對大腸桿菌o164的o－抗原特異的核苷酸的製作方法

2023-05-10 02:33:56

專利名稱：對大腸桿菌o164的o－抗原特異的核苷酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及大腸桿菌O164(Escherichia coli O164)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及大腸桿菌O164中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對O-抗原特異的寡核苷酸快速、準確地檢測人體及環境中的大腸桿菌O164並鑑定這些致病菌中的O-抗原。
背景技術：
大腸桿菌O164是一種較強烈的致病菌，屬於腸侵襲性的大腸桿菌(EIEC)，引起腹瀉。因此對大腸桿菌O164的檢測是重要的，需要一個可以快速、準確地檢測大腸桿菌O164的方法。
位於大腸桿菌表面的脂多糖是大腸桿菌致病的誘因，而O-抗原是脂多糖最外層結構，是免疫系統識別的目標和噬菌體吸附的位點。O-抗原的缺失會造成許多病原體的血清敏感，或者嚴重削弱病原體的毒力[Frank etal(1987)「The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria」.Rev Infect Dis 1771750-1753.Pluschke G et al「Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18K1 Escherichia coli tocomplement-mediated king」.J Bacteriol 42907-913]。大腸桿菌是一個種，種內的菌株一般通過O-抗原和H-抗原(有時通過K-抗原)來鑑定。其中O-抗原具有高度多樣性，大腸桿菌有166種不同的O-抗原，O-抗原的變化可能是大腸桿菌的起源和維持其多樣性的主要原因[Reeves，P.R(1992)「Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations」.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]。
O-抗原是革蘭氏陰性細菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重複的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉移酶將核苷二磷酸單糖轉移到一個固定在細胞內膜的脂分子上，然後在內膜的內側合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過o-抗原轉運酶被轉移到內膜外側，而後通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)「Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens」.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)「Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria」.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。編碼負責O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)「Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature」Trends in Microbiology，4495-503]。在大腸桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位於galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)「Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships」.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)「The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved」.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉移酶基因，寡糖單位處理基因，其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括o-抗原轉運酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉移到細菌內膜外側，再聚合成多糖。糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因只存在於攜帶這些基因的基因簇裡。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯結鍵的不同和寡糖單位之間聯結鍵的不同構成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯結鍵及寡糖單位之間的聯結鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因為O-抗原是極強的抗原，是大腸桿菌重要的致病因素之一，同時它又具有極強的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準確地檢測大腸桿菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標的血清學免疫反應自上世紀30年代以來一直被用於對細菌的分型和鑑定，是鑑定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數量不足，大量的抗血清在製備和儲存中也存在一些困難。另一方面此法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準確性差，所以，現在普遍認為這種傳統的血清學檢測方法將為現代分子生物學方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑑定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)「Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)」，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應於沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列後得到對不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用對E.coli O111的O-抗原特異的源於wbdI基因的寡核苷酸鑑定了一株產毒素的E.coli O111的血清型[「Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli」.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是後來的研究表明Paton，A.W et.al的用源於wbdI基因的寡核苷酸鑑定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結果出現。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認為，這是由於wbdI基因是一個推測的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)「Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111」.Gene 16417-23]，而在其它細菌的O-抗原的結構中也可能有這個糖，所以糖合成路徑基因對於O-抗原並不是高度特異的。
痢疾志賀氏菌3型和大腸桿菌O124的O-抗原的結構是一樣的，大腸桿菌O124和他們的O-抗原的結構很相似。如下所示GlcLA(1-6)aDGlc(1-4)|-3)bDGalNAc(1-3)aDGal(1-6)bDGalf(1-
GlcLA＝4-O-[(R)-1-carboxyethyl]-b-D-glucopyranose痢疾志賀氏菌3型和大腸桿菌O124的O-抗原的結構bDGlc(1-6)aDGlc(1-4)|-6)bDGalf(1-3)bDGalNAc(1-3)bDGal(1-
大腸桿菌O164的O-抗原的結構他們的血清學具有交叉反應。因此通過血清學方法鑑定區分他們是困難的，也有上述所說的缺點。本研究通過現代分子生物學方法對大腸桿菌O164和痢疾志賀氏菌3型進行快速準確的鑑定和區分。

發明內容
本發明的目的是提供了對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸。它是大腸桿菌O164的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源於IS序列和相鄰的wzx基因的特異的核苷酸。
本發明的一個目的是提供了大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列。
本發明的次一目的是提供了構成大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的基因IS序列(能編碼一個轉座酶)，轉運酶基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf4、orf5、orf7、orf9基因；糖合成路徑基因orf2、orf3、glf。它們在O-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。此外，在大腸桿菌O164的O-抗原基因簇裡還有一個完整的插入序列(IS)和orf3內部有一個終止子的突變。
本發明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源於所述的IS序列和相鄰的wzx基因；長度在18-30nt；它們對大腸桿菌O164的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的寡核苷酸對，它們對大腸桿菌O164的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合後的寡核苷酸對大腸桿菌O164的O-抗原也是高度特異的。
本發明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用於核酸擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列，從而通過這些方法來檢測和鑑定大腸桿菌O164的O-抗原及檢測和鑑定大腸桿菌O164。
本發明的再一目的是提供了分離大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細菌的基因簇的全序列。
本發明的目的是由以下技術方案實現的。
本發明對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長14006個鹼基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O164型的O-抗原特異的核苷酸，其中包括命名為IS序列和wzx，orf2，orf3，orf4，orf5，wzy，orf7，glf，orf9的9個基因組成，都位於galF基因和gnd基因之間。
前述的大腸桿菌O164的O-抗原的核苷酸序列，其特徵在於，基因包括如下基因轉運酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf4、orf5、orf7、orf9基因。其中所述的轉運酶基因是SEQ ID NO1中的2518至4011鹼基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的8424至9527鹼基的核苷酸；其中所述的轉運酶基因是SEQ ID NO1中的2518至4011鹼基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的8424至9527鹼基的核苷酸；orf4基因是SEQ ID NO1中的6561至7565鹼基的核苷酸；orf5基因是SEQ ID NO1中的7562至8350鹼基的核苷酸；orf7基因是SEQ ID NO1中的9556至10605鹼基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO1中的11845至12618鹼基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，其分別源於所述的IS序列和相鄰的wzx基因；以及它們的混合或它們的重組。
前述的對大腸桿菌O164的O-抗原高度特異的核苷酸，其特徵在於，所述的源於IS序列的寡核苷酸作為上遊引物，它們是SEQ ID NO1中的1868至1885鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的2265至2284鹼基的核苷酸；所述的源於wzx基因的寡核苷酸作為下遊引物，它們是SEQ ID NO1中的3020至3050鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的2809至2827鹼基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O164型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達O-抗原的細菌、鑑定細菌的O-抗原和細菌的其它多糖抗原中的應用。
前述的對大腸桿菌O164型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達而提供表達大腸桿菌O164型的O-抗原，及製備細菌疫苗中的應用。
前述的對大腸桿菌O164型的O-抗原特異的核苷酸的應用，其特徵在於，它作為引物用於PCR、作為探針用於雜交反應與螢光檢測、或者用於製造基因晶片或微陣列，供檢測細菌的應用。
前述的對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特徵在於，它是用步移法得到的。包括下述步驟(1)基因組的提取提取大腸桿菌O164的基因組；(2)引物的設計在痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇中的相鄰的或相隔的兩個基因內設計上下遊引物；要求上下遊引物分別位於相鄰的兩個基因或相隔的基因內。每一對引物按如下步驟進行試驗。
(3)通過PCR擴增大腸桿菌O164中的O-抗原基因簇的相應序列用每對分布在相鄰基因內的上下遊引物，以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。每對引物將得到不同大小的PCR產物。將得到的PCR產物，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性。合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定，並再設計引物和測序直到從兩端將每個PCR產物的序列測通。
(4)核苷酸序列的拼接及分析應用生物信息學軟體拼接和編輯上述得到的所有的核苷酸序列。
(5)對不準確的序列再次測序以不準確的序列的兩側的序列為模板設計引物，並以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定。
(6)再次進行核苷酸序列的拼接及分析將新得到的序列加入到原有的序列中再次拼接並編輯所有的核苷酸序列。最終得到大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇的準確的全序列。用生物信息學軟體對得到的序列進行序列的比對和分析，並用Artemis軟體做基因的注釋。
(7)特異基因的篩選在比較了大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇後，針對大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇的不同序列即IS序列及相鄰的wzx基因設計引物；上遊引物分布在IS序列內，下遊引物分布在IS序列和相鄰的wzx基因內，以確保其對大腸桿菌O164型的特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，確定它們對大腸桿菌O164型的O-抗原的高度特異性；(8)引物靈敏度的檢測培養大腸桿菌O164，細菌計數後分別將5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養基，取一些與樣品混合過的LB培養基過濾，將過濾液進行培養，從培養好的菌液中取數毫升處理後作為PCR模板用寡核苷酸進行PCR反應，檢測其對大腸桿菌O164的靈敏度前述的對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特徵在於，包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養基中37℃過夜培養大腸桿菌O164，離心收集細胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然後加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之後加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘餘的酚，上清液用2倍體積乙醇沉澱DNA，用玻璃絲卷出DNA並用70％乙醇洗DNA，最後將DNA重懸於30ul TE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)引物的設計在痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇中的相鄰的或相隔的兩個基因內設計上下遊引物；要求上下遊引物分別位於相鄰的兩個基因或相隔的基因內。設計的引物如下


