其表面上固定有促骨生長肽的骨移植材料和支架材料的製作方法

2023-05-09 23:57:11 2

專利名稱：其表面上固定有促骨生長肽的骨移植材料和支架材料的製作方法
技術領域：
本發明涉及骨移植材料和用於組織工程應用的支架，在其表面固定有促骨生長肽(osteogenesis-promoting peptides)，更具體而言，涉及骨移植材料和用於組織工程應用的支架(下文中，稱為支架)，在其表面固定有誘導細胞粘著的肽和/或細胞因子衍生的肽。
背景技術：
支撐牙齒的牙周組織通常包括齒槽骨、在齒槽骨和牙齒之間形成牙周膜的牙周韌帶組織和結締組織。由於牙周炎的發展而導致的齒槽骨的缺損包括牙周韌帶組織的缺損，並且，在治療牙周炎後，由於結締組織的過分生長，在牙周韌帶缺損部位不能對齒槽骨和牙周韌帶組織實施正常修復。而且，即使新骨形成了，外周韌帶組織不能正常分化，以致造成牙齒功能的喪失。
為了解決這些問題，在引導牙周再生中，積極嘗試了用人造屏障膜和自體移植來誘導組織的完全再生或新形成。而且，為了骨組織的再生，組織工程支架被用作骨移植材料。自從近十年報導了一些通過引入骨移植材料和支架來表明有效誘導牙周組織和骨組織的案例以來(Camelo，M.et.al，International J.Periodont.Restorative Dent.21109，2001)，已經使用了不同材料，包括由牛骨製備的骨粉顆粒，作為骨材料和組織工程支架用於組織再生。
同時，為了改善用於骨再生的骨移植材料和支架的效果，目前進行了將能改善組織再生的材料附著到骨移植材料和支架的研究。在這些材料中，報導了細胞外基質或特異性組織生長因子具有良好的損壞骨的修復和再生能力，它們對組織再生的良好能力也在實際的臨床試驗結果中得到了證實。
然而，存在的缺點是大多數細胞外基質和生長因子相對昂貴，且在具有幾十kDa分子量的高分子量活體中不穩定，從而導致其活性降低。特別地，存在的問題是它們會在幾分鐘內消失，以致為了獲得所期望的治療效果而高劑量地施用，如此以來，便引起了副作用。
近來，嘗試了簡單應用這些材料來減少缺陷，所述的簡單應用是指把組織生長因子加到用於引導骨再生的骨移植材料和用於組織工程中的聚合體支架中，從而誘導組織生長因子的緩釋。
而且，已證實了這些嘗試的某些效果。然而，缺陷在於，把組織生長因子與這些骨移植材料進行物理混合的結果是，在初始應用時，生長因子發生突釋，以致在治療期間很難使組織生長因子維持其有效濃度。

發明內容
因此，本發明人已經作出了多方面的努力來解決在現有技術中存在的上述問題，結果發現，在其表面固定有能達到組織再生效果的組織生長因子的活性位點肽和細胞外基質蛋白的骨移植材料和支架顯示了穩定、持久的藥理作用，即使在其上粘著的是低濃度水平的肽也能產生如此效果。本發明是基於這一發現而完成的。
本發明的一個目的是提供用於組織工程應用的骨移植材料和支架，即使其上固定著低濃度水平的誘導細胞粘著的肽和/或組織生長因子衍生的肽，仍可達到所期望的組織再生效果。
為了達到上述目的，本發明提供了用於組織工程應用的骨移植材料和支架，其具有在其表面固定的誘導細胞粘著的肽和/或組織生長因子衍生的肽。特別地，本發明提供了骨移植材料和支架，在其表面固定有具有藥理活性的誘導細胞粘著的肽和/或組織生長因子衍生的肽，因而該骨移植材料和該支架具有藥理活性，從而可提高它們對骨組織再生或其它組織再生的功效。誘導細胞粘著的肽或組織生長因子衍生的肽是通過分離和提取具有生理活性的細胞因子的活性位點胺基酸序列，並對提取物實施化學修飾以維持其活性結構而獲得。
特別地，誘導細胞粘著的肽優選為具有RGD胺基酸序列的肽。更優選地，所述胺基酸序列為CGGRGDS(SEQ ID NO1)或CGGVACDCRGDCFC(SEQ ID NO2)，用以維持RGD胺基酸序列的結構穩定性。而且，組織生長因子衍生的肽為從組織生長因子的活性位點確定並化學合成的肽。優選地，其選自下列肽中的至少一個
骨形態發生蛋白(BMP)-2、4和6[SEQ ID NO3表示BMP-2，SEQ ID NO4表示BMP-4和SEQ ID NO5表示BMP-6]中任何一個的2-18位胺基酸序列；BMP-2的16-34位胺基酸序列(SEQ ID NO6)、47-71位胺基酸序列(SEQID NO7)、73-92位胺基酸序列(SEQ ID NO8)、88-105位胺基酸序列(SEQ IDNO9)、283-302位胺基酸序列(SEQ ID NO10)、335-353位胺基酸序列(SEQID NO11)和370-390位胺基酸序列(SEQ ID NO12)；BMP-4的74-93位胺基酸序列(SEQ ID NO13)、293-313位胺基酸序列(SEQ ID NO14)、360-379位胺基酸序列(SEQ ID NO15)和382-402位胺基酸序列(SEQ ID NO16)；BMP-6的91-110位胺基酸序列(SEQ ID NO17)、397-418位胺基酸序列(SEQID NO18)、472-490位胺基酸序列(SEQ ID NO19)和487-510位胺基酸序列(SEQ ID NO20)；和BMP-7的98-117位胺基酸序列(SEQ ID NO21)、320-340位胺基酸序列(SEQ ID NO22)、390-409位胺基酸序列(SEQ ID NO23)和405-423位胺基酸序列(SEQ ID NO24)；(b)骨涎蛋白的62-69位胺基酸序列(SEQ ID NO25)、139-148位胺基酸序列(SEQ ID NO26)、259-277位胺基酸序列(SEQ ID NO27)、199-204位胺基酸序列(SEQ ID NO28)、151-158位胺基酸序列(SEQ ID NO29)、275-291位胺基酸序列(SEQ ID NO30)、20-28位胺基酸序列(SEQ ID NO31)、65-90位胺基酸序列(SEQ ID NO32)、150-170位胺基酸序列(SEQ ID NO33)和280-290位胺基酸序列(SEQ ID NO34)；(c)轉化生長因子的242-250位胺基酸序列(SEQ ID NO35)、279-299位胺基酸序列(SEQ ID NO36)和343-361位胺基酸序列(SEQ ID NO37)；(d)血小板源生長因子的100-120位胺基酸序列(SEQ ID NO37)和121-140位胺基酸序列(SEQ ID NO39)；(e)酸性成纖維細胞生長因子的23-31位胺基酸序列(SEQ ID NO40)和97-105位胺基酸序列(SEQ ID NO41)；(f)鹼性成纖維母細胞生長因子的16-27位胺基酸序列(SEQ ID NO42)、37-42位胺基酸序列(SEQ ID NO43)和107-112位胺基酸序列(SEQ ID NO45)；(g)牙本質涎蛋白的255-275位胺基酸序列(SEQ ID NO46)、475-494位胺基酸序列(SEQ ID NO47)和551-573位胺基酸序列(SEQ ID NO48)；
(h)肝素結合性EGF樣生長因子的63-83位胺基酸序列(SEQ ID NO49)、84-103位胺基酸序列(SEQ ID NO50)和121-140位胺基酸序列(SEQ ID NO52)；(i)鈣粘蛋白EGF LAG七傳G型受體3(cadherin EGF LAG seven-passG-type receptor 3)的326-350位胺基酸序列(SEQ ID NO53)、351-371位胺基酸序列(SEQ ID NO54)、372-400位胺基酸序列(SEQ ID NO55)、401-423位胺基酸序列(SEQ ID NO56)、434-545位胺基酸序列(SEQ ID NO57)、546-651位胺基酸序列(SEQ ID NO58)、1375-1433位胺基酸序列(SEQ IDNO59)、1435-1471位胺基酸序列(SEQ ID NO60)、1475-1514位胺基酸序列(SEQ ID NO61)、1515-1719位胺基酸序列(SEQ ID NO62)、1764-1944位胺基酸序列(SEQ ID NO63)和2096-2529位胺基酸序列(SEQID NO64)；和(j)成骨細胞特異性鈣粘蛋白(OB-cadherin)的54-159位胺基酸序列(SEQID NO65)、160-268位胺基酸序列(SEQ ID NO66)、269-383位胺基酸序列(SEQ ID NO67)、384-486位胺基酸序列(SEQ ID NO68)和487-612位胺基酸序列(SEQ ID NO69)。
更優選地，在肽的N末端附加有一個有間隔基(CGG-)，該間隔基是由一個半胱氨酸和兩個甘氨酸組成，這樣可易於使肽被化學固定在骨移植材料和支架上。
本發明的活性肽是通過下述方法製得的合成組織生長因子全胺基酸序列中的每一個10-20胺基酸序列，使合成的胺基酸序列接受細胞粘著試驗來篩選具有最高活性的胺基酸序列，然後對所篩選的胺基酸序列的末端實施化學修飾，以便使其易於化學固定在骨移植材料和支架上。這樣，該骨移植材料能僅用在其表面的最少的胺基酸序列來維持活性，同時降低由於體內摻合與藥物的使用而造成的組織生長因子的損耗及副作用，從而提供有利於治療效果的其它優點。
在本發明中，如果在本技術領域使用，可使用所有類型和種類的骨移植材料和支架。這些骨移植材料和支架的優選的實例包括衍生自生物體的骨礦物粉、源於自體骨、牛骨和豬骨的多孔塊狀物(porous blocks)、合成羥基磷灰石粉和多孔塊狀物、磷酸三鈣粉和多孔塊狀物、磷酸二氫鈣粉和多孔塊狀物、由二氧化矽製備的骨移植材料、由二氧化矽和聚合物的混合物製備的骨充填移植材料、由包括殼聚糖、聚乳酸的生物相容性聚合體製備的細顆粒和多孔支架、鈦和立體支架。在這一方面，優選地，骨移植材料和支架的表面被修飾，從而使活性肽易於粘著在其表面。根據本發明的用於組織工程應用的支架包括屏障膜、牙植入物用於牙周骨再生的牙植入物等。
