具有阿魏酸酯酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的製作方法

2023-05-10 07:16:56 3

專利名稱：：具有阿魏酸酯酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用於產生和使用所述多肽的方法。相關領域描述植物細胞壁多糖約構成植物細胞壁的90%，並且能分成三組纖維素，半纖維素和果膠。纖維素代表細胞壁多糖的主要成分。半纖維素是植物細胞壁第二豐富的成分。主要的半纖維素聚合物是木聚糖。植物細胞壁中發現的木聚糖的結構依賴於其來源而顯著不同，但是總是包含日-1，4-連接的0-木糖骨架。0-1，4_連接的D-木糖骨架可以由各種側鏈基團取代，如L-阿拉伯糖，D-半乳糖，乙醯基，阿魏醯基，對-香豆醯基和葡萄糖醛酸殘基。木聚糖骨架的生物降解依賴於兩類酶內切木聚糖酶和木糖苷酶。內切木聚糖酶(EC3.2.1.8)將木聚糖骨架切割成更小的寡糖，其可以進一步由木糖苷酶(EC3.2.1.37)降解成木糖。其它與木聚糖降解有關的酶包括，例如，乙醯基木聚糖酯酶，阿拉伯糖酶，a「葡糖醛酸糖苷酶，阿魏醯基酯酶，和對_香豆酸酯酶。Faulds和Williamson，1991，J.Gen.Microbiol.137:2339_2345描述了來自橄欖色鏈黴菌(Str印tomycesolivochromogenes)的4_羥基-3-甲氧基-肉桂(阿魏醯基)酸酯酶的純化和表徵。Faulds和Williamson，1994，Microbiology140:779_787，描述了來自黑麴黴(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶的純化和表徵。Kroon等，1996，Biotechnol.Appl.Biochem.23:255_262描述了由糖甜菜粕上黑麴黴生長而誘導的阿魏酸酯酶的純化和表徵。deVries等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:4638_4644公開了來自黑麴黴和塔賓麴黴(Aspergillustubingensis)的阿魏酸酯酶基因。Castanares等，1992，EnzymeMicrobiol.Technol.14:875-884，描述了來自嗜松青黴(Penicillumpinophilu)的阿魏醯基/對_香豆醯基酯酶的純化和性質。本發明涉及具有阿魏酸酯酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。發明概述本發明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)包含胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中_高嚴緊條件下與以下雜交4(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少75%同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)胺基酸的變體。本發明還涉及編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自下組(a)編碼包含胺基酸序列的多肽的多核苷酸，所述胺基酸序列與SEQIDN02的成熟多肽具有至少75%同一性；(b)多核苷酸，其在至少中-高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的互補鏈；(c)多核苷酸，其包含與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列具有至少75%同一性的核苷酸序列；和(d)多核苷酸，其編碼SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)胺基酸的變體。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細胞，和產生具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法。本發明還涉及抑制所述具有阿魏酸酯酶活性的多肽在細胞中表達的方法，其包括對細胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包括本發明的多核苷酸的亞序列。本發明還涉及這種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地dsRNA是siRNA或miRNA分子。本發明還涉及用具有阿魏酸酯酶活性的多肽降解含木聚糖材料的方法。本發明還涉及包含分離的多核苷酸的植物，所述多核苷酸編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。本發明還涉及用於產生具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益於產生該多肽的條件下培養包含多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼具有阿魏酸酯酶的多肽；和(b)回收所述多肽。本發明進一步涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中將所述基因可操作地連接於編碼信號肽的核苷酸序列，所述信號肽包含SEQIDNO:2的胺基酸1至18或由SEQIDNO2的胺基酸1至18組成，其中所述基因對於所述核苷酸序列是外源的。附圖簡述圖1顯示特異腐質黴DSM1800CE1阿魏酸酯酶的基因組DNA序列和推導的胺基酸序列(分別為SEQIDNO1和2)。圖2顯示pMMar8的限制圖譜。圖3顯示pHinsFAEBl的限制圖譜。定義阿魏酸酯酶活性術語「阿魏酸酯酶活性」在本文中定義為4-羥基-3-甲氧基肉桂酉先—糖水角軍Bl(4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl-sugarhydrolase)夕舌個生(EC3.1.1.73)，其催化從酯化的糖水解4-羥基-3-甲氧基肉桂醯(阿魏醯基)基團，所述糖通常是「天然」底物中的阿拉伯糖，以產生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏醯基酯酶、羥基肉桂醯基酯酶、FAE-III、肉桂醯酯水解酶、FaeA、FaeB、cinnAE、FAE-I或FAE-II。已經報導了兩種主要的阿魏酸酯酶(Cr印in等，2004，Appl.Microbiol.Biotechnol.63647-652)。A型阿魏酸酯酶從1，5_酯-連接的阿魏醯化的阿拉伯糖釋放阿魏酸，並且在用木聚糖酶預處理或者將木聚糖酶與阿魏酸酯酶共溫育時還能釋放少量的5，5』_和8-0-4』-阿魏酸脫氫二聚體。A型阿魏酸酯酶還表現出對於底物的酚部分的優先性，所述底物包含甲氧基取代，特別是在碳3和/或5處，如在阿魏酸和芥子酸(sinapicacid)中所發生的。就針對合成底物的特異性而言，A型阿魏酸酯酶對於阿魏酸甲酯、芥子酸甲酯和對-香豆酸甲酯有活性，但是對於咖啡酸甲酯沒有活性。B型阿魏酸酯酶釋放與阿魏醯化阿拉伯糖殘基的C-2或阿魏醯化半乳糖殘基的C-6連接的阿魏酸酯，但是不能釋放阿魏酸的二聚形式。B型阿魏酸酯酶對於底物的酚部分表現出優先性，所述底物包含一個或兩個羥基取代，如分別在對香豆酸和咖啡酸中存在的。當存在甲氧基基團時水解速度顯著降低。就針對合成底物的特異性而言，B型阿魏酸酯酶對於咖啡酸甲酯、阿魏酸甲酯和對-香豆酸甲酯有活性，但是對於芥子酸甲酯沒有活性。就本發明而言，根據實施例中描述的方法確定阿魏酸甲酯活性。一個單位的阿魏酸酯酶活性等於能夠在PH5，25°C每分鐘釋放1微摩爾對硝基苯酚陰離子的酶量。本發明的多肽具有SEQIDNO2的成熟多肽的阿魏酸酯酶活性的至少20%，優選至少40%，更優選至少50%，更優選至少60%，更優選至少70%，更優選至少80%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少100%。CE1或CE1家族術語「CE1家族」或「CE1」在本文中定義為根據Coutinho和Henrissat,(1999)Carbohydrate-activeenzymes:anintegrateddatabaseapproach.於"RecentAdvancesinCarbohydrateBioengineering",H.J.Gilbert,G.Davies,B.Henrissat禾口B.Svensson編，TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,pp.3-12屬於糖酯酶家族的多肽。含木聚糖材料術語「含木聚糖材料」在本文中定義為包含木聚糖作為組分的任何物質。木聚糖是包含0-1，4_連接木糖殘基骨架的植物細胞壁多糖。4-0-甲基葡萄糖醛酸和阿拉伯糖的側鏈通常以不同的量與乙醯和阿魏醯基團一起存在。木聚糖是半纖維素的主要組分。分離的多肽術語「分離的多肽」用於本文中指由來源分離的多肽。在一個優選的方面，多肽是如通過SDS-PAGE測定的，至少純，優選至少5%純，更優選至少10%純，更優選至少20%純，更優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，並且最優選至少90%純的多肽。基本上純的多肽術語「基本上純的多肽」在本文表示多肽製備物，所述多肽製備物含有按重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%,更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%，並且甚至最優選至多0.5%的與其天然或重組結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優選所述基本上純的多肽是按存在於製備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，更優選至少98%純，甚至更優選至少99%純，最優選至少99.5%純，並且甚至最優選100%純。本發明的多肽優選是基本上純的形式，即，所述多肽製備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現通過公知的重組方法或由經典純化方法製備多肽。成熟多肽術語「成熟多肽」在本文中定義為多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯後修飾之後的最終形式存在，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截斷、糖基化等。在一個優選的方面，根據預測SEQIDNO2的胺基酸1至18是信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering101-6)，成熟多肽是SEQIDNO2的胺基酸19至291。成熟多肽編碼序列術語「成熟多肽編碼序列」在本文中定義為編碼具有阿魏酸酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個優選的方面，根據預測SEQIDN0:1的核苷酸1至54編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是的SEQIDNO1的核苷酸55至1054。同一性由參數「同一性」描述的兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的同一性程度通過Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)使用EMBOSS軟體(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16276-277)的Needle程序來確定，優選3.0.0版或更高版本。使用的可選參數為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62取代矩陣(BL0SUM62的EMBOSS版)。使用Needle標記為「最高同一性(longestidentity)」(使用-nobrief選項獲得)的輸出結果作為百分比同一性，並計算如下(相同的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數)就本發明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度通過Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上文)使用EMBOSS軟體(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，見上文)的Needle程序來測定，優選3.0.0或更高版本。使用的可選參數為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL取代矩陣(NCBINUC4.4的EMBOSS版)。使用Needle標記為「最高同一性」的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，並計算如下(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數)同源序列術語「同源序列」在本文中定義為在用SEQIDNO:2的特異腐質黴阿魏酸酯酶或其成熟多肽進行的tfasty搜索(Pearson,ff.R.，1999，於BioinformaticsMethodsandProtocols，S.Misener和S.A.Krawetz編，pp.185-219)中E值(或期望值)小於0.001的預測蛋白質。多肽片段術語「多肽片段」在本文中定義為從SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)胺基酸的多肽；其中所述片段具有阿魏酸酯酶活性。在一個優選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少230個胺基酸殘基，更優選至少245個胺基酸殘基，並且最優選至少260個胺基酸殘基。亞序列術語「亞序列(subsequence)」在本文中定義為從SEQIDNO1或其同源序列的5』和/或3』端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽片段。在一個優選的方面，亞序列含有SEQIDN0:1的成熟7多肽編碼序列或其同源序列的至少690個核苷酸，更優選至少735個核苷酸，並且最優選至少780個核苷酸。等位變體(allelicvariant)術語「等位變體」在本文中表示佔據相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術語「分離的多核苷酸」用於本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優選的方面，多核苷酸是如通過瓊脂糖電泳測定的，至少純，優選5%純，更優選至少10%純，更優選至少20%純，更優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，並且最優選至少90%純的多核苷酸。基本上純的多核苷酸術語「基本上純的多核苷酸」用於本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸製備物，並且所述多核苷酸製備物處於適合於在遺傳工程的蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%，並且甚至最優選至多0.5%的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5』和3』非翻譯區，如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優選至少92%純，更優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，甚至更優選至少98%純，最優選至少99%，並且甚至最優選至少99.5%純的。本發明所述多核苷酸優選為基本上純的形式。具體而言，優選在本文公開的多核苷酸是「基本上(essentially)純的形式」，即，所述多核苷酸製備物基本上不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用於本文時術語「編碼序列」的意思是直接指定其蛋白產物的胺基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，並且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成或重組核苷酸序列。cDNA:術語「cDNA」在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子製備的DNA分子。cDNA缺少通常存在於相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然後作為成熟的已剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內含子序列。核酸構建體術語「核酸構建體」用於本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在於(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區段，或所述核酸是合成的。當所述核酸構建體含有表達本發明的編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語「表達盒」同義。調控序列(controlsequence)術語「調控序列」在本文定義為包括對編碼本發明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。