細胞染色試劑及其配製方法和在細胞染色中的應用的製作方法

2023-04-29 12:23:06 2

專利名稱：：細胞染色試劑及其配製方法和在細胞染色中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種能同時分別將細胞核與細胞質染上不同顏色的細胞染色試劑，及其配製方法和在細胞染色中的應用。
背景技術：
：近一個世紀以來，隨著醫學的發展，病理研究的深入，對細胞的定性和定量檢測己成為醫學上的常用方法。細胞形態學分析就是對細胞進行定性檢測的方法，通過在顯微鏡下觀察脫落細胞的形態學特徵來對細胞進行定性分析，以供是否作進一步病理分析作參考。為了對細胞進行觀察，通常要先對整個細胞進行染色，令細胞膜、細胞質和細胞核可以容易的在顯微鏡下觀察，常用的染色方法有蘇木精伊紅染色法(同組織切片染色)、巴氏染色法、紹氏染色法、邁格吉染色等。在細胞形態學分析中僅有幾種描述性的細胞特徵(如很大的細胞核、很大的核漿比例或者顆粒化嚴重的細胞核等)，但是，這些觀察都是主觀的，不具有很好的重複性，而且細胞學家必須經過很好的訓練才能正確地檢測和診斷疾病。此外，由於此種觀測方法主觀因素太強，醫生自身及醫生之間存在著很大的差異，容易導致分析不夠準確。雖然細胞形態學分析的診斷準確率只有60%左右，但在近一個世紀以來仍然在醫學中得到了廣泛的應用。許多國家幾十年的防癌普査結果證實，用巴氏塗片作為子宮頸癌的篩査方法可以及早對子宮頸癌發現和治療，使子宮頸癌死亡率明顯下降。然而，由於受取材方法、塗片製作、染色技巧、閱片水平等因素影響，導致巴氏細胞學方法假陰性率達15%40%。巴氏方法的另一不足是與其它常規細胞病理學診斷方法一樣，對子宮頸癌前病變的發展趨向無法進行預測評估。自從1924年Feulgen(福爾根)等人建立了DNA-Feulgen染色方法以來，至今這種方法仍是DNA定量測定的主要染色方法之一。Feulgen染色是經典顯示去氧核糖核酸的方法，其具體反應原理是，標本經稀鹽酸水解後，DNA分子中的嘌呤鹼基被解離，從而在核糖的一端出現了醛基，醛基具有還原作用，可與無色品紅結合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。近30年來，隨著數碼顯微鏡的發展，現在已經可以捕捉細胞圖像到計算機內存，並對細胞進行非常精確的測量。特別有用的是利用DNA特異和化學計量的染色方法(即染色與細胞核DNA和含量成正比)對細胞核的DNA進行染色，可以測量細胞核的特徵。例如福爾根染色在定量細胞學中得到了廣泛的應用。利用這種方法就可以計算細胞核的DNA含量，從而計算出處於不同細胞周期的細胞數目比例，對不同的細胞類型進行檢測和分類，以及對非整倍體細胞進行檢測等等。DNA含量的變化可作為直接反映腫瘤增殖能力的重要生物學指標。細胞增殖取決於細胞核的DNA複製與細胞分裂。細胞癌變的本質是細胞迅速無限增殖和轉移，測定細胞核DNA含量，可作為惡性腫瘤的客觀指標。然而這種方法受制於DNA固定的好壞、染色的深淺及測定系統(掃描顯微鏡、數位相機、應用軟體等)的品質，並且這種方法沒有利用細胞形態學方面的信息，而這方面的信息對很多病例的診斷和預測有很大的作用。因此，一般來說，這兩種分析方法(定性和定量)有以下問題1、細胞形態學定性分析的方法只基於細胞的形態學特徵，依賴細胞學家的經驗和技巧，誤診率非常高。2、DNA定量分析方法基於DNA特異的染色方法，依賴於細胞核的特徵，不能提供任何關於細胞形態學方面的信息。