屏障膜的優選實例包括，但不限於由聚乳酸製備的多孔膜、由殼多糖或殼聚糖的納米纖維製備的再生膜、由殼多糖或殼聚糖製備的膜狀屏障膜。而且，作為植入物，優選使用鈦植入物，但不限於此。在這一方面，植入物的表面優選被氧化修飾和硝化修飾，從而使活性肽易於粘著在其表面。
與組織生長因子本身相比，根據本發明的肽對體內酶促反應更敏感，並且具有較低的體內免疫原性。當活性肽被固定在用於組織再生的骨移植材料、支架、屏障膜或植入物的表面和用於外科手術時，活性肽的想要的濃度可局部出現並表現出活性，這樣可提高它們的治療效果。因此，該活性肽具有適宜的用於骨組織與牙周組織的再生和修復性能。
本發明的具有游離氨基或在N末端具有半胱氨酸的肽易於通過交聯劑固定在骨移植材料和支架的表面。適宜用於本發明的交聯劑包括，但不限於1，4-二-馬來醯亞胺基丁烷(BMB)、1，11-二-馬來醯亞胺基四甘醇(BM[PEO]4)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二醯亞胺鹽酸化物(EDC)、琥珀醯亞胺基-4-[N-馬來醯亞胺基甲基環己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯](SMCC)和硫代-SMCC、琥珀醯亞胺基6-[3-(2-吡啶二硫基)丙醯胺基]己酸酯(SPDP)和硫代-SPDP、間-馬來醯亞胺基苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)和硫代-MBS、琥珀醯亞胺基[4-(對-馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯](SMPB)和硫代-SMPB。
另外，所述肽是化學連接到骨移植材料和支架的表面，因此，它們以優選0.1-10mg/cm2，更優選1-5mg/cm2的量在其表面。
附圖簡述

圖1顯示了固定在根據本發明的骨移植材料上的肽的電子表面分析(electronic surface analysis)結果。圖1中，(A)顯示在其表面未固定有肽的骨移植材料的電子表面分析結果，(B)顯示在其表面固定有含硫肽的骨移植材料的電子表面分析結果。
圖2顯示共焦雷射掃描顯微圖，該圖顯示本發明的骨移植材料的細胞粘著方式。圖2(A)顯示細胞粘著到不具有固定肽的骨移植材料上的細胞粘著方式，圖(B)和(C)分別顯示在具有源自BMP和骨涎蛋白的肽固定的骨移植材料的表面上的細胞粘著方式。
圖3為顯示了在具有固定肽的本發明的骨移植材料的表面上定量分析細胞粘著的結果圖。
圖4為一張照片，該照片顯示了在收集的細胞中骨組織分化標記物smad1、5和8蛋白的量的蛋白質印跡的測量結果，所述細胞是在將細胞配發在本發明的骨移植材料上，並培養所配發的細胞一定時間後收集的(Con一種不具有固定肽的骨移植材料；BMP一種具有BMP衍生的肽固定在其上的骨移植材料；BSP一種具有固定在其上的涎蛋白衍生的肽的骨移植材料)。
圖5為顯示本發明的骨移植材料在兔顱骨缺陷方面的骨再生能力的一些照片。圖5中，(A)顯示不具有固定在其上的肽的本發明的骨移植材料(HA)在兔顱骨缺陷方面的骨再生能力，(B)顯示本發明的具有固定在其上的肽的骨移植材料(HA)在兔顱骨缺陷方面的骨再生能力。新骨(New Bone)表示由固定在骨移植材料表面的肽生成的骨。
發明詳述下面，本發明將通過更具體的實施例來進一步詳細描述。然而，對本領域的普通技術人員而言顯而易見的是，這些實施例顯然僅用於闡述的目的，而不構成對本發明範圍的限制。
實施例1細胞粘著RGD肽在源於牛骨的骨礦物顆粒上的固定在減壓條件下，用乙醇衝洗源於牛骨的骨礦物顆粒，然後，將其放置於100℃的真空烘箱中20小時，以便除去其表面的雜質。用3-氨丙基乙氧基矽烷(APTES)的己烷溶液處理該骨礦物表面，然後洗滌。這可導致在其表面形成胺殘基，然後給其中加入交聯劑BMB，使其連接。使與交聯劑連接的骨礦物顆粒與SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的肽反應12小時，然後洗滌。這樣可得到在其表面固定有肽的骨礦物顆粒。
實施例2細胞粘著RGD肽在合成的羥基磷灰石和磷酸三鈣上的固定在減壓條件下，用乙醇洗滌合成的羥基磷灰石骨移植粉和磷酸三鈣骨移植粉，然後將其放置於100℃的真空烘箱中，以除去表面雜質。用3-氨丙基乙氧基矽烷(APTES)的己烷溶液處理該骨礦物表面，然後洗滌。這可導致在其表面形成胺殘基，然後給其中加入交聯劑BMB，使其連接。使與交聯劑連接的骨礦物顆粒與SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的肽反應12小時，然後進行洗滌。這樣就得到了在其表面固定有肽的骨礦物顆粒。
實施例3細胞粘著RGD肽在骨移植材料殼聚糖上的固定具有RGD將由殼聚糖製備的以粉狀或多孔支架形式的骨移植材料加入到2ml的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中，以水合其表面。往該溶液中加入作為交聯劑的硫代-SMCC，其濃度為5mg/ml，然後攪拌所得的混合物2小時，從而在殼聚糖骨移植材料的表面引入功能基團。在室溫下反應2小時後，洗滌殼聚糖骨移植材料，然後使其與10mg的SEQ ID NO1的肽的100μl磷酸鹽緩衝液反應24小時。接著，洗滌反應物，即得到具有固定在其上的肽的殼聚糖骨移植材料。
實施例4細胞粘著RGD肽在聚乳酸骨移植材料上的固定將聚乳酸型移植粉或多孔支架加入至磷酸鹽緩衝液(pH4.7)中，以水合其表面，然後與20mg/ml胱胺鹽酸鹽溶液反應。向上述溶液中滴加EDC，以活化在骨移植材料表面上的羧酸。使該混合物反應24小時，洗滌，與二硫蘇糖醇(DTT)溶液(30mg/ml)反應24小時，從而把硫氫基引入到聚乳酸的表面。修飾的聚乳酸移植材料與細胞粘著RGD肽(SEQ ID NO1)混合，從而骨移植材料的硫氫基和肽之間引入S-S鍵，這樣可將肽固定在移植材料上。
實施例5組織生長因子衍生的肽在骨礦物顆粒上的固定為在該實施例中作為組織生長因子衍生的肽使用，肽是通過在每個SEQID NO3和SEQ ID NOS6-9的胺基酸序列的N末端添加CGG間隔基而進行化學合成的，所述SEQ ID NO3和SEQ ID NOS6-9的胺基酸序列包含骨形態發生蛋白BMP-2的細胞粘著和活化域，以便在N末端引入半胱氨酸。
在減壓條件下，用乙醇洗滌源於牛骨的骨礦物顆粒，然後置入100℃真空烘箱中20小時，以除去其表面的雜質。用3-氨丙基乙氧基矽烷(APTES)的己烷溶液處理骨礦物顆粒的表面，然後洗滌。這樣導致在顆粒表面形成氨基殘基，然後，加入濃度為5mg/ml的作為交聯劑的硫代-SMCC。攪拌該混合物2小時，以便引入功能基團至骨移植材料的表面。室溫下反應2小時後，洗滌骨移植材料，使其與10mg肽的100μl磷酸鹽緩衝液反應，然後再洗滌。這樣就製得具有固定在其上的肽的骨移植材料。
實施例6組織生長因子衍生的肽在合成骨移植材料顆粒上的固定在該實施例中，使用了與實施例5中相同的肽作為組織生長因子衍生的肽。在減壓條件下，使用乙醇洗滌合成的羥基磷灰石和磷酸三鈣的無機質顆粒，其作為合成骨移植材料，然後置於100℃的真空烘箱20小時，以便除去其表面雜質。顆粒的表面用3-氨丙基乙氧基矽烷(APTES)的己烷溶液處理，然後洗滌。這可在顆粒表面形成胺殘基，加入5mg/ml作為交聯劑的硫代-SMCC。攪拌該混合物2小時，以在骨移植材料的表面引入功能基團。室溫下反應2小時後，洗滌骨移植材料，然後使其與10mg的肽的100μl磷酸鹽緩衝溶液反應24小時，然後再洗滌。這樣就製得具有固定在其上的組織生長因子衍生的肽的骨移植顆粒。
實施例7組織生長因子衍生的肽在骨移植材料和殼聚糖支架上的固定將由殼聚糖製備的骨移植材料和支架加至2ml的磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中，以水合其表面，加入硫代-SMCC，其濃度為5mg/ml。攪拌混合物2小時，以在殼聚糖骨移植材料的表面上引入功能基團。室溫下反應2小時後，洗滌殼聚糖骨移植材料，然後使其與10mg實施例5中的組織生長因子衍生的肽的100μl磷酸鹽緩衝溶液反應，然後洗滌。這樣可製得具有固定在其上的肽的殼聚糖骨移植材料和支架。
實施例8組織生長因子衍生的肽在聚乳酸的骨移植材料和支架上的固定將聚乳酸的骨移植粉或多孔支架加入至磷酸鹽緩衝液(PH4.7)中，以水合其表面，然後與20mg/ml胱胺鹽酸鹽溶液反應。向該反應溶液中滴加交聯劑EDC，以活化在聚乳酸的骨移植材料表面上的羧酸。反應24小時後，洗滌所得物，並使所得物與1ml二硫蘇糖醇(DTT)溶液(30mg/ml)反應24小時，從而把硫氫基引入至聚乳酸的表面。骨移植材料與組織生長因子衍生的肽相混合，所述肽是具有CGG間隔基連接在其上的SEQ ID NO8的肽，從而自發地在骨移植材料和肽之間引入S-S鍵，這樣將肽固定在骨移植材料上。
實施例9骨涎蛋白衍生的肽在骨礦物顆粒上的固定為在該實施例中作為骨涎蛋白衍生的肽使用，化學合成了如下各肽SEQID NO15的肽、包含具有用於誘導鈣化的活性域結構的肽、包含細胞粘著功能位點的SEQ ID NO27的肽。
在減壓的條件下，用乙醇洗滌源於牛骨的骨礦物顆粒，然後放置於100℃的烘箱20小時，以便除去其表面的雜質。用3-氨丙基乙氧基矽烷(APTES)的己烷溶液骨礦物顆粒的表面，然後洗滌。這樣，在其表面形成胺殘基，然後，加入5mg/ml的交聯劑硫代-SMCC。攪拌所得的混合物2小時，以便給骨移植材料的表面引入功能基團。反應後，洗滌骨移植材料，然後使其與由10mg骨涎蛋白的100μl磷酸鹽緩衝液溶液反應24小時，然後再洗滌。這樣製得具有固定在其上的肽的骨礦物顆粒。
