物質。
細胞裂解是用法式壓榨機(SML儀器)進行的。細胞沉澱物在20ml裂解緩衝液B(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mMEDTA，5mM DTT，1mM PMSF pH8.0)中重新懸浮，利用法式壓榨機以1500psi進行兩步裂解。不溶性的細胞級分和可能存在的包涵體然後在SS-34離心機中(Sorvall)4℃以10,000rpm離心30分鐘而沉澱，從而與依然在上清液中的可溶性的大腸桿菌蛋白或可溶性的表達產物分離開。
為了分析表達，等體積的細胞裂解級分用12.5％的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳和考馬斯亮蘭染色檢查，同時用MLA的特異性抗血清TA5進行蛋白質印跡分析(圖7a)。單克隆抗體TA5[Tonevitsky等1995]由作者提供。象在本發明中應用的其它抗體一樣，它們可用各自的免疫原通過標準的技術來製備，(對於TA5的製備來說，免疫原是ML-1或MLA)。為了檢測表達，對等體積的大腸桿菌裂解物可溶性級分(2，4，6，8道)及不溶的「包涵體」級分(1，3，5，7道)中rMLA組分進行了檢測。為了顯示表達的過程，採用了誘導基因表達之前(1，2道)誘導後2小時(3，4道)、4小時(5，6道)和6小時(7，8道)的樣品。表達在誘導1個小時後，已通過一種對應於rMLA的25KDa的免疫陽性蛋白的出現得到證實，這種蛋白的最大表達是在誘導後2小時。誘導後兩小時rMLA在可溶性和不溶性細胞級分中的分配是各為50％，當表達時間延長時，將會引起不溶性「包涵體」形成的增加。
(II)從不溶性的「包涵體」中分離rMLA大腸桿菌全細胞裂解物的沉澱，依據Babitt等人所述的方法，每次用20ml的STET緩衝液(50mM Tris-HCl，8％(w/v)蔗糖，50mM EDTA，1.5％(v/v)的Tritonx-100，pH7.4)洗兩遍以除去大腸桿菌蛋白。剩餘的沉澱物及其包含的「包涵體」在20毫升的變性緩衝液(6M鹽酸胍，100mM DTT，50mMTris-HCl，pH8.0)中溶解，溶解是通過在室溫不斷攪拌的條件下保溫16小時完成的。
對於rMLA的復性，處於變性緩衝液中的蛋白質溶液被緩慢地逐滴加入到90倍體積的摺疊緩衝液(50mM Tris-HCl 2mMDTT，1mM EDTA pH8.0)中，並在室溫和不斷攪拌的條件下孵育16小時。沉澱的蛋白用一臺GS-3(Sorvall)離心機，4℃6000rpm離心30分鐘分離。包含有rMLA的上清液中加入20％(v/v)的甘油在4℃保存。
(III)通過免疫親和層析純化rMLA對於通過免疫親和層析對rMLA(可溶性的表達產物級分或重摺疊蛋白)的一步純化過程，260μg針對檞寄生凝集素A鏈的抗nMLA的單克隆抗體IgG(TA5，Tonevitsky等1995)依照Harlow和Spur〔1988〕所述的方法，共價固定在A蛋白葡聚糖凝膠CL4B(Sigma，Deisenhofen)上。在rMLA樣品與免疫親和基質共孵育後，用10倍床體積的清洗緩衝液1(1M NaCl，10mM磷酸緩衝液，pH7.0)和10倍床體積的清洗緩衝液2(10mM磷酸緩衝液，pH7.0)去除非特異性結合蛋白後，特異性結合的rMLA用洗脫緩衝液(0.1M甘氨酸，pH2.5)洗脫。洗脫液在包含有1M磷酸緩衝液pH8.0的容器中重調pH值。