(3)通過PCR擴增大腸桿菌O164中的O-抗原基因簇的相應序列用每對分布在相鄰基因內的上下遊引物，以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。PCR反應程序如下在95℃預變性3分鐘，然後95℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(見表中)，退火時間是50秒，72℃延伸時間因引物的不同而不同(見表中)，這樣進行30個循環；最後，在72℃繼續延伸10分鐘，得到PCR產物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性；合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定，並再設計引物和測序直到從兩端將每個PCR產物的序列測通。
(4)核苷酸序列的拼接及編輯用英國劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學實驗室出版的Staden package軟體包的Pregap4和Gap4軟體拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的核苷酸的全長序列。
(5)對不準確的序列再次測序以不準確的序列的兩側的序列為模板設計引物，並以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定。
(6)再次進行核苷酸序列的拼接及分析用Staden package軟體包的Pregap4將新得到的序列加入到原有的序列中再次拼接，並用Gap4軟體編輯所有的核苷酸序列。最終得到大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇的準確的全序列。在得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的核苷酸序列後，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發現基因，找到9個開放的閱讀框，用blast系列軟體與GenBank中的基因比較以發現這些開放閱讀框的功能並確定它們是什麼基因，再用英國sanger中心的Artemis軟體完成基因注釋，用ClustralW軟體做DNA和蛋白質序列間的精確比對，最後得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的結構；並與痢疾志賀氏菌3型的結構比較，發現他們有相同的基因。這些基因具有相同的排列順序。唯一的不同是大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的第一個開放閱讀框之前(5′端)有一個插入序列(IS)。
(7)特異基因的篩選在比較了大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇後，針對大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇的不同序列即IS序列與相鄰的wzx基因設計引物；上遊引物分布在IS序列內，下遊引物分布在IS序列和相鄰的wzx基因內，以確保其對大腸桿菌O164型的特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，確定IS序列對大腸桿菌O164型的O-抗原是高度特異的；可以用上述引物進行PCR，來區分和鑑別環境中的大腸桿菌O164型和痢疾志賀氏菌3型。
(8)引物靈敏度的檢測將大腸桿菌O164的凍存菌液接種到有LB培養基的三角瓶中，30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時至飽和，取培養好的菌液稀釋，取稀釋菌液塗布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養數小時計數，計算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌，攪拌均勻，加入LB培養基，過濾，過濾液於30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時；從培養好的菌液中取數ml於6,000g離心數分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉澱並混勻，放入100℃沸水中煮數分鐘，裂解液於12,000g離心數分鐘，取上清做為PCR模板；用所述的源於IS序列的寡核苷酸作為上遊引物，它們是SEQ IDNO1中的1868至1885鹼基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2265至2284鹼基的核苷酸。所述的源於wzx基因的寡核苷酸作為下遊引物，它們是SEQ ID NO1中的3020至3050鹼基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2809至2827鹼基的核苷酸進行PCR反應，PCR反應體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個循環；反應結束後，取10μl反應產物電泳，若有與預期大小相符的擴增帶，則結果為陽性，若沒有，則結果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個活菌的每份豬肉餡均在2對引物的PCR反應中得到陽性結果；參入0個活菌的豬肉餡在2對引物的PCR反應中得到陰性結果；說明使用上述方法時，這2對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O164的檢測靈敏度均為0.25個菌/g。
也就是，本發明的第一個方面，提供了大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長14006個鹼基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發明的方法得到了大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的結構，如表3所述，它包括命名為IS序列和wzx，orf2，orf3，orf4，orf5，wzy，orf7，glf，orf9的9個基因組成，都位於galF基因和gnd基因之間。
本發明的第二個方面，提供了大腸桿菌O164的O-抗原基因簇中的基因，即轉運酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉移酶基因，包括orf4、orf5、orf7、orf9基因；細菌多糖抗原中特殊的糖合成路徑基因，包括orf2、orf3、glf。它們在O-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本發明的第三個方面，提供了源於大腸桿菌O164的O-抗原基因簇中的IS序列和相鄰的wzx基因的寡核苷酸，它們是IS序列和相鄰的wzx基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優先被用的是列於表1中的寡核苷酸對。在表1中也列出了這些寡核苷酸對在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應的產物的大小，這些PCR反應可用表中的退火溫度進行。這些引物只在以大腸桿菌O164為模板進行的PCR擴增中得到預期大小的產物，而在以表2所列的其它菌為模板進行的PCR擴增中都未得到預期大小的產物。更詳細地說，以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應在大多數細菌中均未得到任何產物，所以，可以確定這些引物即表1所列的寡核苷酸對大腸桿菌O164及它們的O-抗原是高度特異的。
所述的對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟1)基因組的提取；2)引物的設計；3)通過PCR擴增大腸桿菌O164中的O-抗原基因簇的相應序列；4)核苷酸序列的拼接及編輯；5)對不準確的序列再次測序；6)再次進行核苷酸序列的拼接及分析，最終獲得O-抗原基因簇的結構；7)特異基因的篩選；8)引物靈敏度的檢測。
本發明的其他方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
如本發明所述，「寡核苷酸」主要是指來源於O-抗原基因簇中的IS序列和相鄰的wzx基因中的任何一段寡核苷酸，它們在長度上可改變，一般在10到20個核苷酸範圍內改變。尤其是源於IS序列(核苷酸位置是從SFQ ID NO1的1258至2277鹼基)，wzx基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的2518至4011鹼基)內的寡核苷酸對大腸桿菌O164都是高度特異的。
此外，有時兩個遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產生新的O-抗原，從而產生新的細菌類型，新的突變株。在這種環境中，需要篩選出多對寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測的特異性。因此，本發明提供了一整套多對寡核苷酸的混合物，它們源於IS序列和相鄰的wzx基因。這些基因的混合物對一個特殊的細菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對這個細菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是分別源於IS序列和相鄰的wzx基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發明涉及寡核苷酸的鑑定，它們可以用於檢測表達O-抗原的細菌和在診斷中鑑定細菌的O-抗原。
本發明涉及到一種檢測食品中的一個或多個細菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉座酶的IS序列(ii)編碼轉位酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細菌是大腸桿菌O164。可用PCR方法檢測，更可以將本發明方法中的核苷酸標記後作為探針通過雜交反應如southern-blot或螢光檢測，或者通過基因晶片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
本發明者考慮到以下情況當單個的特異的寡核苷酸檢測無效時，寡核苷酸的混合物能與靶區域特異性雜交以檢測樣品。因此本發明提供了一套寡核苷酸用於本發明所述的檢測方法。這裡所說的寡核苷酸是指源於編碼轉座酶的IS序列和編碼轉位酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對一個特殊的細菌的O-抗原來說是特異的，這一特殊的細菌O-抗原是由大腸桿菌O164表達的。
另一方面，本發明涉及到一種檢測排洩物中的一個或多個細菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉座酶的IS序列(ii)編碼轉位酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交。這些細菌是大腸桿菌O164。可用本發明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發明中的寡核苷酸分子標記後作為探針通過雜交反應如southern-blot或螢光檢測，或者通過基因晶片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
一般一對寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個寡核苷酸可雜交於非特異性區域。因此，當特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時，至少能選出一對寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當一個特殊的基因簇中所有基因都獨一無二時，此方法也能應用於識別此基因簇內的基因混合物的核苷酸分子。因此本發明提供了一整套用於檢測本發明方法的多對寡核苷酸，在這裡多對寡核苷酸是源於(i)編碼轉座酶的IS序列(ii)編碼轉位酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因。這套寡核苷酸對一個特殊的細菌多糖來說是特異的。
另一方面，本發明也涉及到一種檢測源於病人的樣品中的一個或多個細菌多糖抗原的方法。樣品中的一個或多個細菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個基因中的一對寡核苷酸中的一個特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉座酶的IS序列(ii)編碼轉位酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與樣品中的至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細菌是大腸桿菌O164。可用本發明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發明中的寡核苷酸標記後作為探針通過雜交反應，或者通過基因晶片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
本發明者相信本發明不必限於以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應用於檢測所有表達O-抗原和鑑定O-抗原的細菌。由於O-抗原合成和其他多糖抗原(如細菌胞外抗原)合成之間的相似性，本發明的方法和分子也應用於這些其他的多糖抗原。
本發明首次公開了大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的全長序列，而且可從這個未被克隆的全長基因簇的序列中產生重組分子，通過插入表達可產生表達大腸桿菌O164的O-抗原，並成為有用的疫苗。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件。
實施例1基因組的提取。
在5mL的LB培養基中37℃過夜培養大腸桿菌O164，離心收集細胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然後加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之後加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提兩次，取上清液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘餘的酚。上清液用2倍體積乙醇沉澱DNA，用玻璃絲卷出DNA並用70％乙醇洗DNA，最後將DNA重懸於30ul TE中。基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
實施例2引物的設計在痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇中的相鄰的或相隔的兩個基因內設計上下遊引物；要求上下遊引物分別位於相鄰的兩個基因或相隔的基因內。設計的引物如下


實施例3通過PCR擴增大腸桿菌O164中的O-抗原基因簇的相應序列用每對分布在相鄰基因內的上下遊引物，以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。PCR反應程序如下在95℃預變性3分鐘，然後95℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(見表中)，退火時間是50秒，72℃延伸時間因引物的不同而不同(見表中)，這樣進行30個循環；最後，在72℃繼續延伸10分鐘，得到PCR產物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性；合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定，並再設計引物和測序直到從兩端將每個PCR產物的序列測通。
實施例4核苷酸序列的拼接及編輯用英國劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學實驗室出版的Staden package軟體包的Pregap4和Gap4軟體拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的核苷酸的全長序列。
實施例5對不準確的序列再次測序以不準確的序列的兩側的序列為模板設計引物，並以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定。
實施例6再次進行核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學實驗室出版的Staden package軟體包的Pregap4和Gap4軟體拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質量主要由兩個方面來保證1)對大腸桿菌O164的基因組作6個LongPCR反應，然後混合這些產物以產生文庫。2)對每個鹼基，保證3個以上高質量的覆蓋率。在得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的核苷酸序列後，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發現基因，找到9個開放的閱讀框，用blast系列軟體與GenBank中的基因比較以發現這些開放的閱讀框的功能並確定它們是什麼基因，再用英國sanger中心的Artemis軟體完成基因注釋，用C1ustral W軟體做DNA和蛋白質序列間的精確比對，最後得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的結構，如表3所示。