實施例10骨涎蛋白衍生的肽在合成的骨移植顆粒上的固定在該實施例中，使用與實施例9中使用的相同的肽。在減壓條件下，用乙醇洗滌羥基磷灰石和磷酸三鈣礦物顆粒，然後放置於100℃的真空烘箱中20小時，以便除去其表面的雜質。用3-氨丙基乙氧基矽烷(APTES)的己烷溶液處理顆粒表面，然後洗滌。這樣在顆粒表面形成胺殘基，然後，加入5mg/ml的交聯劑硫代-SMCC。攪拌該混合物2小時，以在骨移植材料的表面引入功能基團。反應完全後，洗滌骨移植材料，加入10mg與實施例9中所使用的相同的肽的100μl磷酸鹽緩衝液溶液，並允許反應24小時。洗滌反應物，這樣就製得具有固定在其上的肽的骨礦物顆粒。
實施例11包含骨涎蛋白的粘著和活化位點的肽在殼聚糖骨移植材料上的固定在該實施例中，使用與實施例9中使用的相同的肽。將殼聚糖骨移植材料和支架加入至2ml磷酸鹽緩衝液(PH7.4)中，以水合其表面。往上述所得溶液加入5mg/ml的交聯劑硫代-SMCC，攪拌2小時，以將功能基團引入至骨移植材料的表面。反應完全後，洗滌殼聚糖骨移植材料，然後加入10mg肽的100μl磷酸鹽緩衝溶液，並使它們反應24小時，然後洗滌。這樣就獲得具有固定在其上的肽的殼聚糖骨移植材料和支架。
實施例12包含骨涎蛋白的粘著和活化位點的肽在聚乳酸的骨移植材料和支架上的固定在該實施例中，使用與實施例9中使用的相同的肽。將聚乳酸骨移植粉或支架加入至磷酸鹽緩衝液(PH4.7)中，以水合其表面，然後與20mg/ml胱胺鹽酸鹽溶液發生反應。向上述反應溶液中滴加EDC，以活化聚乳酸骨移植材料表面上的羧酸。反應24小時後，洗滌反應產物並加入1ml二硫蘇糖醇(DTT)溶液(30mg/ml)，並使它們反應24小時，從而把硫氫基引入至骨移植材料和支架的表面。骨移植材料和支架與肽相混合，以便自發地在骨移植材料和肽之間引入S-S鍵，這樣就將肽固定在骨移植材料上。
實施例13促骨生長肽在殼聚糖屏障膜上的固定把殼聚糖屏障膜加入至2ml磷酸鹽緩衝液(PH7.4)中，以水合屏障膜的表面。往上述溶液中加入5mg/ml交聯劑硫代-SMCC，攪拌該混合物2小時，以引入功能基團至屏障膜的表面。反應完全後，洗滌屏障膜，給其中分別加入由各5ml的肽溶於100μl磷酸鹽緩衝液而製得的溶液，該肽是具有SEQ IDNO1的細胞粘著肽、在實施例9中用的BMP-2衍生的肽以及在實施例9中用的骨涎蛋白的肽的100μl磷酸鹽緩衝溶液，並使它們反應達24小時。洗滌後，即得到具有固定在其上的肽的屏障膜。
實施例14促骨生長肽在聚乳酸屏障膜上的固定將聚乳酸屏障膜加入至磷酸鹽緩衝液(pH 4.7)中，以水合其表面，然後與20mg/ml胱胺鹽酸鹽反應。往反應混合物中滴加交聯劑EDC，以活化在聚乳酸表面上的羧酸。反應24小時後，洗滌屏障膜，給其中加入1ml DTT溶液(30mg/ml)，並使它們發生反應24小時，以引入硫氫基至屏障膜的表面。所得屏障膜與SEQ ID NO1的細胞粘著肽、用實施例5中的BMP-2衍生的肽和在實施例9中使用的的骨涎蛋白衍生的肽中的每一個相混合，從而自發地在在屏障膜和肽之間引入S-S鍵，這樣就把肽固定在屏障膜上。
實施例15促骨生長肽在鈦植入物上的固定用氮等離子體處理由鈦製備的植入物的表面，從而在其表面形成胺基。把5mg/ml的交聯劑硫代-SMCC加至植入物中，攪拌2小時，從而把功能基團引入至其表面。反應完全後，洗滌植入物，給其中加入各5ml的肽溶於100μl磷酸鹽緩衝液而製得的溶液，該肽是具有SEQ ID NO1的細胞粘著肽、在實施例5中用的源於BMP-2的肽以及在實施例9中用的源於骨涎蛋白的肽中，並使它們發生反應達24小時。洗滌得到的植入物，這樣就能得到具有固定在其上的肽的植入物。
測試試驗1對根據本發明的骨移植材料的表面的分析為了分析在實施例1-12中製備的每一個具有固定在其上的肽的骨移植材料的表面，用2％的戊二醛溶液固定骨移植材料。用1％的四氧化鋨溶液處理被固定的骨移植材料，然後洗滌，脫水和烘乾。
用XPS方法分析所製備的骨移植材料的表面，該方法使通過鑑定固定在某一物質表面上的成分來確定鍵的存在與否。在這方面，鍵的存在與否取決於硫的存在與否，因為根據本發明，在骨移植材料和固定在骨移植材料上的肽之間存在二硫鍵。
圖1顯示對固定在本發明的殼聚糖骨移植材料上的肽的分析結果。在圖1中，(A)顯示由未經過肽修飾的殼聚糖製備的骨移植材料的表面，(B)顯示具有固定在其表面的含硫的肽的骨移植材料。如圖1所示，可以觀察到硫存在於具有固定在其上的肽的骨移植材料的表面，這說明肽已經被固定。而且，為了確定在骨移植材料的整個表面區域中存在肽的固定比例，測量了硫在具有固定在其上的肽的骨移植材料中的含量。結果如下面的表1所示，在不具有肽的殼聚糖中未檢測到硫，而在具有固定在其上的肽的殼聚糖中，檢測到8.66％的硫。
表1

測試實施例2本發明的骨移植材料的細胞粘著測試將成骨細胞(MC3T3細胞系)接種到實施例3、7和11中製備的固定肽在其上的骨移植材料上，然後培養1天又4小時。用2％的戊二醛溶液固定具有培養的成骨細胞的骨移植材料。把用1％的triton X-100處理的螢光標記鬼筆環肽溶液加到固定的骨移植材料中，從而染色細胞質。接著，當樣品被洗滌和固定後，用共焦雷射掃描顯微鏡可以觀察到粘著到骨移植材料上的細胞(圖2)。
在圖2中，(A)顯示與不具有肽的骨移植材料的細胞粘著，(B)和(C)分別顯示與具有BMP衍生的肽和骨涎蛋白衍生的肽固定在其上的骨移植材料的細胞粘著。結果是，對於不具有固定在其上的肽的骨移植材料，可觀察到細胞的球狀和不穩定的粘著；然而，在具有BMP衍生的肽和具有骨涎蛋白衍生的肽的骨移植材料的表面，可觀察到細胞的穩定粘著(包括在培養細胞4小時後，大多數細胞的細胞質的延展)。
圖3顯示對於細胞粘著的定量分析結果。如圖3所示，相對不具有固定在其上的肽的骨移植材料而言，被肽修飾的殼聚糖骨移植材料顯示了細胞粘著的顯著升高，而且這種升高在任一濃度下與被固定的肽的量成正比。
實施例3確定分化標記蛋白在根據本發明的具有固定在其上的肽的骨移植材料表面上培養的成骨細胞的表達為了確定分化標記蛋白在根據本發明的具有固定在其上的肽的骨移植材料表面上培養的成骨細胞的表達，通過Western雜交分析分化標記蛋白smad 1、5和8的表達水平。
把成骨細胞接種到骨移植材料和具有固定在其上的肽的骨移植材料的表面，然後培養2周。培養後，提取細胞中的總蛋白，並通過測量在280nm下的吸收值而對總蛋白進行定量。取2μl蛋白溶液(1mg/ml)，並在聚丙稀醯胺凝膠上進行電泳，然後與分化標記蛋白smad 1、5和8的抗體反應。接著，使蛋白質溶液與標記的二抗(secondary antibody)反應，觀察到由於凝膠的展開而出現的蛋白質帶，測定它們的濃度。
結果如圖4所示，相對在不具有固定在其上的肽的骨移植材料上培養的細胞而言，在具有固定的肽的骨移植材料的表面上培養的smad蛋白的表達顯著升高。這表明，對於生長在具有在其表面上固定有組織生長因子衍生的肽的骨移植材料的表面生長的細胞而言，其以易於進行的方式而分化成骨組織。
測試實施例4具有固定在其上的肽的骨移植材料對兔顱骨再生的影響將在實施例1-5中製備的具有固定的肽的骨移植材料移植到兔顱骨環形缺損處(rabbit cranial circular defects)，以檢測它們的骨再生能力。在被麻醉兔的顱部位點，形成了直徑為8mm的顱骨環形缺損。將骨移植材料和具有固定的肽的骨移植材料以50mg/缺損的用量移植至骨缺損處，並且把骨膜和表皮雙層相互縫合在一起。移植兩周後，殺死該動物，將從該動物身上所採集的樣品用福馬林溶液固定，然後包埋組織，以製備厚度為20μl的樣品。用鹼性品紅和甲苯胺藍染色所製備的樣品，因而製備非脫鈣樣品。運用光學顯微鏡來給所製備的樣品拍照。
圖5顯示具有固定的肽的骨移植材料的骨再生效果。如圖5所示，本發明的具有促骨生長肽粘著在其表面的骨移植材料用於圖顱骨缺損(B)，其相對不具有肽的骨移植材料(A)而言，在兩周內顯示了顯著的骨再生能力。
儘管本發明參照某些具體特徵詳細地進行了描述，但是對於本領域的普通技術人員而言顯而易見的是，其僅僅是作為優選的實施方案，並沒有限定本發明的範圍。因此，本發明的基本範圍將通過附加的權利要求書及其等同物來限定。本領域的普通技術人員應當理解在不背離附加的權利要求書中描述的本發明的範圍和精神內，對本發明作出簡單的修飾、改變和添加是可能的。
工業實用性如上所述，本發明提供具有用誘導細胞粘著的肽和/或組織生長因子衍生的肽固定在其表面上的骨移植材料和支架，它們即使在低濃度劑量水平上也可取得理想的組織再生效果。
本發明的用於組織工程應用的骨移植材料和支架具有固定在其表面的促骨生長肽，其能促進細胞粘著和細胞分化為骨組織，並且能防止根據現有技術的簡單摻合而導致的組織生長因子的快速降解以及由於組織生長因子滲漏至體內而導致的副作用。而且，它們可極大降低由於大量使用組織生長因子來提高其局部濃度而造成的成本。
序列表110首爾國立大學工業基金會120其表面上固定有促骨生長肽的骨移植材料和支架材料130PP-B0100140PCT/KR2005/0008011412005-03-1815010-2004-190101512004-03-1916069170KopatentIn 1.7121012117212PRT213人造序列220
223含RGD的肽4001Cys Gly Gly Arg Gly Asp Ser1 5210221111212PRT213人造序列220
223含RGD的肽4002Val Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys1 5 10210321117212PRT213人造序列220