(IV)rMLB在大腸桿菌中的表達為了表達重組的檞寄生凝集素B鏈，在裝有1升LBAMP培養基的容量為2升的溝狀組織搖瓶中，接種5ml靜置培養的大腸桿菌BL 21/p77-MLA菌株的預培養物，37℃搖床培養。利用578nm的濁度測試儀觀測生長，當細胞密度達到OD578≈0.9-1.0時加入0.5mM IPTG以誘導基因表達。為收穫菌體，在誘導4小時後，用一個GS-3離心機(Sorvall)在4℃，以5000rpm離心20分鐘以獲得沉澱，棄去培養基。
用一臺法式榨機TM(SLM機械)進行細胞裂解。細胞沉澱在20ml裂解緩衝液B(20mM磷酸緩衝液，50nM氯化鈉，1mM ED TA，1mM PMSF，pH7.2)中重懸浮，在1500psi下用法式壓榨機2步裂解。不溶性的細胞級分和可能的「包涵體」，然後在SS-34離心機(Sorvall)上在4℃下以10,000rpm離心30分鐘獲得沉澱，並且與可溶性的大腸桿菌蛋白或依然在上清中的表達產物分離開。
為分析表達，等體積的細胞裂解級分用12.5％SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢查和考馬斯亮蘭染色以及用特異抗MLB的抗血清TB33進行蛋白質印跡分析(圖7b)。單克隆抗體TB33〔Tonevitsky等1995〕由本作者提供。它們是用標準技術製備的。相應的抗體，可以由本技術領域內的專業人員用ML-1或MLB作為免疫原利用標準技術製備。為分析表達，對大腸桿菌的可溶級分(2，4，6，8道)和不可溶級分(1，3，5，7道)中的rMLB含量做了檢測。為了顯示表達的過程，採用了基因表達誘導前(1+2道)，誘導後2小時(3+4道)4小時(5+6道)、6小時(7+8道)的樣品。表達在誘導後1小時已經由相對應於檞寄生凝集素B鏈的31KPa的免疫陽性產物的出現而證明，該蛋白在誘導後4小時達到最高表達。在誘導後4小時，rMLB在可溶性和不可溶性裂解產物級分中的分配各為約50％，延長表達時間，將會使表達的rMLB在不溶性「包涵體」中積累。
(V)從不溶性「包涵體」中分離rMLB大腸桿菌全細胞裂解物的沉澱物，用每次20ml的STET-緩衝液(50mM Tris-HCl，8％(w/v)蔗糖，50mM EDTA；1.5％(v/v)Triton X-100pH 7.4)依據Babitt等人〔1990〕所述的方法衝洗兩次，以除去大腸桿菌蛋白。剩餘的沉澱物及在其中所包含的「內涵體」通過在室溫搖床上孵育16小時在20ml變性緩衝液(6M鹽酸胍，100mM DTT，50mMTris-HCl，pH8.0)中溶解。
為了rMLB的復性，將處在變性緩衝液中的蛋白溶液，逐滴緩慢地加入到90倍體積的摺疊緩衝液(20mM磷酸緩衝液，50mM KCl，1mMEDTA，100mM葡萄糖，10％(v/v)甘油，10mM β-乳糖pH5.3)中並在室溫攪拌的條件下孵育16小時。沉澱的蛋白用GS-3離心機(Sorvall)在4℃下以600rpm離心30分鐘，從而使之與可溶性的摺疊的rMLG級分分離(VI)利用N-乙醯-D-半乳糖胺瓊脂糖凝膠上的親和層析分離rMLB為了分離具有活性的可結合糖基的rMLB，N-乙醯半乳糖胺瓊脂糖凝膠親和基質(PIERCE，USA)用10倍床體積的層析緩衝液平衡(50mM磷酸緩衝液，300mM NaCl，1mM EDTA，10％(v/v)甘油，0.05％(v/v)Tween-20 pH7.0)。樣品的施用是通過將親和基質分批在含rMLB樣品的溶液中4℃孵育至少2小時進行的。在用層析緩衝液清洗親和基質以除去非特異性結合蛋白後，結合的rMLB用競爭性的替代物在層析緩衝液(pH4.0)中的0.3M N-乙醯半乳糖胺洗脫。