到目前為止，還沒有一種方法可以同時進行細胞的形態學特徵定性分析和DNA定量分析，然而，在許多疾病診斷過程中，為了提高準確率，需要同時進行定性和定量兩方面檢測，因此需要分別進行兩次切片和染色，不僅十分麻煩，還增加病患的費用負擔，而且，定性和定量檢測的結果不能一一對應，比如說醫生在觀測細胞形態學特徵是發現某個具有特異性的細胞，想得到該細胞的DNA定量分析數據以便進行對照確認時，卻無法實現，因為無法在進行DNA定量分析的切片中找到對應的細胞以進行分析。因此，為了同時進行細胞形態學分析和DNA的定量檢測，亟需一種能同時將細胞核與細胞質、細胞膜染上不同顏色的細胞染色試劑及染色方法，本案油然而生。
發明內容本發明的目的是提供一種能同時將細胞核與細胞質、細胞膜染上不同顏色的細胞染色試劑，以便於同時進行細胞形態學分析和DNA的本發明的再一目的是提供上述細胞染色試劑的配製方法。本發明的目的還在於提供一種使用上述細胞染色試劑同時將細胞核與細胞質、細胞膜染上不同顏色的染色方法。為了達成上述目的，本發明的解決方案是細胞染色試劑,包括B.S液、染色液、漂洗液、EA50染液，其中5每400毫升B.S液是由甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升配製而成；每210毫升染色液包括Thionin(硫肼)100.00毫克，叔丁醇液(分析純)87.0毫升，5mol/L鹽酸(分析純)5.2毫升，1800毫克亞硫酸氫鈉(分析純)，餘量為蒸餾水；每200毫升漂洗液包括偏重亞硫酸鈉(分析純)l.0克，5mol/L鹽酸(分析純)2.0毫升，蒸餾水198.0毫升；每600毫升EA50染液包括15毫升純淨水，亮綠0.3克，水溶性曙紅Y2克，95%乙醇450毫升，純甲醇125毫升，冰醋酸10毫升，磷鉤酸1克。上述細胞染色試劑的配製方法如下-B.S液的配製甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升，混合均勻；染色液的配製精確稱取Thionin(硫肼)IOO.OO毫克，加入蒸餾水100.0毫升加熱煮沸812分鐘後冷卻至45°C55°C(夏季45°C50°C)，加入叔丁醇液(分析純)87.0毫升，混勻後再加入5mol/L鹽酸(分析純)5.2毫升，加入1800毫克亞硫酸氫鈉(分析純)，混合，加蒸餾水至210毫升後置磁力加熱攪拌器上避光攪拌60分鐘後，(攪拌環境溫度在33。C38。C)過濾後調PH至l.31,5(25°C)即可；5mol/L鹽酸的配製取420毫升鹽酸(分析純)原液加蒸餾水至1000.00毫升；漂洗液的配製稱取偏重亞硫酸鈉(分析純)1.0克，加入5mol/L鹽酸(分析純)2.0毫升，加蒸餾水至200.0毫升，混合均勻，漂洗液應在使用前現配現用；EA50染液的配製a.用吸管吸取10毫升純淨水置於一隻乾淨標本管中，用記號筆標記伊紅，吸取5毫升純淨水置於另一隻乾淨標本管中，用記號筆標記亮綠；b.稱取亮綠0.3克倒入標記亮綠的標本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到亮綠完全溶解；c.稱取水溶性曙紅Y2克倒入標記伊紅的標本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到伊紅完全溶解；d.量取95%乙醇450毫升倒入洗淨的染色缸中，再量取純甲醇125毫升倒入缸中；e.將溶解完全的亮綠液倒入缸中，將溶解完全的伊紅液倒入缸中，吸取冰醋酸10毫升加入缸中，稱取磷鎢酸1克加入缸中，用攪棒攪動至混合均勻即可使用。以上描述的細胞染色試劑各組分的體積和質量只是提供一種比例關係，並不表示本產品發明的各組分只能使用上述的體積和質量。