純化生物物質的連續流動等電聚焦方法和設備的製作方法

2023-05-10 13:26:26 2

專利名稱：純化生物物質的連續流動等電聚焦方法和設備的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過連續流動等電聚焦(isoelectric focusing)的新方法(連續聚焦)和設備(連續聚焦器，contifocuser)純化、離析、濃縮和分離有機或生物物質，一種利用低電導場(electrically low-conductivefield)濃縮或分離帶電物質的技術。不必使用離心、過濾、吸附或載體電解質或兩性電解質緩衝液以建立合適的pH梯度。
用等電聚焦分離帶電分子，如從含蛋白質的混合物中分離蛋白質，是已知技術，其原理是帶電兩性分子在特定pH，即所謂的等電點(pI值)下淨電荷為零。如果經受一電場，物質將遷移到自身等電點的pH，因此得到分離。
靜電等電聚焦方法和設備是已知的，例如公開在WO79/00942、EP-A-256552和US 5,256,269中。這種類型設備的缺點是純化量少，其收集是以批式操作進行的。本發明技術背景描述在US 4,465,582(1982)中的連續流動電泳設備中，在電極室中應用了控制的流體流動，流動是平行的，但獨立於「工作」室中的流動。
US 5,160,594公開了一種等電聚焦設備，在每一個槽中具有強制循環，即循環等電聚焦過程。在本發明中不使用循環。美國專利使用一串裝置以防止部分純化的和未純化的兩性物質之間的混合。在每個槽中需要附加冷卻來降低電阻的發熱。通過離子選擇膜，將強酸和強鹼，即陰極電解液和陽極電解液限制在電極室中，以抗禦帶負電或正電的離子，並建立合適的pH梯度。與US 5,160,594不同，本發明使用離子選擇膜用於不同的目的，即選擇允許低分子物質通過電極空間，並從電極流出口排出。所有現有技術中的裝置都需要載體兩性電解質用於工作室，它們具有相對低的電導率和緩衝能力。US 5,160594公開的最大電導率高達600μS/cm，比本發明的高達5000μS/cm的電導率低得多。與其它現有技術的裝置一樣，不是設計用來在工業規模上進行純化的，此外，US 5,160,594沒有提供純化物質的實施例。
不使用載體兩性電解質緩衝溶液，但用於工業規模的連續流動等電聚焦方法和設備公開在匈牙利專利210,584(1992)中。該專利描述了一種通過遷移(gravitation)到分離室達到流出口高度的上流系統。該系統具有兩個非導電溶液室，其中第二室具有兩個或多個溶液流出口，以及一個溶液從第一室流入第二室底部的下流通道。一對電極位於第二室。在第二室中設置多個相鄰的間壁，間壁延伸穿過該室，以在水平方向上基本上沒有溶液的對流和逆流通道。HU 210,584的缺點是在流入溶液室中，可能自身形成梯度。溶液的流入是通過滴加進行的，難以控制。與本發明類似，匈牙利專利中的上流系統的固有梯度形成不易受損，但是，兩室系統複雜，難於構造。此外，有機溶液的分離發生在第二分離室的相對兩側，靠近電極。無機離子容易與要分離的單組分無機或生物物質混合。通過需要第二分離步驟。
發明描述本發明提供一種在導電溶液中分離物質的連續聚焦器，該設備是由非導電材料製成，包括一個磚塊狀的分離室，其具有一個液體流入口，兩個電極空間流出口，一個或多個工作溶液流出口，以及溶液從底部向上流動到頂部流出口的通道。分離室的高度、寬度和深度的比可以如3∶2∶0.2。沿分離室的兩個最窄的相對壁的豎向位置上設置一對電極。它們用於連接外部直流(DC)電源。
設備被兩個由離子選擇膜製成的間壁分為三部分。這些間壁在設備中靠近電極的兩側垂直定位，以至於它們中的每一個都離開兩端約1/25-1/15。兩間壁在底部都有開孔，其直徑為設備流入管的一半。特別地，包圍陰極空間的是陽離子選擇膜，而另一個是陰離子選擇膜。離子選擇膜具有選擇允許陽離子或陰離子通過的專一性以從廢物流出口清除。
在兩端，廢物流出孔位於電極附近，與頂邊的距離為設備的1/40-1/10。工作流出口用於收集要純化和物質，位於相同的高度，在中間。有利的是連續聚焦器具有至少三個所述流出口。除電極空間外，在流出口之間是由非導電材料製成的分割間壁，其上部四分之一閉合，從底部向上，如至其高度的四分之三處具有小的開孔。
作為進一步的改進，可以在設備的上述間壁之間的剩餘空間內放置多個相鄰交替的鋸齒形或T形或多T形間壁元件，但電極空間除外。這些也由非導電材料製成，被穿孔或由離子或分子可雙向滲透的多孔材料製成，從底部向上延伸至工作流出口最低高度，並延伸跨過室。間壁自由地放置在設備的整個寬度上，是一種新元件，使溶液基本上沒有對流，但是，使電解質或兩性顆粒在水平方向上未擾動的流動。穿孔膜成相互間隔關係，以至於提供了未擾動的垂直流動。本發明與現有技術的設備相比具有一重要的優點，它可以處理高達3,600L/天的蚯蚓酶(按現有技術HU 210,584280-300L)，生產80,000-170,000U純化酶/L/天(HU 210,58460,000-70,000U)。
本發明的另一優點是溶液或懸浮液可以具有50-5000μS/cm的電導率，而不是現有技術的裝置中的50-2000μS/cm(US5,160,594在表中描述的電導率高達600μS/cm)。
在本發明中，溶液沿所述設備中的化學惰性通道流動，垂直向上通過多個由兩膜間壁之間的垂直的流路，膜間壁將分開的電極和其間的工作空間分開。少量的溶液水平流動通過這些間壁上的小孔。在電極之間施加一偏壓(bias voltage)，使得帶電組分在水平方向上分離，並在水平方向上向跨過設備向陰極或陽極移動。當組分通過位於設備上部附近的流出口流出時，被收集。小的低分子量和帶電組分，即金屬和離子，向電極空間移動。它們經廢物流出口從設備中排出，這樣，它們與向設備中央移動的較高分子量物質分離。
在本發明中，目標物質至少包括一種以其pI值為特徵的兩性物質，所述物質被兩性雜質所包圍。當施加偏壓電勢時，由所述雜質在設備水平方向上形成pH梯度。在pH梯度上，兩性物質被驅動到其pH值與所述物質pI相當的點上，並被中和(neutralised)。因此，物質向設備上部的流出口垂直流動。