(VII)體外檞寄生凝集素鏈的重聚合以製備全蛋白重組的檞寄生凝集素全蛋白(rML)可以從分離的摺疊的檞寄生凝集素A和B鏈起始，或經共摺疊復性從變性蛋白開始製備。
對於分離的摺疊的單鏈的重聚合，分離的檞寄生凝集素B鏈在20mM磷酸緩衝液、50mM NaCl、1mM EDTA、pH7.2中，在4℃條件下，與過量1摩爾的rMLB共孵育16～48小時。為了形成鏈間二硫橋，反應混合物在如下條件下孵育含6mM穀胱甘肽(還原態與氧化態之比為5∶1)，或含10mM穀胱甘肽(還原態與氧化態之比為2∶1)的氧化還原系統加1mM的蛋白二硫鍵異構酶(BoehringerMannheim)。
對於通過共摺疊從變性的單鏈開始的重聚合，rMLB鏈以2mg/ml的濃度溶解在6M鹽酸胍、1mM ETT、50mM Tris-HCl、pH8.0中，為了完全還原半胱氨酸殘基，將rMLB鏈溶解在6M鹽酸胍、100mMDTT、50mM T-HCl pH8.0中，在室溫孵育20分鐘後，通過在PD-10上(Pharmacia，Sweden)的凝膠滲透重新更換6M鹽酸胍、50mMTris-HCl pH 8.0的緩衝液，最終將濃度調整到200μg/ml。rMBL與過量一摩爾的rMLA共摺疊來重聚合。以1∶30的比率將胍溶液緩慢地稀釋到偶聯緩衝液(50mM磷酸鈉緩衝液、50mM KCl、1mMEDTA；10％(v/v)甘油、100mM葡萄糖，10mM乳糖，pH8.0)中，並在4℃下孵育16小時。為了形成鏈間二硫橋，反應混合物在含2mM穀胱甘肽(還原態與氧化態比為1∶1)的氧化還原體系存在下孵育。
偶聯反應混合物對貯存緩衝液進行透析(50mM磷酸鈉緩衝液、300mM NaCl、1mM EDTA；10％(v/v)甘油，0.05％(v/v)Tween-20，pH8.0)。異二聚體形成的檢測和鑑定是用非還原條件下的SDS-PAGE和隨後的蛋白質印跡分析進行的，後者應用了針對檞寄生凝集素A鏈(TA5)或B鏈的單克隆抗體(TB33)。合成的全蛋白的分離或游離rMLA單體或rMLA凝聚體的分離，是利用在(VI)中所述的親和層析進行的，後者應用了N-乙醯半乳糖胺葡聚糖或乳糖基瓊脂糖。
實施例8。
rMLA和rMLB的等電點均一性。
1～2μg rMLA、天然的MLA、rMLB、天然的MLB或ML全蛋白與IEF標準蛋白(BioRad，USA)一起，在Servalyt PreNets IEF-凝膠(pH3～10 125×123mm，150μm Serva Heidelbeg)上進行等電聚焦。為了分析，蛋白通過半乾電影印(semi-dry electroblotting)法固定到硝基纖維素膜(0.2μm，SchleicherSchüll，Dassel)上。利用一個MLA-特異的單克隆抗體CTA5(Tonevitsky等1995)對rMLA和nMLA，用一個MLB特異的單克隆抗體(TB33，Tonevitsk等/1995)對rMLB、nMLB和ML全蛋白進行免疫染色，免疫複合體則利用聯接有鹼性磷酸酶的抗鼠IgG-IgG(Sigma Deisenhofen)染色，並與底物NBT和BCIP反應(圖8)。
儘管高度純化的檞寄生凝集素A鏈以及B鏈都是等電點非均一蛋白，nMLA和nMLB的等電點分別為5.2∶5.4∶5.5∶6.2和7.1∶7.3，重組的rMLA鏈和rMLB鏈都是等電點均一蛋白，各自等電點為6.8和5.1(圖8)。因此，重組的檞寄生凝集素蛋白均一的遷移率證明了rML的均一性，而自然存在的ML全蛋白存在有大量分子變體，具有微不均一性。