通過檢索和比較發現，在大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的galF和wzx之間有一段序列(1258bp-2277bp)，比較表明它與Pseudomonas putida的tnpA基因編碼的蛋白在341個胺基酸裡有68％的相似性。與Caulobacter crescentusIS1111A/IS1328/IS1533家族的轉座酶也有60％的相似性，在它的兩端也有反向重複序列。因此這段序列是一個插入序列。發現orf1與E.coli O157H7的wzx基因在440個胺基酸中有17％的胺基酸序列是一樣的，即有17％的相同性，42％的相似性；而且和Bacteroidesfragilis的wzx基因在506個胺基酸中有20％的相同性，42％的相似性，此wzx基因有13個潛在的穿膜區，而通過Eisenberg等的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984)「Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]發現orf1也有13個潛在的穿膜區，而且與許多wzx蛋白相似，orf2在wzx蛋白的氨基端有一個大約50個胺基酸的保守基序，所以可以確定orf1是wzx基因，命名為wzx。Orf2與Sinorhizobium meliloti的一個假設的蛋白在363個胺基酸中有34％的相同性，有52％的相似性，暫時將orf2命名為orf2基因。Orf3也與Sinorhizobium meliloti的一個假設的蛋白在226個胺基酸中有23％的相同性，42％的相似性，暫時將orf4命名為orf4基因。Orf2和Orf3參與合成與轉移丙酮酸的，在orf3內有一個終止密碼子，使其失去了功能，因此大腸桿菌O164的O-抗原中沒有丙酮酸的側鏈，與痢疾志賀氏菌3型。orf4與Streptococcus thernophilus的eps9I基因在239個胺基酸中有30％的相同性，54％的相似性，而eps9I基因是糖基轉移酶基因；另外orf4與Streptococcus agalactiae的CpsIaI基因在390個胺基酸中有29％的相同性，47％的相似性，CpsIaI基因是一個N-乙醯糖基轉移酶基因，所以認為orf4是一個糖基轉移酶基因，命名為orf4。orf5與大腸桿菌的cap8J基因表現出較高的同源性，此基因編碼半乳糖基轉移酶，所以orf5是半乳糖基轉移酶基因，命名為orf5。orf6是一個預測帶有10個跨膜片段的蛋白，它的內膜的拓撲結構具有眾所周知的O-抗原聚合酶的典型特徵，此外，它與E.coli的編碼O-抗原聚合酶的wzy基因在355個胺基酸中有23％的相同性，44％的相似性；與Streptococcus thermophilus的wzy基因在353個胺基酸中有22％的相同性，44％的相似性，所以命名orf6為wzy基因。orf7與Streptococcus pneumoniae中編碼半乳糖基轉移酶的cpsI基因和Streptococcus pneumoniae中編碼半乳糖基轉移酶的cps23FU基因在胺基酸水平上分別有34.5％和33％的相同性，而在痢疾志賀氏菌3型的O-抗原結構中有半乳糖，所以確定orf7也是一個半乳糖基轉移酶基因，命名為orf7。orf8有63％的胺基酸序列與E.coli K12的O-抗原基因簇的glf基因的胺基酸序列相同，表明它們之間有高度的同源性。此外，glf基因編碼的酶催化合成糖Galf，這正是痢疾志賀氏菌3型O-抗原結構中的成分，所以推測orf8是glf基因，命名為glf。orf9與Bifidobacterium longum的基因BL0045和Bacteoides fragilis的wcfN基因在胺基酸水平上擁有33％的相同性，而這兩個基因是胞外多糖基因簇中的糖基轉移酶基因。因此orf9也是一個糖基轉移酶基因，命名為orf9基因。
根據大腸桿菌O164的結構推測它應有四個糖基轉移酶基因，分別轉移五個糖以合成O-抗原的寡糖單位。需要wzx基因將寡糖單位轉移到膜外，wzy基因將寡糖單位聚合成多糖，寡糖單位中的特殊單糖也由O-抗原基因簇合成，如Galf由glf基因合成，這些基因在大腸桿菌O164的O-抗原基因簇裡都被發現。但在大腸桿菌O164 O-抗原的結構裡還有GalNAc。在Yersinaenterocolitica O8中，UDP-GalNAc是由gne基因編碼的半乳糖變位酶催化UDP-GlcNAc生成的，在大腸桿菌O164的O-抗原基因簇裡還沒有發現gne基因，但是Peter Reeves等通過PCR發現在某些菌如E.coli O124中的其他基因簇裡有gne基因，也即是O-抗原基因簇外的gne基因轉化UDP-GlcNAc生成UDP-GalNAc提供O-抗原合成必需的糖，所以我們認為gne基因可能在大腸桿菌O164的其他基因簇裡。
上述分析表明，大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇與痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇具有相同的基因。這些基因具有相同的排列順序。唯一不同的是大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的第一個開放閱讀框之前(5′端)有一個插入序列(IS)。這是痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇不具有的。
(7)特異基因的篩選在比較了大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇後，針對大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇的不同序列即IS序列與相鄰的wzx基因設計引物；上遊引物分布在IS序列內，下遊引物分布在IS序列和相鄰的wzx基因的交界處或wzx基因內，以確保其對大腸桿菌O164型的特異性，這些基因在核苷酸序列中的位置見表1。在表中還列出了每個引物的大小。以每對引物用表中所列的相應的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進行PCR，得到了相應的PCR產物，其大小也列於表中。用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，確定IS序列對大腸桿菌O164型的O-抗原是高度特異；可以用上述引物進行PCR，鑑定大腸桿菌O164型並區分環境中的大腸桿菌O164型和痢疾志賀氏菌3型。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在於所有的大腸桿菌的基因組中且高度保守的一個基因，所以我們根據mdh基因設計了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然後從166種血清型的大腸桿菌中提取基因組，方法如前所述。用這對引物從166種血清型的大腸桿菌的基因組中PCR以鑑定大腸桿菌並檢測其基因組的質量。
表2是用於篩選特異基因的166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測的方便，我們將它們每12-19個菌分為一組，總共13組。它們的來源都列於表中。
在第8組中含有大腸桿菌O164的基因組DNA作為陽性對照。第13組中是不含有大腸桿菌O164的基因組DNA，作為陰性對照。以每組菌做模板，用表1中的每對引物按如下條件做PCR在95℃預變性2分鐘後，95℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(參照表1)，退火時間是50秒，72℃延伸2分鐘，這樣進行30個循環。最後在72℃繼續延伸10分鐘，反應體系是25ul。反應完畢後，取10ulPCR產物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增出的片段。
對於IS序列與相鄰的wzx基因，有4對引物被檢測，每對引物分別分布在IS序列與相鄰的wzx基因中。除了在第8組中做PCR後得到了預期大小的正確的一條帶外，在其他組中都沒有擴增到任何大小正確的帶。所以IS序列對大腸桿菌O164及其O-抗原都是高度特異的。
(8)引物靈敏度的檢測將大腸桿菌O164的凍存菌液接種到有LB培養基的三角瓶中，30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時至飽和，取培養好的菌液稀釋，取稀釋菌液塗布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養數小時計數，計算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌，攪拌均勻，加入LB培養基，過濾，過濾液於30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時；從培養好的菌液中取數ml於6,000g離心數分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉澱並混勻，放入100℃沸水中煮數分鐘，裂解液於12,000g離心數分鐘，取上清做為PCR模板；用所述的源於IS序列的寡核苷酸作為上遊引物，它們是SEQ ID NO1中的1868至1885鹼基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2265至2284鹼基的核苷酸。所述的源於wzx基因的寡核苷酸作為下遊引物，它們是SEQ ID NO1中的3020至3050鹼基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2809至2827鹼基的核苷酸進行PCR反應，PCR反應體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應的條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個循環；反應結束後，取10μl反應產物電泳，若有與預期大小相符的擴增帶，則結果為陽性，若沒有，則結果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個活菌的每份豬肉餡均在4對引物的PCR反應中得到陽性結果；參入0個活菌的豬肉餡在4對引物的PCR反應中得到陰性結果；說明使用上述方法時，這4對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O164的檢測靈敏度均為0.25個菌/g。
通過對O抗原基因簇的克隆和在減毒的疫苗菌株中的表達，可以組建重組疫苗。O抗原為最主要的革蘭氏陰性菌的表面抗原，可以引起強烈的免疫反應，是製造重組疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret實驗室成功的將志賀氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙門氏菌Tyziai疫苗菌中表達，動物實驗證明可以引起兔子的免疫反應(Molecular Microbiology1993，7239-252)。中國軍事醫學科學院的小組也在從事與Viret實驗室類似的工作。王磊實驗室在1999年成功的將大腸桿菌O111的O抗原基因簇在沙門氏菌疫苗STM-1中表達，並證明組建成的菌株可以引起小鼠的血液和體液反應(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本發明O164的O抗原特異基因序列可以應用於組建重組疫苗。
根據本發明的對大腸桿菌O164型的O-抗原特異的核苷酸序列(SEQ IDNO1所示)，構造特異核酸探針，將其固定到晶片的載體上製成生物晶片，將要檢測的樣品適當處理後，與生物晶片進行雜交反應，然後利用生物晶片信號分析設備就可以得到樣品中相應的細菌情況。這種大腸桿菌O抗原鑑定的DNA晶片將可以直接用於臨床和其它檢驗場所(如食品加工和生產行業，畜牧獸醫行業海關檢疫等的微生物檢驗)。這種晶片只需要擴大產量，在完全相同的條件下就可以產業化。
表3是大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的結構表，在表中列出了大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的結構，共IS序列和9個基因組成，每個基因用方框表示，並在方框內寫入基因的名稱。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，它們不屬於O-抗原基因簇，我們只是用它們的一段序列設計引物來擴增O-抗原基因簇的全長序列。
表4是大腸桿菌O164的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大腸桿菌O164的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準確位置，在每個開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。在細菌中開放閱讀框的起始密碼子有兩個ATG和GTG。
SEQ ID NO1序列(SEQUENCE LISTING)110天津生物晶片技術有限責任公司
120對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸130對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸1601170PatentIn version 3.2210121114006212DNA213Escherichia coli4001ctcctggtaa ctcacgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcttatgaa60ttagaatctc tccttgagca gcgcgtgaag cgtcaactgt tggcggaagt acaatctatc120tgtccgccgg gcgtgaccat tatgaacgtg cgtcagggtg aacctttagg tttaggccac180tccatcttat gtgcgcgacc tgccattggt gacaacccat ttatcgtggt actgccagac240gtagtgatcg acgacgccag cgccgacccg ctgcgctaca accttgctgc catgattgcg300cgcttcaacg aaacgggccg tagccaggtg ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct360gaatactccg tcatccagac caaagaaccg ctggaccgtg aaggtaaagt cagccgcatt420gttgaattta tcgaaaaacc ggatcagccg cagacgctgg actcagacat catggccgta480ggtcgctatg tgctttctgc cgatatttgg ccggaactag aacgcactca gcctggtgca540tgggggcgta ttcagctgac tgatgctatt gccgaactgg cgaaaaaaca gtccgttgat600gccatgctga tgactggaga cagctacgac tgcggtaaaa aaatgggcta tatgcaggcg660tttgtgaagt acggactgcg taacctgaaa gaaggggcga agttccgcaa aggtattgag720aggttgttga atgattaaaa acatgaacaa atataacggt aaataagaga aattgtaacg780gcagtgagga tttgcggcga agctcaaacg tggcgaatat ccctgtcgtt atttattaat840aaatcatcgt actaacaatg gaataaaaaa gtgccttgtt ttaagtttta caggatattc900cttgtttctg gaggagattg ataagacaat cagcatctga atttatcaga acttgtgtgt960cttgctgatt acattgttat attcatgcag tgtactggta gctgtggagc caggggcggt1020agcgtgcatt aatattcaca atatattctt ttaaatgtaa gcagaattaa tcgaacctaa1080ataatgtcac gtaacaaaat aatcataaaa atgtaatgaa cgcatcccac acaattaaac1140acggagcagt atgatggtta aaagggtgaa actggcaggt gtggagcctc gcagattccg1200gcatcatagt gcccaatacg ggatgcataa agctccctca gactggagac tccacaaatg1260aaatatacac cggttggcgt tgatatcgca aaacatgtca ttcagattca cttcatcaat1320gagcacacag gtgaagtggt tgataaacag ttgcgtagac aggattttct gacgttcttc1380ggcaaccgtg agccatgcct gattggtatg gaggcctgtg gaggttctca gcactgggca1440cgggaactga caaaacttgg tcataaagtc cggttgttgc aggcccgctt cgttaaggca1500ttcgtcatgg gcaataagaa tgatgtgatg gatgcccggg ctatctggat ggcggttcag1560cagccgggta aagaaatcgc cgtaaaaaca gaagaacagc agtcggtact ggttctgcac1620cgtacccgca tgcaactggt gaagttccgg accgcacaaa ttaatgccct gcacgggacg1680ttactggagt ttggtgaaac catccacaaa ggccgggcag cgatggagcg ggagttcccc1740gaagcactgg aacggatgaa agagagactg ccaccgtatc tcattatggt tctggaaaac1800cagtacaacc gactgaatga gctggactca ctgatagagg atattgaaaa acagcttacc1860agcgtggcga ggcagaatga aacctgtaag cggttgctgg atattcctgg cgttggacca1920cttattgcga cggcagcggt ggccaccatg ggggaagcat cagcgtttaa atcggggcga1980gagttcgccg catatgttgg tctggttcca aaacaaactg gctccggagg gaaagtacgt2040ctgctgggga taagcaaacg tggtgacact tatctcagga cattatttat ccacggtgca2100agagcggtgg cattagtagc taaagagcct ggcccgtgga taaccgaact gaaaaaacgt2160cgtccagcca gtgtggcaat cgtcgccatg gcaaacaagc tggcacgaac agtatgggcg2220ataaccgccc atgaccgtaa gtatgacagg aaccacgtca gtatcagacc atattaatcg2280