各個調控序列對於編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調控序列對於彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用於引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區的連接。可操作地連接術語「可操作地連接」在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置於相對於多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語「表達」包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。表達載體術語「表達載體」在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，並且所述多核苷酸與提供用於其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語「宿主細胞」包括任何細胞類型，所述細胞類型對於使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)0修飾術語「修飾」在本文的意思是，對由SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)胺基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)胺基酸側鏈的置換。人工變體當用在本文時，術語「人工變體」的意思是具有阿魏酸酯酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的核苷酸序列的生物體產生。所述修飾的核苷酸序列通過人為幹預(humanintervention)，通過修飾公開於SEQIDNO:1或它們的同源序列的多核苷酸序列來獲得。發明詳述具有阿魏酸酯酶活性的多肽在第一個方面，本發明涉及包含胺基酸序列的分離的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性(下文中的「同源多肽」)。在一個優選的方面，所述同源多肽包含胺基酸序列，其與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個胺基酸，優選相差五個胺基酸，更優選相差四個胺基酸，甚至更優選相差三個胺基酸，最優選相差兩個胺基酸，並且甚至最優選相差一個胺基酸。本發明的多肽優選包含SEQIDNO2的胺基酸序列或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段。在一個優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。在另一個優選方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一個優選方面，多肽包含SEQIDNO2的胺基酸19至291，或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段。在另一個優選方面，多肽包含SEQIDN0:2的胺基酸19至291。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO2的胺基酸序列或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO2的成熟多肽組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO2的胺基酸19至291或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDN0:29的胺基酸19至291組成。在第二個方面，本發明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優選非常低嚴緊條件下，更優選低嚴緊條件下，更優選中嚴緊條件下，更優選中_高嚴緊條件下，甚至更優選高嚴緊條件下，並且最優選非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續的核苷酸或優選至少200個連續的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽片段。在一個優選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的胺基酸序列或其片段，可用於設計核酸探針，以根據本領域內公知的方法從不同屬和種的菌株鑑定和克隆編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用於與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑑定和從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短於完整序列，但長度上應為至少14，優選至少25，更優選至少35，並且最優選至少70個核苷酸。然而，優選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優選至少300個核苷酸，更優選至少400個核苷酸，或最優選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是優選至少600個核苷酸，更優選至少700個核苷酸，更優選至少800個核苷酸，或最優選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針包含於本發明中。因而，可從由這些其它生物體製備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交並且編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離來自這些其它生物體的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料並且固定於其上。為了鑑定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優選用在Sounthern印跡中。就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應於SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；包含於SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，其全長互補鏈；或它們的亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個優選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸55至1054。在另一個優選方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優選方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一個優選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)NRRLB-50077中的質粒pHinsFAEBl中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。在另一個優選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50077中的質粒pHinsFAEBl中含有的成熟多肽編碼序列區域。對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS,200ug/ml已剪切並且變性的鮭精DNA中，並且對於非常低和低嚴緊性為25%的甲醯胺、對於中和中-高嚴緊性為35%的甲醯胺、或對於高和非常高嚴緊性為50%的甲醯胺，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至24小時。對於長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優選至少在45°C(非常低嚴緊性)，更優選至少在50°C(低嚴緊性)，更優選至少在55°C(中嚴緊性)，更優選至少在60°C(中-高嚴緊性)，甚至更優選至少在65°C(高嚴緊性)，並且最優選至少在70°C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比牛艮據Bolton禾口McCarthy計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM石舞酸二fil內(sodiummonobasicphosphate)，0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交後洗滌最佳12至24小時。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，並用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三方面，本發明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，其由包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%同一性的同一性程度，其編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。參見本文的多核苷酸部分。在第四方面，本發明涉及SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)胺基酸的人工變體。優選地，胺基酸改變對性質是較不重要的(ofaminornature)，即保守的胺基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性；通常為1至大約30個胺基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的小延伸,如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸組(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性胺基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小胺基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的胺基酸取代是本領域已知的，並且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979，於TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個基本胺基酸，非基本胺基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和a-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保守胺基酸、不由遺傳密碼編碼的胺基酸和非天然胺基酸可以取代胺基酸殘基。「非天然胺基酸」在蛋白質合成後已經過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同於基本胺基酸的化學結構。非天然胺基酸能夠以化學方法合成，並且優選是商業上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。可供選擇的是，胺基酸改變具有這樣的性質以使多肽的物理化學性質改變。例如，胺基酸改變可改進多肽的熱穩定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑑定親本多肽中的必需胺基酸。在後一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，並且測試所得突變分子的生物活性(即，阿魏酸酯酶活性)以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而測定，如通過以下這些技術如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點胺基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899_904；fflodaver等，1992，FEBSLett.30959-64必需胺基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據本發明的多肽相關。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然後是有關的篩選方法，例如由Reidhaar-Olson禾口Sauer，1988，Science24153-57；Bowie禾口Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；W095/17413；或W095/22625公開的那些方法來進行並測試單個或多個胺基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利號5，223，409；W092/06204)和區域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，並且使用本領域內標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個胺基酸殘基的重要性，並且能夠應用於未知結構的多肽。SEQIDNO2的成熟多肽，如SEQIDNO2的胺基酸19至291的胺基酸取代、缺失和/或插入的總數是10，優選9，更優選8，更優選7，更優選至多6，更優選5，更優選4，甚至更優選3，最優選2，並且甚至最優選1。具有阿魏酸酯酶活性的多肽的來源本發明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發明而言，用於本文與給定的來源有關的術語「獲得自」，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產生。在一個優選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發明具有阿魏酸酯酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈黴菌12屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性；或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一個優選的方面，所述多肽是嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在另一個優選的方面，所述多肽是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸瘟亞種(Str印tococcusequisubsp.Zooepidemicus)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在另一個優選的方面，所述多肽是不產色鏈黴菌(Str印tomycesachromogenes)、除蟲鏈黴菌(Streptomycesavermitilis)、天藍鏈黴菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈黴菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈黴菌(Streptomyceslividans)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。本發明具有阿魏酸酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，並且更優選酵母多肽如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍黴屬(Yarrowia)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性；或更優選絲狀真菌多肽如枝頂孢黴屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、麴黴屬(Aspergillus)、短梗黴屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤黴屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質黴屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)>M(Lentinula)>Leptospaeria>|ifM(Magnaporthe)>Melanocarpus>多孔菌屬(Meripilus)、毛黴屬(Mucor)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、新考瑪脂黴屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青黴屬(Paecilomyces)、青黴屬(PeniciIlium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛黴屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸黴屬(Tolypocladium)、木黴屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一個優選的方面，所述多肽是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太，所述多月太具有阿魏酸酯酶活性。