實施例9rMLA的核糖體失活酶活性的檢測由免疫親和層析化純化的rMLA(重摺疊的)或rMLA(可溶性的)以及天然的MLA鏈(nMLA)的蛋白濃度按Bradford〔1976〕所述的方法利用BSA標準來測定。
為了對MLA的rRNA-N-糖苷酶活性進行檢測和定量，利用「TNT偶聯的網狀細胞體系」(Promega USA)建立了一種非放射性檢測系統。每次反應中，等量(20μl)的TNT體系在30℃先預孵育15分鐘。為了對翻譯抑制定量，對照反應中加入2μl相應的緩衝液，而測試反應中加入2μl的MLA系列稀釋液(濃度從350～0pM)。對於每個反應，間隔8分鐘取兩個樣品，並在液氮中冷凍以中止反應。在生物發光實驗中用液體閃爍計數器測定螢光素酶相對量，(sqrt-cpm)，作為翻譯活性的計量。以各反應在不同時間取樣測得的squt-cpm差別作為相對翻譯活性的計量。沒有RIP的對照反應中的活性作為零失活率(IAR)。
通過用相對翻譯失活率與rMLA的濃度(蛋白濃度)相對照，再利用非線性回歸法得出與對照反應相比具有50％的翻譯活性抑制的蛋白濃度。此IC50值是一個系統依賴性的值，從而可以對rMLA(可溶的)、rMLB(重摺疊的)以及nMLA的酶活力進行檢測和定量。
圖9顯示了重組MLA鏈的核糖體失活酶活性的檢測。通過對可溶性表達產物(rMLA)的分離和從「包涵體」中分離的蛋白的重摺疊(重摺疊的rMLA)，可以獲得具有酶活性的表達產物。rMLA(可溶性的)和rMLA(重摺疊的)表現IC50值10.71.3pM或15.6±6.6pM相應的活性。因此它們表現出比天然MLA鏈(IC501.1±0.7pM)低的毒性。
實施例10檞寄生凝集素B鏈的糖基結合活性對於檞寄生凝集素B鏈的糖基結合活性的檢測以及對於天然的重組的檞寄生凝集素B鏈的糖基結合活性及專一性的比較，是在競爭性糖存在的情況下，用酶聯凝集素反應(ELIA)來進行的。nMLB鏈和rMLB鏈的結合活性通過用主要用於半乳糖以及N-乙醯乳糖胺殘基的固定化脫唾液酸胎球蛋白基質，和主要用於唾液酸的固定化胎球蛋白基質來確定。
對於糖基質的固定化，將110μl的1.1mg脫唾液酸胎球蛋白(SigmaDeisenhofen)或1.1mg胎球蛋白(Sigma.Deisenhofen)在11ml PBS中的溶液轉移到MaxiSorp C96微孔板(Nunc，Wiesbaden)上，室溫孵育16小時。用150μl/孔PBS-T(10mM磷酸鈉緩衝液，130mM NaCl，0.1％(v/v)Tween-20，pH7.2)衝洗微孔板三次後，微孔板用200μl/孔PBS-T-1％BSA(10mM磷酸鈉緩衝液，130mM NaCl，0.1％(v/v)Tween-20，1％(w/v)BSA，pH7.2)在36℃孵育一個小時，以封閉非特異性結合位點，然後用上述的溶液衝洗。為進行試驗，應用了濃度為100～500ng/ml(優選400ng/ml)的100μl的B鏈製劑。實驗濃度通過將樣品稀釋在PBS-0.05％ BSA(10mM磷酸鈉緩衝液，130mM NaCl，0.05％(w/v)BSA，pH7.2)中來調整。每個試驗濃度和對照準備2-3份。用PBS-0.05％BSA或相應的製備緩衝液進行對照測定。為了測定結合的特異性，樣品在有游離的、競爭性糖存在的情況下孵育。為了從脫唾液酸胎球蛋白或胎球蛋白基質上將結合的rMLB、nMLB或ML全蛋白置換下來，應用的各種糖及相應的濃度範圍為半乳糖在0～280mM為佳；N-乙醯半乳糖胺0～280mM；乳糖0～140mM；或唾液酸0～140mM。