ctgataccat taaacaatga actcttaaca aaagggtgaa tgctgaaagg ttgctatggc 2340ggccagagtg atgacaaaga caggtaagac cgtgactcac taaacctgaa cagtattttg 2400ggcttgaagt ccgccgtgaa aataaggggt gagtcggcga attacatagg ggctcgcagc 2460gttacggctg caataaagcc ggatataaag ctgcaaccta cccgtcatgt caaaacaatg 2520gatgccttgc aaacgggatg cgttcatata aatactatgt ttttggcaac aagaacctta 2580gtttctttaa gtgtttcatt ttacacaaca agaatagtta tacaacagtt gggggcggca 2640gactatggct tatttaatat catttatgga gttgtaacat tttttacatt cgtagtcacc 2700gcgatgaatg attctgtaca gcgttatatt gcaataggtg ttggttcaca aaaaatatcg 2760gttattagag atgctgtaaa aaatagtatg tttatatttg ttatatctgc tttcatattg 2820gcagtatgtc ttcttttggc aaggggggtg atcatacata atattttaaa tatacctaaa 2880gattctattg aaaatgcaag tgtgttatat ttggttgcag tattttcaat aaccatactt 2940ataattcaga cgccacttaa tgcgatggtg ttagcatacg agaaaatgtc attttacgca 3000tacatgatga tatttgaaat ggtagctaaa atgagtatgg ctttgttact aactttactg 3060gaaaaagata aggtcattgt atattcaata cttttaggtt ctatttcttt ttttaacttg 3120ttggtttatt tatgctactg cttgatatgt tttaaaaaat caatgtttgg tgggagaata 3180aaatttagag tgctgaaaga aatttcaact ttttcatttt ggaatatatt tggtaatttc 3240tcttacatgt gcagagttca gggagtgaac attgtaatta atatgtttta cgctatagcc 3300gtgaatgcag catatgcgat ttcgattact gttttaaatg caattaatac acttacgcaa 3360tcattaatta cagcattaag gcctcaaata tttaaatcat atggcgaatg tgatttaaaa 3420agatataatc atctagttct ctttggttca aaatatacat tttcaatatt gtttctgtta 3480agtagccctg taattctatg tgcggatgag ttgttaaaga tatggcttga tattgtacca 3540gattatacag ttgaatttgt gaggttggtc attgttgtgg cttttattga tagtttttca 3600tatagcatga ttgctggtat tcaggctacg ggtaggatta aaacatatca actagttgtt 3660agtttaattg tcctaattaa tttgccgtta acctttattt tgtttaaggc aggaaataat 3720gttttaagta tgttttatcc atttattgtt actgccatta tcaatcaagg tttaaggttg 3780tattttatct atatcaatgc aggttttgat tataagaagt atttcactgt tgtgatctat 3840ccttgcttgt tagctgtatg cttatcgtta gtgacagata tttcaattaa aaaaatgctt 3900ccatttaaca gtgttattga tgttttaatt gtgtgtattt ttattttttc attcaataca 3960ataatttttt attgggttgt agtttctaaa aaggaaaaaa atggttatta gaaaccctga 4020aaagaaaagt gaaataacaa taaaagatgt tatagacaat gaactctgta ctggttgtgg 4080agtttgtatt tcggaagata gtagcaaaac ctcctttatg aaatggaatt ctgaaggttt 4140ttatgagcca tgtttctctc ctgtatcaac attattcaat atgcagcgtg tttgtccctt 4200taacttaagt agggatacat tagtgaatga ggatgaactt gcgcatgagt tttttgatgg 4260taagggatat ttagattctg aggttgggtt ttataaaaaa atatatgtgg gttattctaa 4320acattttaga gagacttcat cctccggtgg tatagctaca tatgtatttg aacaacttct 4380tagacgtaag tatgttgatg ctctatttat agttagggag cttggtggtt catatggata 4440tcaagtcttc gataatccag aacatattaa ggatatgtct aaaacaagat attatcctgt 4500aacgctagaa aagttatttg ataatattta taagcttaat ggtagagtgg ccgtttcagg 4560agtggcatgt tttattaaag ccattaggct caaacaacat taccatccag aactgaaaga 4620gaaaatacca ttccttgttg gtataatttg tggaggactc aaaagtcgat attacactga 4680ttatttatca cagtctgctg gttgtgtcag tgagtaccaa aatgctgagt atcgagtgaa 4740aaagaaagat agtcatgctc ttgactatcg tttcacatgt gttgagaaat caaataatat 4800aattcattct gttgatatgc aaagaatggg ggatatgtgg ggttcagggc tatttaaggc 4860aaacgcatgt gactattgtg atgatgttac aaccgaactc gcagacatat cattgggtga 4920
tgcctggatt tcgccataca atatggatgg agctggtaat aatgtagttg tatgtcgctc 4980caccacagct catgaaatta ttttatctgg gattgagaaa aaagacttag aattaacgga 5040actcgaatta gagcagttga aattgtcaca acaaggaagt tttaaccaca ggcataaagg 5100attattatat agaataaaaa atgcagagaa aaataatcgc ttagtgcctg ttaagaggaa 5160aagattctta cgctctatat cttttttatt aaagttaatt caaaaacaac gatcagttac 5220aaggagaaaa agcatagaga tatggatgga aactcaaaat tcagcaactt tcgataagaa 5280aatgaaggga tatttattca cgttgcgttg gttaacagtg gtcaatagga aattaagtcg 5340gatgttcaag attgtttctc taaatagaat gggtaaaaaa tgaaagttgc aatattaact 5400caaccattac atacgaatta tggtggcaca ttacaagcct atgcattaca aaaagtcttg 5460attaatttgg gacatgaacc agagactatt aattataggt cgaaaattaa gaggccacta 5520tttatccgtg ttgtgttgtc aaaaattaaa aggatagtat tatgccgaaa aatcacattt 5580gattttacaa cacaagatag aattaatatt aggaagcatc atcaatcttt cattgataca 5640agattaaact attcagagga gattaacggt actgaggggt tgagagatta tattttaaaa 5700aataattacg gtgctgtaat aataggtagt gatcagacat ggagaccaat atattcgcct 5760agaatagatt cattttttct cgatttttta agtgatgtaa acgatataaa aaatggcata 5820tgcagcatct tttggtactg ataaatggga gttcacggag tcacaaacta atttatttaa 5880attgttactt tcaaaatttg actatgtttc agttagagag tcctcaggag tcaaattatg 5940tagtgaaaaa tttggtttga aagcagagtt ggttttagat ccgacattgc tattgacatt 6000cgaagattat actcatttat tagacaatga ctatattaat cttcataagg gaaaggtgtt 6060tagttatgta cttgatgaga attacgacaa aaaaaacttt atagacacag tagcaagtac 6120tctccgcaca acgtcatttt atacttaccc taaaaaaatc actaaagatg aatatgtgat 6180tagaaattat tccgagtatg aatatccgcc aatagaatat tggatttctt cgtttaaggc 6240cgctgaattt attgtaacag attcatttca tggaacagta ttttctatta tttttaacaa 6300acccttcatc gccattgcaa atgaagagag aggaaaggct agatttacgt cactattgga 6360aatgtttggt cttgaaagac gacttgtgag taatttagat gatgttgatt taaagcttgt 6420aaatgaaaaa attaactatg gccccataaa tgaaaaaatt gcttatttta gagaagagtg 6480ccttaaaaag ttgcagttaa tgctaataaa ataatcagat tatgtatgtc tctctacaat 6540taaaatatga atgttgatcg atgaagaatt gtaaagtatc tgtaattatt ccggtctata 6600atgcggaaaa atatatacaa cgttgtattt taagcttatt aaagcagaca ttagatgatg 6660ttgaaattat catcattgat gatggttcta ctgataattc actttctata ataaaagaaa 6720ctgttgcatt gcatactgct agtagagctc gccaaaagag aatcaatata atctctcgag 6780aaaacaaagg agttgcctat acacgaagtc agggattgag actttcgcag ggggaattta 6840tcattcattt tgatagtgat gattgggcaa aatccaatat gctggaggaa atgtataaga 6900caattgtttc caataatgca gacatggtta tatgcgatta ttttttagtg aagaataata 6960aagaaatact tataaaacag agagtggagt atgagccaaa gaaatgtatt agatatctac 7020tgactggtga gctagaaggg tttacatgga acaaactaat tagaaaaaaa tatatcgata 7080aaaataaaat tgattttgtt aataaaatta cttatatgga ggattttttg ttcatattaa 7140gtgtgttact acacaatcct aaaattattt ttcaggattg tgcatattat tattatcaaa 7200aaagcaatcc taaatctcta actagccatg ctagtgtgga taggctttct gaaatgatta 7260aagccgtaag tgaaatagaa aagaagataa ataaatataa tttacaaaag tatctgaata 7320acgagtttca attgtttaag ttaaaacaaa aaatttggtt tatatctata agtaagttaa 7380atgttaatga taatgtatgg aatctctttc ctgaaacaaa tccatttata tcaaaggtaa 7440atgtgctttt ttattataaa atagtgcttt ttcttgatag tattaaactg cgtttttttt 7500caaataagat catttatctc attggattgg tgcaggcttt attacaagaa aggaaagaga 7560agtgatacca aaaataattc attactgctg gttcggtcgc tctccattgt cggaattaac 7620