為了提高設備的能力，兩個連續聚焦器以成對構造的方式靠在一起，由防水壁隔開。這種「成對聚焦器」具有共用的電極空間(2，4)，位於設備的兩端，一對電極供兩個聚焦室使用。成對聚焦器具有共用的流入口(7)，位於設備的底部中央，入流在兩個聚焦器之間等份分配。從兩個電極空間可以設置一個或兩個電極流出口(11)。成對聚焦器在兩側都有工作流出口(12)，這一點正如最初的連續聚焦器。成對聚焦器的流量增加了一倍，分離能力也增加了一倍，但所需的電能只增加三分之一。
下面描述在工業規模上純化、分離和濃縮生物物質。不需離心、過濾、吸附步驟或額外載體兩性電解質緩衝以建立合適的pH梯度。在設備的整個寬度上垂直設置多個細分和穿孔的、顆粒可以雙向穿過的間壁，這是一種新方式，使溶液基本上沒有對流，產生了沒有擾動的垂直流體流動。
連續聚焦器被設計用來成本有效地純化如質粒、肽、胺基酸、酶、免疫球蛋白、抗原，用於診斷試劑盒，或者製備病毒或細菌亞單位疫苗、變應素，以及用於分離細胞集合體或在乳汁、血液、或尿中所含的重組體產品。連續聚焦器還可以用於從酵母或細菌發酵過程、抗生素、有機溶劑、飲用水和飲料中除去雜質或有毒物質。
連續聚焦器也可以用於分離或純化從微生物(包括細菌、真菌、酵母、藻類或其它單細胞或寡細胞(oligocellular)微生物)或動物(包括哺乳動物、昆蟲、無脊椎動物)或植物(包括海藻、浮遊生物、蘑菇、苔蘚植物、草本、或高等動物)或其一部分或其衍生物中表達或提取的產物。這些產物包括微生物表達產品，由轉基因哺乳動物—如在其乳汁中生產藥用製品的奶牛或豬—生產的物質，從林業和栽培植物中提取的物質。其例子是天然色素、農藥、木質素、多元醇如木糖醇、碳水化物、單糖或多聚糖類，如木聚糖和微晶纖維素、飲食的和其它纖維、糖蛋白、脂蛋白。
附圖簡述

圖1是本發明設備的透視圖；圖2是從垂直方向看的設備正視圖；圖3是沿圖2中線3-3垂剖的設備側視圖；圖4是沿圖2中線3-3垂剖的成對構造的設備側剖圖；圖5是具有鋸齒間壁的設備的頂視圖；圖6是具有T形間壁的設備的頂視圖；圖7是成對構造的設備的頂視圖；圖8是設備中三種間壁的頂視圖；圖9是安裝了四個間壁的設備的頂視圖；圖10是操作時沿著設備寬度方向上的電導率的曲線；圖11是本發明設備的示意側視圖。
優選方案的描述連續流動等電聚焦設備，連續聚焦器現在參看附圖，其中相似的部件用相似的標記表示。參看圖1-11，設備1包括一個通常為矩形的電化學惰性容器，具有端壁2，底板3，前壁4和後壁5。在每一個流出口之間，設備1中提供了垂直連接後壁5和前壁4的間壁6，但電極空間的流出口除外。從這些間壁的底部起的三分之一高度上，有孔，或由多孔材料製成。後壁5的底部有一流入口7，底板3的寬度W2大於設備1的寬度W1(參看圖2)，兩個電極9由間壁10與設備的其它部件分開，間壁10由離子選擇膜形成，即陰離子選擇膜靠近陽極，陽離子選擇膜靠近陰極。在設備頂部的電極流出口，電極空間與其它工作流出口12具有相同的液面。在設備1中的間壁6之間的空間由多個不太優選的C形間壁(10)，或鋸齒形穿孔間壁(13)或多個由多孔材料製成的T形間壁(6)分開，它們之間的間距分別為1cm、0.5mm和0.3mm(參看圖8)。
如圖8所示，本發明使用了要分離的含有有機或生物物質的液體溶液原料，其優選的電導率為50-5,000μS/cm。不使用載體兩性電解質來建立適當的pH梯度。來自源14的流量可以通過合適的閥15調節，閥由非導電材料製成。工作流出口12的數目取決於所用分離過程的性質。分離的溶液從出口11中的每一個收集到合適的容器16中，如圖11所示。設備1包括一個調整螺旋8，它設置在底板3的外側端，其中，螺旋8用來調節前壁4上的流出口12的水平高度。
設備1上提供了一對分開的電極9，它們與端壁2相鄰。電極9基本上從設備1的底部延伸到頂邊，是這樣安裝的例如，可以通過多個保持託座容易地插入或取出。電極9，它們是陽極或陰極，在端壁2的頂部的電連接線或插頭處終止，以利於將電極9連接與外部電源連接，如圖2中的「P」。電極9優選是化學惰性的，在處於所施加的偏壓條件下，還要能穩定地抵抗陽極和陰極在同一溶液中溶解。使用鉑和碳是令人滿意的。另外，設備的壁優選由化學和電惰性的材料形成或塗覆，如聚四氟乙烯、丙烯酸酯樹脂、陶瓷或玻璃材料。
參看圖5、6、7和8，設備1中提供了多個液體可滲透的、C形、鋸齒形、或T形垂直間壁元件13，它們從設備1的底部到正好低於流出口11和12的液面的點之間垂直延伸，並沿防水安裝的間壁6和10水平延伸，電極空間除外。C形或鋸齒形間壁13包括多個直徑為0.5-1mm的孔或洞，它們沿垂直方向等距間隔。T形間壁元件13由約50μm的多孔材料製成。垂直間壁6基本上具有與設備1相同的高度。
電極空間的間壁10是防水安裝的，它們的作用是低分子陰離子或陽離子可以從工作室向陽極空間或陰極空間通過離子選擇膜。間壁基部的小孔允許溶液有限地通過電極空間流動，以洗出濃縮離子。間壁6的上部三分之一是防水安裝的。其作用對設備的構造和在最後步驟中—經工作流出口12離開設備之前—流過設備過程中分離的液體組分的良好分離是重要的。穿孔的間壁部件13具有多種作用。第一，小孔或洞允許流體水平流動通過設備1。第二，當在電極9之間建立了電壓之時，小孔提供了多個水平的離子逆流通道。此外，多個T形或鋸齒形間壁元件13便於在設備1中形成垂直流動通道，允許在圖3、4和5所示的設備1中形成從設備1底部向上到上部的連續層流。最後，間壁13在設備1中抑制了電極9之間的擾動和水平對流。