在另一個優選方面，所述多肽是解纖維枝頂孢黴(Acremoniumcellulolyticus)、Ml^^9(Aspergillusaculeatus)Λ^^ftβ(Aspergillusawamori)Λffiβ(Aspergillusfumigatus)、臭麴黴(Aspergillusfoetidus)、曰本麴黴(Aspergillusjaponicus)、構巢麴黴(Aspergillusnidulans)、漂麴黴(Aspergillusniger)、米麴黴(Aspergillusoryzae)、嗜角質金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾穀德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾鬥德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖,廉抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅,廉抱(Fusariumroseum)、接骨木,廉抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱,廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓,廉抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、米M毛毒(Mucormiehei)、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青黴(Penicilliumfuniculosum)、產紫青黴(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、THielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(THielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、THielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(THielaviaspededonium)、^包冑(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、zhtMi包胃(Thielaviaterrestris)、@He(Trichodermaharzianum)(Trichodermakoningii)、長枝木黴(Trichodermalongibrachiatum)、裡氏木黴(Trichodermareesei)或綠色木黴(Trichodermaviride)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在另一個優選方面，所述多肽是灰腐質黴(Humicolagrisea)、特異腐質黴(Humicolainsolens)或疏棉狀腐質黴(Humicolalmuginosa)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一個更優選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的特異腐質黴多肽。在一個最優選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的特異腐質黴DSM1800多肽，例如，包含SEQIDNO2的成熟多肽的多肽。可理解的是對於前述的種，本發明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員將容易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養物保藏中心對於公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農業研究機構專利培養物保藏中心北區研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑑定和獲得這些多肽。用於從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內公知的。隨後可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。本發明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合於本發明的核苷酸序列(或其部分)來產生融合的多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，並包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，並且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，從融合蛋白質釋放具有阿魏酸酯酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限於，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568_76；Svetina等，2000,J.Biotechnol.76245-251；Rasmussen-Wilson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488_3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498_503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基後通過因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505_512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸後通過腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982_987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989,Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240_248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg後通過凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld435-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln後通過TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln後通過基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)。多核苷酸本發明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發明具有阿魏酸酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由編碼本發明具有阿魏酸酯酶活性的多肽的核苷酸序列組成。在一個優選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1或由SEQIDNO=I組成。在另一個更優選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50077中所含質粒pHinsFAEBl中含有的序列，或由大腸桿菌NRRLB-50077中所含質粒pHinsFAEBl中含有的序列組成。在另一個優選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。在另一個優選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸55至1054或由SEQIDNO1的核苷酸55至1054組成。在另一個更優選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50077中所含質粒pHinsFAEBl中含有的成熟多肽編碼序列或由大腸桿菌NRRLB-50077中所含質粒pHinsFAEBl中含有的成熟多肽編碼序列組成。本發明還包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO2的胺基酸序列或其成熟多肽組成；由於遺傳密碼的簡併性，所述核苷酸序列不同於SEQIDNO1或其成熟多肽編碼序列。本發明還涉及SEQIDNO1的亞序列，所述亞序列編碼具有阿魏酸酯酶活性的SEQIDNO2的片段。本發明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，或由具有至少一個突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。用於分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特性的克隆DNA片段，從而實現從這種基因組DNA克隆本發明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基於核苷酸序列的擴增(NASBA)。可以從腐質黴屬菌株，或其它或相關生物體克隆多核苷酸，並且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發明還涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%同一性的同一性程度，其編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。修飾編碼本發明多肽的核苷酸序列對於合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術語與所述多肽「基本上相似」指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同於從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩定性、最適PH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO:1的多肽編碼區存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的胺基酸序列，但是符合意欲產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產生不同的胺基酸序列。關於核苷酸取代的概述，參見，例如，Ford等，1991,ProteinExpressionandPurification2一107。對於本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對於分子功能重要的區域之外進行，並且仍然產生活性多肽。對於由本發明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的並且因此優選不進行取代的胺基酸殘基，可以根據本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，見上文)來鑑定。在後一技術中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，並且測試所得突變分子的阿魏酸酯酶活性，以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。底物_酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構測定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上文；Smith等，1992，見上文；Wlodaver等，1992，見上文)。本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優選低嚴緊條件，更優選中等嚴緊條件，更優選中_高嚴緊條件，甚至更優選高嚴緊條件，並且最優選非常高的嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在一個優選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的所述成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴緊條件下，將DNA的群體與以下序列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。在一個優選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構建體本發明還涉及包含本發明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(幾個)調控序列可操作地連接，所述調控序列在合適的宿主細胞中在與該調控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。可以用許多方式操作編碼本發明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴於表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調控序列可以是適當的啟動子序列，其是由用於表達編碼本發明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，並且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用於指導本發明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈黴菌(Str印tomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727_3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"於ScientificAmerican,1980,242:74_94中；禾口在Sambrook等，1989，見上文中描述。用於指導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米麴黴TAKA澱粉酶、曼赫根毛黴(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性α-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(glaA)、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶、構巢17麴黴乙醯胺酶、鑲片鐮孢澱粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、裡氏木黴β-葡糖苷酶、裡氏木黴纖維二糖水解酶I、裡氏木黴纖維二糖水解酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶I、裡氏木黴內切葡聚糖酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶III、裡氏木黴內切葡聚糖酶IV、裡氏木黴內切葡聚糖酶V、裡氏木黴木聚糖酶I、裡氏木黴木聚糖酶II、裡氏木黴β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性α-澱粉酶基因和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截斷的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對於酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992，Yeast8:423_488描述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3』末端可操作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、黑麴黴α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對於酵母宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對於酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對於宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作地連接於編碼多肽的核苷酸序列的5』-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴丙糖磷酸異構酶。對於酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，並且在轉錄時，宿主細胞將其識別為信號以將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發明中使用。