微孔板在上樣後在36℃孵育2小時，然後用上述方法衝洗。對於每一個加樣孔，加入10μl/孔羊抗檞寄生凝集素血清(1∶19800稀釋於PBS-T-0.1％BSA-Tx(10mM磷酸鈉緩衝液，130mM NaCl，0.1％(v/v)Tween-20，0.1％(w/v)BSA，1％(v/v)Triton-X100，pH7.2)中的血清，36℃孵育2小時，然後如上所述衝洗。為檢測免疫複合體，每加樣孔中加入辣根過氧化物酶聯接的抗羊IgG-IgG(SigmaDeisenhofen)100μl，二抗以1∶3500的稀釋在PBS-1％BSA中(10mM磷酸鈉緩衝液，130mM NaCl，1％(w/v)BSA，pH7.2)，36℃孵育一小時。各孔然後用150μl/孔的PBS-T洗6次。為了顯色，加入100μl/孔的底物溶液(1片鄰苯二胺片劑(Sigma Deinsenhofen)在25ml 65mM檸檬酸pH5.0中加10μl 30％的過氧化氫)，並在室溫暗處孵育20分鐘。通過加入100μl/1M硫酸/孔來終止反應。利用吸收光度計在450nm(參比波長690nm)處測定，同時用4參數法(4-ParameterFit)從測得的數據來計算IC50值。
圖10顯示了從固定化的脫唾液酸胎球蛋白-配基用遞增量的D-半乳糖(圖10a)、β-乳糖(圖10b)或N-乙醯半乳糖胺(圖0c)置換rMLB和nMLB的數值，圖10也顯示了用遞增量的唾液酸從固定化的胎球蛋白-配體置換的數值，這些數值是在ELLA體系中觀測到的。nMLB和rMLB的結合特性用相對應於半數最大置換的IC50值描述。
儘管植物nMLB鏈的糖基結合主要被半乳糖(IC50＝4.5mM)和β-乳糖(IC50＝4.9mM)所競爭，重組的rMLB鏈令人吃驚地具有顯著改變的糖基結合專一性。與nMLB的糖基結合活性不同，rMLB的糖基結合活性不能被半乳糖(IC50值未定)所競爭，而且僅被β-乳糖有限程度地競爭(IC50＞70mM)。除了對於半乳糖和β乳糖急劇降低的親和力外，重組的rMLB鏈還具有對N-乙醯半乳糖胺的顯著的專一性(IC50＝109mM)。對nBLB描述的另一結合唾液酸配體的活性，對於重組的rMLB鏈同樣也可以檢測到(圖10d)。對於植物nMLB鏈(IC50＝49.8mM)和重組的rMLB鏈(IC50＝47.1mM)檢測到相同的結合親和力。
相對於植物的主要是半乳糖/β-乳糖特異結合的nMLB鏈，重組製備的MLB鏈具有一個明顯地向N-乙醯半乳糖胺/唾液酸結合方向轉移的明顯不同的糖基結合專一性。
實施例11。
在體外重聚合的rML全蛋白對於人淋巴白血病細胞的細胞毒作用的檢測。
檞寄生凝集素全蛋白完整性的檢測是通過對人的單核(淋巴性)白血病細胞系MOLT-4(歐洲動物細胞培養物保藏中心，編號NO.85011413)的細胞毒作用的定量分析進行的。
MOLT-4細胞培養於無血清的MDC-1培養基(PANSYSTEMS，Aidenbach)中，並將細胞密度調整至1.5×105MOLT-4細胞/ml，其中活細胞＞98％，以備檢測。為了測定細胞毒作用，96孔微孔板的每孔中，添加相當於18000細胞/孔的90μl MOLT-4細胞懸液，並混以10μl的樣品溶液。
在本實驗中，相應地使用了檞寄生凝集素全蛋白製劑(批量號#220793(Madaus)以及編號BRAIN 12/94，是用乳糖基葡聚糖，用標準技術，從檞寄生的葉中或檞寄生茶中分離的〔Franz等1977〕)以及體外重聚合的rML全蛋白，濃度範圍是1～100pg/ml(1.6fM-1.66pM)，用MDC-1細胞培養基系列稀釋。各濃度樣品和對照準備6個平行樣。