參看圖9，設備1具有間壁6，在兩個相鄰工作流出口12之間，沿間壁的外邊沿到前壁4和後壁5之間密封，形成液體不能通過的密封。每個小室的中提供了多個間壁元件13，由間壁6分開，相應於工作流出口12。在操作中，含有要分離物質的混合物分散或溶解在蒸餾水中，起始物質的濃度應使電導率在50-5,000μS/cm之間。然後，以恆定的流速從流入口7向設備1中注入溶液或分散液。當設備1被注入到正好低於出口11-12的高度時，終止溶液的流入，調整螺旋8使流出口11-12水平對齊。然後，將電極9連接到外部電源「P」，在電極9之間加上一直流(DC)電壓降，溶液進入設備1。由於電極9之間的低電流，建立了進入設備1的溶液中的化合物水平流動。在連續聚焦過程中，要分離溶液中的組分在設備的水平方向自動形成pH梯度，含有起始物質的各種兩性組分在設備中被驅動或聚焦到具有相應於其本身pI或等電點的pH的位置。強烈極化的低分子量雜質聚焦到電極空間，並通過電極空間的廢物流出口從設備中清除。一旦組分被分離並在本身的pI下中和，它們在電場中在水平方向就不能移動了，但仍然在間壁13之間的流動通道中向著設備1的上部垂直流動。這些流出物經工作流出口12收集或丟棄。此外，溶液可以循環到原始溶液中，即容器14中，或循環到串聯的另一連續聚焦器中。設備1中的流出口12的數目取決於要分離的組分的數目。當具有不同等電點的多種組分要分離時，可以使用更多數量的流出口。為了使連續聚焦器能適應多種不同物質的分離，設備1可以這樣構造在前壁4的內部設置幾個帶滑動元件的流出口12，通過出口12打開或關閉流出通道。
一般來說，每分鐘的流量保持在設備1的室體積的十分之一。流量與設備1的體積之間的關係對設備1是有效的，其中通過增加高度同時保持設備1的寬度不變可以使其體積變大。帶電組分在電場中水平遷移所需的時間保持不變。所以增加設備的垂直高度可以允許更高的流量。如果組分的pI值與其它組分的接近，則相應於所形成的pH梯度。需要提高解析度(resolution)。這可以通過增加設備的水平長度來實現，要求較長的組分水平遷移時間和較低的流量。
確定流量上限的另一因素是在設備的整個工作空間內建立和維持穩定的pH梯度。當溶液內的兩性雜質的分子量明顯低於目標物質時，則建立pH梯度的時間短於要純化組分的遷移時間。低分子量組分的移動速度快。此外，具有極端pI值(＜pH2-＞pHl2)的物質經離子選擇膜移動到電極空間，關通過廢物流出口排出。在其中，設備內的pH梯度首先是基於低分子量的雜質的，此後，由較高分子量的組分維持。
圖10說明了穩定操作狀態下設備1內的電導率的輪廓，表明了在工作空間電導率最低，在電極空間較高，在該空間內低分子量或帶電組分被濃縮。這說明了連續聚焦器在從如水、飲料和有機溶劑中除去雜質中是有用的。
本發明設備使用簡單的靜電場，可以在無人操縱狀態下工作幾天，因為沒有需要操作人員連續照料的電化學裝置或其它裝置。對於大多數連續聚焦應用來說，優化操作特徵，即在最小電阻發熱實現快速分離所需的功率為3-50W。蚯蚓酶的工業純化本發明可以用於純化來自無脊椎動物—如加利福尼亞蚯蚓赤子愛勝蚓(Eisenia foetida)—的酶，以下將說明幾個工業應用的非限制性實例。酶以如下方法生產蚯蚓在農業殘渣中生長， 在整個堆肥中撮取和排洩，製造了生物腐植土或蠕蟲堆肥。誘引劑用於分離蚯蚓和生物腐植土，蚯蚓用自來水洗滌，通過冷凍或在容器中突然降壓來殺死，並用蒸餾水勻化。通過存活繁殖(survival breeding)選擇蚯蚓用於生產所需高濃度酶。
使用成對構造的連續聚焦器(體積為2×25L)，其流量為2.5L/min(3,600L/天)。每天可以從四個工作流出口(廢物流出口在中間)得到總量為2,000L的純化酶。使用第二連續聚焦操作以進一步純化。兩個連續聚焦操作產生的蛋白質濃度為1g/L。最終產量為約1,200L/天，酶的平均活性為80-170U/ml。與細菌發酵生產的類似製品的酶活性(0.001-0.002U/ml相比，這是有利的。10L的用於蚯蚓酶純化的連續聚焦器在1997年4月於瑞士日內瓦舉辦的國際發明展覽會上獲得了金獎。實施例1-來自赤子愛勝蚓的天然酶的分離和純化從赤子愛勝蚓獲得五種新的純化的非細菌酶。這一實施例中的酶按如下方法製備收集十公斤經遺傳選擇的赤子愛勝蚓品系。蚯蚓在-18℃下冷凍24小時，然後在含有0.1％乙二醛的4℃冷水中解凍。這一粗懸浮液一部分一部分地在高容量混合機中混合，並在100L蒸餾水中勻化。這一溶液在連續流離心機中離心分離，上清液引入到2L的連續聚焦器中。使用具有四個流出口的設備。使用250V的DC電壓，80毫安的電流，建立起100ml/min的最初流量。所有操作在4-10℃下進行。連續聚焦持續16小時。來自各個工作流出口的溶液分別收集，相應的等電點為8.3、7.0、6.5、3.2和2.8。由製備SDS電泳法獲得的每一活性酶組分通過無機和消化水解，胺基酸殘餘物通過自動胺基酸分析儀測定。對三次分析進行計數，計算胺基酸的平均量和百分數。五種酶，按pI值下降的順序，分別是Eisenase-一種具有蛋白水解活性的鹼性酶混合物，pI為8.3，pH最優值為6.0，分子量為13.2kDa，偶氮酪蛋白(azocasein)裂解活性為100-120U/mg(在37℃和pH7.5下，每分鐘每一個單位可以水解磺胺-偶氮酪蛋白(Merck Catalogue p.142,1992)由Folin-Ciocatteau試劑測得的產生1.0μM(＝181μg)酪氨酸的比色當量)。一個偶氮酪蛋白裂解活性單位(U)是蛋白水解活性的一種度量，定義為每分鐘能分解1μM偶氮酪蛋白的酶的量，在370nm下由UV光譜估計(Tomarelli等，J.Lab.Clin.Medicine 34，428，1949)。這種酶稱為「eisenase」，作為肽鏈內切酶以及肽鏈端解酶與絲氨酸的混合物，具有金屬蛋白水解(metalloproteolytic)活性，被描述在「International EnzymeClassification Catalogue」中，具有ECC 3.4.21.1，3.4.21.4，3.4.23.6，3.4.21.14中。它可以用於天然保護，如肉的包裝中，以及用於局部皮膚處理。
Fellulase-一種具有纖維素水解活性和蛋白水解活性的酶，pI為7.0，pH最優值為5.9，分子量約為54kDa。這種酶稱為「fellulase」，具有ECC 3.2.1.4的特徵。纖維素水解活性約10-20U/mg(在pH5.0和37℃下，每小時從纖維素中釋放出1.0μM葡萄糖)。Fellulase在低酸性環境中發揮纖維素水解活性。