對於絲狀真菌宿主細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴α-葡糖苷酶。對於酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。調控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的胺基酸序列，並且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5』端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5』端可含有對於所述編碼序列異源的信號肽編碼序列。異源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養基中)的任何信號肽編碼序列可在本發明中使用。對於細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖澱粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內醯胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對於絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、特異腐質黴纖維素酶、特異腐質黴內切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質黴脂肪酶。對於酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。在一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO:2的胺基酸1至18，或者由SEQIDNO:2的胺基酸1至18組成。在另一個優選方面，信號肽編碼序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至54，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至54組成。調控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位於多肽氨基末端的胺基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前多肽通常是無活性的並且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼區。當信號肽和前肽區二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽區置於緊接著(nextto)多肽氨基末端，並且將信號肽區置於緊接著前肽區的氨基末端。同樣理想的是添加調節序列，其允許相對於宿主細胞的生長來調節多肽的表達。調節系統的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。原核系統中的調節系統包括lac、tac和trp操縱基因系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GALl系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調節序列可操作地連接。表達載體本發明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發明的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選擇的是，可以通過在適當的用於表達的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構建體來表達本發明的核苷酸序列。在製備表達載體的過程中，將編碼序列置於載體中，從而將該編碼序列與適當的表達調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，並且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴於載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主複製載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用於確保自複製的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中並且與整合了該載體的染色體一起複製的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉座子(transposon)。本發明的載體優選地含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性。對於酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限於amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶)、hph(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase))、sC(硫酸腺苷醯轉移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優選用在麴黴屬細胞中的是構巢麴黴或米麴黴的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發明的載體優選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立於基因組的自主複製。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用於通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用於指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優選含有足夠數量的核酸，如100至10，000鹼基對，優選400至10，000鹼基對，並且最優選800至10，000鹼基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主複製，載體可以進一步包含複製起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地複製。複製起點可以是介導自主複製的任何質粒複製子(r印licator)，其在細胞中發揮功能。術語「複製起點」或「質粒複製子」在本文定義為能夠使質粒或載體體內複製的核苷酸序列。細菌複製起點的實例是允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起點，和允許在芽孢桿菌屬中複製的質粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的複製起點。用於酵母宿主細胞中的複製起點的實例是2微米複製起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的複製起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構建包含該基因的質粒或載體能夠根據公開於WO00/24883中的方法完成。可以將多於一個拷貝的本發明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或將可擴增的選擇性標記基因包括於多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，和由此得到多核苷酸的額外拷貝。用於連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細胞本發明還涉及重組宿主細胞，其包含本發明的分離的多核苷酸，可有利地用於多肽的重組生產中。將包含本發明的多核苷酸的載體導入宿主細胞，使載體作為染色體整合體或如前所述的自複製的染色體外載體維持。術語「宿主細胞」包括由於複製過程中發生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何後代。宿主細胞的選擇在很大程度上依賴於編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是在本發明的多肽的重組產生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限於，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈黴菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌和海洋芽孢桿菌。革蘭氏陰性細菌包括但不限於，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限於，嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優選的方面，細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限於，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在21另一個優選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈黴菌屬細胞。在本發明的實施中有用的鏈黴菌屬細胞包括但不限於，不產色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌、天藍鏈黴菌、灰色鏈黴菌和淺青紫鏈黴菌。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是不產色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是天藍鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈黴菌細胞。可通過如下方法實現將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)，使用感受態細胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823_829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209_221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742_751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5771—5278)。可通過如下方法實現將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈黴菌屬細胞例如原生質體轉化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，FoliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)，或轉導(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)。可通過如下方法實現將DNA引入到假單胞菌屬細胞，例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈球菌屬細胞，例如天然感受態(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.321295-1297)，原生質體轉化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68189-2070)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45409-436)。然而，可以使用任何已知的將DNA引入宿主細胞的方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優選的方面，宿主細胞是真菌細胞。「真菌」用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，於AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上)。在一個更優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。「酵母」用在本文包括產子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內孢黴目(Endomycetales))、產擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬於半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner，F.A.，Passmore,S.Μ.，禾口Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。在一個甚至更優選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍黴屬細胞。在一個最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是YarrowiaIipolytica細胞。在另一個更優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特徵在於由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它複雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵的。在甚至更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢黴屬、麴黴屬、短梗黴屬、煙管黴屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Cori0Ius)JIl球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質黴屬、梨孢菌屬、毛黴屬、毀絲黴屬、新考瑪脂黴屬、脈孢菌屬、擬青黴屬、青黴屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬/嗜熱黴屬、梭孢殼屬、彎頸黴屬、栓菌屬(Trametes)或木黴屬細胞。在一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴細胞。在另一個最優選方面，絲狀真菌宿主細胞是杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B譽角質金包子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、|￡金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質黴、疏棉狀腐質黴、米黑毛黴、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌、產紫青黴、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium),輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢黴、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴或綠色木黴細胞。可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用於轉化麴黴屬和木黴屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用於轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法轉化酵母=Becker和Guarente，於Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產生方法本發明還涉及用於產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優選的方面，所述細胞是腐質黴屬的細胞。在一個更優選的方面，所述細胞是特異腐質黴。在一個最優選的方面，所述細胞是特異腐質黴DSM1800。本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，其包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養如本文所述的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，其包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，該多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌到培養基中，其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本領域已知的對於所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用於測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發明還涉及植物，例如，轉基因植物、植物部分或植物細胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發明具有阿魏酸酯酶活性的多肽，從而以可回收的量表達和產生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收。