細胞在37℃5％CO2的孵育箱中孵育72小時。細胞毒作用的定量檢測是通過用可溶性甲染料測定細胞的生存率來進行的。利用WST-1方法〔Scudiero等1988〕用相應的細胞增殖試劑WST-1(Boehringer Mannheim)測生存率。
重組的全蛋白以及雜合的全蛋白rMLB/nMLB相對於天然蛋白，表現出一致的生物學活性，對於MOLT4-的細胞毒作用的IC50值為10～30pg/ml。然而，在測試的濃度範圍中(rMLB最高到1ng/ml)，rMLB並沒有表現細胞毒效應。
實施例12
重組的檞寄生凝集素(rML)對人的單核細胞系U937的凋亡誘導。
對於用重組的檞寄生凝集素(rMLA/rMLB)進行的凋亡誘導過程的檢測是用螢光染料DAPI對核染色進行的〔Hotz等1992〕。在核形態上的典型凋亡變化在顯微鏡下可見，對每樣品計數500-100個細胞的方法來定量。使用無血清培養基對實驗的靈敏度是必要的，因為血清蛋白的存在會大大減少可用凝集素的數目(10％FCS下減少約40倍，Ribereau-Gayon等1995)。24小時的誘導時間只允許與MOLT實驗部分直接相關，因為細胞毒作用在生存率實驗中只有在72小時才明顯顯示出，而凋亡是一種可以較早檢測出來的效應。如果孵育時間過長，凋亡就會被二級的壞死所遮蓋。
圖12顯示了在用重組的ML全蛋白作用後，凋亡的U937細胞比率顯著的上升。在70pg/ml濃度下，凋亡細胞的數目在24小時後在無血清培養的兩個不同的培養物中增加3倍。因此，和天然蛋白〔Janssen等1993〕一樣，重組的檞寄生凝集素也可以誘導細胞凋亡。
實施例13在PBMC模型中，重組的檞寄生凝集素的免疫刺激作用在人複雜的免疫系統網絡中，細胞因子TNF-α(單核細胞，巨噬細胞)和IFN-rLT輔助細胞)是處於中心地位的介質。
從健康血液供體中得到的人的單核細胞(PBMC，包含單核細胞和淋巴細胞)依照生產商(Pharmacia，Sweden)的說明；通過FICOLL-PAQUE密度梯度離心法分離。
為了誘導釋放TNF-α，細胞(4×106單核細胞/ml)先在RPMI1640培養基(包含10％(v/v)胎牛血清，100U/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素)中只與重組的檞寄生凝集素蛋白孵育18小時、然後與從馬流產沙門氏細菌(Solmonella abortus equi)中分離的1μg/ml的脂多糖作為輔助刺激因子再孵育24小時，孵育是在37℃5％CO2和＞95％的相對溼度的條件下，在U形的細胞培養多孔板上，在充氣的孵箱中進行的、然後，在無細胞的上清液中，INF-α的濃度可以用任何ELISA方法定量(Genzyme Diagnostics，Rüsselsheim)。
對於誘導釋放IFN-γ，細胞在上述的培養基中與重組的檞寄生凝集素單獨孵育1個小時，然後，再與作為輔助性刺激因子的植物血凝集素-L(濃度0.5μg/ml)一起共孵育65小時，方法如上所述。然後在無細胞上清液中，用ELISA(ENDOGEN INC，Cambridge USA)方法定量IFN-γ的相應濃度。
實施例14在skin2ZK 1200模型中重組檞寄生凝集素的免疫刺激作用。
作為生物檢測法確立的skin2模型，由一片三維的包含成纖維細胞的皮膚，和其自然分泌的基質中的未角質化的角質細胞而來的結構化上皮組成〔Joller等1996〕。皮膚組織片(11×11mm2，來自人，原代培養細胞，Advanced Tissue Science ATS，La Jolla USA)提供時放在瓊脂糖中的尼龍網上，接收後立即轉移到特殊培養基A(ATS，La JallaUSA)中。