223BMP-2的部分肽4003Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His1 5 10 15Pro
210421114212PRT213人造序列220
223BMP-4的部分肽4004Cys Ser Pro Lys His His Pro Gln Arg Ser Arg Lys Lys Asn1 5 10210521113212PRT213人造序列220
223BMP-6的部分肽4005Cys Ser Ser Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg Arg His1 5 10210621117212PRT213人造序列220
223BMP-2的部分肽4006Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His1 5 10 15Ala210721125212PRT213人造序列
220
223BMP-2的部分肽4007Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile1 5 10 15Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn20 25210821120212PRT213人造序列220
223BMP-2的部分肽4008Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser1 5 10 15Met Leu Tyr Leu20210921118212PRT213人造序列220
223BMP-2的部分肽4009Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr1 5 10 15Gln Asp2101021120212PRT213人造序列220
223BMP-2的部分肽
40010Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg1 5 10 15His Pro Leu Tyr202101121120212PRT213人造序列220
223BMP-2的部分肽40011Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser1 5 10 15Met Leu Tyr Leu202101221121212PRT213人造序列220
223BMP-7的部分肽40012Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr1 5 10 15Gln Asp Met Val Val202101321121212PRT213人造序列220
223BMP-4的部分肽40013
Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile1 5 10 15Ser Met Leu Tyr Leu202101421121212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白的部分肽40014Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg1 5 10 15Arg His Ser Leu Tyr202101521121212PRT213人造序列220
223BMP-4的部分肽40015Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile1 5 10 15Ser Met Leu Tyr Leu202101621121212PRT213人造序列220
223BMP-4的部分肽40016Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr1 5 10 15
Gln Glu Met Val Val202101721120212PRT213人造序列220
223BMP-6的部分肽40017Tyr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu Tyr Phe202101821122212PRT213人造序列220
223BMP-6的部分肽40018Val Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ala Cys1 5 10 15Arg Lys His Glu Leu Tyr202101921120212PRT213人造序列220
223BMP-6的部分肽40019Tyr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu Tyr Phe20
2102021124212PRT213人造序列220
223BMP-6的部分肽40020Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr1 5 10 15Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys202102121120212PRT213人造序列220
223BMP-7的部分肽40021Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu Tyr Phe202102221121212PRT213人造序列220
223BMP-7的部分肽40022Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu1 5 10 15Tyr Val Ser Phe Arg2021023
21120212PRT213人造序列220
223BMP-7的部分肽40023Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu Tyr Phe202102421119212PRT213人造序列220
223BMP-7的部分肽40024Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr1 5 10 15Arg Asn Met210252118212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白部分肽40025Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu1 52102621110212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白部分肽
40026Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu1 5 102102721118212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白部分肽40027Tyr Glu Thr Tyr Asp Glu Asn Asn Gly Glu Pro Arg Gly Asp Thr Tyr1 5 10 15Arg Ile210282116212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白部分肽40028Glu Glu Gly Glu Glu Glu1 5210292118212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白部分肽40029Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu1 52103021117212PRT213人造序列
220
223骨涎蛋白部分肽40030Tyr Glu Ile Tyr Glu Ser Glu Asn Gly Glu Pro Arg Gly Asp Asn Tyr1 5 10 15Arg210312119212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白部分肽40031Lys Asn Leu His Arg Arg Val Lys Ile1 52103221126212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白部分肽40032Asp Ser Ser Glu Glu Asn Gly Asp Asp Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu1 5 10 15Glu Glu Glu Thr Ser Asn Glu Gly Glu Asn20 252103321121212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白部分肽40033Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asn Glu Asn Glu Glu Ser1 5 10 15
Glu Ala Glu Val Asp202103421111212PRT213人造序列220
223骨涎蛋白部分肽40034Ser Glu Asn Gly Glu Pro Arg Gly Asp Asn Tyr1 5 10210352119212PRT213人造序列220
223TGF的部分肽40035Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr1 52103621121212PRT213人造序列220