對純化的五種酶的樣品進行分析，分析其功能和蛋白質的物理特徵。數據列於以下的兩張表中表1E.foetida酶的功能和物理蛋白質特徵
a由連續聚焦測定的等電點。
b≥最大活性50％的範圍。
c由SDS-PAGE測定的。
d由胺基酸含量(未糖基化的)計算得到的。
e完全水解所測定的總數。
f通過對聚絲氨酸、聚精氨酸、聚色氨酸以及聚色氨酸精氨酸的活性測定的。
g在37℃和pH6.9下通過對澱粉的活性測定的。
h在20℃和pH4.8下通過對澱粉的活性測定的(在這一研究中，在一個酶催化活性線上，通過製備SDS電泳僅獲得了α-澱粉酶。β-澱粉酶的損失可能是由於在SDS中的離解)i通過對纖維素天青(Cellulose azure)(Merck)Fernley，N.H.，Hiochem.，J.，87，90(1963)的活性測定的。
j通過對甘油三酯No.339(Merck)的活性測定的。
kMichaelis常數是通過每種單一酶對特異底物測定的。
l表示酶的活性為0.1U的數量級。
表2E.foetida酶的胺基酸組成(值±5％)<
Fetilase-一種具有α-和β-澱粉分解、尤其是蛋白水解活性的酶，pI為6.5，pH最優值為7.2，分子量約為29kDa，分解偶氮酪蛋白的活性為80-100U/mg。這種酶稱為「fetilase」，具有ECC 3.2.1.1，3.2.1.2，3.4.22.6的特徵。fetilase澱粉分解的活性約為20-40U/mg(每一單位在pH6.9和37℃下，3分鐘內從澱粉中釋放出1.0mg麥芽糖(P.Bernfeld「Methods in Enzymology 1，149，1955」))。Fetilase可以用作啤酒釀造過程中的低大麥澱粉酶的替代物，和作為藥物中胰腺的酶替代物。
Fetipase-一種具有脂解活性和略微有一些蛋白水解活性的酶，pI為3.2，pH最優值為4.6，分子量約為14.5kDa，分解偶氮酪蛋白的活性為80-100U/mg。這種酶稱為「fetipase」，具有ECC 3.1.1.1，3.1.1.3，3.4.2.6的特徵。Fetipase的脂解活性約為20U/mg(每一單位在pH7.7和37℃下，一個小時內從甘油三酯內水解出1.0meq脂肪酸)。Fetipase可以用作洗滌組合物中的活性物質。
Wormase-一種具有蛋白水解活性的酸性酶混合物，pI為約2.8，pH最優值為3.6，分子量約為31kDa，分解偶氮酪蛋白的活性為80-100U/mg(在pH7.5和37℃下，測得每分鐘每一單位水解酪蛋白產生相當於1.0μM(＝181μg)酪氨酸的比色當量)。這種酶稱為「Wormase」，具有ECC 3.4.23.1，3.4.23.6和3.4.22.3的特徵。Wormase可以用於洗滌粉，用於食品和飲料工業，特別在相對低的pH下分解不需要的蛋白質；而在果汁、啤酒和酒的應用中，一般其pH的範圍為3.9-6.0。該酶能降低約70％的蛋白質含量，可以減少、或者可以取消飲料生產過程中的過濾步驟。實施例2-赤子愛勝蚓酶混合物的工業用途酶混合物(enzymmix)是多種酶的組合物，由wormase、eisenase、fetipase和fetilase組成，其比率為30∶40∶15∶15，其活性如下wormase＝65-90U/ml，eisenase＝80-100U/ml，fetilase＝60-90U/ml，fetipase＝60-90U/ml。通過水解，酶混合物主要分解和降解蛋白質，也分解和降低澱粉和脂類。蛋白質殘餘物(來自啤酒和葡萄酒)、澱粉、肌蛋白(肉和培根中)被部分裂解或降解，獲得改進的味道。酶混合物可以取代廢水的細菌純化，而不需曝氣。酶混合物可以用於生物洗滌粉、洗滌粉、清洗產品、肥皂、牙膏、香波等。酶混合物可以與表面活性劑結合使用，請參看下面的描述。酶混合物可以用於將汙水中多氯雙酚(polychlorobiphenyls)(PCB′s)的濃度從40μg/L降低到5μg/L。酶混合物不會對人體或皮膚引起變應性、溼疹或毒性。與細菌發酵生產的類似產品相比，它含有的總蛋白質少30倍。
Recultol用於補救(remediation)尤其被礦物油汙染物汙染的土壤。它由酶混合物和一半體積的長鏈(C23)二羧酸表面活性劑，即所謂的「laurylan」。Recultol可以分兩次噴灑到受害的區域而直接施加到土壤上，或者可以加入到下層土壤區域中的強制水循環中。1毫升Recultol可以裂解50毫克汙染物。要補救的土壤的平均劑量是300-700L/HA加150-300L laurylan。Recultol可以用於加速垃圾堆場地的分解。其特殊的用途是清理油輪，因為其酶催化活性不受較高的鹽濃度的幹擾。從海上漏油的補救可以通過將酶混合物附著到載體上來實現，這種載體優選是一種可降解產品，其密度應能浮在油相的上面，還具有憎水-油相的性質。兩種製備都包括通過從工廠連續聚焦獲得的可降解顏料，紅色或白色。上表面的顏色將從白色變到粉紅色。在固體表面的情況下，水泥、混凝土、鐵路等，用Recultol補救可以在高壓下，用在1,000L溫水(高達50℃)中的1L酶混合物和1L laurylan的混合物來實現。
Sanamor是一種液體洗滌工具，含有酶混合物、表面活性劑和消毒劑，0.1％的乙二醛。Sanamor可以用於洗滌肉、牛奶和食品工業的管道和設備。Sanamor可以代替需要高溫而且必須用大量水洗淨的酸和氫氧化物。Sanamor的稀釋因子為1∶100-1∶200，工作溫度為40℃。僅僅需要在標準時間20分鐘洗滌一次即可。Sanamor的另一好處是可以清除隱藏在管道角落的沉積物和汙垢。它能裂開有機基質。因此，酶和水解產物可以通過對整個管道系統進行一次總的清洗就能洗淨。通過向雞和其排棄物上定期噴灑Sanamor可以減少雞舍中NH4的排放。因為雞舍中三分之二的NH4排放是由細菌在排棄物中作用產生的，因此處理排棄物是必須的。