IL-1α和IL-6都是與人免疫系統相關的刺激性細胞因子。為誘導釋放IL-1α和IL-6，皮膜組織片和測試物質，在2ml的特殊培養基B(ATS，La Jolla USA)中共孵育24小時，用12杯的細胞培養板(Corning Glass Works Gorning USA)在37℃、5％CO2和＞95％的相對溼度的情況下進行孵育。在無細胞上清液中，用ELISA對IL-1α(量化人IL-1α實驗，RD Systems.Inc.Minneapolis，USA)和IL-6(人白細胞介素-6 ELISA，Boehringer Mannheim GmbH)進行定量。
skin2模型表明IL-1α的釋放被0.25～8ng rML/ml以劑量依賴方式誘導，IL-6的釋放也以劑量依賴方式為0.5-8ng rML/ml所誘導(圖14)。令人吃驚的是，上述的所有細胞因子的釋放都不能由單獨的重組rMLB引起。這個發現與早先本領域內的知識完全相反，以前認為，免疫刺激作用主要由凝集素的B鏈活性引起〔Hajto等1990〕。
實施例15重組的檞寄生凝集素B鏈(rMLB)對免疫活性細胞的活化。
免疫活性細胞的活化是用細胞表面蛋白CD69的誘導來檢驗的。CD 69是T細胞、B細胞特別是自然殺傷細胞(NK細胞)活化後第一批出現的細胞表面抗原之一，因為其對於腫瘤細胞的識別和裂解作用而在對腫瘤的自然防禦中起主要的作用。CD 69是上述免疫活性細胞群體的一種活化標誌，因為靜止期的淋巴細胞不表達該細胞表面蛋白。而且，對於可誘導的CD 69表面蛋白，可檢測到對NK細胞和TcRγ/δT細胞的細胞裂解活性的傳導功能〔Moretta等1991〕。
為用流式細胞計(FACS)檢測人單核細胞的表面標記，PBMC用與實施例13中相似的方法在Hypague(Sigma)中用梯度離心法分離。在將細胞溶解在含5％FCS的RPMI 160培養基中，並以約250000細胞/每孔的量接種到微孔板上後，溶液分別與1、10、30和100ng的試驗底物rMLB共孵育4小時。在冰浴中與螢光標記的抗CD 69共孵育20分鐘，接著用含5％FCS的Hank氏液清洗。沉澱的標記細胞被加入到200μl Sheath液(Sheath Fluid)中，並在FACScan(Becton Dickinson)中測量。平均螢光值相應於每細胞CD 69標誌的數量以及在整個細胞群體中CD 69陽性細胞所佔的份額。
在濃度範圍為1～100ng/ml時，按細胞表面CD 69的出現以及按CD 69陽性細胞的份額計，都可檢測到單核細胞的活化。可以觀察到一個鐘形的劑量依賴性曲線。在本實例中，既使在最高濃度100ng/ml rMLB的情況下，也未檢測到對PBMC的細胞毒作用。
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權利要求
1.一種核酸分子，其(a)編碼一種在成熟後表現出檞寄生凝集素二聚體生物學功能的前蛋白原，並具有在圖4c中所描述的核酸序列；(b)編碼(a)中的前蛋白原的一個片段，該片段具有檞寄生凝集素二聚體的生物活性部位；(c)由於簡併性而與(a)或(b)的核酸分子不同；或者(d)在嚴緊條件下與(a)、(b)、或(c)的核酸分子雜交，並且編碼具有在(a)或(b)中所述的生物功能或活性的多肽。
2.如權利要求1中所述的核酸分子，其中所述片段是檞寄生凝集素的A鏈，並由在圖4a中所示的核酸序列所編碼。
3.如權利要求1中所述的核酸分子，其中所述片段是檞寄生凝集素的B鏈，並由在圖4b中所示的核酸序列所編碼。
4.如權利要求1到權利要求3的任一項中所述的核酸分子，它是DNA分子。