或者，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用於改進食品或飼料的質量，例如，改進營養價值、適口性(palatability)和流變性質(rheologicalproperties)，或用於破壞抗營養因子。轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和穀類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是菸草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(calIus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細胞區室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)禾口細胞質(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什麼組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發明的應用的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含於本發明範圍內的還有這些植物、植物部分和植物細胞的後代。表達本發明多肽的轉基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構建。簡而言之，通過如下方法構建所述植物或植物細胞將編碼本發明多肽的一個或多個(幾個)表達構建體併入植物宿主基因組或葉綠體基因組，並且將所得的修飾植物或植物細胞繁殖為轉基因植物或植物細胞。表達載體便利地是包含編碼本發明多肽的多核苷酸的核酸構建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該多核苷酸序列所需的適當的調節序列可操作地連接。此外，表達構建體可以包含對於鑑定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了表達構建體和將該構建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(後者依賴於使用的DNA引入方法)。調節序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉運序列的選擇，舉例來說，基於期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發育、階段或組織特異性的，並且基因產物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調節序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對於組成性表達，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck等，1980,Cell21:285_294，Christensen等，1992,PlantMo.Biol.18:675_689；Zhang等，1991,PlantCell3:1155_1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊蓮和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863_878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885_889)，來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708_711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935_941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
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公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在TO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991_1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85_93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，Molecularandgeneralgenetics248:668_674)，或傷口誘導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573_588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理諸如溫度、乾旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤黴酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動子增強子元件也可以用於實現本發明多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內含子，其置於啟動子和編碼本發明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上文，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構建體的任何其它部分可以選自本領域內可得到的那些。將核酸構建體根據本領域已知的常規技術併入植物基因組，所述常規技術包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990，Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989,Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉移(genetransfer)，是產生轉基因雙子葉植物的優選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15_38)，而且它也可以用於轉化單子葉植物，雖然對於這些植物其他的轉化方法是常用的。目前，產生轉基因單子葉植物的優選的方法，是用粒子(用轉化DNA塗覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2275-281;Shimamoto,1994，CurrentOpinionBiotechnology5:158_162；Vasil等，1992，Bio/Technology10667-674)。轉化單子葉植物的可供選擇的方法是基於原生質體轉化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415_428所描述的。轉化之後，根據本領域熟知的方法選擇具有併入的表達構建體的轉化體並且再生成為完整植物。通常設計轉化方法用於通過如下方法在再生期間或在後續世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構建體的共轉化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發明還涉及用於產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養包含多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼本發明具有阿魏酸酯酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。去除或減少阿魏酸酯酶活性本發明還涉及用於產生親本細胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發明的26多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法導致在相同條件下培養時，與親本細胞相比突變的細胞產生較少的所述多肽。可以使用本領域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過減少或消除編碼本發明多肽的核苷酸序列的表達來構建突變細胞。在一個優選的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區或其對活性關鍵的部分，或表達編碼區所需的調節元件。這種調節或調控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達的部分。用於可能的修飾的其它調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子和轉錄激活子。可以通過向親本細胞施以誘變，並且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達減少或消除的突變細胞來進行核苷酸序列的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機的，可以通過例如使用合適的物理或化學誘變劑進行，通過使用合適的寡核苷酸進行，或通過將所述DNA序列進行PCR產生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進行誘變。適合於本發明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當使用這些試劑時，通常通過如下方法來進行所述誘變在合適條件下存在優選的誘變劑時溫育待誘變的親本細胞，並篩選和/或選擇顯示基因表達減少的或無基因表達的突變體細胞。通過導入、取代或去除基因中的一個或多個(幾個)核苷酸或其轉錄或翻譯所需的調控元件可以實現所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領域已知的方法通過定位誘變或PCR產生的誘變可以實現這種修飾或失活。儘管在理論上所述修飾可以在體內進行，即，直接在表達待修飾核苷酸序列的細胞上進行，但優選如下面所示例的那樣在體外進行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過細胞表達的便利方式的例子是基於基因取代，基因缺失，或基因破壞的技術。例如，在基因破壞方法中，將相應於內源核苷酸序列的核酸序列在體外進行誘變以產生缺陷性的核酸序列，隨後將其轉化入親本細胞中以產生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標記，其可用於選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉化子。在一個特別優選的方面，用可選擇的標記(如本文所述的那些)來破壞所述核苷酸序列。或者，可以使用與所述核苷酸序列互補的序列通過確定的反義或RNAi技術來進行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導入與所述基因的核苷酸序列互補的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細胞的表達，所述序列可以在細胞中轉錄並且能夠與細胞中產生的mRNA雜交。在允許所述互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質的量。本發明進一步涉及親本細胞的突變體細胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調控序列的破壞或缺失，這導致與親本細胞相比突變體細胞產生更少的多肽或不產生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細胞作為表達天然和/或異源多肽的宿主細胞特別有用。所以，本發明進一步涉及生產天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有益於生產多肽的條件下培養突變細胞；和(b)回收所述多肽。術語「異源多肽」在本文中定義為對宿主細胞不是天然的多肽，進行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過重組DNA技術對宿主細胞操作的結果其表達在量上改變的天然蛋白。在另一方面，本發明涉及通過發酵可產生本發明的多肽以及目標蛋白產物的細胞來生產基本上無阿魏酸酯酶活性的蛋白質產品的方法在發酵之前、過程中或發酵完成之後向發酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制阿魏酸酯酶活性的試劑，從發酵液中回收目標產物，並且任選地將回收的產物進行進一步純化。在另一方面，本發明涉及如下生產基本上無阿魏酸酯酶活性的蛋白質產品的方法在允許產物表達的條件下培養細胞，將得到的培養液進行組合的PH和溫度處理以基本上減少阿魏酸酯酶活性，和從發酵液中回收產物。或者，可以將從培養液回收的酶製備物進行組合的PH和溫度處理。所述組合的pH和溫度處理可任選地與阿魏酸酯酶抑制劑處理組合使用。依照本發明的這個方面，可能去除至少60%，優選至少75%，更優選至少85%，還更優選至少95%，並且最優選至少99%的阿魏酸酯酶活性。可使用此方法獲得阿魏酸酯酶活性的完全去除。組合的pH和溫度處理優選在2-4或9-11範圍內的pH和至少60_70°C範圍內的溫度進行一段足夠的時間以達到期望的效果，通常30至60分鐘是足夠的。用於培養和純化感興趣的產物的方法可以通過本領域已知的方法進行。用於產生基本上無阿魏酸酯酶的產物的本發明的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質例如酶的產生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，澱粉分解酶(anxiolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細胞壁降解酶。這些酶的實例包括氨肽酶、澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質酶(chitinase)、角質酶(cutinase)、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商素過氧化酶、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。阿魏酸酯酶缺陷細胞也可以用於表達在製藥上引起興趣的異源蛋白質如激素、生長因子、受體等。可理解的是術語「真核多肽」不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過胺基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強活性、熱穩定性、PH耐受性等。在另外的方面，本發明涉及基本上無阿魏酸酯酶活性的蛋白質產物，其通過本發明的方法產生。抑制具有阿魏酸酯酶活性的多肽表達的方法本發明還涉及抑制多肽在細胞中表達的方法，其包括對細胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或者在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包含本發明多核苷酸的亞序列。在一個優選的方面，dsRNA是長約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更長的雙鏈體核苷酸。dsRNA優選是小幹擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個優選的方面，dsRNA是用於抑制轉錄的小幹擾RNA(SiRNA)。在另一個優選的方面，dsRNA是用於抑制翻譯的微RNA(miRNA)。本發明還涉及用於抑制細胞中多肽表達的這些雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的部分。雖然本發明不受到任何特定作用機制的限制，但dsRNA能進入細胞，並引起相似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括內源mRNA。當細胞接觸dsRNA時，來自同源基因的mRNA選擇性地受到稱為RNA幹擾(RNAi)的過程的降解。本發明的dsRNA可以用於基因沉默療法。在一個方面，本發明提供使用本發明的dsRNAi選擇性地降解RNA的方法。所述過程可以在體外、在活體外(exvivo)或在體內進行。在一個方面，dsRNA分子能夠用於產生細胞、器官或動物中的功能缺失突變(loss-of-functionmutation)。製備或使用選擇性降解RNA的dsRNA分子的方法在本領域中公知，參見，例如，美國專利號6，506，559；美國專利號6，511，824；美國專利號6，515，109；和美國專利號6，489，127。組合物本發明還涉及包含本發明的多肽的組合物。優選地，所述組合物富含這種多肽。術語「富含」表示所述組合物的阿魏酸酯酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(enrichmentfactor)±曾力口。