酶預混物(Enzympremix)是同一混合物，但酶被吸附地適當的載體上，如沸石或膨潤土上。飼料混合物可以加入到半自動養殖裝置的雞或豬的飼料中，作為生長促進劑以提高飼料的轉化率。它還降低了a.o.，動物合成自身酶所需的能量。在用酶預混物進行的試驗中，沒有在處理的動物和動物飼養者身上觀察到副作用或毒性。對小鼠來說，不能確定致死劑量，因為這些材料似乎是作為正常食物被消耗了。
在這一實施例中，為了比較，製備的酶混合物分兩組實驗，10,000隻半自動養殖裝置中餵養的雞(Omega BT Kft.，匈牙利，布達佩斯1078)。在生命的第一周，兩組都餵食雛雞前期飼料，從第二周起，兩組都餵帶有抗菌素的高能量飼料，在最後一周(第7周)，最終混合物不帶抗菌素。水供應不限量。兩組的唯一區別是從生命的第二天起，在混合飼料混合物時，每噸要供應的飼料中混入1升酶混合物。在達到所需的體重後，可以在兩組間觀察到明顯的差別，接受酶混合物的一組是有利的。區別在於(1)在短時間內生長較快，每隻雞的最終體重高200克(在36天內獲得的平均體重為2,000克對42天1,800克)，(2)加酶組的飼料轉化率高9.5％，(3)總損失減少52％(總死亡率為5.5％對11.5％)。在飼料混合物中加入酶混合物，和用Sanamor噴灑雞群和排棄物配合起來進行，在4天的期間內，酶混合物組的雞舍氣味好。明顯降低了NH4的排放，但未精確測量。在這種情況下，總的NH4排放量減少了70％。實施例3-溶菌酶的分離溶菌酶是一存在於眼淚和蛋清中的酶。例如，從2,000隻蛋中收集蛋清(約50升)，稀釋在冰冷的蒸餾水中，達150升，所有操作在約4℃下進行。溶液過濾，並引入到具有三個流出口(加兩個電極流出口)的4升連續聚焦器中。連續聚焦器開始時填充蒸餾水。流量調節到75ml/min，建立1,000V的DC電壓，系統最初的功率為1.5W。在加入了粗蛋清懸浮液後，功率升高到10.5W。連續聚焦器運行34小時。在最靠近陰電極的工作流出口收集40升這種材料，pH10.5，含有溶菌酶的濃度為200U/ml。這種懸浮液逐漸引入具有三個工作流出口和兩個電極流出口的1升的連續聚焦器。蒸餾水的流量調節到10ml/min，1,000V/DC。最初的輸出功率為1.6W，在添加了溶菌酶懸浮液後升高到5W。連續聚焦器運行3天。在pH10.5下從最靠近陰極的流出口收集流出物，分析結果是溶菌酶的活性為1,500U/ml。這一組分為12升，此後分四份引入到200×1500mm的色譜柱，柱中填有分子篩凝膠Spheron P-200，收集到25毫升組分。確定蛋白質含量和溶菌酶的活性。觀察到五個蛋白質峰。第一個峰含有純化的溶菌酶，其蛋白質裂解活性為20,000U/g。實施例4-α-澱粉酶的分離枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株在基礎科學、醫學和工業上具有重要性，由於幾個實驗室的共同努力，近來已對其整個基因組(genome)進行了測序(Nature 390，p237和p1249，1997)。這一形成孢子的革蘭氏陽性菌的順序提供了革蘭氏陽性病原體對抗生素抗藥性的線索，對幾種在工業上使用的酶進行了編碼。
在這一實施例中，枯草芽孢桿菌菌株A-200是在500L的發酵罐中在37℃下培養12小時得到的。當用光譜在550nm下測定得到的值＞0.5時，終止細菌的生長。經分離器從培養基中分離出細菌群。上清液引入10L的連續聚焦器，流量為250ml/min，施加的DC電壓為350V。使用帶三個工作流出口的連續聚焦器，在兩個電極側具有兩個流出口，一個在設備的中間。電極流出口的流出液被丟棄掉，從中間流出口流出的溶液被引入5L的第二連續聚焦器。再使用帶三個流出口的設備，純化的α-澱粉酶從中間收集。流量調節到100ml/min，施加的DC電壓為500V。中間流出口產生相對純化的α-澱粉酶，澱粉水解活性為200U/g。實施例5-胰島素的分離在這一實施例中，將市售的胰島素(NovoNordisk，DK)懸浮在蒸餾水中，濃度為1mg/ml。將3升這種懸浮液引入到1L的連續聚焦器中，該連續聚焦器具有五個流出口(兩個電極流出口，三個用於收集工作溶液的流出口)。條件是流量25ml/min，DC電壓400V，功率8W的電流。連續聚焦器運行2小時。在靠近陽極的第一工作流出口，收集800ml純化的胰島素。對比PAGE分析顯示，對於未處理的胰島素製劑中，在12-8kB之間有四條泳道。在進行了連續聚焦後，相應於純化的胰島素，僅在10kB上觀察到二條泳道。如果胰島素需要進一步純化，可以進行額外的凝膠色譜分離，使用100×500mm色譜柱，柱中填充Spheron P-20。純化的胰島素出現在第一蛋白質峰。實施例6-細胞溶素的純化工業級細胞溶素可以從不同的來源獲得。可以用作使動物飼料升級的胺基酸原料。如果需要高純度的細胞溶素，不得不使用多個複雜步驟，而使得最終產品更加昂貴。在這實施例中，用本發明來純化細胞溶素。工業級的細胞溶素被稀釋在蒸餾水中，濃度為3％。電導率為2,000μS/cm。將500升這種溶液引入到3L的連續聚焦器中，該連續聚焦器具有如實施例5設置的五個流出口。從第一流出口收集純化的細胞溶素，其電導率約500μS/cm，細胞溶素的濃度＞15％。輸入蛋白質的損失為約5-10％，但這包括來自原細菌發酵的雜質的損失。實施例7-威士忌酒的純化對於大多數酒精餾出物，需要一個或兩個蒸餾步驟以除去各種不希望的雜質，如乙酸戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二烷酸乙酯，它們破壞了酒的味道。除去這些不希望組分僅可以通過額外的蒸餾來實現。本發明提供了一種成本有效的純化方法。在這一實施例中，一種加拿大品牌的威士忌酒被引入到10L的連續聚焦器中。流量為1L/min，DC電壓調節到1,000V，電流為10mA，功率為10W。使用三個工作流出口(兩個電極流出口和一個在中間的流出口)。從所有流出口獲得的威士忌酒經全體專家評判其顏色、氣味和味道的差別，只有從第三個流出口收集的樣品需要進一步蒸餾。另外兩個樣品被混合，改進了質量和味道。