223TGF的部分肽40036Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys1 5 10 15Cys Val Arg Gln Leu202103721119212PRT213人造序列
220
223TGF的部分肽40037Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val1 5 10 15Pro Gln Ala2103821121212PRT213人造序列220
223PDGF的部分肽40038Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Gln Glu Gln Arg202103921120212PRT213人造序列220
223PDGF的部分肽40039Ala Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg1 5 10 15Arg Pro Pro Lys20210402119212PRT213人造序列220
223AFGF的部分肽
40040Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys1 5210412118212PRT213人造序列220
223AFGF的部分肽40041Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys1 52104221112212PRT213人造序列220
223BFGF的部分肽40042Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys1 5 10210432116212PRT213人造序列220
223BFGF的部分肽40043Pro Asp Gly Arg Val Asp1 5210442117212PRT213人造序列220
223BFGF的部分肽40044
Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu1 5210452116212PRT213人造序列220
223BFGF的部分肽40045Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr1 52104621121212PRT213人造序列220
223牙本質涎蛋白的部分肽40046Glu Asp Glu Gly Ser Gly Asp Asp Glu Asp Glu Glu Ala Gly Asn Gly1 5 10 15Lys Asp Ser Ser Asn202104721120212PRT213人造序列220
223牙本質涎蛋白的部分肽40047Asp Asp Ala Asn Ser Glu Ser Asp Asn Asn Ser Ser Ser Arg Gly Asp1 5 10 15Ala Ser Tyr Asn202104821123
212PRT213人造序列220
223牙本質涎蛋白的部分肽40048Asp Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser1 5 10 15Ser Asp Ser Asp Ser Ser Asp202104921122212PRT213人造序列220
223肝素結合性表皮生長因子的部分肽40049Asp Leu Gln Glu Ala Asp Leu Ala Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser1 5 10 15Lys Pro Gln Ala Leu Ala202105021120212PRT213人造序列220
223肝素結合性表皮生長因子的部分肽40050Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys1 5 10 15Gly Leu Gly Lys202105121113212PRT213人造序列
220
223肝素結合性表皮生長因子的部分肽40051Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr Lys Asp Phe Cys1 5 102105221120212PRT213人造序列220
223肝素結合性表皮生長因子的部分肽40052Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro1 5 10 15Gly Tyr His Gly202105321125212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40053Pro Gln Tyr Asn Tyr Gln Thr Leu Val Pro Glu Asn Glu Ala Ala Gly1 5 10 15Thr Ala Val Leu Arg Val Val Ala Gln20 252105421121212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40054Asp Pro Asp Ala Gly Glu Ala Gly Arg Leu Val Tyr Ser Leu Ala Ala1 5 10 15
Leu Met Asn Ser Arg202105521129212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40055Ser Leu Glu Leu Phe Ser Ile Asp Pro Gln Ser Gly Leu Ile Arg Thr1 5 10 15Ala Ala Ala Leu Asp Arg Glu Ser Met Glu Arg His Tyr20 252105621123212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40056Leu Arg Val Thr Ala Gln Asp His Gly Ser Pro Arg Leu Ser Ala Thr1 5 10 15Thr Met Val Ala Val Thr Val2021057211112212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40057Glu Gln Ala Gln Tyr Arg Glu Thr Leu Arg Glu Asn Val Glu Glu Gly1 5 10 15Tyr Pro Ile Leu Gln Leu Arg Ala Thr Asp Gly Asp Ala Pro Pro Asn
20 25 30Ala Asn Leu Arg Tyr Arg Phe Val Gly Pro Pro Ala Ala Arg Ala Ala35 40 45Ala Ala Ala Ala Phe Glu Ile Asp Pro Arg Ser Gly Leu Ile Ser Thr50 55 60Ser Gly Arg Val Asp Arg Glu His Met Glu Ser Tyr Glu Leu Val Val65 70 75 80Glu Ala Ser Asp Gln Gly Gln Glu Pro Gly Pro Arg Ser Ala Thr Val85 90 95Arg Val His Ile Thr Val Leu Asp Glu Asn Asp Asn Ala Pro Gln Phe100 105 11021058211106212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40058Ser Glu Lys Arg Tyr Val Ala Gln Val Arg Glu Asp Val Arg Pro His1 5 10 15Thr Val Val Leu Arg Val Thr Ala Thr Asp Arg Asp Lys Asp Ala Asn20 25 30Gly Leu Val His Tyr Asn Ile Ile Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe35 40 45Ala Ile Asp Ser Leu Thr Gly Glu Ile Gln Val Val Ala Pro Leu Asp50 55 60Phe Glu Ala Glu Arg Glu Tyr Ala Leu Arg Ile Arg Ala Gln Asp Ala65 70 75 80Gly Arg Pro Pro Leu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Ala Ser Ile Gln Val85 90 95
