能夠以協同方式引起基因表達轉錄後沉默的方法和組合物的製作方法

2023-04-29 13:17:56

專利名稱：能夠以協同方式引起基因表達轉錄後沉默的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於在轉錄後使基因表達沉默的方法，更具體地，涉及組合物，其比單 獨使用所述組合物的各組分能獲得更高的沉默水平。
背景技術：
基因表達的高效和特異性的抑制是某些基因治療方案和功能性基因研究的基礎。 特定基因的表達有時對於細胞是有毒的，會產生疾病，比如在受感染細胞中的病毒基因的 表達，這在遺傳性疾病中大多是消極的，或者基因表達會受到限制，比如致癌基因。抑制這 些有毒基因表達可以治癒由它們引發的疾病。此外，基因組和蛋白質組的研究允許分離大 量的基因，其中一些具有未知的功能。這些技術允許將這些基因分類，或根據它們的表達水 平，或根據調節所述表達的條件，但有關它們的功能並未談太多。通過這些基因表達的系統 性和特異性的抑制，可開發簡單的方案以確定它們的功能。對於一個基因表達的特異性抑制的最簡單的方式是降低由其轉錄的RNA的穩定 性或阻止它轉錄成蛋白質。基於反義技術的最常用的傳統系統(反義核酶和寡核苷酸)仍 然沒有取得很多成功，可能因為為了發揮功能，它們需要與「體內」的靶RNAs相互作用，而 這些通常覆蓋著蛋白質，形成使它們免於這些相互作用的二級或三級結構。另一個可選的特異性抑制一個基因的表達的方法是通過使用RNA幹擾而降低RNA 的穩定性。這個技術允許通過使用所謂的小幹擾RNAs (siRNAs)促進感興趣的基因的特異 性降解，小幹擾RNAs (siRNAs)由一個RNA雙鏈構成，該RNA雙鏈由兩個互補的具有21-22 個核苷酸長度具有突出的3，端的RNA鏈構成。(Elbashir，S. M.等，Genes Dev. 2001,15 188-200)。SiRNAs與互補的mRNAs序列在被稱作RISC的多蛋白複合體內雜交，其是mRNAs 發生降解的地方。然而，基於siRNAs的使用的基因沉默方法由於高成本的通過化學合成的 siRNAs的製備而變的複雜，尤其是當需要將它們大量使用於動物模型或者未來用於人類中 時。為避免與siRNA合成的高成本有關的問題，已發展出允許在來自shRNAs的實際細胞中 產生siRNAs的策略。然而，這種技術需要發展，以便於序列的選擇，以確保最高的特異性和 最低的毒性。此外，siRNAs的使用變的更加困難，這是因為靶mRNA最佳位點的識別需要過 多實驗，所以與靶mRNA雜交的siRNA具有最高特異性和最低毒性，siRNAs的使用變的更加 困難還因為例如激活對幹擾素和「脫靶」的響應等的副作用，其中RNA鏈和與靶不同的轉錄 子不完全互補(非特異)的結合產生了一系列不必要的效果。一個可替代的方式可以是小核核糖核蛋白(snRNPs)的功能特性的使用，小核核 糖核蛋白的一部分與mRNAs的前體的特異性序列相互作用，參與到核內mRNA成熟過程的不 同階段。就UlsnRNP來說，其由蛋白質U1A，70K，U1C和與7個與RNA分子(UlsnRNAs)結合 的Sm蛋白組成。它的RNA的5』末端與待去除序列、內含子的5』端通過鹼基配對雜交，其 在mRNA前體的剪接位點進行。這種相互作用通過蛋白質與UlsnRNAs和將被處理的mRNA 的直接或間接的相互作用而穩定。一旦UlsnRNP與mRNA前體相互作用，將觸發一系列其它 蛋白質和snRNPs的結合，這將確定消除內含子。為此，需要將UlsnRNP與mRNA前體分離。