上述細胞染色試劑在細胞染色方法中的應用，包括以下步驟第1步，將制好的標本片自然乾燥。第2步，將乾燥的標本片置入無水乙醇液內固定30分鐘後，直接放入B.S液中固定60分鐘，取出後用蒸餾水洗滌二次，再放入5mol/L的鹽酸內酸化60分鐘(酸化溫度在22-C25-C)，取出後用蒸餾水洗滌2次。第3步，將經上述處理過的標本片放入染色缸內，加滿染色液染色67分鐘(染色溫度在22°C25°C)，傾出染液，用蒸餾水衝洗56次。第4步，用漂洗液洗滌三次(第一次12分鐘，第二次12分鐘，第三次12分鐘)，再用水洗滌2至3次。第5步，進入復染，放入95%乙醇液內浸泡23分鐘。第6步，在巴氏染色液III(EA50染液)中染胞槳58分鐘。第7步，放入95%乙醇內浸泡23分鐘。第8步，在無水乙醇中浸泡兩次每次23分鐘。第9步，將乾燥的脫水片放入二甲苯原液缸內透明3060秒。第10步，將透明過的標本片用中性樹膠加蓋玻片封固。採用上述方案後，本發明提供的細胞染色試劑，能使細胞核染上較深的顏色，而細胞質和細胞膜染上較淺的顏色，使得細胞被染色後，在顯微鏡捕捉到的圖像中，深色的細胞核和淺色的細胞質和細胞膜都能清晰的呈現。這樣，通過顯微鏡觀察，在定量測定細胞核DNA的同時還能檢測細胞的形態學特徵用以定性分析，可以提高細胞檢測及分類的準確性。圖1是經染色處理後的細胞在顯微鏡下觀測到的圖像；圖2是條形碼為145731的甩片在顯微鏡下觀察的圖像；圖3是條形碼為145732的甩片在顯微鏡下觀察的圖像；圖4是條形碼為145733的甩片在顯微鏡下觀察的圖像；具體實施例方式以下提供一個具體實施例以詳細說明本發明提供的細胞染色試劑的配製及使用方法，但並不用於限定本發明的權利範圍。染色試劑的配製B.S液的配製甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升，混合均勻；染色液的配製精確稱取Thionin(硫肼)IOO.OO毫克，加蒸餾水100.0毫升加熱煮沸10分鐘後冷卻至45°C55°C(夏季45°C50°C)，加入叔丁醇液(分析純)87.0毫升，混勻後再加入5mol/L鹽7酸(分析純)5.2毫升，加入1800毫克亞硫酸氫鈉(分析純)，混合，加蒸餾水至210毫升後置磁力加熱攪拌器上避光攪拌60分鐘後，(攪拌環境溫度在33。C38-C)過濾後調PH至1.31.5(25°C)即可；5mol/L鹽酸的配製取420毫升鹽酸(分析純)原液加蒸餾水至1000.00毫升；漂洗液的配製稱取偏重亞硫酸鈉(分析純)1.0克，加入5mol/L鹽酸(分析純)2.0毫升，加蒸餾水至200.0毫升，混合均勻，漂洗液應在使用前現配現用；EA50染液的配製(1)用吸管吸取10毫升純淨水置於一隻乾淨標本管中，用記號筆標記伊紅，吸取5毫升純淨水置於另一隻乾淨標本管中，用記號筆標記亮綠；(2)稱取亮綠0.3克倒入標記亮綠的標本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到亮綠完全溶解；(3)稱取水溶性曙紅Y2克倒入標記伊紅的標本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到伊紅完全溶解；(4)量取95%乙醇450毫升倒入洗淨的染色缸中，再量取純甲醇125毫升倒入缸中；(5)將溶解完全的亮綠液倒入缸中，將溶解完全的伊紅液倒入缸中，吸取冰醋酸IO毫升加入缸中，稱取磷鎢酸l克加入缸中，用攪棒攪動至混合均勻即可使用。使用本發明提供的細胞染色試劑對細胞切片進行染色處理的具體步驟是第1步，將制好的標本片自然乾燥。