Val Asp Ile Asn Asp His Ile Pro Ile Phe100 1052105921159212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40059Asp Asp Asn Val Cys Leu Arg Glu Pro Cys Glu Asn Tyr Met Lys Cys1 5 10 15Val Ser Val Leu Arg Phe Asp Ser Ser Ala Pro Phe Leu Ala Ser Ala20 25 30Ser Thr Leu Phe Arg Pro Ile Gln Pro Ile Ala Gly Leu Arg Cys Arg35 40 45Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Asp Phe Cys Glu50 552106021137212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40060Glu Leu Asp Leu Cys Tyr Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys1 5 10 15Ala Arg Arg Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Val Cys Arg Pro Arg Phe Thr20 25 30Gly Glu Asp Cys Glu352106121140212PRT213人造序列
220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40061Glu Ala Gly Arg Cys Val Pro Gly Val Cys Arg Asn Gly Gly Thr Cys1 5 10 15Thr Asp Ala Pro Asn Gly Gly Phe Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Gly20 25 30Ala Phe Glu Gly Pro Arg Cys Glu35 4021062211205212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40062Val Ala Ala Arg Ser Phe Pro Pro Ser Ser Phe Val Met Phe Arg Gly1 5 10 15Leu Arg Gln Arg Phe His Leu Thr Leu Ser Leu Ser Phe Ala Thr Val20 25 30Gln Gln Ser Gly Leu Leu Phe Tyr Asn Gly Arg Leu Asn Glu Lys His35 40 45Asp Phe Leu Ala Leu Glu Leu Val Ala Gly Gln Val Arg Leu Thr Tyr50 55 60Ser Thr Gly Glu Ser Asn Thr Val Val Ser Pro Thr Val Pro Gly Gly65 70 75 80Leu Ser Asp Gly Gln Trp His Thr Val His Leu Arg Tyr Tyr Asn Lys85 90 95Pro Arg Thr Asp Ala Leu Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ser Lys Asp Lys100 105 110Val Ala Val Leu Ser Val Asp Asp Cys Asp Val Ala Val Ala Leu Gln115 120 125
Phe Gly Ala Glu Ile Gly Asn Tyr Ser Cys Ala Ala Ala Gly Val Gln130 135 140Thr Ser Ser Lys Lys Ser Leu Asp Leu Thr Gly Pro Leu Leu Leu Gly145 150 155 160Gly Val Pro Asn Leu Pro Glu Asn Phe Pro Val Ser His Lys Asp Phe165 170 175Ile Gly Cys Met Arg Asp Leu His Ile Asp Gly Arg Arg Val Asp Met180 185 190Ala Ala Phe Val Ala Asn Asn Gly Thr Met Ala Gly Cys195 200 20521063211181212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40063Pro His His Phe Arg Gly Asn Gly Thr Leu Ser Trp Asn Phe Gly Ser1 5 10 15Asp Met Ala Val Ser Val Pro Trp Tyr Leu Gly Leu Ala Phe Arg Thr20 25 30Arg Ala Thr Gln Gly Val Leu Met Gln Val Gln Ala Gly Pro His Ser35 40 45Thr Leu Leu Cys Gln Leu Asp Arg Gly Leu Leu Ser Val Thr Val Thr50 55 60Arg Gly Ser Gly Arg Ala Ser His Leu Leu Leu Asp Gln Val Thr Val65 70 75 80Ser Asp Gly Arg Trp His Asp Leu Arg Leu Glu Leu Gln Glu Glu Pro85 90 95Gly Gly Arg Arg Gly His His Val Leu Met Val Ser Leu Asp Phe Ser
100 105 110Leu Phe Gln Asp Thr Met Ala Val Gly Ser Glu Leu Gln Gly Leu Lys115 120 125Val Lys Gln Leu His Val Gly Gly Leu Pro Pro Gly Ser Ala Glu Glu130 135 140Ala Pro Gln Gly Leu Val Gly Cys Ile Gln Gly Val Trp Leu Gly Ser145 150 155 160Thr Pro Ser Gly Ser Pro Ala Leu Leu Pro Pro Ser His Arg Val Asn165 170 175Ala Glu Pro Gly Cys1802106421136212PRT213人造序列220
223鈣粘蛋白，EGF LAG七傳G型受體3的部分肽40064Cys Pro Cys Arg Pro Gly Ala Leu Gly Arg Gln Cys Asn Ser Cys Asp1 5 10 15Ser Pro Phe Ala Glu Val Thr Ala Ser Gly Cys Arg Val Leu Tyr Asp20 25 30Ala Cys Pro Lys3521065211106212PRT213人造序列220
223成骨細胞特異性鈣粘蛋白的部分肽40065Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe Val Ile Glu Glu Tyr Thr Gly Pro1 5 10 15
Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu His Ser Asp Ile Asp Ser Gly Asp20 25 30Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Glu Gly Ala Gly Thr Ile Phe35 40 45Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His Ala Thr Lys Thr Leu Asp50 55 60Arg Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr Leu Met Ala Gln Ala Val Asp Arg65 70 75 80Asp Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Val Lys Val85 90 95Gln Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe100 10521066211109212PRT213人造序列220
223成骨細胞特異性鈣粘蛋白的部分肽40066Leu His Glu Thr Tyr His Ala Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly1 5 10 15Thr Ser Val Ile Gln Val Thr Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr20 25 30Gly Asn Ser Ala Lys Leu Val Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln Pro Tyr35 40 45Phe Ser Val Glu Ala Gln Thr Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu Pro Asn50 55 60Met Asp Arg Glu Ala Lys Glu Glu Tyr His Val Val Ile Gln Ala Lys65 70 75 80Asp Met Gly Gly His Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys Val Thr
85 90 95Ile Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Lys Phe100 10521067211115212PRT213人造序列220