氣相色譜分析說明各組分的變化如下乙酸戊酯從0.04下降到0.01mg/100ml、己酸乙酯從0.05下降到0.02、辛酸乙酯從0.03下降到0.01、癸酸乙酯從0.025下降到0.001、十二烷酸乙酯從0.01下降到0.005mg/100ml。實施例8-伏特加酒的純化在這一實施例中，20升斯洛伐克和荷蘭品牌的伏特加酒被引入3升的連續聚焦器中。流量為3L/hr，開始時的DC電壓設定在275V，電流為80mA，功率為22W。由於從廢物流出口除去了電解質，電導率下降。電源上升到750V，電流下降，功率為12-18W。兩個工作流出口對應40％和60％的工作室。在兩個工作流出口和廢物流出口測定的酒精濃度均為41％。從靠近陰極側的第一個工作流出口獲得的伏特加味道「辛辣」，可以用作「清洗」酒精。第二工作流出口產生的伏特加味道「軟(soft)」。多不飽和脂肪酸以及醛的濃度分別下降75％和80％。在1997年4月於瑞士日內瓦舉辦的第25屆國際發明展覽會上，該展品獲得了金獎。
成對構造的連續聚焦器用於純化伏特加的流量為5L/min，即7,200L/天。每天總共獲得6,800升純化的伏特加。在這一純化過程中，多不飽和脂肪酸和醛的含量分別下降68％和88％。實施例9-葡萄酒的純化天然葡萄酒含有高濃度的酸性組分。此外，由於過度發酵質量可能變差，或者殘留的酵母產品可能引起變壞。使用常用的方法很難除去酸性特徵和人為的(artificial)味道。本發明提供了一種在本實施例中展示的改進葡萄酒質量的技術方案50升帶酸味的Tocai葡萄酒，其pH為3.8，被引入到10升的連續聚焦器中，流量調節到200ml/min，在電極間建立250V的DC電壓。該設備具有三個工作流出口，包括兩個廢物流出口。分離進行4小時。流出物由全體葡萄酒品嘗專家評判其顏色、氣味和味道。從中間的工作流出口和陰極流出口收集到改善了的葡萄酒。樣品被混合在一起，得到了改進質量的葡萄酒，pH為5.2。輸入量的80％得到了回收。電導率從1,670μS/cm下降到1,200μS/cm，表明不希望的帶電低分子被除去了。實施例10-飲用水的純化飲用水的純化和生產取決於水的供應源。最後一個純化步驟通常是花費最大或最困難的。通過吸附過濾可以除去細菌汙染，但化學汙染物更難處理，如亞硝酸鹽、硝酸鹽以及各種金屬會產生更大的問題。
本發明提供了一種在相對小的規模上純化水的工具，如以最小的能量和設備成本用於家庭、車隊、農場和工廠。本發明設備能處理的最高鹽濃度約為900-1,200mg/L。因此，不能用這種連續聚焦器進行海水脫鹽。內部體積為1升的設備，最大生產能力為約150L/天。如果5個設備平行設置，能純化水約750L/天。
在這一實施例中，向帶有一個工作流出口和兩個靠近電極的流出口的10L連續聚焦器中引入1L/min的流量。DC電源調節到100V和一個電流值，使功率為25W。分析表明，中間流出口產生純化的飲用水，而電極流出口的流出物含有大量不希望的離子和元素。水的體積損失為15-20％。這一實驗的分析結果如下組分 前 後組分 前後銅8.71.6 鋅 71.0 12.4鐵12.3 1.2 砷 0.12 0.04鎳0.05 痕量 鉛 0.71 0.05鉻3.14 0.8 鎘 痕量 無汞0.05 痕量從中間工作流出口獲得的飲用水的質量可以通過調節電壓、功率和/或流量來調整。室體積或設備的數量可以根據所需條件來布置，例如，對有200頭家畜的使用深井飲用水的農場，家畜需要約40,000L/天，或40,000∶24∶60＝28L/min的流量。因此，需要六個10升的連續聚焦器，其流量為5L/min。實施例11-免疫球蛋白的分離11a.小鼠在這一實施例中，我們使用300ml用兔IgG(Sevac，Prague)免疫的小鼠的血清庫。這一血清用冰冷的蒸餾水按1∶3的比例稀釋，1,200ml的這種溶液用於1L的連續聚焦器，該連續聚焦器具有五個預定的流出口。連續聚焦器開始時填充蒸餾水。流量調節到8ml/min，DC電壓1,000V，系統起始的輸出功率為1.6W。在加入了血清後，由於電導率的升高，功率提高到5W。連續聚焦進行約3小時。通過免疫電泳對五個流出口進行免疫球蛋白測試。在陽極側第二流出口處檢測到免疫球蛋白，pH在4至6之間。當用抗兔IgG的抗血清進行被動血凝試驗時，這一流出口的抗IgG滴度為1∶128。將180毫升的這一材料引入色譜柱，柱中填充Spheron P-200，用蒸餾水保持平衡。收集10毫升組分，檢測免疫球蛋白的存在。證明有四個蛋白質峰。在第一峰中存在半純化的免疫球蛋白，其濃度為0.5mg/ml。被動血凝試驗所得到的結果是抗IgG滴度為1∶1024。收集該峰的所有這些樣品，用冷凍乾燥進一步濃縮。
11b.人在這一實施例中，純化具有抗B肝病毒抗原(HBsAg)抗體的人血清庫。用蒸餾水將2升血清稀釋到8升，即稀釋因子為1∶4，用尿素飽和到8M；加入0.1％的乙二醛。最後體積為10升，引入具有四個流出口的1升的連續聚焦器中。將流量調節到0.25L/小時，起始的DC輸出功率是10W。在加入血清後，功率升高到14W。連續聚焦器運行5小時。從陽極側第二個流出口收集蛋白質主體，8mg/ml，包括特異抗體，pH為5.6。總共收集2升。在血凝試驗中，抗HBsAg免疫球蛋白的滴度為1∶512。HBsAg抗體可以按如下所述進一步通過凝膠色譜來純化半純化的血清樣品分成五份，每份400毫升，每一份都引入單獨的色譜柱，柱中填充Spheron P-200。獲得四個蛋白質峰。第一峰含有特定抗體。從五個凝膠色譜分離過程中收集所有的特定抗體，並稀釋在總體積為4,500毫升的蒸餾水中。然後重複上述連續聚焦。從中間的兩個流出口收集HBsAg抗體，其pH分別為5.1和5.4。
本發明可有效地製備針對由如酶、蛋白酶、毒素或病毒功細菌表面蛋白質誘導的光譜免疫應答的抗抗體。在免疫調節的網絡理論(JerneAnn.Immunol.125373-389)中，抗獨特型抗體的模擬特性被描述為抗原的有功能的內部反映。採用本發明純化免疫球蛋白組分的方法，我們已開始了中試研究，製備抗經典的豬瘟病毒—屬於瘟病毒屬(Pestivirus genus)—的疫苗。