第2步，將乾燥的標本片置入無水乙醇液內固定30分鐘後，直接放入B.S液中固定60分鐘，取出後用蒸餾水洗滌二次，再放入5mol/L的鹽酸內酸化60分鐘(酸化溫度在22。C25。C)，取出後用蒸餾水洗滌二次。第3步，將經上述處理過的標本片放入染色缸內，加滿染色液染色67分鐘(染色溫度在22°C25°C)，傾出染液，用蒸餾水衝洗6次。第4步，用漂洗液洗滌三次(第一次12分鐘，第二次12分鐘，第三次12分鐘)，再用水洗滌2至3次。第5步，進入復染，放入95%乙醇液內浸泡23分鐘。第6步，在巴氏染色液III(EA50染液)中染胞漿58分鐘。第7步，放入95%乙醇內浸泡23分鐘。第8步，在無水乙醇中浸泡兩次每次23分鐘。第9步，將乾燥的脫水片放入二甲苯原液缸內透明3060秒。第10步，將透明過的標本片用中性樹膠加蓋玻片封固。本發明提供的染色方法對細胞進行了復染，以使細胞質、細胞膜與細胞核分別被染上不同深淺的顏色以便觀測(如圖l所示)。為保證本發明提供的染色試劑不會對細胞核的DNA定量測試造成影響，還進行了以下兩項實驗81、選取3例標本，編號分別為標本l，標本2和標本3，每例標本各做2張甩片，其中一張使用本發明提供的染色試劑進行復染，將細胞核與細胞質都染上顏色，另一張不經過復染，只對細胞核進行常規染色，得出細胞數Nomal/abnomal(正常/異常)與積分光密度值(IOD)的對照。參見附表1是經過復染與沒有經過復染的掃描結果對比。附表ltableseeoriginaldocumentpage9參見圖2至圖4，採用本發明提供的染色方法對細胞切片進行染色後，在顯微鏡下觀察，背景清楚，胞核染深藍色，並且一個個清晰可見，胞漿多數呈紅色，少量綠色。從附表1中的DNA檢測數據來看，經過復染與沒有經過復染的檢測結果相近，說明此種染色試劑不會對細胞核的DNA定量檢測產生影響。2.選取5例標本，每例標本做l張甩片，先用常規方法對每例細胞切片進行細胞核染色，通過掃描得出DI值(DNA指數)；然後對細胞切片進行退染，退染後採用本發明提供的染色方法對每例細胞切片進行染色，通過掃描得出DI值(復染)。附表2是經掃描得出的41組細胞核DI值的對照。附表2tableseeoriginaldocumentpage915tableseeoriginaldocumentpage10以上每組細胞核的DI值是同一細胞核經常規方法染色(染色)及採用本發明提供的染色試劑染色(復染)後的細胞核DNA含量(DI值)的對比，統計學分析結果表明，第一組與第二組之間無統計學差異。綜上所述，本發明提供的細胞染色試劑能使細胞核染上較深的顏色，而細胞質和細胞膜染上較淺的顏色，使得細胞被染色後，在顯微鏡捕捉到的圖像中，深色的細胞核和淺色的細胞質和細胞膜都能清晰的呈現。且採用本發明提供的染色方法對細胞進行染色後，在顯微鏡下觀察，細胞核呈現較深的顏色，細胞質和細胞膜呈現較淺的顏色，都能清晰呈現，且不會對細胞核的DNA定量測定造成影響。這樣，通過顯微鏡觀察，在定量測定細胞核DNA的同時還能檢測細胞的形態學特徵用以定性分析，可以提高細胞檢測及分類的準確性。權利要求1、細胞染色試劑，其特徵在於包括B.S液、染色液、漂洗液、EA50染液，其中每400毫升B.S液是由甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升配製而成；每210毫升染色液包括硫肼100.00毫克，叔丁醇液87.0毫升，5mol/L鹽酸5.2毫升，1800毫克亞硫酸氫鈉，餘量為蒸餾水；每200毫升漂洗液包括偏重亞硫酸鈉1.0克，5mol/L鹽酸2.0毫升，蒸餾水198.0毫升；每600毫升EA50染液包括15毫升純淨水，亮綠0.3克，水溶性曙紅Y2克，95％乙醇450毫升，純甲醇125毫升，冰醋酸10毫升，磷鎢酸1克。