223成骨細胞特異性鈣粘蛋白的部分肽40067Pro Gln Arg Leu Tyr Gln Met Ser Val Ser Glu Ala Ala Val Pro Gly1 5 10 15Glu Glu Val Gly Arg Val Lys Ala Lys Asp Pro Asp Ile Gly Glu Asn20 25 30Gly Leu Val Thr Tyr Asn Ile Val Asp Gly Asp Gly Met Glu Ser Phe35 40 45Glu Ile Thr Thr Asp Tyr Glu Thr Gln Glu Gly Val Ile Lys Leu Lys50 55 60Lys Pro Val Asp Phe Glu Thr Glu Arg Ala Tyr Ser Leu Lys Val Glu65 70 75 80Ala Ala Asn Val His Ile Asp Pro Lys Phe Ile Ser Asn Gly Pro Phe85 90 95Lys Asp Thr Val Thr Val Lys Ile Ser Val Glu Asp Ala Asp Glu Pro100 105 110Pro Met Phe11521068211106212PRT213人造序列220
223成骨細胞特異性鈣粘蛋白的部分肽
40068Pro Met Phe Leu Ala Pro Ser Tyr Ile His Glu Val Gln Glu Asn Ala1 5 10 15Ala Ala Gly Thr Val Val Gly Arg Val His Ala Lys Asp Pro Asp Ala20 25 30Ala Asn Ser Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Asp Arg His Thr Asp Leu Asp35 40 45Arg Phe Phe Thr Ile Asn Pro Glu Asp Gly Phe Ile Lys Thr Thr Lys50 55 60Pro Leu Asp Arg Glu Glu Thr Ala Trp Leu Asn Ile Thr Val Phe Ala65 70 75 80Ala Glu Ile His Asn Arg His Gln Glu Ala Gln Val Pro Val Ala Ile85 90 95Arg Val Leu Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro100 10521069211126212PRT213人造序列220
223成骨細胞特異性鈣粘蛋白的部分肽40069Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe Ile Cys Glu Ser Asp Gln Thr1 5 10 15Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val Thr Ile Ser Ala Asp Asp Lys20 25 30Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe Ile Phe Ser Leu Pro Pro Glu35 40 45Ile Ile His Asn Pro Asn Phe Thr Val Arg Asp Asn Arg Asp Asn Thr50 55 60Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Phe Ser Arg Gln Lys Gln Asp
65 70 75 80Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser Asp Gly Gly Ile Pro Pro Met85 90 95Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Lys Val Cys Gly Cys Asp Val Asn100 105 110Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn Ala Glu Ala Tyr Ile Leu Asn115 120 12權利要求
1.骨移植材料，其表面上固定有誘導細胞粘著的肽和/或組織生長因子衍生的肽。
2.根據權利要求1的骨移植材料，其中，誘導細胞粘著的肽具有RGD胺基酸序列。
3.根據權利要求2的骨移植材料，其中，誘導細胞粘著的肽具有CGGRGDS(SEQ ID NO1)或CGGVACDCRGDCFC(SEQ ID NO2)胺基酸序列。
4.根據權利要求1的骨移植材料，其中，組織生長因子衍生的肽選自下列肽中的至少一個(a)骨形態發生蛋白(BMP)-2、4和6[SEQ ID NO3表示BMP-2，SEQ IDNO4表示BMP-4和SEQ ID NO5表示BMP-6]中任何一個的2-18位胺基酸序列；BMP-2的16-34位胺基酸序列(SEQ ID NO6)、47-71位胺基酸序列(SEQ ID NO7)、73-92位胺基酸序列(SEQ ID NO8)、88-105位胺基酸序列(SEQ ID NO9)、283-302位胺基酸序列(SEQ ID NO10)、335-353位胺基酸序列(SEQ ID NO11)和370-390位胺基酸序列(SEQ ID NO12)；BMP-4的74-93位胺基酸序列(SEQ ID NO13)、293-313位胺基酸序列(SEQ ID NO14)、360-379位胺基酸序列(SEQ ID NO15)和382-402位胺基酸序列(SEQ IDNO16)；BMP-6的91-110位胺基酸序列(SEQ ID NO17)、397-418位胺基酸序列(SEQ ID NO18)、472-490位胺基酸序列(SEQ ID NO19)和487-510位胺基酸序列(SEQ ID NO20)；和BMP-7的98-117位胺基酸序列(SEQ IDNO21)、320-340位胺基酸序列(SEQ ID NO22)、390-409位胺基酸序列(SEQID NO23)和405-423位胺基酸序列(SEQ ID NO24)；(b)骨涎蛋白的62-69位胺基酸序列(SEQ ID NO25)、139-148位胺基酸序列(SEQ ID NO26)、259-277位胺基酸序列(SEQ ID NO27)、199-204位胺基酸序列(SEQ ID NO28)、151-158位胺基酸序列(SEQ ID NO29)、275-291位胺基酸序列(SEQ ID NO30)、20-28位胺基酸序列(SEQ ID NO31)、65-90位胺基酸序列(SEQ ID NO32)、150-170位胺基酸序列(SEQ ID NO33)和280-290位胺基酸序列(SEQ ID NO34)；(c)轉化生長因子的242-250位胺基酸序列(SEQ ID NO35)、279-299位胺基酸序列(SEQ ID NO36)和343-361位胺基酸序列(SEQ ID NO37)；(d)血小板源生長因子的100-120位胺基酸序列(SEQ ID NO37)和121-140位胺基酸序列(SEQ ID NO39)；(e)酸性成纖維細胞生長因子的23-31位胺基酸序列(SEQ ID NO40)和97-105位胺基酸序列(SEQ ID NO41)；(f)鹼性成纖維母細胞生長因子的16-27位胺基酸序列(SEQ ID NO42)、37-42位胺基酸序列(SEQ ID NO43)和107-112位胺基酸序列(SEQ ID NO45)；(g)牙本質涎蛋白的255-275位胺基酸序列(SEQ ID NO46)、475-494位胺基酸序列(SEQ ID NO47)和551-573位胺基酸序列(SEQ ID NO48)；(h)肝素結合性EGF樣生長因子的63-83位胺基酸序列(SEQ ID NO49)、84-103位胺基酸序列(SEQ ID NO50)和121-140位胺基酸序列(SEQ ID NO52)；(i)鈣粘蛋白EGF LAG七傳G型受體3的326-350位胺基酸序列(SEQ IDNO53)、351-371位胺基酸序列(SEQ ID NO54)、372-400位胺基酸序列(SEQID NO55)、401-423位胺基酸序列(SEQ ID NO56)、434-545位胺基酸序列(SEQ ID NO57)、546-651位胺基酸序列(SEQ ID NO58)、1375-1433位胺基酸序列(SEQ ID NO59)、1435-1471位胺基酸序列(SEQ ID NO60)、1475-1514位胺基酸序列(SEQ ID NO61)、1515-1719位胺基酸序列(SEQ IDNO62)、1764-1944位胺基酸序列(SEQ ID NO63)和2096-2529位胺基酸序列(SEQID NO64)；和(j)成骨細胞特異性鈣粘蛋白(OB-cadherin)的54-159位胺基酸序列(SEQID NO65)、160-268位胺基酸序列(SEQ ID NO66)、269-383位胺基酸序列(SEQ ID NO67)、384-486位胺基酸序列(SEQ ID NO68)和487-612位胺基酸序列(SEQ ID NO69)。
5.根據權利要求4的骨移植材料，其中組織生長因子衍生的肽在N末端附加有半胱氨酸。