所述組合物可以包含本發明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物。或者，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、滷素過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽穀氨醯胺酶(ρ印tidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。可以通過例如屬於以下屬或種的微生物產生其它酶麴黴屬，優選棘孢麴黴、泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴；鐮孢屬，優選杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質黴屬，優選特異腐質黴或疏棉狀腐質黴；或木黴屬，優選哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴或綠色木黴。可以依照本領域內已知的方法製備多肽組合物，並且可以是液體或幹組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本領域內已知方法將包括於所述組合物中的多肽穩定化。下面給出的是本發明多肽組合物的優選的用途的實例。本發明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基於本領域內已知的方法確定。用途本發明還涉及用於使用具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法。本發明的多肽能用於降解或修飾植物細胞壁或來自植物細胞壁的任何含木聚糖材料。各種用途的實例如下所述(其它用途參見，WO2002/18561)。本發明的多肽的劑量和使用該製備物的其它條件可以基於本領域內已知的方法確定。通過完全或部分去除側分支可以促進木聚糖的酶法降解。在降解木聚糖的過程中，本發明的多肽優選與其它木聚糖降解酶組合使用，如木聚糖酶、乙醯木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和它們的組合。例如，可以由乙醯木聚糖酯酶去除乙醯基團；由α-阿拉伯糖苷酶去除阿拉伯糖基團；由阿魏酸酯酶去除阿魏醯基，並由α-葡糖醛酸糖苷酶去除葡糖醛酸基團。由木聚糖酶，或木聚糖酶和側分支水解酶的組合釋放的寡聚物可進一步由木糖苷酶降解成游離木糖。本發明的多肽優選是組合物的組分，所述組合物包含一種或多種(幾種)木聚糖降解酶，特別是木聚糖酶。在下述各種用途中，本發明的多肽優選與一種或多種(幾種)木聚糖降解酶組合使用。因此，本發明還涉及用於降解含木聚糖材料的方法，其包括用這種具有阿魏酸酯酶活性的多肽處理含木聚糖材料。在一個優選的方面，進一步用木聚糖降解酶處理含木聚糖材料。木聚糖降解酶選自下組木聚糖酶，乙醯木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，和它們的組合。可以降解植物細胞以促進不同類型的處理，促進木聚糖之外的組分的純化或提取，如從穀類純化β_葡聚糖或β_葡聚糖寡聚體，提高飼料價值，降低水結合容量，提高廢水裝置中的降解能力，促進轉化，例如草和玉米轉化成青貯飼料，等。本發明的多肽可以用於各種植物細胞壁來源材料或廢料的酶法水解，例如，來自造紙的廢料，或者農業殘餘物如麥秸，玉米穗軸、玉米纖維、全玉米植物、乾果殼、草、植物皮殼、豆莢，酒糟、糖甜菜粕等。多肽還可以用於修飾植物細胞壁來源物質的粘度。例如，多肽可以用於降低含木聚糖材料的粘度，促進粘性含木聚糖材料的加工，如在小麥分離中。本發明的多肽還與有限活性的其它木聚糖分解酶一起使用以降解木聚糖，產生寡糖。寡糖可用作膨脹劑，如從穀類細胞壁物質釋放的阿拉伯木聚糖寡糖，或者來自穀類的或多或少經過純化的阿拉伯木聚糖。本發明的多肽還可以與其它木聚糖分解酶組合使用，以將木聚糖降解成木糖和其它單糖(美國專利5，658，765)。釋放的木糖可以轉化成其它化合物。本發明的多肽還可以用於木質纖維素生物質降解或轉化成可發酵糖中，以產生，例如，燃料、飲用乙醇和/或發酵產品(例如，酸、醇、酮、氣體等)。多肽優選與其它木聚糖降解酶和纖維素酶組合物(內切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶)組合使用。本發明的多肽可以與其它酶如葡聚糖酶一起使用，以促進從富含油的植物物質提取油，如從玉米胚提取玉米油。本發明的多肽還可以在烘培中使用，以提高麵團的發麵、彈性和/或穩定性和/或烘培產品的體積、團粒結構和/或保鮮性質。多肽可以用於製備麵團或者從任何類型的麵粉或粉(例如，基於小麥、黑麥、大麥、燕麥或玉蜀黍)製備的烘培產品。用本發明的多肽製備的烘培產品包括麵包、麵包卷、小艇餡餅(baquettes)等。為了烘培，本發明的多肽可以用作唯一或主要酶活性，或者可以與其它酶如木聚糖酶、脂肪酶、澱粉酶、氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，過氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶組合使用。本發明的多肽還可以用於動物飼料的修飾，並且可以在體外(通過修飾飼料的組分)或體內發揮作用。可以向包含大量阿拉伯木聚糖和葡糖醛酸木聚糖的動物飼料組合物中加入多肽，例如，包含穀類如大麥、小麥、黑麥、燕麥或玉蜀黍的飼料。在加入飼料時，多肽將促進植物細胞壁材料的體內分解，一部分是由於腸粘度下降(Bedford等，1993，Proceedingsofthe1stSymposiumonEnzymesinAnimalNutrition，pp.73—77)，從30而實現動物對植物營養成分的利用得到改善。因此，動物的生長速率和/或飼料轉化比例(即，消化的飼料的重量相對於增重的比例)提高。本發明的多肽還可以用於紙和紙漿工業，尤其是在漂白過程中用於增加漂白紙漿的亮度，從而降低漂白階段使用的氯的量，並增加循環紙過程中紙漿的游離度(Eriksson，1990,WoodScienceandTechnology24:79_101；Paice等，1988,Biotechnol.andBioeng.32:235-239，和Pommier等，1989，TappiJournal187-191)。此外，多肽可以用於含木質纖維素紙漿的處理，從而提高其漂白能力。木質纖維素紙漿的處理可以，例如，如美國專利No.5，658，765、WO93/08275、WO91/02839和W92/03608中所述進行。本發明的多肽還可以用於啤酒釀造中，特別是可增加包含，例如，大麥和/或高粱麥芽的麥芽汁的過濾能力(W02002/24926)。多肽可以以與常規用於釀造的戊聚糖酶相同的方式使用，例如，如ViStor等，1993，J.Inst.Brew.99:243_248和EP227159所述。此外，多肽可以用於處理釀酒酒糟，即，啤酒麥芽汁生產的殘餘物，其中包含大麥或發芽大麥或其它穀類，從而促進殘餘物的利用，例如，用作動物飼料。本發明的多肽可以用於分離植物細胞壁材料的組分，特別是穀物組分如小麥組分。特別關注的是將小麥分離成谷蛋白/麵筋(gluten)和澱粉，即，具有可觀商業利益的組分。所述分離工藝可通過使用本領域已知方法進行，方便地為作為水力旋流(hydroclone)或傾析工藝進行的所謂打糊(batter)工藝(或溼磨工藝)。在所述打糊工藝中，起始材料為待進行分離的植物材料(如小麥)的稀釋的可泵送的分散液。在小麥分離工藝中，所述分散液通常由小麥粉與水製得。本發明的多肽還可以用於製備水果或蔬菜汁以增加產量。本發明的多肽還可以用作用於紡織品的酶法煮煉(scouring)系統的組分。本發明的多肽還可以與其它酶功能組合用於洗衣洗滌劑應用。信號月太本發明還涉及核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼蛋白質的基因，該基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDNO:2的胺基酸1至18或由SEQIDNO2的胺基酸1至18組成，其中所述基因對於核苷酸序列是外源的。在一個優選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至54，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至54組成。本發明還涉及包含這種核酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發明還涉及用於產生蛋白質的方法，包括(a)在適合於產生所述蛋白質的條件下培養這樣的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。所述蛋白質對於宿主細胞可以是天然的或異源的。術語「蛋白質」在本文的意思不是指特定長度的編碼產物，並且因此包含肽、寡肽和蛋白質。術語「蛋白質」還包含組合以形成編碼產物的兩種或兩種以上多肽。所述蛋白質還包括雜合多肽，其包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的蛋白質獲得，其中一個或多個(幾個)對於宿主細胞可以是異源或天然的。蛋白質進一步包括上述蛋白質和雜合蛋白質天然存在的等位基因變異和工程的變異。優選蛋白質是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報告蛋白(reporter)。在一個更優選的方面，所述蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構酶或連接酶。在一個甚至更優選的方面，所述蛋白質是氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。基因可以從任何原核、真核或其它來源獲得。通過以下實施例進一步對本發明進行描述，但不應將其理解為對本發明範圍的限制。實施例材料作為緩衝液和底物使用的化學品是至少試劑等級的商業產品。菌株將特異腐質黴DSM1800用作編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽的家族CEl基因的來源。黑麴黴MBinl20菌株(W02004/090155)用於表達編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽的特異腐質黴基因。培養基PDA平板由每升39g馬鈴薯右旋糖瓊脂組成。YP培養基由每升IOg酵母提取物和20g細菌用蛋白腖組成。COVEA脲-乙醯胺+平板由每升20mlCOVEA鹽溶液，220g山梨醇，IOg葡萄糖，IOmlIM乙醯胺和30g細菌用瓊脂；pH5.2組成。COVEA鹽溶液由每升26gKCl、26gMgSO4、76gKH2PO4和50mlCOVEA痕量元素溶液組成。Cove痕量元素溶液由每升0.04gNa2B4O7·10Η20、0·4gCuSO4·5Η20、1·2gFeSO4·7Η20、0·7gMnSO4·H20,0.8gNa2MoO2·2H20和IOgZnSO4·7H20組成。M410培養基由每升50g麥芽糖，50g葡萄糖，2gMgSO4·7H20，2gKH2PO4,4g檸檬酸酐粉末，8g酵母提取物，2g脲，0.5gAMG痕量金屬溶液，和0.5gCaCl2；pH6.0組成。AMG痕量金屬溶液由每升14.3gZnSO4·7Η20，2·5gCuSO4·5Η20，0·5gNiCl2·6Η20，13.8gFeSO4·7Η20，8·5gMnSO4·7Η20，和3g檸檬酸組成。LB培養基由每升IOg胰蛋白腖、5g酵母提取物和5g氯化鈉組成。實施例1特異腐質黴阿魏酸酯酶的鑑定N-末端蛋白質測序。根據製造商建議的條件，在CRITERI0N8_16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)上分離包含推定的酯酶的20μ1ULTRAFL0L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)。使用PRECISIONPLUSPROTEIN標準品(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)作為分子量標記物。在配備有Trans-Blot轉化池的CRITERION凝膠設備(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)上，以100伏特，使用10%甲醇，pH11.0中的10MCAPS(3-[環己基氨基]-1-丙烷磺酸)，歷時2小時，將蛋白質樣品從SDS-PAGE凝膠電印跡在PVDF膜(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上。用40%甲醇/1%乙酸中的0.1%考馬斯藍R-250將膜染色20秒鐘，並在50%甲醇中脫色以觀察蛋白質條帶。切下30kDa的蛋白質條帶並測序。根據製造商建議的規程，使用具有在線毛細管HPLC和液相三氟乙酸(TFA)傳遞的PROCISE494蛋白質測序儀(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)進行肽和蛋白質的N-末端測序。通過在線毛細管HPLC，用在450ml的溶劑A3和B2(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)中的9ml包含乙酸、乙酸鈉和己烷磺酸鈉的PREMIX濃縮物(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)完成乙內醯苯硫脲-胺基酸的檢測，其中溶劑A3包含在水中的3.5%四氫呋喃，而溶劑B2包含乙腈/2-丙醇。用AppliedBiosystems610數據分析軟體2.Ia版(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)，用MACINTOSHG4處理器收集並分析數據。通過在光源下顯示層析圖而進行序列測定。N-末端確定為Ala-Ser-Leu-Gln-Gln-Val-Trp-Asn-Trp-Gly-Ala-Asn-Pro(SEQIDNO2的胺基酸19至31)。ULTRAFL0L的蛋白質分級。首先使用HIPREP26/10脫鹽柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ,USA)，將ULTRAFL0L的2ml等分試樣緩衝液交換入含150mM氯化鈉的20mM乙酸鈉pH5中。然後使用以具有3，000道爾頓分子量截留膜的VIVASPIN20離心柱(VivascienceAG,Hannover,Germany)的超濾，將得到的緩衝液交換的物質(18.5ml)濃縮至3ml。然後在HIL0AD26/60SUPERDEX200製備級大小排阻柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)上通過大小排阻層析，用相同的緩衝液等度洗脫來分級經過緩衝液交換和濃縮的ULTRAFL0L材料的2ml等分試樣。將在280nm顯示出UV吸光度的級分合併成來自不同洗脫時間的六個單獨的匯集物，每個匯集物的總體積為20-40ml。使用以具有3，000道爾頓分子量截留膜VIVASPIN20離心柱超濾，將匯集的級分濃縮至l_5ml。根據製造商建議的條件，在CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠上分離每個濃縮的匯集級分的20μ1。使用PRECISIONPLUSPROTEIN標準品作為分子量標記物。從盒中去除凝膠，並用考馬斯藍(G250)蛋白質染料(BIO-SAFECoomassieStain,Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules，CA，USA)染色，並且用剃刀刀片切下可見條帶，用於蛋白質鑑定分析。用於肽測序的多肽凝膠內消化。使用MULTIPROBEIILiquidHandlingRobot液體操作機器人(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA,USA)進行凝膠內消化。在IOOmM碳酸氫銨pH8.0中用50μ1IOmM二硫蘇糖醇(DTT)還原30kDa蛋白質凝膠條帶30分鐘。還原後，在IOOmM碳酸氫銨pH8.0中用50μ155mM碘乙醯胺將凝膠塊烷基化20分鐘。使乾燥的疑膠塊在室溫在25μ1胰蛋白酶消化溶液中膨脹30分鐘，所述溶液包含6ng測序級胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)每μ50mM碳酸氫銨pH8，然後在40°C消化8小時。上述每個反應步驟之後都用合適的溶液按照製造商的標準規程，進行多次洗滌和預洗滌。使用50μ1乙腈在反應之間使凝膠塊脫水，並且在各步驟之間將凝膠塊風乾。用甲酸/2%乙腈在HPLC級水中兩次提取肽30分鐘。將肽提取溶液轉移至96孔有邊的PCR型板(ABGene,Rochester,NY,USA)，其已經冷卻至10_15°C，並用96孔板蓋(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA,USA)覆蓋以防止蒸發。進一步在4°C保存板直至可進行質譜分析。蛋白質鑑定。對於串聯質譜進行的從頭肽測序，使用Q-T0FMICR0(WatersMicromassMSTechnologies,Milford,MA,USA)，一種混合的正交四柱時間飛行質譜儀進行LC/MS/MS分析。Q-T0FMICR0可以使用MASSLYNX軟體4.1版完全由微處理器控制(WatersMicromassMSTechnologies，Milford，MA，USA)。Q-T0FMICR0配備有ULTIMATE毛細管和納米流HPLC系統，其與FAM0S微型自動取樣器和SWITCHOSII柱切換設備(LCPackings/Dionex,Sunnyvale,CA,USA)偶聯，用於濃縮和使樣品脫鹽。將樣品載入到配置在進樣環中的保護柱(300μmIDX5cm,PEPMAPC18)，並使用SwitchosII泵以0.1%甲酸水溶液以40μ1每分鐘洗滌2分鐘。