2、如權利要求1所述的細胞染色試劑的配製方法，其特徵在於:B.S液的配製甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升，混合均勻；染色液的配製精確稱取硫肼100.00毫克，加入蒸餾水100.0毫升加熱煮沸812分鐘後冷卻至4555°C，加入叔丁醇液87.0毫升，混勻後再加入5mol/L鹽酸5.2毫升，加入1800毫克亞硫酸氫鈉，混合，加蒸餾水至210毫升後置磁力加熱攪拌器上避光攪拌6070分鐘，攪拌環境溫度在33-C38。C，過濾後在25。C調ffl至1.31.5;漂洗液的配製稱取偏重亞硫酸鈉1.0克，加入5mol/L鹽酸2.0毫升，加蒸餾水至200.0毫升，混合均勻；EA50染液的配製a.用吸管吸取10毫升純淨水置於一隻乾淨標本管中，用記號筆標記伊紅，吸取5毫升純淨水置於另一隻乾淨標本管中，用記號筆標記亮綠；b.稱取亮綠0.3克倒入標記亮綠的標本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到亮綠完全溶解；c.稱取水溶性曙紅Y2克倒入標記伊紅的標本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到伊紅完全溶解；d.量取95%乙醇450毫升倒入洗淨的染色缸中，再量取純甲醇125毫升倒入缸中；e.將溶解完全的亮綠液倒入缸中，將溶解完全的伊紅液倒入缸中，吸取冰醋酸10毫升加入缸中，稱取磷鎢酸l克加入缸中，用攪棒攪動至混合均勻。3、如權利要求1所述的細胞染色試劑在細胞染色中的應用，其特徵在於包括以下步驟第l步，將制好的標本片自然乾燥；第2步，將乾燥的標本片置入無水乙醇液內固定30分鐘後，直接放入B.S液中固定60分鐘，取出後用蒸餾水洗滌二次，再放入5mol/L的鹽酸內酸化60分鐘，酸化溫度在2225"C，取出後用蒸餾水洗滌2次；第3步，將經上述處理過的標本片放入染色缸內，加滿染色液染色67分鐘，染色溫度在2225°C，傾出染液，用蒸餾水衝洗56次；第4步，用漂洗液洗滌三次，第一次12分鐘，第二次12分鐘，第三次12分鐘，再用水洗滌2至3次；第5步，進入復染，放入95c/。乙醇液內浸泡23分鐘；第6步，在EA50染液中染胞漿58分鐘；第7步，放入95c/。乙醇內浸泡23分鐘；第8步，在無水乙醇中浸泡兩次，每次23分鐘；第9步，將乾燥的脫水片放入二甲苯原液缸內透明3060秒；第10步，將透明過的標本片用中性樹膠加蓋玻片封固。全文摘要本發明提供的細胞染色試劑，包括B.S液、染色液、漂洗液、EA50染液，其中每400毫升B.S液是由甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升配製而成；每210毫升染色液包括硫肼100.00毫克，叔丁醇液87.0毫升，5mol/L鹽酸5.2毫升，1800毫克亞硫酸氫鈉，餘量為蒸餾水；每200毫升漂洗液包括偏重亞硫酸鈉1.0克，5mol/L鹽酸2.0毫升，蒸餾水198.0毫升；每600毫升EA50染液包括15毫升純淨水，亮綠0.3克，水溶性曙紅Y2克，95％乙醇450毫升，純甲醇125毫升，冰醋酸10毫升，磷鎢酸1克。本發明還提供了上述細胞染色試劑的配製方法及其在細胞染色中的應用。文檔編號C12Q1/04GK101560543SQ200810070939公開日2009年10月21日申請日期2008年4月18日優先權日2008年4月18日發明者布蘭科·帕爾切克申請人:麥克奧迪實業集團有限公司