6.根據權利要求5的骨移植材料，其中附加的半胱氨酸是CGG間隔基形式。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的骨移植材料，其中骨移植材料選自下述中的任意一種源自生物體的骨礦物粉和源於自體骨、牛骨和豬骨的多孔塊狀物、合成的羥基磷灰石粉和多孔塊狀物、磷酸三鈣粉和多孔塊狀物、磷酸一鈣粉和多孔塊狀物、由二氧化矽製備的骨移植材料、由二氧化矽和聚合物的混合物製備的骨充填移植材料、由包括殼聚糖、聚乳酸的生物相容性聚合體製備的細顆粒和多孔支架、和鈦，以及立體支架。
8.根據權利要求5的骨移植材料，其中骨移植材料的表面固定有交聯劑。
9.根據權利要求8的骨移植材料，其中交聯劑選自下述任意一種或多種1，4-二-馬來醯亞胺基丁烷(BMB)、1，11-二-馬來醯亞胺基四甘醇(BM[PEO]4)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二醯亞胺鹽酸化物(EDC)、琥珀醯亞胺基-4-[N-馬來醯亞胺基甲基環己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯](SMCC)和硫代-SMCC、琥珀醯亞胺基6-[3-(2-吡啶二硫基)丙醯胺基]己酸酯(SPDP)和硫代-SPDP、間-馬來醯亞胺基苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)和硫代-MBS、琥珀醯亞胺基[4-(對-馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯](SMPB)和硫代-SMPB。
10.用於組織工程用途中的支架，其表面上固定有誘導細胞粘著的肽和/或組織生長因子衍生的肽。
11.根據權利要求10的用於組織工程應用中的支架，其中，誘導細胞粘著的肽具有RGD胺基酸序列。
12.根據權利要求11的用於組織工程應用的支架，其中，誘導細胞粘著的肽具有CGGRGDS(SEQ ID NO1)或CGGVACDCRGDCFC(SEQ ID NO2)胺基酸序列。
13.根據權利要求10的用於組織工程應用的支架，其中，組織生長因子衍生的肽選自下列肽中的至少一個(a)骨形態發生蛋白(BMP)-2、4和6[SEQ ID NO3表示BMP-2，SEQ IDNO4表示BMP-4和SEQ ID NO5表示BMP-6]中任何一個的2-18位胺基酸序列；BMP-2的16-34位胺基酸序列(SEQ ID NO6)、47-71位胺基酸序列(SEQ ID NO7)、73-92位胺基酸序列(SEQ ID NO8)、88-105位胺基酸序列(SEQ ID NO9)、283-302位胺基酸序列(SEQ ID NO10)、335-353位胺基酸序列(SEQ ID NO11)和370-390位胺基酸序列(SEQ ID NO12)；BMP-4的74-93位胺基酸序列(SEQ ID NO13)、293-313位胺基酸序列(SEQ ID NO14)、360-379位胺基酸序列(SEQ ID NO15)和382-402位胺基酸序列(SEQ IDNO16)；BMP-6的91-110位胺基酸序列(SEQ ID NO17)、397-418位胺基酸序列(SEQ ID NO18)、472-490位胺基酸序列(SEQ ID NO19)和487-510位胺基酸序列(SEQ ID NO20)；和BMP-7的98-117位胺基酸序列(SEQ IDNO21)、320-340位胺基酸序列(SEQ ID NO22)、390-409位胺基酸序列(SEQID NO23)和405-423位胺基酸序列(SEQ ID NO24)；(b)骨涎蛋白的62-69位胺基酸序列(SEQ ID NO25)、139-148位胺基酸序列(SEQ ID NO26)、259-277位胺基酸序列(SEQ ID NO27)、199-204位胺基酸序列(SEQ ID NO28)、151-158位胺基酸序列(SEQ ID NO29)、275-291位胺基酸序列(SEQ ID NO30)、20-28位胺基酸序列(SEQ ID NO31)、65-90位胺基酸序列(SEQ ID NO32)、150-170位胺基酸序列(SEQ ID NO33)和280-290位胺基酸序列(SEQ ID NO34)；(c)轉化生長因子的242-250位胺基酸序列(SEQ ID NO35)、279-299位胺基酸序列(SEQ ID NO36)和343-361位胺基酸序列(SEQ ID NO37)；(d)血小板源生長因子的100-120位胺基酸序列(SEQ ID NO37)和121-140位胺基酸序列(SEQ ID NO39)；(e)酸性成纖維細胞生長因子的23-31位胺基酸序列(SEQ ID NO40)和97-105位胺基酸序列(SEQ ID NO41)；(f)鹼性成纖維母細胞生長因子的16-27位胺基酸序列(SEQ ID NO42)、37-42位胺基酸序列(SEQ ID NO43)和107-112位胺基酸序列(SEQ ID NO45)；(g)牙本質涎蛋白的255-275位胺基酸序列(SEQ ID NO46)、475-494位胺基酸序列(SEQ ID NO47)和551-573位胺基酸序列(SEQ ID NO48)；(h)肝素結合性EGF樣生長因子的63-83位胺基酸序列(SEQ ID NO49)、84-103位胺基酸序列(SEQ ID NO50)和121-140位胺基酸序列(SEQ ID NO52)；(i)鈣粘蛋白EGF LAG七傳G型受體3的326-350位胺基酸序列(SEQ IDNO53)、351-371位胺基酸序列(SEQ ID NO54)、372-400位胺基酸序列(SEQID NO55)、401-423位胺基酸序列(SEQ ID NO56)、434-545位胺基酸序列(SEQ ID NO57)、546-651位胺基酸序列(SEQ ID NO58)、1375-1433位胺基酸序列(SEQ ID NO59)、1435-1471位胺基酸序列(SEQ ID NO60)、1475-1514位胺基酸序列(SEQ ID NO61)、1515-1719位胺基酸序列(SEQ IDNO62)、1764-1944位胺基酸序列(SEQ ID NO63)和2096-2529位胺基酸序列(SEQID NO64)；和(j)成骨細胞特異性鈣粘蛋白(OB-cadherin)的54-159位胺基酸序列(SEQID NO65)、160-268位胺基酸序列(SEQ ID NO66)、269-383位胺基酸序列(SEQ ID NO67)、384-486位胺基酸序列(SEQ ID NO68)和487-612位胺基酸序列(SEQ ID NO69)。
14.根據權利要求4的用於組織工程應用的支架，其中組織生長因子衍生的肽在N末端附加有半胱氨酸。
15.根據權利要求5的用於組織工程應用的支架，其中附加的半胱氨酸是CGG間隔基的形式。
16.根據權利要求10-15中任一項所述的用於組織工程應用的支架，其中骨移植材料選自下述中的任意一種源自生物體的骨礦物粉和源於自體骨、牛骨和豬骨的多孔塊狀物、合成的羥基磷灰石粉和多孔塊狀物、磷酸三鈣粉和多孔塊狀物、磷酸一鈣粉和多孔塊狀物、由二氧化矽製備的骨移植材料、由二氧化矽和聚合物的混合物製備的骨充填移植材料、由包括殼聚糖、聚乳酸的生物相容性聚合體製備的細顆粒和多孔支架、和鈦、以及立體支架。
17.根據權利要求10的用於組織工程應用的支架，用於組織工程應用的支架是屏障膜或植入物。
18.根據權利要求17的用於組織工程應用的支架，其中屏障膜是由聚乳酸製成的多孔膜；由幾丁質或殼聚糖的納米纖維製成的再生膜；或由幾丁質或殼聚糖製成的膜狀屏障膜。
19.根據權利要求17的用於組織工程應用的支架，其中植入物是鈦植入物。
20.根據權利要求17的用於組織工程應用的支架，其中植入物的表面通過氧化和硝化進行修飾，從而使活性肽易於粘著在其表面。
21.根據權利要求10的用於組織工程應用的支架，其中骨移植材料的表面固定有交聯劑。
22.根據權利要求21的用於組織工程應用的支架，其中交聯劑選自下述中的一種或多種1，4-二-馬來醯亞胺基丁烷(BMB)、1，11-二-馬來醯亞胺基四甘醇(BM[PEO]4)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二醯亞胺鹽酸化物(EDC)、琥珀醯亞胺基-4-[N-馬來醯亞胺基甲基環己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯](SMCC)和硫代-SMCC、琥珀醯亞胺基6-[3-(2-吡啶二硫基)丙醯胺基]己酸酯(SPDP)和硫代-SPDP、間-馬來醯亞胺基苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)和硫代-MBS、琥珀醯亞胺基[4-(對-馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯](SMPB)和硫代-SMPB。
全文摘要
本發明涉及用於組織工程應用的骨移植材料和支架，在其表面固定有促骨生長肽。更具體而言，本發明涉及用於組織工程應用的骨移植材料和支架，在其表面固定有誘導細胞粘著的肽和/或組織生長因子衍生的肽。藉助固定在其表面上的促骨生長肽，本發明的用於組織工程應用的骨移植材料和支架能提高與再生相關的細胞的移行、增殖和分化，從而最終使組織再生最大化。而且，固定在表面的肽具有小分子量，表明減少了施用於人體時產生免疫反應的風險，並能以穩定的形式存在於體內，從而顯示出持久效果。因此，當用於牙周組織、齒槽骨和其它的骨組織的再生時，肽使得實施外科手術更方便，並能顯示高的療效。
文檔編號A61C8/00GK1933859SQ200580008894
公開日2007年3月21日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年3月19日
發明者樸玧貞, 鄭鍾平, 李承晉, 李相勳 申請人:首爾國立大學工業基金會