11c.豬在這一實施例中，使用以Chinese C毒株為基礎的市售的豬瘟病毒(SFV)疫苗對五頭體重100千克的豬進行免疫。在免疫五周後，殺掉豬並放血。在800rpm下離心獲得10升血清。血清用蒸餾水稀釋三倍，得30升，並用尿素飽和到8M；加入0.1％的乙二醛。這一材料引入到有五個流出口的2L連續聚焦器中。開始時的條件是流量調節到100ml/min，DC電源為250V。連續聚焦運行5小時。從兩個流出口，第一流出口pH4.5，第二流出口pH6.2，收集的樣品中觀察到特異的抗SFV抗體。使用SFV中和(VNT)試劑盒(Sevac，Prague)(因為這完全是未曾預料的觀察，原始SFV疫苗經過了聚焦操作，也說明其中SFV疫苗包括兩種SFV，可能包括SFV E2(gp55)和SFV ERNS表位，兩者誘導中和抗SFV抗體。VNT表明兩個病毒峰都是SFV特異的，沒有觀察到BVD病毒的汙染)。因此獲得了兩種抗SFV血清組分(L)。這兩種組分都冷凍乾燥，然後稀釋在含0.9％NaCl的蒸餾水中，使蛋白質濃度為3mg/ml，分別引入到填充了SpheronP-40的色譜柱，每個組分進行一次。pH6.2的組分產生一種VNT抗體滴度為1∶512的蛋白質組分。pH4.5的組分在通過凝膠色譜後產生了四個蛋白質組分。兩個峰是SFV抗體陽性的，VNT抗體滴度為1∶64。三個單個的SFV抗體陽性組分和三個混合的SFV抗體陽體組分用於山羊免疫，以研究本發明是否能製備針對豬瘟的抗獨特型疫苗。實施例12-新的抗大腸桿菌(E.Coli)感染的亞單位疫苗的製備按現有技術，已開發了抗E.Coli的各種粘著因子的一系列疫苗。對於這些粘著因子，每一個都進行單獨的發酵步驟。這一實施例描述了一種獨特的多組分亞單位重組體疫苗，是針對牛、豬和綿羊的E.coli感染的，為此，僅需要一個細菌發酵步驟。第二個改進是按本發明的生產遺傳修飾的E.coli構造體是由攜帶K 88 ab抗原的E.coli菌株G-7(從Veterinary Faculty，University of Kosice，SK購得)；攜帶K 88 ac抗原的E.coli菌株U-200(State Veterinary UniversityMontevideo，Uruguary)；攜帶K-99抗原和攜帶Lt腸毒素抗原的E.coli菌株S-IH(CZ Collection of Microorganisims，Brno，SK)；和E.coli987-P菌株(Dr.Salajka，Ivanovice na Hane，CZ)製備的。使用限制性內切酶BglI、BglII和Pst，克隆編碼質粒的抗原，經分析和製備PAGE，分離出20-90kDa的DNA鏈，並以各種組合經Lambda L4連接酶連接。通過電穿孔將這種構造體轉染到無質粒的E.coli菌株H-110中。選擇兩種編碼抗氯黴素和四環素的構建體，它們含有所有上述粘著因子和腸毒素。K88 ab、ac、K99、987/P和Lt腸毒素基因的整合和表達通過血凝測驗檢測。使用五十個順序的細菌培養步驟以證明所有外源抗原的整合和表達的穩定性。修飾的E.coli菌株H-110在一個300L的發酵罐中培養。培養8小時後，收集細菌培養物，並在800rpm下離心。得到750g細菌沉澱物，這一材料在20L冰冷的蒸餾水中剪切表面蛋白質(菌毛)10分鐘。第一次剪切後，溶液再在3,000rpm下離心，收集上清液。剩下的沉澱物稀釋在冰冷的20L蒸餾水中，加入750g玻璃珠，並混合10分鐘。表面蛋白質在九個流出口的連續聚焦器中進一步純化，其中兩個靠近電極，四個工作流出口，以及它們之間的三個廢物流出口。連續聚焦器在75ml/min的流量、500VDC電壓、14W、4℃的條件下運行9小時。從第2、4、6、8(工作)流出口流出的溶液，相應pH4.5-5.0、pH6.0-7.0、7.0-7.5、pH9.5-10.0，分別生產了純化的組分，分別含有K 88 ab，ac；987-P；腸毒素LT；和K99抗原。由被動血凝試驗測定其滴度，純化的抗原可以被稀釋5-10倍以達到1∶512的滴度。不需要濃縮步驟。製備包括0.5mg/ml的K 88 ab，ac，K99，987/P和LT腸毒素抗原的穩定油乳液。加入助劑(Spe-col，20％W/W，ID-DLO Institute，Lelystad，NL)和0.1％乙二醛。用這種新的重組體亞單位疫苗使離分娩還有五周的妊娠母牛接種，以獲得被動免疫後代。觀察到小牛的母體抗體滴度高於現有技術疫苗所觀察到的2-3倍。觀察到的由於E.coli腹瀉和E.coli膿毒產生的損失較小(1.5％)。用致病E.coli菌株(2ml，含有109個細菌/ml)進行攻擊實驗，沒有導致高的死亡率。這種疫苗特別適合於不能獲得或不因其它原因不想使用抗生素的飼養業。實施例13-多核苷酸的純化現有技術中已經使用等電聚焦程序基於抗生素的抗藥性來分離攜帶E.coli粘著因子的不均勻性DNA質粒，這種E.coli粘著因子是E.coli腹瀉膿毒的一種病原體。在本實施例中，按Maniatis et al.Bacteriology(1982)標準方法，從E.coli菌株F 027(質粒RMS 151)、C 600(RSF 1010)和J 53(pSa)分離DNA質粒。用3％甘油的蒸餾水溶液以稀釋DNA質粒。1升的每種質粒，含有約7μg的純DNA/100ml，用於連續聚焦。使用具有9個工作流出口的0.5升的小連續聚焦器。流量為50ml/hr。對於每一質粒的製備，運行10小時。獲得了如下結果質粒RMS 151分離成兩個組分，在第一和第三陽極流出口，pH分別為2.7和4.1。基於針對抗生素的抗藥性，質粒DNA等電分離產生的組分具有不同的性質即原始的質粒RNS 151對四環素和氨苄青黴素都有抗藥性，而現在僅一個組分對四環素具有抗藥性，另一組分僅對氨苄青黴素具有抗藥性。質粒pSa被分離成三個組分，出現在第一、第二和第三個陽極流出口，pH分別為2.1、3.4和4.2。然而，質粒RFS 1010在連續聚焦後還保持均一性，僅從第二陽極流出口收集到一個具有四環素和氨苄青黴素抗藥性的組分，pH為2.9。通過紫外光譜測定，質粒濃度升高到20-28μg DNA/100ml，是原始樣品的4倍。對於RMS 151和pSa質粒的每一組分，也測得了類似的濃度。