aaagcagtgc attgcaagct gggagaaata ttgtcctgaa tataaaatca taagatggga 7680tgaaaataat gtcgatttga attcttgttc ttttgttaga caagcttata aagaaaaaaa 7740atgggcgttc gtttctgatt atgtaaggct taaagtggtt aatgaatatg gcggtatcta 7800tcttgataca gatgttgaat taataaagcc attagatgat ttgttaatat atcctgcata 7860tataggcttt gaaattaaca aggaatggta tgtaaattct ggtttggggt tcggttctgt 7920taataataat ccggttttag aatcattaat tatggagtat gaaaatatta attttgtaaa 7980tgaggatggg actctaaata taacgccgtg ccccataaga gaaacaaaag cattaacaaa 8040aataggttta attcctgatg gtcaatgtca atcttttgat aatatagtga ttttttctgc 8100agattatttt tgtcctgtat ctataacagg tgagagaaat ttttctgata aaacatattc 8160aatacatcat tacgatgcta gttggttttc tgagcaaaag agaaaaggcc tgcaacgtaa 8220aaagagattt ataaaactat tcggcaacct aataggcaca tatattaata aaccttttat 8280ttttgtagat gaatgtcgcg agttcggatt agttaaagca atcaagaata tgcgttccaa 8340ttttccttaa tttttagtgt taaggaataa gtttcgttaa aatactttat tcatttaatt 8400aataaaggtt taatggtgat tagatgtact ttcttttgtt cttctcaata ttttattttg 8460tatacgtaat cttaatagga acattatgtc ataactataa agcccttttg attttttcac 8520taatccctct gacaatagtg tcaggtataa gatataatgt cggctttgat tttatgtcat 8580atgttgatta tttcaatcaa ctcaaatatt caaatgatat atatctagat tctaccttta 8640agtatataag ctactttacc tattatatag gaggtaacga acagattttg tttctgatat 8700atgcggtttt ttattcggtt gcactttatt ttttaataaa actggtattg gaaaattata 8760taacggaaat aaataatttt tatactattg gacttgtgtt atcattttat tcgttttatt 8820ttttattatc atttaatcaa attagggctg tattatcagc tctaatacta tgttatgggc 8880tattaaaaaa taaaatagat ttttctttta taataacaat tacattaagt attctttttc 8940actctgcagc aatgttcatt ttacctcttt attttgtcct aagaaaaata aatgtaacag 9000ttctgttggt gatattccct tttttggttg ttgcttcatt ctttaatatt ttttcagata 9060ttgtgagatt cattctgaca ttgctaaata gtcgtttttt aacatatttt aactctgaat 9120attttgttcc aaggacggga atggaaaaaa tgtatagtat gatctcaatg attattgttt 9180tgggaatggt tgtttgtttg tctaaattat tacctaaaaa gtttgattta atgataaagt 9240ttgttattct ttttgttcta cttagagcga tgtcaattga tatattgatt tttgctaggt 9300ttagtgattt tcttaaacca atggctataa ttcttatatt taccgctgtt tatttttctt 9360cgaataaagt gcgacctaga attatccttc ctttttattt aattatgaca ttgtttctct 9420gtatttttaa tataataatc ggatcgaata taactaaggg gaactattat acttatggtt 9480ataacatttg cttttttggc aataaatgta tagataaatt ttattagtaa ttgtcatttg 9540atacttctgg tatttatgga aaaatatatg aataactttt cttgtaaaga acccccttca 9600tttattgaaa ataaaattat attatcaatt attcttcctg tatataacgt atcagagtat 9660ttaattgagt gcctaaacag tttgctgtta gacgttcatg aacgttatct taatagatgt 9720gaagtaattg tggttgatga tggttcaact gataattcat ttgaattaat gagagagtat 9780tctttgaaat atcctgaatc tattaagatt tattcgaaat tcaatggtgg tctctcagat 9840gcaagaaact atggattatt aaaatcttca ggtaaatata tttcttttgt tgattcagat 9900gatgttgtta atagaggttt tataaaggaa atcatcaatt tcattgatgc ctatgatttt 9960gatatattgt catttgactt catgaagttt tttaataata atgatgctct tattctttca 10020caaatagatg aattctccaa aatggcagaa agagtagatt cggagttcta caagtccaag 10080cctgtttttg cttggaataa agtttatcga cgttctcttt tcgacaatga agtatttcct 10140aaggggtggt attatgaaga tgttgcatta attccgttat tattagatag agcaaaagtt 10200ttataccata ttaatagcgt ttgttatttt tatagacaga gacaaggagc aatcactttt 10260
ttttatgaca ataaatatct tgatatttta aaaggagtgt cttttttata tgacaggtca 10320caatcttcat tcattaaaac gataattata aatcagtttt ttactttaac cttactatct 10380ttaagattgc cgactgataa ttatttcatg aatatgaggg ggattattga tacctattgt 10440gaaaaatttg acttggattc ctttgagcct aaactaatat taaaacacat tcctttttta 10500ttgcttaaaa aattgaagtc gctgtgtgtt tatccactgt atttatttaa acctgcagtt 10560tttttacata aacaaattaa acattttaga ggaaaactaa agtgaaatat gattatataa 10620ttataggtag tggtcttttt gggagtgtgt ttgcacatga attagggaaa atgaaaaaaa 10680aggtcaaggt tattgagcgt cgtgatcatg ttggtggtaa tgtatattgt gagaatattg 10740aaggaattaa tgttcataaa tatggcgcac atatatttca tactaacgat aaagaaatat 10800gggattatgt aaatcaattt gtagagttta atagatatac aaattcacca ttagcttttt 10860caaaaggtaa aatttataat ttacctttta acatgaatac ctttaatcaa ctctgggggg 10920ctattactcc tcaacatgcg aaagaaatta ttaaaaagca aagcggtgaa ataagtggaa 10980ataaaccaag gaatcttgaa gagcaagcta tttctttggt gggacgagat atttataatt 11040gtttgattaa ggagtacact gagaaacaat ggggacgacc ttgcactgaa ttgccatcat 11100ttattataaa acgactccct gttaggttta catacgataa taactatttt aatgaccagt 11160atcaaggaat accagtcggt ggttacaata aattaatcga tgcattatta aatggtattg 11220aagttcaaac atgcactgac tattttgaag agaagaaata ttgggattct attgcaaaga 11280aaattattta tacagggcct attgataagt tttattgcta taaatttgga gctttggatt 11340atcgatcatt aaaatttgag catgaattac tgaatgtcga taattttcaa gggaatgctg 11400ttgtaaatta tatagacaaa aaattcccat tcactcgtat aatagaacat aaattttttg 11460aatttggtga acagcataat actctcatta ctcgagagta cccaaaagaa ttcgaagaag 11520gcgatgagta ttactatcct gtcaatgatg aaaaaaatat gcaaatctat aaaatgtatt 11580ataatctttc taaacaggaa agtaatgtga tttttggtgg acgtcttgcg gaatataaat 11640attatgacat gcatcaagtt atcaaatcag ctttaaatgc attccgaaaa gaggtacgtt 11700taggtgaata aagaagtaat cgcagttatt gtaacctata atagaaaagc attattgctg 11760aaagttatag atgctgttat taaccaaagt tatccactaa aaaaaatatt gataatagat 11820aataatagta ctgatggtac ggagatgttt atttcaaata ggctctctga cgtggtgaag 11880tataaaaata cgggggataa tttagggggg gctggcgggt tttatagagg attcatagag 11940gcggaaaaat atggctatga ttatctttgg ttaatggacg atgattttat gcctacagtg 12000aattgtcttg aaatattaat atcaaatagc cctgatggta ttgtccaacc tgttagatat 12060aacttggatg aaacttgtgc agagctttct ccattaactt atgatttatc taacccattt 12120aagttaaacc ctaaaggtac accattaaaa aattacttaa atacaattgg taataaatct 12180gcgaaggtag atattgaagc tattccattt gaaggtccat tgatttcacg aaaggttgtt 12240gaaaaaatag gctatccaga gcctaagttt tttatttttt gtgatgacat tgaatacgct 12300attaaagcta aaagaaaggg gattcccatc cagtgcaatc ttaaagccaa ggcataccgc 12360cttttggtca acaatcaagg taatgatctt ctttcctgga aaggatattt tatgcttcga 12420aatcttttct acctgcataa aacgtatggg accaatttcc ttgttagaca aaaacctatc 12480gtattgggat taggatatgc attgtcgtgt gtattgaaat gcaatttttc tcaacttccc 12540gttatatggc gtgctttttg ggattcatct acgttaagaa ataccgaaaa attcaggccc 12600gaaatgagaa gtaaataatt tattattatg tttttattaa ttaatgtcga tttttactaa 12660aattcttaac acgatattta tccctgacag gagtaaacaa tgtcaaagca acagatcggc 12720gtcgtcggta tggcagtgat ggggcgcaac cttgcgctca acatcgaaag ccgtggttat 12780accgtctcta ttttcaaccg ttcccgtgaa aaaacggaag aagtgattgc cgaaaatcca 12840ggcaaaaaac tggttcctta ctatacggtg aaagagtttg ttgaatctct ggaaacgcct 12900cgtcgcatcc tgttaatggt gaaagcaggt gcaggcacgg atgctgctat tgattctctc 12960
aagccatacc tcgataaagg tgacatcatc attgatggtg gtaacacctt cttccaggac 13020accattcgtc gtaaccgtga gctttctgca gaaggcttta acttcattgg taccggtgtt 13080tccggcggtg aagagggggc gctgaaaggg ccgtccatca tgcctggtgg ccagaaagaa 13140gcctatgaac tggttgcacc gatcctgacc aaaatcgccg cagtagctga agacggggag 13200ccatgcgtta cctatattgg tgccgatggt gcaggtcact atgtgaagat ggttcacaac 13260ggtattgaat acggtgatat gcaactgatt gctgaagcct attctctgct taaaggtggc 13320ctgaacctca ccaacgaaga actggcgcag acctttaccg agtggaataa cggtgaactg 13380agcagctacc tgatcgacat cactaaagac atcttcacta aaaaagatga agacggtaac 13440tacctggttg atgtgattct ggatgaagca gcaaacaaag gtaccggtaa atggactagc 13500cagagcgcgc tggatctcgg cgaaccgctg tcgctgatta ccgagtctgt gtttgcacgt 13560tatatctctt ctctgaaaga tcagcgcgtt gccgcgtcta aagttctcac tggcccgaaa 13620gcacagccag ctggcgaaaa ggctgagttc atcgaaaaag ttcgtcgtgc gctgtatctg 13680ggcaaaatcg tttcttacgc tcagggcttc tctcagctac gcgccgcgtc tgaagagtac 13740aactgggatc tgaactacgg cgaaatcgcg aagattttcc gtgctggttg catcatccgt 13800gcgcagttcc tgcagaaaat caccgatgcc tatgccgaaa atccgcagat cgctaacctg 13860ctgctggctc cgtacttcaa gcaaattgcc gatgactacc agcaggcgct gcgcgatgtc 13920gtcgcttacg cagtacagaa cggtatcccg gttccgacct tcgccgctgc ggttgcctat 13980tatgacagct accgttctgc tgttct 14006表1源於大腸桿菌O164的O抗原基因簇中IS序列和wzx基因的引物及PCR數據引物 引物位置引物所處PCR產物產生正確 PCR的退火的基因的長度 大小電泳 溫度(℃)帶的組數第一條正向引物 1868至1885鹼基 IS序列 1182bp 0 58第一條反向引物 3020至3050鹼基 O-抗原轉運酶第四條正向引物 2265至2284鹼基 IS序列 5620 55第四條反向引物 2809至2827 O-抗原轉運酶表2 166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源組號 該組中含有的菌株 來源1、野生型大腸桿菌 O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18， IMVSaO19ab，O20，O21，O22，O23，O242、野生型大腸桿菌 O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35， IMVSaO36，O37，O38，O40，O41，O42，O433、野生型大腸桿菌 O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O164，O52，O54，O55，O56， IMVSaO57，O58，O60，O61，O62，O534、野生型大腸桿菌 O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSaO79，O80，O81，O82，O83，O685、野生型大腸桿菌 O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99， IMVSa