在75μπιIDX15cm，C18,3μm,IOOA,PEPMAP納米流融合毛細管柱(LCPackings,SanFrancisco,CA,USA)上，使用NAN-75校準器(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)以來自175μ1/分鐘的分流的175nl/分鐘的流速分離肽。在45分鐘的間隔中應用0.甲酸中的5%至80%乙腈的分步洗脫梯度。在215nm監測柱洗脫液，並通過配有納米噴霧界面的電子噴霧離子源將洗脫液導入Q-TOFMICRO中。以探測掃描模式獲取數據，m/z的質量範圍為400-1990，將針對MS的標準切換至MS/MS以包括高於10.0次計數每秒的離子強度，並且電荷狀態為+2、+3和+4。可以1.9秒的掃描時間和0.1秒的掃描間隔時間獲得多達4種共洗脫物質的分析光譜。通常使用45伏特的錐孔電壓，並且對碰撞能量編程以根據洗脫肽的質量和電荷狀態而變化，並且在10-60伏特的範圍內。合併獲取的光譜，平滑處理，並以自動的方式放在中央，並產生峰列表。使用PR0TEINLYNX全局伺服器2.2.05軟體(WatersMicromassMSTechnologies,Milford,MA,USA)和PEAKSStudio4.5版(SPl)(BioinformaticSolutionsInc.，Waterloo,Ontario,Canada)針對所選資料庫搜索峰列表。評價來自PR0TEINLYNX和PEAKSStudio搜索的結果，並進一步通過評價每個目的離子的MS/MS光譜而分析未鑑定蛋白質，並且通過鑑定y和b離子系列和將質量差異與合適的胺基酸相匹配來確定從頭序列。從凝膠內消化的30kDa多肽凝膠條帶的幾個多電荷離子獲得肽序列。將514.772m/z序列的二電荷胰蛋白酶肽確定為Asn-Ser-Tyr-Pro-Gly-Tyr-[Asp/Asn]-Gly-Arg(SEQIDNO:2的胺基酸195至203)。將516.33lm/z序列的三電荷胰蛋白酶肽離子確定為[Ile/Leu]-Gly-His-Ala-Pro-Ala-Val-Asp-Glu-[Gln/Lys]-[Gln/Lys]-Leu-Leu-Arg(SEQIDNO2的胺基酸269至282)。將516.33lm/z序列的另一個三電荷胰蛋白酶肽離子確定為Met-[Gln/Lys]-[Ile/Leu]-Val-His-Gly-[Ile/Leu]-[Gln/Lys]-Asp-Phe-[Ile/Leu]-Val-Arg(SEQIDNO2的胺基酸207至219)。將540.305m/z序列的二電荷胰蛋白酶肽離子確定為Pro-[Gln/Lys]-Cys(a)-Gly-Tyr-Glu-Ala-Leu-Lys(SEQIDNO2的胺基酸220至228)。Cys(a)是半胱氨酸丙烯醯胺，來自SDS-PAGE的人工產物。[Ile/Leu]和[Gln/Lys]不能區分，因為它們的質量相當。實施例2特異腐質黴DSM1800基因組DNA提取特異腐質黴DSM1800在45°C在PDA平板上生長至匯合(confluence)。從PDA平板切下4mm2方塊，接種到包含25mlYP培養基的帶擋板125ml搖瓶中，所述培養基包含2%葡萄糖，並在41°C在200rpm振蕩溫育2天。使用MIRACLOTH(Calbiochem,LaJolla,CA,USA)通過過濾富集菌絲，在去離子水中洗滌兩次，並在液氮下冷凍。用研缽和杵，將冷凍菌絲磨成細粉，並使用DNEASYPlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)分離總DNA。實施例3從特異腐質黴DSM1800分離阿魏酸酯酶基因的部分片段使用共有-簡併雜合寡核苷酸引物程序(C0DEH0P；Rose等，1998，NucleicAcidsResearch26:1628_1635)，根據實施例1中所述的已鑑定肽片段，設計如下所示的簡併引34物，其具有與相關的阿魏酸酯酶序列同源的區域。弓丨物FAEsenseF5'-CARCARGTNTGGAAYTGGGGNGC-3『(SEQIDNO3)簡併引物FAEsensF的蛋白質翻譯QQVffNWG引物HiFAE-degR5'-GGCGGCGGCCGTCRTANCCNGGRTA-3『(SEQIDNO4)簡併引物HiFAE-degR的蛋白質翻譯YPGYDGRR為了獲得特異腐質黴阿魏酸酯酶基因的初始DNA片段，在40°C-60°C中的六個不同退火溫度進行梯度PCR。擴增反應物(25μ1)包括作為模板的80ng特異腐質黴DSM1800基因組DNA,dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,引物FAEsenseF和引物HiFAE-degR#50pmol,IXADVANTAGEGC-MeltLA(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA)，和1.25單位ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.，Westbury，NY,USA)進行擴增，程序為在95°C預變性1分鐘；30個循環，每個循環為95°C變性30秒，50°C+/_10°C退火30秒(6個梯度選擇)並在72°C延長1分鐘；並在72°C最終延長6分鐘。在TBE(10.8gTris鹼，5.5g硼酸和4ml0.5MEDTApH8.0每升)緩衝液中，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物。從凝膠切除來自56°C退火溫度的約700bp的PCR產物條帶，根據製造商的說明，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)純化，並使用染料-終止子化學(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods3847-60)和引物步移，用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動化DNA測序儀(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems,Inc.，FosterCity,CA,USA)測序。獲得部分序列，其編碼實施例1中鑑定的肽片段，並用於設計簡併引物。實施例4全長特異腐質黴阿魏酸酯酶基因的鑑定根據製造商的說明，使用GEN0MEWALKER通用試劑盒(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)鑑定來自特異腐質黴DSM1800的全長阿魏酸酯酶基因。簡而言之，分別用四種可留下平末端的不同的限制性酶(DraI，EcoRV,PvuII和StuI)消化來自特異腐質黴DSM1800的總基因組DNA。然後分別將每批消化的基因組DNA與GEN0MEWALKER銜接頭(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)連接以產生四個文庫。然後將這四個文庫作為PCR反應中的模板，使用如下所示的基因特異性引物，其中兩個用於編碼阿魏酸酯酶的N-末端的5』末端片段上遊的一級和二級PCR擴增，另兩個用於編碼阿魏酸酯酶的C-末端的3』末端片段下遊的一級和二級PCR擴增。根據從如實施例3中所述獲得的特異腐質黴的部分阿魏酸酯酶基因序列，設計下述引物。N-末端引物Hins_FAE_GSPl_Rl(—級)5'-CATGGCATGGCGAGCAGGGCATTGCTT-3『(SEQIDNO5)引物Hins_FAE_GSP2_Rl(二級)5'-GCGGTCCGGCACATAGATGTGGAACTG-3『(SEQIDNO6)35C-末端引物Hins_FAE_GSPl_Fl(—級)5'-GGAGCCATTCTTCGGCGGGATATTGGG-3『(SEQIDNO7)引物Hins_FAE_GSP2_Fl(二級)5'-TATCAAATCATGCGGCGCGACTAACCG-3『(SEQIDNO8)一級擴增物在25μ1終體積中包括作為模板的1μ1(約6ng)各個文庫，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,IOpmol銜接頭引物(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA),50pmol弓丨物Hins_FAE_GSPl_Rl或Hins_FAE_GSPl_Fl，IXADVANTAGEGC-MeltLA緩衝液(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)，和1.25單位ADVANTAGE,GC基因組聚合酶混合物。使用EPPEND0RFMASTERCYCLER5333進行N-末端擴增，程序為在95°C預變性1分鐘；7個循環，每個循環為95°C變性25秒；在72°C退火併延伸5分鐘；和32個循環，每個循環為95°C變性25秒；在67°C退火併延伸5分鐘；和在67°C最終延伸7分鐘。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進行C-末端擴增，程序為在95°C預變性1分鐘；5個循環，每個循環為在95°C變性25秒；在72°C退火併延伸5分鐘；和7個循環，每個循環為在95°C變性25秒；在72°C退火併延伸5分鐘；和32個循環，每個循環為在95°C變性25秒；在67°C退火併延伸5分鐘；和在67°C最終延伸7分鐘。二級擴增物在25μ1終體積中包括作為模板的1μ1各個一級PCR產物，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,IOpmol銜接頭引物2(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA),50pmol引物Hins_FAE_GSP2_Rl或Hins_FAE_GSP2_Fl，IXADVANTAGEGC-MeltLA緩衝液(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)，和1.25單位ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER.5333進行擴增，程序為在95°C預變性1分鐘；5個循環，每個循環為在95°C變性25秒；在72°C退火併延伸5分鐘；和20個循環，每個循環為在95°C變性25秒；在67°C退火併延伸5分鐘；和在67°C最終延伸7分鐘。在TBE緩衝液中通過1.O%瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物。由5』末端PCR擴增，分析3個產物條帶來自DraI文庫的600bp產物條帶，來自EcoRV文庫的Ikb產物條帶，和來自PvuII文庫的2.5kb產物條帶。從凝膠切除這3個產物條帶，根據製造商的說明，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化，並測序。由3』末端PCR擴增，分析3個產物條帶來自EcoRV文庫的650bp產物條帶，來自PvuII文庫的400bp產物條帶，和來自StuI文庫的1.3kb產物條帶。從凝膠切除這3個產物條帶，根據製造商的說明，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化，並測序。使用染料-終止子化學(Giesecke等，1992，見上文)和引物步移策略，用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動化DNA測序儀進行PCR片段的DNA測序。使用銜接頭引物2、引物Hins_FAE_GSP2_Rl，引物Hins_FAE_GSP2_Fl，和引物SeqFAENtermanti(如下所示)測序。弓丨物SeqFAENtermanti5'-GCTTTACTGCCATCGCAGGGCATTCCA-3『(SEQIDNO9)審核核苷酸序列數據的質量，並在PHRED/PHRAP軟體(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)的協助下將所有序列互相比較。將PCR片段序列結果與如實施例3中所述獲得的特異腐質黴的部分阿魏酸酯酶基因序列比較並比對。根據本實施例和實施例3中獲得的基因片段構建基因模型，允許用其它同源阿魏酸酯酶確定基因的5』和3』末端。實施例5克隆特異腐質黴阿魏酸酯酶基因並構建黑麴黴表達載體設計如下所示的兩個合成寡核苷酸引物以從實施例2中製備的基因組DNAPCR擴增特異腐質黴阿魏酸酯酶基因。使用InFusion克隆試劑盒(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)將片段直接克隆入表達載體pBM120a(W02006/078256)。HinsFAEBDsenseNCO5'-ACACAACTGGCCATGCGTTTCTCGACCATCCTCTCG-3'(SEQIDNO10)HinsFAEBInfantiPAC5'-CAGTCACCTCTAGTTATTAGATAAGCCTGAAGAACC-3'(SEQIDNO11)黑體字代表編碼序列。其餘序列與pBM120a的插入位點同源。在PCR反應物中各使用五十皮摩爾上述引物，所述PCR反應物在25μ1終體積中包括80ng特異腐質黴基因組DNA，IXADVANTAGEGC-MeltLA緩衝液，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,和1.25單位ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER.5333進行擴增，程序為在94°C1分鐘的1個循環；30個循環，每個循環為在94°C30秒，58°C30秒，和70°C90秒；和在70°C最終延伸5分鐘。然後加熱塊進入4°C浸泡循環。在TBE緩衝液中通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物，其中從凝膠切除約1.0-1.Ikb的產物條帶，並且根據製造商的說明，使用QIAQUICK.凝膠提取試劑盒純化。用NcoI和PacI消化質粒pBM120a，在TBE緩衝液中通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，並根據製造商的說明，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化。使用InFusion克隆試劑盒將基因片段和消化載體連接在一起，得到pMMarS(圖2)，其中阿魏酸酯酶基因在黑麴黴中性α-澱粉酶和米麴黴丙糖磷酸異構酶(NA2_tpi啟動子)的啟動子雜合體的控制下轉錄。連接反應物(20μ1)包括1XInFusion緩衝液(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)，IXBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)，1μ1InFusion酶(110稀釋)(BDBiosciences,PaloAlto，CA，USA)，106ng用NcoI和PacI消化的pBM120a，和96ng純化的特異腐質黴PCR產物。在室溫溫育反應物30分鐘。根據製造商的說明，使用兩微升反應物轉化大腸桿菌XLlOS0L0PACK.Gold超感受態細胞(stratagene,LaJolla,CA,USA)。通過限制性消化檢測包含pMMar8的大腸桿菌轉化體，並使用BI0R0B0T9600(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)製備質粒DNA。使用染料-終止子化學(Giesecke等，1992，見上文)和引物步移策略，通過用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動化DNA測序儀測序而確認pMMar8中的特異腐質黴阿魏酸酯酶基因插入。使用如下所示的引物996271Na2tpi正向啟動子和引物996270AMG反向測序996271Na2tpi正向啟動子5'-ACTCAATTTACCTCTATCCACACTT-3『(SEQ.IDNO12)996270AMG反向5'-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT-3『(SEQ.IDNO13)將包含pMMar8的克隆挑進補加100μg氨苄青黴素每ml的2X50mlLB培養基中，並在37°C在200rpm振蕩在250ml玻璃燒杯中過夜生長。按照製造商的說明，使用QIAGEN小型試劑盒分離質粒pMMar8。用PmeI消化質粒pMMar8，在TBE緩衝液中用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，並根據製造商的說明，在製備中使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化包含阿魏酸酯酶基因的片段，用於轉化黑麴黴Mbinl20原生質體。使用Τ0Ρ0TA克隆試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)將相同的1.0-1.IkbPCR片段克隆進pCR2.l-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)以產生pHinsFAEBl(圖3)。通過DNA測序確認pHinsFAEBl中的特異腐質黴阿魏酸酯酶插入。於2007年11月20日將大腸桿菌pHinsFAEBl保藏於農業研究機構專利培養物保藏中心，北區研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)。實施例6編碼CEl家族阿魏酸酯酶的特異腐質黴基因組序列的表徵審核核苷酸序列數據(實施例5)的質量，並在PHRED/PHRAP軟體(UniversityofWashington,Seattle,WA，USA)的協助下將所有序列互相比較。核苷酸序列(SEQIDNO1)和推定的胺基酸序列(SEQIDNO2)如圖1所示。基因組片段編碼291個胺基酸的多肽，中間插入2個預測的內含子，分別為73和108個鹼基對。