5.如權利要求1到權利要求3的任一項中所述的核酸分子，它是RNA分子。
6.一種核酸分子，它是權利要求1到5的任一項中所述核酸分子的反義鏈。
7.包含有權利要求1到6的任一項中所述的至少一種核酸分子的載體。
8.如權利要求7中所述的載體，它既包含有如權利要求2或4中所述的核酸分子，又包含有如權利要求3或4中所述的核酸分子。
9.如權利要求7或8中所述載體，它是一種表達載體。
10.由至少一種如權利要求7到9任一項中所述載體轉化的宿主。
11.如權利要求10所述的宿主，它是哺乳動物細胞、植物細胞、細菌、真菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或轉基因植物。
12.如權利要求11中所述的宿主，其中細菌是大腸桿菌，真菌細胞是麴黴屬的細胞，昆蟲細胞中是灰翅夜蛾細胞，優選草地夜蛾細胞。
13.由權利要求1到5的任一項中所述的核酸分子或權利要求7到9的任一項中所述的載體所編碼的和/或由權利要求10到12的任一項中所述的宿主產生的多肽。
14.如權利要求13中所述的多肽，該多肽帶有至少一種化學或酶學修飾。
15.如權利要求13或14中所述多肽，它是一種融合蛋白。
16.具有檞寄生凝集素生物功能的一種多肽二聚體，其中一個單體由如權利要求2，4或5的任一項中所述的核酸分子所編碼，另一個單體由如權利要求3到5中任一項中所述的核酸分子所編碼。
17.如權利要求16中所述的多肽二聚體，其中至少有一個單體是如權利要求14或15中所述的多肽。
18.特異性結合如權利要求13到15的任一項中所述的多肽和或結合由權利要求16或17中所述的多肽二聚體的一種抗體或其片段或衍生物。
19.產生如權利要求13到15的任一項中所述的多肽或由權利要求16或17中所述的多肽二聚體的方法，其中如權利要求10到12的任一項中所述的宿主在合適的條件下培養，並分離如此獲得的多肽或多肽二聚體。
20.包含有至少一種如權利要求13到15的任一項中所述的多肽或如權利要求16或17中所述的多肽二聚體的一種免疫毒素。
21.一種藥物組合物，其包含有如權利要求13到15的任一項中所述的多肽和/或如權利要求16或17中所述的多肽二聚體和/或如權利要求20中所述的免疫毒素和必要時與藥物可接受的載體混合。
22.可特異性地與權利要求1到5的任一項中所述的核酸分子或與這些核酸分子的互補鏈雜交的一種引物或引物對。
23.一種診斷組合物，其至少包括(a)權利要求1到5任一項中所述的核酸分子；(b)權利要求22中所述的一種引物和/或引物對；和/或(c)權利要求13到15的任一項中所述的多肽和/或權利要求16或17中所述的多肽二聚體。
24.一種植物保護劑，其包含有權利要求13到15的任一項中所述的多肽和/或權利要求16或17中所述的多肽二聚體。
全文摘要
本發明涉及編碼成熟後表現檞寄生凝集素二聚體生物活性的前蛋白原的核酸分子,包含有上述核酸分子的載體,由上述載體所轉化的宿主和由上述核酸分子所編碼的多肽和多肽二聚體。本發明的多肽和多肽二聚體具有廣泛的醫療應用價值。因此,本發明還進一步涉及包含有本發明的多肽或多肽二聚體的藥物和免疫毒素,以及包含有本發明的核酸分子和本發明的多肽或多肽二聚體和/或本發明的可特異性地與本發明的核酸分子雜交的引物的診斷組合物。最後,本發明還涉及包含有本發明的多肽和/或多肽二聚體的植物保護劑。
文檔編號C12N1/21GK1192240SQ96196025
公開日1998年9月2日 申請日期1996年6月25日 優先權日1995年6月26日
發明者H·蘭岑, J·艾克, A·保爾, H·琴科 申請人:科隆馬道斯股份公司