O101，O102，O103，O104，O105，0106，O97，6、野生型大腸桿菌O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSaO115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O1177、野生型大腸桿菌O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O164，O137，IMVSaO138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O1408、野生型大腸桿菌O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153 b9、野生型大腸桿菌O168，O169，O170，O171，O172，O173， c痢疾志賀氏菌 D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13 d10、鮑氏志賀氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， dB16，B17，B1811、福氏志賀氏菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v4)，F5(v7)，F6， dDS，DR12、野生型大腸桿菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155， IMVSaO124，O167，O162，O121，O127，O149，O11913、野生型大腸桿菌 去除大腸桿菌O164的第8組菌為了檢測的方便，每12-19個菌分為一組，總共12組，第13組作為陰性對照a.Institude of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australiab.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.O172和O173來自於Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其餘來自於IMVSd.中國預防醫學科學院流行病學研究所表3是大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的結構表 表4是大腸桿菌O164的O-抗原基因簇中的基因的位置表CTCCTGGTAA CTCACGCGTC CAAGAACGCG GTCGAAAACC ACTTCGACAC CTCTTATGAA 60TTAGAATCTC TCCTTGAGCA GCGCGTGAAG CGTCAACTGT TGGCGGAAGT ACAATCTATC 120TGTCCGCCGG GCGTGACCAT TATGAACGTG CGTCAGGGTG AACCTTTAGG TTTAGGCCAC 180TCCATCTTAT GTGCGCGACC TGCCATTGGT GACAACCCAT TTATCGTGGT ACTGCCAGAC 240GTAGTGATCG ACGACGCCAG CGCCGACCCG CTGCGCTACA ACCTTGCTGC CATGATTGCG 300CGCTTCAACG AAACGGGCCG TAGCCAGGTG CTGGCAAAAC GTATGCCGGG TGACCTCTCT 360GAATACTCCG TCATCCAGAC CAAAGAACCG CTGGACCGTG AAGGTAAAGT CAGCCGCATT 420GTTGAATTTA TCGAAAAACC GGATCAGCCG CAGACGCTGG ACTCAGACAT CATGGCCGTA 480GGTCGCTATG TGCTTTCTGC CGATATTTGG CCGGAACTAG AACGCACTCA GCCTGGTGCA 540TGGGGGCGTA TTCAGCTGAC TGATGCTATT GCCGAACTGG CGAAAAAACA GTCCGTTGAT 600GCCATGCTGA TGACTGGAGA CAGCTACGAC TGCGGTAAAA AAATGGGCTA TATGCAGGCG 660TTTGTGAAGT ACGGACTGCG TAACCTGAAA GAAGGGGCGA AGTTCCGCAA AGGTATTGAG 720AGGTTGTTGA ATGATTAAAA ACATGAACAA ATATAACGGT AAATAAGAGA AATTGTAACG 780GCAGTGAGGA TTTGCGGCGA AGCTCAAACG TGGCGAATAT CCCTGTCGTT ATTTATTAAT 840AAATCATCGT ACTAACAATG GAATAAAAAA GTGCCTTGTT TTAAGTTTTA CAGGATATTC 900CTTGTTTCTG GAGGAGATTG ATAAGACAAT CAGCATCTGA ATTTATCAGA ACTTGTGTGT 960CTTGCTGATT ACATTGTTAT ATTCATGCAG TGTACTGGTA GCTGTGGAGC CAGGGGCGGT 1020AGCGTGCATT AATATTCACA ATATATTCTT TTAAATGTAA GCAGAATTAA TCGAACCTAA 1080
ATAATGTCAC GTAACAAAAT AATCATAAAA ATGTAATGAA CGCATCCCAC ACAATTAAAC 1140ACGGAGCAGT ATGATGGTTA AAAGGGTGAA ACTGGCAGGT GTGGAGCCTC GCAGATTCCG 1200IS起始位點GCATCATAGT GCCCAATACG GGATGCATAA AGCTCCCTCA GACTGGAGAC TCCACAAATG1260AAATATACAC CGGTTGGCGT TGATATCGCA AAACATGTCA TTCAGATTCA CTTCATCAAT 1320GAGCACACAG GTGAAGTGGT TGATAAACAG TTGCGTAGAC AGGATTTTCT GACGTTCTTC 1380GGCAACCGTG AGCCATGCCT GATTGGTATG GAGGCCTGTG GAGGTTCTCA GCACTGGGCA 1440CGGGAACTGA CAAAACTTGG TCATAAAGTC CGGTTGTTGC AGGCCCGCTT CGTTAAGGCA 1500TTCGTCATGG GCAATAAGAA TGATGTGATG GATGCCCGGG CTATCTGGAT GGCGGTTCAG 1560CAGCCGGGTA AAGAAATCGC CGTAAAAACA GAAGAACAGC AGTCGGTACT GGTTCTGCAC 1620CGTACCCGCA TGCAACTGGT GAAGTTCCGG ACCGCACAAA TTAATGCCCT GCACGGGACG 1680TTACTGGAGT TTGGTGAAAC CATCCACAAA GGCCGGGCAG CGATGGAGCG GGAGTTCCCC 1740GAAGCACTGG AACGGATGAA AGAGAGACTG CCACCGTATC TCATTATGGT TCTGGAAAAC 1800CAGTACAACC GACTGAATGA GCTGGACTCA CTGATAGAGG ATATTGAAAA ACAGCTTACC 1860AGCGTGGCGA GGCAGAATGA AACCTGTAAG CGGTTGCTGG ATATTCCTGG CGTTGGACCA 1920CTTATTGCGA CGGCAGCGGT GGCCACCATG GGGGAAGCAT CAGCGTTTAA ATCGGGGCGA 1980GAGTTCGCCG CATATGTTGG TCTGGTTCCA AAACAAACTG GCTCCGGAGG GAAAGTACGT 2040CTGCTGGGGA TAAGCAAACG TGGTGACACT TATCTCAGGA CATTATTTAT CCACGGTGCA 2100AGAGCGGTGG CATTAGTAGC TAAAGAGCCT GGCCCGTGGA TAACCGAACT GAAAAAACGT 2160CGTCCAGCCA GTGTGGCAAT CGTCGCCATG GCAAACAAGC TGGCACGAAC AGTATGGGCG 2220IS終止位點ATAACCGCCC ATGACCGTAA GTATGACAGG AACCACGTCA GTATCAGACC ATATTAATCG 2280CTGATACCAT TAAACAATGA ACTCTTAACA AAAGGGTGAA TGCTGAAAGG TTGCTATGGC 2340GGCCAGAGTG ATGACAAAGA CAGGTAAGAC CGTGACTCAC TAAACCTGAA CAGTATTTTG 2400GGCTTGAAGT CCGCCGTGAA AATAAGGGGT GAGTCGGCGA ATTACATAGG GGCTCGCAGC 2460Wzx起始位點GTTACGGCTG CAATAAAGCC GGATATAAAG CTGCAACCTA CCCGTCATGT CAAAACAATG2520GATGCCTTGC AAACGGGATG CGTTCATATA AATACTATGT TTTTGGCAAC AAGAACCTTA 2580GTTTCTTTAA GTGTTTCATT TTACACAACA AGAATAGTTA TACAACAGTT GGGGGCGGCA 2640GACTATGGCT TATTTAATAT CATTTATGGA GTTGTAACAT TTTTTACATT CGTAGTCACC 2700GCGATGAATG ATTCTGTACA GCGTTATATT GCAATAGGTG TTGGTTCACA AAAAATATCG 2760GTTATTAGAG ATGCTGTAAA AAATAGTATG TTTATATTTG TTATATCTGC TTTCATATTG 2820GCAGTATGTC TTCTTTTGGC AAGGGGGGTG ATCATACATA ATATTTTAAA TATACCTAAA 2880GATTCTATTG AAAATGCAAG TGTGTTATAT TTGGTTGCAG TATTTTCAAT AACCATACTT 2940ATAATTCAGA CGCCACTTAA TGCGATGGTG TTAGCATACG AGAAAATGTC ATTTTACGCA 3000TACATGATGA TATTTGAAAT GGTAGCTAAA ATGAGTATGG CTTTGTTACT AACTTTACTG 3060GAAAAAGATA AGGTCATTGT ATATTCAATA CTTTTAGGTT CTATTTCTTT TTTTAACTTG 3120TTGGTTTATT TATGCTACTG CTTGATATGT TTTAAAAAAT CAATGTTTGG TGGGAGAATA 3180AAATTTAGAG TGCTGAAAGA AATTTCAACT TTTTCATTTT GGAATATATT TGGTAATTTC 3240TCTTACATGT GCAGAGTTCA GGGAGTGAAC ATTGTAATTA ATATGTTTTA CGCTATAGCC 3300GTGAATGCAG CATATGCGAT TTCGATTACT GTTTTAAATG CAATTAATAC ACTTACGCAA 3360TCATTAATTA CAGCATTAAG GCCTCAAATA TTTAAATCAT ATGGCGAATG TGATTTAAAA 3420AGATATAATC ATCTAGTTCT CTTTGGTTCA AAATATACAT TTTCAATATT GTTTCTGTTA 3480AGTAGCCCTG TAATTCTATG TGCGGATGAG TTGTTAAAGA TATGGCTTGA TATTGTACCA 3540GATTATACAG TTGAATTTGT GAGGTTGGTC ATTGTTGTGG CTTTTATTGA TAGTTTTTCA 3600TATAGCATGA TTGCTGGTAT TCAGGCTACG GGTAGGATTA AAACATATCA ACTAGTTGTT 3660
AGTTTAATTG TCCTAATTAA TTTGCCGTTA ACCTTTATTT TGTTTAAGGC AGGAAATAAT 3720GTTTTAAGTA TGTTTTATCC ATTTATTGTT ACTGCCATTA TCAATCAAGG TTTAAGGTTG 3780TATTTTATCT ATATCAATGC AGGTTTTGAT TATAAGAAGT ATTTCACTGT TGTGATCTAT 3840CCTTGCTTGT TAGCTGTATG CTTATCGTTA GTGACAGATA TTTCAATTAA AAAAATGCTT 3900CCATTTAACA GTGTTATTGA TGTTTTAATT GTGTGTATTT TTATTTTTTC ATTCAATACA 3960Orf2起始位點ATAATTTTTT ATTGGGTTGT AGTTTCTAAA AAGGAAAAAAATGGTTATTA GAAACCCTGA 4020wzx終止位點AAAGAAAAGT GAAATAACAA TAAAAGATGT TATAGACAAT GAACTCTGTA CTGGTTGTGG 4080AGTTTGTATT TCGGAAGATA GTAGCAAAAC CTCCTTTATG AAATGGAATT CTGAAGGTTT 4140TTATGAGCCA TGTTTCTCTC CTGTATCAAC ATTATTCAAT ATGCAGCGTG TTTGTCCCTT 4200TAACTTAAGT AGGGATACAT TAGTGAATGA GGATGAACTT GCGCATGAGT TTTTTGATGG 4260TAAGGGATAT TTAGATTCTG AGGTTGGGTT TTATAAAAAA ATATATGTGG GTTATTCTAA 4320ACATTTTAGA GAGACTTCAT CCTCCGGTGG TATAGCTACA TATGTATTTG AACAACTTCT 4380TAGACGTAAG TATGTTGATG CTCTATTTAT AGTTAGGGAG CTTGGTGGTT CATATGGATA 4440TCAAGTCTTC GATAATCCAG AACATATTAA GGATATGTCT AAAACAAGAT ATTATCCTGT 4500AACGCTAGAA AAGTTATTTG ATAATATTTA TAAGCTTAAT GGTAGAGTGG CCGTTTCAGG 4560AGTGGCATGT TTTATTAAAG CCATTAGGCT CAAACAACAT TACCATCCAG AACTGAAAGA 4620GAAAATACCA TTCCTTGTTG GTATAATTTG TGGAGGACTC AAAAGTCGAT ATTACACTGA 4680TTATTTATCA CAGTCTGCTG GTTGTGTCAG TGAGTACCAA AATGCTGAGT ATCGAGTGAA 4740AAAGAAAGAT AGTCATGCTC TTGACTATCG TTTCACATGT GTTGAGAAAT CAAATAATAT 4800AATTCATTCT GTTGATATGC AAAGAATGGG GGATATGTGG GGTTCAGGGC TATTTAAGGC 4860AAACGCATGT GACTATTGTG ATGATGTTAC AACCGAACTC GCAGACATAT CATTGGGTGA 4920TGCCTGGATT TCGCCATACA ATATGGATGG AGCTGGTAAT AATGTAGTTG TATGTCGCTC 4980CACCACAGCT CATGAAATTA TTTTATCTGG GATTGAGAAA AAAGACTTAG AATTAACGGA 5040ACTCGAATTA GAGCAGTTGA AATTGTCACA ACAAGGAAGT TTTAACCACA GGCATAAAGG 5100ATTATTATAT AGAATAAAAA ATGCAGAGAA AAATAATCGC TTAGTGCCTG TTAAGAGGAA 5160AAGATTCTTA CGCTCTATAT CTTTTTTATT AAAGTTAATT CAAAAACAAC GATCAGTTAC 5220AAGGAGAAAA AGCATAGAGA TATGGATGGA AACTCAAAAT TCAGCAACTT TCGATAAGAA 5280AATGAAGGGA TATTTATTCA CGTTGCGTTG GTTAACAGTG GTCAATAGGA AATTAAGTCG 5340Orf2終止位點GATGTTCAAG ATTGTTTCTC TAAATAGAAT GGGTAAAAAA TGAAAGTTGC AATATTAACT 5400Orf3起始位點CAACCATTAC ATACGAATTA TGGTGGCACA TTACAAGCCT ATGCATTACA AAAAGTCTTG 5460ATTAATTTGG GACATGAACC AGAGACTATT AATTATAGGT CGAAAATTAA GAGGCCACTA 5520TTTATCCGTG TTGTGTTGTC AAAAATTAAA AGGATAGTAT TATGCCGAAA AATCACATTT 5580GATTTTACAA CACAAGATAG AATTAATATT AGGAAGCATC ATCAATCTTT CATTGATACA 5640AGATTAAACT ATTCAGAGGA GATTAACGGT ACTGAGGGGT TGAGAGATTA TATTTTAAAA 5700AATAATTACG GTGCTGTAAT AATAGGTAGT GATCAGACAT GGAGACCAAT ATATTCGCCT 5760AGAATAGATT CATTTTTTCT CGATTTTTTA AGTGATGTAA ACGATATAAA AAATGGCATA 5820TGCAGCATCT TTTGGTACTG ATAAATGGGA GTTCACGGAG TCACAAACTA ATTTATTTAA 5880ATTGTTACTT TCAAAATTTG ACTATGTTTC AGTTAGAGAG TCCTCAGGAG TCAAATTATG 5940TAGTGAAAAA TTTGGTTTGA AAGCAGAGTT GGTTTTAGAT CCGACATTGC TATTGACATT 6000CGAAGATTAT ACTCATTTAT TAGACAATGA CTATATTAAT CTTCATAAGG GAAAGGTGTT 6060TAGTTATGTA CTTGATGAGA ATTACGACAA AAAAAACTTT ATAGACACAG TAGCAAGTAC 6120TCTCCGCACA ACGTCATTTT ATACTTACCC TAAAAAAATC ACTAAAGATG AATATGTGAT 6180