全長編碼序列和成熟編碼序列的％G+C含量分別為62.9%和62.5%。使用SignalP軟體程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1-6)預測信號肽為18個殘基。預測的成熟蛋白質包含273個胺基酸，分子量為31.9kDa。預測的多聚羥基丁酸解聚酶結合域出現在胺基酸36至248。基於推定的胺基酸序列，根據Coutinho和Henrissat，1999，見上文，阿魏酸酯酶落入糖酯酶家族CE1。使用如在EMBOSS的Needle程序中所實施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上文)及缺口開放罰分10、缺口延伸罰分0.5和EBL0SUM62矩陣來確定胺基酸序列的比較配對全局比對。比對顯示，特異腐質黴家族CEl阿魏酸酯酶基因的成熟多肽的推定胺基酸序列與粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶B(UniProt登錄號Q9HGR3)的推定胺基酸序列具有68.3%的同一性(缺口除外)。實施例7黑麴黴MBinl20中特異腐質黴家族CEl阿魏酸酯酶的轉化和表達在黑麴黴MBinl20中表達特異腐質黴CEl家族阿魏酸酯酶基因。根據Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419_1422的方法製備黑麴黴MBinl20原生質體。使用三微克PmeI消化的pMMar8轉化黑麴黴MBinl20。用由PmeI消化的pMMar8轉化黑麴黴MBinl20得到13個轉化體。將這些轉化體分離到各個COVEA脲-乙醯胺+平板。從13個轉化體的匯合COVEA脲-乙醯胺+平板剪切兩個3mm2瓊脂塊，並單獨接種到125ml塑料搖瓶中的25mlM410培養基中，並在34°C在250rpm振蕩溫育。溫育5天後，根據製造商的說明，在CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠上用CRITERION細胞(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)分析各個培養物的6μ1上清。用ΒΙΟ-SAFE考馬斯染料將得到的凝膠染色。培養物的SDS-PAGE譜顯示，3個轉化體具有約30kDa的條帶。進行第二次轉化得到另外15個轉化體。通過相同的過程分析這些轉化體，並且，一個轉化體，即黑麴黴MMar206，顯示約30kDa的家族CEl阿魏酸酯酶基因的表達。黑麴黴MMar206在COVEA脲-乙醯胺+平板上在34°C生長至匯合。將五個3mm2瓊脂塊放在2.8升搖瓶中的包含2%葡萄糖的4X500mlYP中，在34°C以250rpm振蕩生長，並在4天後收穫。在3000Xg離心全部培養液以去除生物質。將上清無菌過濾並在5至10°C保存。實施例8特異腐質黴家族CEl阿魏酸酯酶(FAEB)的純化首先將在黑麴黴MBinl20宿主中表達重組特異腐質黴阿魏酸酯酶的搖瓶培養液上清(實施例7)緩衝液交換入20mMTris-HClpH8中，並使用PallFiltron切線流過濾系統濃縮，所述系統包括UltrapumpII，ULTRARESERVOIR5L，和截留分子量為5000Da的ULTRASETTE5KOmega切線流濾膜(PallCorporation,EastHills，NY，USA)。然後使用以20mMTris-HClpH8平衡的20mlMEPHYPERCEL樹脂(PallCorporation,EastHills,NY,USA)通過用IOOmM乙酸鈉pH4.5洗脫來純化所得的緩衝液交換材料(129ml)。收集用IOOmM乙酸鈉pH4.5洗脫的級分，並匯集在280nm有UV吸光度的級分(45ml)。然後根據製造商建議的條件，使用CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠分離7.5μ1匯集的部分。使用PRECISIONPLUSI3ROTEINtm標準品作為分子量標記物。用INSTANTBLUE考馬斯藍蛋白質染料(ExpedeonProteinSolutions,Cambridge,UK)將凝膠染色。在28kDa和30kDa可見兩條條帶，對應於純化的特異腐質黴阿魏酸酯酶蛋白質。根據製造商建議的條件，用PNGaseF(NewEnglandBiolabs,Ipswich,ΜΑ,USA)將特異腐質黴阿魏酸酯酶的3μ1等分試樣去糖基化。根據製造商建議的條件，使用CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠分離得到的材料和對照，對照中用水代替PNGaseF。使用PRECISIONPLUSPROTEIN標準品作為分子量標記物。用考馬斯藍G250蛋白質染料將凝膠染色。對照顯示28kDa和30kDa的條帶，而用PNGaseF去糖基化的樣品表現出27kDa的單條帶。還使用對硝基苯基阿魏酸(InstituteofChemistry,SlovakAcademyofSciences,Bratislava,Slovakia)作為底物，測試了包含純化的特異腐質黴阿魏酸酯酶蛋白的合併級分的酶活性。在96孔COSTAR微量滴定板(ComingInc.，Corning,NY,USA)中進行活性實驗。首先在DMSO中製備IOOmM對硝基苯基阿魏酸溶液，然後在包含0.01%TWEEN20的50mM乙酸鈉pH5.0中稀釋至ImM懸浮液。然後通過向ImM對硝基苯基阿魏酸懸浮液加入純化的特異腐質黴阿魏酸酯酶材料的等分試樣，使最終的底物濃度為0.5mM對硝基酚阿魏酸酯酶，啟動酶反應。允許反應在25°C繼續進行30分鐘，此時加入IMTris-HClpH8.0，並且使用SPECTRAMAX340PC讀板儀(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA),通過405nm吸光度的增加確定釋放的對硝基酚鹽陰離子的量，所述讀板儀修正了不溶底物材料在540nm的背景吸光度。使用微板BCA蛋白質實驗試劑盒確定純化的特異腐質黴阿魏酸酯酶的蛋白濃度。一個單位的阿魏酸酯酶活性定義為在PH5，25°C能每分鐘釋放1微摩爾對硝基酚鹽陰離子的酶量。測定特異腐質黴阿魏酸酯酶的活性為5.8單位每mg純化蛋白。實施例9特異腐質黴阿魏酸酯酶的底物特異性如實施例8中所述的特異腐質黴阿魏酸酯酶分別與四種甲酯底物中的每一種一起溫育，所述底物包括4_羥基肉桂酸甲酯(對-香豆酸甲酯)，3，4_二羥基肉桂酸甲酯(咖啡酸甲酯)，4-羥基-3-甲氧基肉桂酸甲酯(阿魏酸甲酯)，和3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸甲酯(芥子酸甲酯)(ApinChemicalsLTD，Abingdon，Oxon，UK)。反應物(270μ1)包括250或265μ120mMMESpH6;20或5μ1純化的特異腐質黴阿魏酸酯酶；和Img甲酯39底物。在環境條件(25°C)下在暗處溫育反應物22.5小時。溫育後，通過薄層層析評價反應物的酯水解。使用2.5x7.5cm矽膠60F254平板，250μm厚(EMDChemicals,Darmstadt,Germany)通過在平板上印跡1μ1，用11乙酸乙酯庚烷加冰醋酸(1滴/4ml)，並用MINERALIGHT燈(UVPInc.，SanGabriel,CA,USA)在254nm的紫外光下使其可見，由此進行薄層層析。根據在254nm的紫外光下酸水解產物與四種底物的真正標準品和相應的酸產物(全部獲得自Apin，如所述，4-羥基-3-甲氧基肉桂酸除外，其獲得自Sigma-Aldrich，SaintLouis,MO,USA)相比的相對可觀察點強度，通過出現相應的酸水解產物定量評價酯水解。當實驗中特異腐質黴阿魏酸酯酶的蛋白濃度為0.14mg蛋白質每ml時，對於4_羥基肉桂酸甲酯、3，4_二羥基肉桂酸甲酯和4-羥基-3-甲氧基肉桂酸甲酯，清楚觀察到酯水解。對於3，5_二甲氧基-4-羥基肉桂酸甲酯，觀察到少量水解。當實驗中特異腐質黴阿魏酸酯酶的蛋白濃度為0.035mg蛋白質每ml時，對於4-羥基肉桂酸甲酯、3，4_二羥基肉桂酸甲酯和4-羥基-3-甲氧基肉桂酸甲酯，清楚觀察到酯水解。對於3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸甲酯，在更低的酶加載量未觀察到酯水解。結果表明阿魏酸酯酶具有水解所選擇的肉桂酸衍生物的甲酯的能力，所述甲酯包括阿魏酸甲酯和相關化合物。實施例10特異腐質黴阿魏酸酯酶對於預處理的玉米纖維水解的作用評價了特異腐質黴阿魏酸酯酶對於預處理的玉米纖維水解的效果。玉米纖維是玉米粒溼磨產生的部分。玉米纖維是在去除澱粉和進一步處理之後留下的種皮和殘餘胚。通過在140°C高壓滅菌150分鐘而預處理玉米纖維。使用下述方法，將底物中阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的量確定為175、317和261g每kg乾物質。使用稀鹽酸通過糖水解確定阿拉伯糖和木糖。將預處理的玉米纖維轉移至125ml錐形燒瓶並稀釋以包含約10%乾物質。在油浴中在100°C預處理玉米纖維樣品。通過在100°C加入5ml2M鹽酸2小時而開始水解。溫育後，將搖瓶在冰上冷卻，並用4M氫氧化鈉中和。用MINISART10.2微米注射器式濾器(SartoriusAG,Goettingen,Germany)過濾樣品，並在DIONEXBIOLC系統(DionexCorporation，Sunnyvale，CA，USA)上分析阿拉伯糖和木糖。通過將玉米纖維的預處理樣品進行兩部硫酸水解而確定葡萄糖。向壓力管(AceGlass,Inc.，Vineland，NJ,USA)中約300mg乾燥的玉米纖維加入3ml72%硫酸。混合樣品並在30°C水浴60分鐘。每隔5至10分鐘攪拌樣品。60分鐘後，去除樣品並加入84ml去離子水。將樣品放在高壓滅菌器中並在121°C加熱1小時。冷卻後，過濾樣品以去除殘餘固體，並通過加入碳酸鈣而中和。根據下述方法，用DIONEXBIOLC系統確定葡萄糖濃度。將樣品(10μ1)載入如配備有與CARB0PACPAl保護柱(4x50mm)(DionexCorporation,Sunnyvale,CA,USA)組合的DIONEXCARB0PACPAl分析柱(4x250mm)的DIONEXBIOLC系統上。用IOmM氫氧化鉀以Iml每分鐘的流速等度分離單糖，並由脈衝電化學檢測器以脈衝安培檢測模式檢測。電極電勢程序為+0.1伏(t=0-0.4秒)至-2.0伏(t=0.41-0.42秒)至0.6伏(t=0.43秒)和最後-0.1伏(t=0.44-0.50秒)，同時從t=0.2-0.4秒將得到的信號積分。使用阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的混合物(各成分濃度0.0050-0.075g每升)為標準品。用裡氏木黴纖維素分解蛋白組合物(裡氏木黴培養液，包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱黴GH61多肽和米麴黴β-葡糖苷酶融合體；PCT/US2008/065417)和裡氏木黴β-木糖苷酶進行預處理玉米纖維的水解。裡氏木黴β-木糖苷酶如Rasmussen等，2006，BiotechnologyandBioengineering94:869_876所述使用米麴黴的標準培養技術通過在米麴黴中表達而重組獲得。特異腐質黴阿魏酸酯酶如實施例8中所述獲得。在溫度50"C和pH5.0在2mlEPPENDORF管(EppendorfAG,Germany)中的50mM乙酸鈉中進行預處理玉米纖維的水解。在可對每個樣品進行恆定加熱和混合的EPPENDORFTHERM0MIXERComfort(EppendorfAG,Germany)中溫育樣品。使用的底物量是2.5w/w%，總樣品體積為2ml。在裡氏木黴纖維素分解蛋白組合物和裡氏木黴β-木糖苷酶的頂部以Img酶每g乾物質的酶加載量加入來自特異腐質黴的阿魏酸酯酶。以5mg酶每g乾物質的加載量加入裡氏木黴纖維素分解蛋白組合物，並且以Img酶每g乾物質的加載量加入裡氏木黴β-木糖苷酶。24小時後通過在加熱塊(TechneInc.，BurlingtonNJ,USA)中在100°C將樣品加熱10分鐘而終止水解。使用配備N0VA-PAKC18，4μm，3.9x150mm柱(WatersCorporation,Milford,ΜΑ,USA)的ICS-3000離子層析系統分析阿魏酸(Dionex，Sunnyvale,CA,USA)。在300nm波長檢測阿魏酸。使用兩種洗脫液洗脫液1是0.IM磷酸pH2.5+lmM三氟乙酸(TFA)，而洗脫液2是乙腈。用包含85%洗脫液1和15%洗脫液2的溶液以0.5ml每分鐘的流量等度分析阿魏酸。使用下述公式，通過確定由底物釋放的糖的量佔開始加入量的百分比來計算轉化率。用樣品數據的雙尾分布和等方差(equalvariance)進行T-檢驗。轉化率(％)=(水解物中的糖量/加入的底物中的糖量)χ100以Img酶每克乾物質的酶加載量加入來自特異腐質黴的阿魏酸酯酶，連同Img酶每g乾物質的裡氏木黴β「木糖苷酶和5mg酶每g乾物質的裡氏木黴纖維素分解蛋白質組合物，比較此時預處理玉米纖維的轉化率和僅加入Img酶每g乾物質的來自裡氏木黴的β-木糖苷酶和5mg酶每g乾物質的裡氏木黴纖維素分解蛋白質組合物時的預處理玉米纖維的轉化率，證明相對轉化率從100.0顯著(P<0.0047)增加至115.0(表1)。還實現了相對半纖維素轉化率從100.0顯著(P<0.0247)增加至115.8(表2)。表權利要求一種具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)包含胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75％同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)胺基酸的變體。2.權利要求1的多肽，其包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其具有阿魏酸酯酶活性的片段，或由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其具有阿魏酸酯酶活性的片段組成。3.權利要求1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或其編碼具有阿魏酸酯酶活性的片段的亞序列，或由SEQIDNO:1的核苷酸序列或其編碼具有阿魏酸酯酶活性的片段的亞序列組成。4.權利要求1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含在大腸桿菌NRRLB-50077所含的質粒pHinsFAEBl中。5.分離的多核苷酸，其包含編碼權利要求1-4中任一項的多肽的核苷酸序列。6.核酸構建體，其包含權利要求5的多核苷酸，所述多核苷酸與一個或多個(幾個)調控序列可操作地連接，所述調控序列指導所述多肽在表達宿主中產生。7.重組宿主細胞，其包含權利要求6的核酸構建體。8.用於產生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益於所述多肽產生的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。9.用於產生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益於所述多肽產生的條件下培養包含核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。10.用於產生親本細胞的突變體的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼權利要求1-4中任一項的多肽的核苷酸序列，其導致突變體與親本細胞相比產生較少的所述多肽。11.通過權利要求10的方法產生的突變細胞。12.用於產生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益於所述多肽產生的條件下培養轉基因植物或植物細胞，所述轉基因植物或植物細胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。13.轉基因植物、植物部分或植物細胞，其已經用編碼權利要求1-4中任一項的多肽的多核苷酸轉化。14.雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其包括權利要求5的多核苷酸的亞序列，其中可選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。15.抑制細胞中具有阿魏酸酯酶活性的多肽的表達的方法，其包括對細胞施用或在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包括權利要求5的多核苷酸的亞序列。16.核酸構建體，其包含編碼蛋白質的基因，所述基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDNO2的胺基酸1至18或者由SEQIDNO2的胺基酸1至18組成，其中所述基因對於所述核苷酸序列是外源的。17.重組宿主細胞，其包含權利要求16的核酸構建體。18.用於產生蛋白質的方法，其包括(a)在有益於所述蛋白質產生的條件下培養權利要求17的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。19.用於降解含木聚糖材料的方法，其包括用權利要求1-4中任一項的具有阿魏酸酯酶活性的多肽處理所述含木聚糖材料。20.權利要求19的方法，其進一步包括用木聚糖降解酶處理所述含木聚糖材料。全文摘要本發明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用於製備和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N15/82GK101939420SQ200880126491公開日2011年1月5日申請日期2008年12月3日優先權日2007年12月7日發明者米歇爾·馬蘭塔,金伯利·布朗申請人:諾維信公司