本發明在純化DNA上的優點是純化的質粒是基於不同的pI值獲得的，對抗生素具有不同的抗藥性，同時達到了4倍的濃度。對大規模生產而言，兩者都是很重要的。實施例14-四環素的純化現有等電聚焦方法用於純化從Spofa CSFR(United Pharma-ceutical Works，CZ)購得的市售四環素製劑。四環素被分離成四個具有不同顏色和pH值的四個峰，在抗E.coli的抗生素抗藥性實驗中，一個組分表現出提高的殺菌活性，兩個在抗鏈球菌(Streptococcus spp)中具有提高的殺菌活性。在pH6.8下收集的純化樣品具有94％的抑制作用，而原始四環素只有85％。在pH2.3下收集的一個組分含有白三烯，是具有三個共軛雙鍵的花生四烯酸的一組具有生物活性的代謝產物，能引起毒性和變應性的反應。在使用本發明的生產過程中，這些多不飽和脂肪酸可以除去。
在本實施例中，200克同一品牌的市售四環素溶解在2升的含30％乙醇的蒸餾水中，並引入800毫升的具有8個工作流出口的連續聚焦器中。流量調節到40ml/min，DC電源的起始輸出功率調節到4W。從奇數流出口中收集四個組分，即在pH2.2下得到棕色、在pH6.8下得到亮黃色、在pH7.9下得到橙黃色、在pH9.2下得到橙色組分。四個廢物流出口位於其間。四個組分進行抗E.coli G7菌株和金黃色葡萄球菌(Streptococcus aureus)，Cat，No.644 527(Czech Collection ofMicroorganisms)的殺菌實驗。在圓片周圍細菌充分生長的區域標記為「-」，有圓片大小的空白區域標記為「+」，在圓片大小兩倍的區域沒有細菌生長標記為「++」，更大的區域標記為「+++」。記錄pH2.2、6.8、7.9和9.2的組分在抗兩種菌株上的殺菌活性，從陽極側記錄分別為「-」、「+++」、「++」和「+」。此結果說明，可以使用成對構造的連續聚焦器(2×25L體積)，其流量為2.5L/min(3600L/天)。每天可以從pH6.8的流出口得到360升純化的四環素。中試研究可以確定是否可以獲得類似的殺菌活性得以增強、毒素得以去除的其它抗生素產品。
權利要求
1.一種通過等電聚焦分離液體介質中的帶電物質的連續流動設備，包括分離室，一對放置在分離室中的其橫截端部的垂直電極，位於室上部同一高度的兩個或多個流出口，所述兩個或多個流出口的每一個之間的至少在所述流出口高度上分割所述室的垂直壁，至少一個可滲透垂直間壁，其特徵在於該設備進一步包括用於將電極空間與所述液體室中央部分分開的、位於陰極附近的垂直陽離子選擇膜和位於陽極附近的垂直陰離子選擇膜，在每個電極空間內的位於所述室上部的輔助流出口。
2.權利要求1的連續流動等電聚焦設備，其中所述離子選擇膜分別可以滲透低分子量陽離子和陰離子，對高分子量物質基本上是不可滲透的。
3.權利要求1或2的連續流動等電聚焦設備，其中所述可滲透垂直間壁被構造以防止水平擾動，如鋸齒形壁或T形壁。
4.權利要求1-3中任何一項的連續流動等電聚焦設備，包括至少三個所述主流出口。
5.權利要求1-4中任何一項的連續流動等電聚焦設備，進一步包括基本上垂直於所述垂直壁的垂直交叉壁，在所述交叉壁的任一側提供流出口。
6.一種從含水混合物中分離或純化物質的方法，其特徵在於使用權利要求1-5中任何一項的連續流動等電聚焦設備。
7.權利要求6的方法，其中維持含水混合物向上的單向流動。
8.權利要求7的方法，其中所述單向流動的流量為25-250L/L/天。
9.權利要求6-8中任何一項的方法，其中要分離的物質包括飲用水或其它含有或不含有酒精的飲料中的雜質。
10.權利要求6-8中任何一項的方法，其中所述物質是多核苷酸、胺基酸、肽、蛋白質，包括抗原和免疫球蛋白、酶、抗生素、變應素、生物鹼、或來自細胞培養的組分。
11.權利要求6-8中任何一項的方法，其中所述物質是由微生物、陸生或海洋動物或植物或其一部分表達或提取的物質或其衍生物。
12.由權利要求10或11的方法獲得的純化物質。
13.含有由權利要求10或11的方法獲得的抗原的疫苗或試劑盒。
14.一種從蚯蚓，特別是從物種赤子愛勝蚓，得到的純化水解酶，相應於具有表1和/或2中的一個或多個特徵的eisenase、fellulase、fetilase、fetipase、wormase，或其兩種或多種的混合物。
15.權利要求14的酶或其混合物在補救土壤和土壤下層水、除去海水中的油洩漏、廢水處理和清洗海船(油船)中的應用。
16.權利要求14的酶或其混合物在清潔屠宰場、擠奶機、(汽車)清洗機、浴室、地板、管道和設備中的應用。
17.權利要求14的酶或其混合物作為生長促進劑的應用。
18.權利要求14的酶或其混合物在氣味處理或減少氨排放中的應用。
19.權利要求14的酶或其混合物在香波或牙膏中的應用。
20.權利要求14的fetilase作為釀造助劑的應用。
全文摘要
本發明提供了一種通過等電聚焦從溶液或懸浮液中以工業化的規模分離和純化帶電物質的設備和方法。該設備包括分離室,一對放置在分離室中的端部的垂直電極(9),位於每一個電極(9)附近用於將電極空間和設備中央部分分開的陰離子或陽離子選擇膜(10),位於室上部的用於分離液體組分的一個或多個流出口(12),位於每個電極空間上部的輔助流出口(11),至少在所述流出口(11,12)高度上在每一個所述的流出口之間的、隔開所述室的一個或多個垂直壁(6),多個保證無對流地向上流動的可滲透的垂直間壁(13)。本發明設備不需額外的兩性緩衝溶液以建立合適的pH梯度,能用於純化多核苷酸、胺基酸、肽、蛋白質、有機溶劑和飲料。
文檔編號C02F1/469GK1251538SQ98802715
公開日2000年4月26日 申請日期1998年2月20日 優先權日1997年2月20日
發明者赫爾本·福佩·德伯爾, 奧託·索瓦 申請人:塞爾伯呂企業公司