TAGAAATTAT TCCGAGTATG AATATCCGCC AATAGAATAT TGGATTTCTT CGTTTAAGGC 6240CGCTGAATTT ATTGTAACAG ATTCATTTCA TGGAACAGTA TTTTCTATTA TTTTTAACAA 6300ACCCTTCATC GCCATTGCAA ATGAAGAGAG AGGAAAGGCT AGATTTACGT CACTATTGGA 6360AATGTTTGGT CTTGAAAGAC GACTTGTGAG TAATTTAGAT GATGTTGATT TAAAGCTTGT 6420AAATGAAAAA ATTAACTATG GCCCCATAAA TGAAAAAATT GCTTATTTTA GAGAAGAGTG 6480orf3終止位點CCTTAAAAAG TTGCAGTTAA TGCTAATAAA ATAATCAGAT TATGTATGTC TCTCTACAAT6540Orf4起始位點TAAAATATGA ATGTTGATCGATGAAGAATT GTAAAGTATC TGTAATTATT CCGGTCTATA6600ATGCGGAAAA ATATATACAA CGTTGTATTT TAAGCTTATT AAAGCAGACA TTAGATGATG 6660TTGAAATTAT CATCATTGAT GATGGTTCTA CTGATAATTC ACTTTCTATA ATAAAAGAAA 6720CTGTTGCATT GCATACTGCT AGTAGAGCTC GCCAAAAGAG AATCAATATA ATCTCTCGAG 6780AAAACAAAGG AGTTGCCTAT ACACGAAGTC AGGGATTGAG ACTTTCGCAG GGGGAATTTA 6840TCATTCATTT TGATAGTGAT GATTGGGCAA AATCCAATAT GCTGGAGGAA ATGTATAAGA 6900CAATTGTTTC CAATAATGCA GACATGGTTA TATGCGATTA TTTTTTAGTG AAGAATAATA 6960AAGAAATACT TATAAAACAG AGAGTGGAGT ATGAGCCAAA GAAATGTATT AGATATCTAC 7020TGACTGGTGA GCTAGAAGGG TTTACATGGA ACAAACTAAT TAGAAAAAAA TATATCGATA 7080AAAATAAAAT TGATTTTGTT AATAAAATTA CTTATATGGA GGATTTTTTG TTCATATTAA 7140GTGTGTTACT ACACAATCCT AAAATTATTT TTCAGGATTG TGCATATTAT TATTATCAAA 7200AAAGCAATCC TAAATCTCTA ACTAGCCATG CTAGTGTGGA TAGGCTTTCT GAAATGATTA 7260AAGCCGTAAG TGAAATAGAA AAGAAGATAA ATAAATATAA TTTACAAAAG TATCTGAATA 7320ACGAGTTTCA ATTGTTTAAG TTAAAACAAA AAATTTGGTT TATATCTATA AGTAAGTTAA 7380ATGTTAATGA TAATGTATGG AATCTCTTTC CTGAAACAAA TCCATTTATA TCAAAGGTAA 7440ATGTGCTTTT TTATTATAAA ATAGTGCTTT TTCTTGATAG TATTAAACTG CGTTTTTTTT 7500CAAATAAGAT CATTTATCTC ATTGGATTGG TGCAGGCTTT ATTACAAGAA AGGAAAGAGA 7560orf5起始位點 orf4終止位點AGTGATACCA AAAATAATTC ATTACTGCTG GTTCGGTCGC TCTCCATTGT CGGAATTAAC7620AAAGCAGTGC ATTGCAAGCT GGGAGAAATA TTGTCCTGAA TATAAAATCA TAAGATGGGA 7680TGAAAATAAT GTCGATTTGA ATTCTTGTTC TTTTGTTAGA CAAGCTTATA AAGAAAAAAA 7740ATGGGCGTTC GTTTCTGATT ATGTAAGGCT TAAAGTGGTT AATGAATATG GCGGTATCTA 7800TCTTGATACA GATGTTGAAT TAATAAAGCC ATTAGATGAT TTGTTAATAT ATCCTGCATA 7860TATAGGCTTT GAAATTAACA AGGAATGGTA TGTAAATTCT GGTTTGGGGT TCGGTTCTGT 7920TAATAATAAT CCGGTTTTAG AATCATTAAT TATGGAGTAT GAAAATATTA ATTTTGTAAA 7980TGAGGATGGG ACTCTAAATA TAACGCCGTG CCCCATAAGA GAAACAAAAG CATTAACAAA 8040AATAGGTTTA ATTCCTGATG GTCAATGTCA ATCTTTTGAT AATATAGTGA TTTTTTCTGC 8100AGATTATTTT TGTCCTGTAT CTATAACAGG TGAGAGAAAT TTTTCTGATA AAACATATTC 8160AATACATCAT TACGATGCTA GTTGGTTTTC TGAGCAAAAG AGAAAAGGCC TGCAACGTAA 8220AAAGAGATTT ATAAAACTAT TCGGCAACCT AATAGGCACA TATATTAATA AACCTTTTAT 8280TTTTGTAGAT GAATGTCGCG AGTTCGGATT AGTTAAAGCA ATCAAGAATA TGCGTTCCAA 8340orf5終止位點TTTTCCTTAATTTTTAGTGT TAAGGAATAA GTTTCGTTAA AATACTTTAT TCATTTAATT8400Orf6起始位點AATAAAGGTT TAATGGTGAT TAGATGTACT TTCTTTTGTT CTTCTCAATA TTTTATTTTG8460TATACGTAAT CTTAATAGGA ACATTATGTC ATAACTATAA AGCCCTTTTG ATTTTTTCAC 8520TAATCCCTCT GACAATAGTG TCAGGTATAA GATATAATGT CGGCTTTGAT TTTATGTCAT 8580ATGTTGATTA TTTCAATCAA CTCAAATATT CAAATGATAT ATATCTAGAT TCTACCTTTA 8640
AGTATATAAG CTACTTTACC TATTATATAG GAGGTAACGA ACAGATTTTG TTTCTGATAT 8700ATGCGGTTTT TTATTCGGTT GCACTTTATT TTTTAATAAA ACTGGTATTG GAAAATTATA 8760TAACGGAAAT AAATAATTTT TATACTATTG GACTTGTGTT ATCATTTTAT TCGTTTTATT 8820TTTTATTATC ATTTAATCAA ATTAGGGCTG TATTATCAGC TCTAATACTA TGTTATGGGC 8880TATTAAAAAA TAAAATAGAT TTTTCTTTTA TAATAACAAT TACATTAAGT ATTCTTTTTC 8940ACTCTGCAGC AATGTTCATT TTACCTCTTT ATTTTGTCCT AAGAAAAATA AATGTAACAG 9000TTCTGTTGGT GATATTCCCT TTTTTGGTTG TTGCTTCATT CTTTAATATT TTTTCAGATA 9060TTGTGAGATT CATTCTGACA TTGCTAAATA GTCGTTTTTT AACATATTTT AACTCTGAAT 9120ATTTTGTTCC AAGGACGGGA ATGGAAAAAA TGTATAGTAT GATCTCAATG ATTATTGTTT 9180TGGGAATGGT TGTTTGTTTG TCTAAATTAT TACCTAAAAA GTTTGATTTA ATGATAAAGT 9240TTGTTATTCT TTTTGTTCTA CTTAGAGCGA TGTCAATTGA TATATTGATT TTTGCTAGGT 9300TTAGTGATTT TCTTAAACCA ATGGCTATAA TTCTTATATT TACCGCTGTT TATTTTTCTT 9360CGAATAAAGT GCGACCTAGA ATTATCCTTC CTTTTTATTT AATTATGACA TTGTTTCTCT 9420GTATTTTTAA TATAATAATC GGATCGAATA TAACTAAGGG GAACTATTAT ACTTATGGTT 9480orf6終止位點ATAACATTTG CTTTTTTGGC AATAAATGTA TAGATAAATT TTATTAGTAATTGTCATTTG9540orf7起始位點ATACTTCTGG TATTTATGGA AAAATATATG AATAACTTTT CTTGTAAAGA ACCCCCTTCA9600TTTATTGAAA ATAAAATTAT ATTATCAATT ATTCTTCCTG TATATAACGT ATCAGAGTAT 9660TTAATTGAGT GCCTAAACAG TTTGCTGTTA GACGTTCATG AACGTTATCT TAATAGATGT 9720GAAGTAATTG TGGTTGATGA TGGTTCAACT GATAATTCAT TTGAATTAAT GAGAGAGTAT 9780TCTTTGAAAT ATCCTGAATC TATTAAGATT TATTCGAAAT TCAATGGTGG TCTCTCAGAT 9840GCAAGAAACT ATGGATTATT AAAATCTTCA GGTAAATATA TTTCTTTTGT TGATTCAGAT 9900GATGTTGTTA ATAGAGGTTT TATAAAGGAA ATCATCAATT TCATTGATGC CTATGATTTT 9960GATATATTGT CATTTGACTT CATGAAGTTT TTTAATAATA ATGATGCTCT TATTCTTTCA 10020CAAATAGATG AATTCTCCAA AATGGCAGAA AGAGTAGATT CGGAGTTCTA CAAGTCCAAG 10080CCTGTTTTTG CTTGGAATAA AGTTTATCGA CGTTCTCTTT TCGACAATGA AGTATTTCCT 10140AAGGGGTGGT ATTATGAAGA TGTTGCATTA ATTCCGTTAT TATTAGATAG AGCAAAAGTT 10200TTATACCATA TTAATAGCGT TTGTTATTTT TATAGACAGA GACAAGGAGC AATCACTTTT 10260TTTTATGACA ATAAATATCT TGATATTTTA AAAGGAGTGT CTTTTTTATA TGACAGGTCA 10320CAATCTTCAT TCATTAAAAC GATAATTATA AATCAGTTTT TTACTTTAAC CTTACTATCT 10380TTAAGATTGC CGACTGATAA TTATTTCATG AATATGAGGG GGATTATTGA TACCTATTGT 10440GAAAAATTTG ACTTGGATTC CTTTGAGCCT AAACTAATAT TAAAACACAT TCCTTTTTTA 10500TTGCTTAAAA AATTGAAGTC GCTGTGTGTT TATCCACTGT ATTTATTTAA ACCTGCAGTT 10560orf7終止位點TTTTTACATA AACAAATTAA ACATTTTAGA GGAAAACTAA AGTGAAATAT GATTATATAA10620orf8起始位點TTATAGGTAG TGGTCTTTTT GGGAGTGTGT TTGCACATGA ATTAGGGAAAATGAAAAAAA10680AGGTCAAGGT TATTGAGCGT CGTGATCATG TTGGTGGTAA TGTATATTGT GAGAATATTG 10740AAGGAATTAA TGTTCATAAA TATGGCGCAC ATATATTTCA TACTAACGAT AAAGAAATAT 10800GGGATTATGT AAATCAATTT GTAGAGTTTA ATAGATATAC AAATTCACCA TTAGCTTTTT 10860CAAAAGGTAAAATTTATAAT TTACCTTTTA ACATGAATAC CTTTAATCAA CTCTGGGGGG 10920CTATTACTCC TCAACATGCG AAAGAAATTA TTAAAAAGCA AAGCGGTGAA ATAAGTGGAA 10980ATAAACCAAG GAATCTTGAA GAGCAAGCTA TTTCTTTGGT GGGACGAGAT ATTTATAATT 11040GTTTGATTAA GGAGTACACT GAGAAACAAT GGGGACGACC TTGCACTGAA TTGCCATCAT 11100TTATTATAAA ACGACTCCCT GTTAGGTTTA CATACGATAA TAACTATTTT AATGACCAGT 11160
ATCAAGGAAT ACCAGTCGGT GGTTACAATA AATTAATCGA TGCATTATTA AATGGTATTG 11220AAGTTCAAAC ATGCACTGAC TATTTTGAAG AGAAGAAATA TTGGGATTCT ATTGCAAAGA 11280AAATTATTTA TACAGGGCCT ATTGATAAGT TTTATTGCTA TAAATTTGGA GCTTTGGATT 11340ATCGATCATT AAAATTTGAG CATGAATTAC TGAATGTCGA TAATTTTCAA GGGAATGCTG 11400TTGTAAATTA TATAGACAAA AAATTCCCAT TCACTCGTAT AATAGAACAT AAATTTTTTG 11460AATTTGGTGA ACAGCATAAT ACTCTCATTA CTCGAGAGTA CCCAAAAGAA TTCGAAGAAG 11520GCGATGAGTA TTACTATCCT GTCAATGATG AAAAAAATAT GCAAATCTAT AAAATGTATT 11580ATAATCTTTC TAAACAGGAA AGTAATGTGA TTTTTGGTGG ACGTCTTGCG GAATATAAAT 11640ATTATGACAT GCATCAAGTT ATCAAATCAG CTTTAAATGC ATTCCGAAAA GAGGTACGTT 11700orf8終止位點TAGGTGAATA AAGAAGTAAT CGCAGTTATT GTAACCTATA ATAGAAAAGC ATTATTGCTG 11760AAAGTTATAG ATGCTGTTAT TAACCAAAGT TATCCACTAA AAAAAATATT GATAATAGAT 11820orf9起始位點AATAATAGTA CTGATGGTAC GGAGATGTTT ATTTCAAATA GGCTCTCTGA CGTGGTGAAG 11880TATAAAAATA CGGGGGATAA TTTAGGGGGG GCTGGCGGGT TTTATAGAGG ATTCATAGAG 11940GCGGAAAAAT ATGGCTATGA TTATCTTTGG TTAATGGACG ATGATTTTAT GCCTACAGTG 12000AATTGTCTTG AAATATTAAT ATCAAATAGC CCTGATGGTA TTGTCCAACC TGTTAGATAT 12060AACTTGGATG AAACTTGTGC AGAGCTTTCT CCATTAACTT ATGATTTATC TAACCCATTT 12120AAGTTAAACC CTAAAGGTAC ACCATTAAAA AATTACTTAA ATACAATTGG TAATAAATCT 12180GCGAAGGTAG ATATTGAAGC TATTCCATTT GAAGGTCCAT TGATTTCACG AAAGGTTGTT 12240GAAAAAATAG GCTATCCAGA GCCTAAGTTT TTTATTTTTT GTGATGACAT TGAATACGCT 12300ATTAAAGCTA AAAGAAAGGG GATTCCCATC CAGTGCAATC TTAAAGCCAA GGCATACCGC 12360CTTTTGGTCA ACAATCAAGG TAATGATCTT CTTTCCTGGA AAGGATATTT TATGCTTCGA 12420AATCTTTTCT ACCTGCATAA AACGTATGGG ACCAATTTCC TTGTTAGACA AAAACCTATC 12480GTATTGGGAT TAGGATATGC ATTGTCGTGT GTATTGAAAT GCAATTTTTC TCAACTTCCC 12540GTTATATGGC GTGCTTTTTG GGATTCATCT ACGTTAAGAA ATACCGAAAA ATTCAGGCCC 12600orf9終止位點GAAATGAGAA GTAAATAATT TATTATTATG TTTTTATTAA TTAATGTCGA TTTTTACTAA 12660AATTCTTAAC ACGATATTTA TCCCTGACAG GAGTAAACAA TGTCAAAGCA ACAGATCGGC 12720GTCGTCGGTA TGGCAGTGAT GGGGCGCAAC CTTGCGCTCA ACATCGAAAG CCGTGGTTAT 12780ACCGTCTCTA TTTTCAACCG TTCCCGTGAA AAAACGGAAG AAGTGATTGC CGAAAATCCA 12840GGCAAAAAAC TGGTTCCTTA CTATACGGTG AAAGAGTTTG TTGAATCTCT GGAAACGCCT 12900CGTCGCATCC TGTTAATGGT GAAAGCAGGT GCAGGCACGG ATGCTGCTAT TGATTCTCTC 12960AAGCCATACC TCGATAAAGG TGACATCATC ATTGATGGTG GTAACACCTT CTTCCAGGAC 13020ACCATTCGTC GTAACCGTGA GCTTTCTGCA GAAGGCTTTA ACTTCATTGG TACCGGTGTT 13080TCCGGCGGTG AAGAGGGGGC GCTGAAAGGG CCGTCCATCA TGCCTGGTGG CCAGAAAGAA 13140GCCTATGAAC TGGTTGCACC GATCCTGACC AAAATCGCCG CAGTAGCTGA AGACGGGGAG 13200CCATGCGTTA CCTATATTGG TGCCGATGGT GCAGGTCACT ATGTGAAGAT GGTTCACAAC 13260GGTATTGAAT ACGGTGATAT GCAACTGATT GCTGAAGCCT ATTCTCTGCT TAAAGGTGGC 13320CTGAACCTCA CCAACGAAGA ACTGGCGCAG ACCTTTACCG AGTGGAATAA CGGTGAACTG 13380AGCAGCTACC TGATCGACAT CACTAAAGAC ATCTTCACTA AAAAAGATGA AGACGGTAAC 13440TACCTGGTTG ATGTGATTCT GGATGAAGCA GCAAACAAAG GTACCGGTAA ATGGACTAGC 13500CAGAGCGCGC TGGATCTCGG CGAACCGCTG TCGCTGATTA CCGAGTCTGT GTTTGCACGT 13560TATATCTCTT CTCTGAAAGA TCAGCGCGTT GCCGCGTCTA AAGTTCTCAC TGGCCCGAAA 13620GCACAGCCAG CTGGCGAAAA GGCTGAGTTC ATCGAAAAAG TTCGTCGTGC GCTGTATCTG 13680GGCAAAATCG TTTCTTACGC TCAGGGCTTC TCTCAGCTAC GCGCCGCGTC TGAAGAGTAC 13740
AACTGGGATC TGAACTACGG CGAAATCGCG AAGATTTTCC GTGCTGGTTG CATCATCCGT 13800GCGCAGTTCC TGCAGAAAAT CACCGATGCC TATGCCGAAA ATCCGCAGAT CGCTAACCTG 13860CTGCTGGCTC CGTACTTCAA GCAAATTGCC GATGACTACC AGCAGGCGCT GCGCGATGTC 13920GTCGCTTACG CAGTACAGAA CGGTATCCCG GTTCCGACCT TCGCCGCTGC GGTTGCCTAT 13980TATGACAGCT ACCGTTCTGC TGTTCT 14006以上僅是本發明較佳實施例，並非對本發明作任何限制，凡依本發明技術實質對以上實施例作修改、等同變化與修飾，均屬本發明技術方案的範圍內。
權利要求
1.一種對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，其是如SEQID NO1所示的分離的核苷酸，全長14006個鹼基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權利要求1所述的對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，其包括命名為IS序列和wzx，orf2，orf3，orf4，orf5，wzy，orf7，glf，orf9的9個基因組成，都位於galF基因和gnd基因之間。
3.按照權利要求2所述的對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，所述的基因包括轉運酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf4、orf5、orf7、orf9基因，其中所述的轉運酶基因是SEQID NO1中的2518至4011鹼基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的8424至9527鹼基的核苷酸；orf4基因是SEQ ID NO1中的6561至7565鹼基的核苷酸；orf5基因是SEQ ID NO1中的7562至8350鹼基的核苷酸；orf7基因是SEQ ID NO1中的9556至10605鹼基的核苷酸；orf9基因是SEQID NO1中的11845至12618鹼基的核苷酸。
4.按照權利要求1或2所述的對大腸桿菌O164的O-抗原特異的寡核苷酸，其特徵在於，其分別源於所述的IS序列和相鄰的wzx基因；以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權利要求4所述的對大腸桿菌O164的O-抗原高度特異的核苷酸，其特徵在於，所述的源於IS序列的寡核苷酸作為上遊引物，它們是SEQ ID NO1中的1868至1885鹼基的核苷酸SEQ ID NO1中的2265至2284鹼基的核苷酸所述的源於wzx基因的寡核苷酸作為下遊引物，它們是SEQ ID NO1中的3020至3050鹼基的核苷酸SEQ ID NO1中的2809至2827鹼基的核苷酸
6.權利要求1所述的對大腸桿菌O164型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達O-抗原的細菌、鑑定細菌的O-抗原和細菌的其它多糖抗原中的應用。
7.權利要求1所述的對大腸桿菌O164型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達而提供表達大腸桿菌O164型的O-抗原，以及製備細菌疫苗中的應用。
8.按照權利要求1所述的對大腸桿菌O164型的O-抗原特異的核苷酸的應用，其特徵在於，它作為引物用於PCR、作為探針用於雜交反應與螢光檢測、或者用於製造基因晶片或微陣列，供檢測細菌的應用。
9.權利要求1所述的對大腸桿菌O164型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，這些方法是基於我們已經得到了痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇的全序列，並申請了專利。在此基礎上，我們又按如下方法破譯了大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇的全序列。其特徵在於，其包括下述步驟(1)基因組的提取提取大腸桿菌O164的基因組(2)引物的設計在痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇中的相鄰的或相隔的兩個基因內設計上下遊引物；要求上下遊引物分別位於相鄰的兩個基因或相隔的基因內。每一對引物按如下步驟進行試驗。(3)通過PCR擴增大腸桿菌O164中的O-抗原基因簇的相應序列用每對分布在相鄰基因內的上下遊引物，以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。每對引物將得到不同大小的PCR產物。將得到的PCR產物，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性。合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定，並再設計引物和測序直到從兩端將每個PCR產物的序列測通。(4)核苷酸序列的拼接及分析應用生物信息學軟體拼接和編輯上述得到的所有的核苷酸序列。(5)對不準確的序列再次測序以不準確的序列的兩側的序列為模板設計引物，並以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定。(6)再次進行核苷酸序列的拼接及分析將新得到的序列加入到原有的序列中再次拼接並編輯所有的核苷酸序列。最終得到大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇的準確的全序列。用生物信息學軟體對得到的序列進行序列的比對和分析，並用Artemis軟體做基因的注釋。(7)特異基因的篩選在比較了大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇後，針對大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇的不同序列即IS序列及相鄰的wzx基因設計引物；上遊引物分布在IS序列內，下遊引物分布在IS序列和wzx基因內，以確保其對大腸桿菌O164型的特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，確定它們對大腸桿菌O164型的O-抗原的高度特異性；(8)引物靈敏度的檢測培養大腸桿菌O164，細菌計數後分別將5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養基，取一些與樣品混合過的LB培養基過濾，將過濾液進行培養，從培養好的菌液中取數毫升處理後作為PCR模板用寡核苷酸進行PCR反應，檢測其對大腸桿菌O164的靈敏度
10.權利要求9所述的對大腸桿菌O164的O-抗原特異的核苷酸的分離和鑑定方法，其特徵在於，包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養基中37℃過夜培養大腸桿菌O164，離心收集細胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然後加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之後加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘餘的酚，上清液用2倍體積乙醇沉澱DNA，用玻璃絲卷出DNA並用70％乙醇洗DNA，最後將DNA重懸於30ul TE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)引物的設計在痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇中的相鄰的或相隔的兩個基因內設計上下遊引物；要求上下遊引物分別位於相鄰的兩個基因或相隔的基因內。設計的引物如下galF基因的引物為5』-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3』，編號為#1523；wzx基因的引物為3』-GGCACTTACGTCGTATA-5′，引物編號為#82；wzx基因的引物為5』-TGTGCAGAGTTCAGGGAG-3』，引物編號為#100；Orf2基因的引物為3′-GCAAAGTCCTCACCGTA-5′，引物編號為#hp-2；Orf2基因的引物為5′-AGCGTGTTTGTCCCTTTA-3′，引物編號為#hp-1；Orf3基因的引物為3′-ATTAGAAGTATTCCCTTTCC-5′，引物編號為#hp-4；Orf3#基因的引物為5′-AGGACGCATCATCAATCT-3′，引物編號為#hp-3；Orf4基因的引物為3′-ACACCTATCCGAAAGACTT-5′，引物編號為#72；Orf4基因的引物為5′-AAGGAGTTGCCTATACACG-3′，引物編號為#204；Orf5基因的引物為3′-CTAACCACGTCCGAAATA-5′，引物編號為#209；Orf5基因的引物為5′-TGGAGTATGAGCCAAAGAA-3′，引物編號為#208；wzy基因的引物為3′-GCTTATTTCACGCTGGATCT-5′，引物編號為#58；wzy基因的引物為5′-TTTGTTTCTGATATATGCGGT-3′，引物編號為#57；Orf7基因的引物為5′-CGAAATTCAATGGTGGTC-3′，引物編號為#214；Orf7基因的引物為5′-TTCAATGGTGGTCTCTCA-3′，引物編號為#75；Orf9基因的引物為3′-TGAAGGGCAATATACCGC-5′，引物編號為#78；Orf9基因的引物為5′-TGGACGATGATTGTATGC-3′，引物編號為#213；gnd基因的引物為5』-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3』，引物編號為#1524.(3)通過PCR擴增大腸桿菌O164中的O-抗原基因簇的相應序列用每對分布在相鄰基因內的上下遊引物，以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。PCR反應程序如下在95℃預變性3分鐘，然後95℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(見表中)，退火時間是50秒，72℃延伸時間因引物的不同而不同(見表中)，這樣進行30個循環；最後，在72℃繼續延伸10分鐘，得到PCR產物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性；合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定，並再設計引物和測序直到從兩端將每個PCR產物的序列測通。(4)核苷酸序列的拼接及編輯用英國劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學實驗室出版的Staden package軟體包的Pregap4和Gap4軟體拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的核苷酸的全長序列。(5)對不準確的序列再次測序以不準確的序列的兩側的序列為模板設計引物，並以大腸桿菌O164型的基因組為模板進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合併4管PCR產物送到測序公司，用他們的相應的上下遊引物從兩個方向對純化後的相應的PCR產物進行核苷酸的序列測定。(6)再次進行核苷酸序列的拼接及分析用Staden package軟體包的Pregap4將新得到的序列加入到原有的序列中再次拼接，並用Gap4軟體編輯所有的核苷酸序列。最終得到大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇的準確的全序列。在得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的核苷酸序列後，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發現基因，找到9個開放的閱讀框，用blast系列軟體與GenBank中的基因比較以發現這些開放閱讀框的功能並確定它們是什麼基因，再用英國sanger中心的Artemis軟體完成基因注釋，用ClustralW軟體做DNA和蛋白質序列間的精確比對，最後得到大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的結構；並與痢疾志賀氏菌3型的結構比較，發現他們有相同的基因。這些基因具有相同的排列順序。唯一的不同是大腸桿菌O164的O-抗原基因簇的第一個開放閱讀框之前(5′端)有一個插入序列(IS)。(7)特異基因的篩選在比較了大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇後，針對大腸桿菌O164型的O-抗原基因簇和痢疾志賀氏菌3型的O-抗原基因簇的不同序列即IS序列與相鄰的wzx基因設計引物；上遊引物分布在IS序列內，下遊引物分布在相鄰的wzx基因內，以確保其對大腸桿菌O164型的特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，確定IS序列對大腸桿菌O164型的O-抗原是高度特異；可以用上述引物進行PCR，來區分和鑑別環境中的大腸桿菌O164型和痢疾志賀氏菌3型。(8)引物靈敏度的檢測將大腸桿菌O164的凍存菌液接種到有LB培養基的三角瓶中，30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時至飽和，取培養好的菌液稀釋，取稀釋菌液塗布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養數小時計數，計算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌，攪拌均勻，加入LB培養基，過濾，過濾液於30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時；從培養好的菌液中取數ml於6,000g離心數分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉澱並混勻，放入100℃沸水中煮數分鐘，裂解液於12,000g離心數分鐘，取上清做為PCR模板；用所述的源於IS序列的寡核苷酸作為上遊引物，它們是SEQID NO1中的1868至1885鹼基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2265至2284鹼基的核苷酸。所述的源於wzx基因的寡核苷酸作為下遊引物，它們是SEQID NO1中的3020至3050鹼基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2809至2827鹼基的核苷酸進行PCR反應，PCR反應體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個循環；反應結束後，取10μl反應產物電泳，若有與預期大小相符的擴增帶，則結果為陽性，若沒有，則結果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個活菌的每份豬肉餡均在2對引物的PCR反應中得到陽性結果；參入0個活菌的豬肉餡在2對引物的PCR反應中得到陰性結果；說明使用上述方法時，這2對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O164的檢測靈敏度均為0.25個菌/g。
全文摘要
本發明提供一種對大腸桿菌O164(Escherichiacoli O164)的O－抗原特異的核苷酸，它是大腸桿菌O164中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長14006個鹼基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；還包括源於大腸桿菌O164的O－抗原基因簇中IS和wzx基因的寡核苷酸；本發明通過PCR證實寡核苷酸對大腸桿菌O164的O－抗原都有高度的特異性；本發明還公開了用本發明的寡核苷酸檢測和鑑定人體及環境中的大腸桿菌O164的方法。
文檔編號C12P19/34GK1563060SQ20041001904
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月19日 優先權日2004年4月19日
發明者王磊, 楊靜華, 郭宏傑 申請人:天津生物晶片技術有限責任公司