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此夕卜，當UlsnRNP結合到RNA時，它抑制了附近序列的加工作用和聚腺苷酸化體 系。UlsnRNP的70K蛋白能夠與聚腺苷酸絡合物的聚(A)聚合酶(PAP)亞基的羧基末端結 合，抑制其功能(Gunderson et al.，1997，Genes & Dev. 11 :761_773)。UlsnRNP對加工和聚腺苷酸化體系的抑制作用已用於控制基因表達。因此，據 描述，可以修飾與內含子剪接區域的識別相關的U1 snRNAs的區域，使得其特異性的與靶 mRNA的3』末端外顯子結合，導致所述靶mRNA的降解。這種方法已經用於降低報告基因的 表達(US20030082149，Beckley，S. A. et al.，2001，Mol. Cell. Biol. ,21 :2815_2825，Furth， P. A. et al.，1994，Mol. Cell. Biol.，14 :5278_5289，Fortes, P. et al.，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :8264_8269 和 EP1384784)和內源性基因的表達(Furth，P. A. et al.， supra, Fortes, P. et al. ，supra，禾口 Liu，P等人，2004，Nucleic Acid Res. ，32 :1512—1517)。 Sajic 等人(Nucleic Acids Res.，2007，35 :247_255)已描述了對病毒 HIV-1RNA 的末端外 顯子具有特異性的修飾U1能夠抑制來自HIV-1基因組的轉錄物的表達，從而抑制所述病毒 的複製。然而，使用所述U1 snRNAs去抑制靶基因在體內的表達的可能性受限於下列難題， 即如何尋找良好的具有最高特異性和最低毒性的且具有最大抑制作用的靶序列。因此，正 如在RNAi中所發生的，需要改進基於U1 snRNA的基因沉默方法，其允許U1在低細胞內濃 度時達到有效的沉默水平，從而它們的毒性被降低，並使所述沉默方法在體內的應用同樣 成為可能。發明概述本發明的作者已經驚人地示出，修飾的對特定靶基因具有特異性的UlsnRNAs和 用於相同靶基因的基因表達沉默劑的聯合使用導致靶基因的表達的抑制大於分別使用每 一種試劑時所觀察到的結果。因此，第一方面，本發明涉及包括一個或多個容器的組合物或試劑盒部分，其包 括(i)第一組分，包括至少一個U1 snRNA或編碼U1 snRNA的多聚核苷酸，其中所述 U1 snRNA在其與內含子5』端的GU共有序列結合的結合序列內被修飾，使的其特異性結合 靶mRNA前體的3』端外顯子的預選區域，並且其能夠抑制所述靶mRNA前體的成熟；和(ii)第二組分，包括至少一個特異性靶向由mRNA前體的加工形成的mRNA的mRNA 預選區域的基因表達沉默試劑，如在⑴中所限定的，其是U1 snRNAs的靶標，並且其能夠 導致所述靶mRNA在體內的沉默。本發明的第二方面涉及一種多聚核苷酸，其包括(i)編碼至少一個U1 snRNA的序列，該U1 snRNA在其與內含子5』端的⑶共有序 列的結合序列內被修飾，使的其特異性的結合靶mRNA前體的3』端外顯子的預選區域，並且 其能夠抑制靶mRNA前體的加工，和(ii)編碼沉默劑的序列，該沉默劑特異性靶向結合由mRNA前體加工形成的mRNA 的預選區域，該沉默劑是由如在(i)中所限定的聚核苷酸編碼的UlsnRNAs的靶標，並且其 能夠導致所述靶mRNA在體內的沉默。在另一方面，本發明涉及包括本發明的多聚核苷酸的表達載體，包括本發明的載 體的細胞和包括本發明的多聚核苷酸的轉基因動物。
在另一方面，本發明涉及具有本發明的多聚核苷酸、載體或者細胞的作為藥劑使 用的組合物或試劑盒。在另一方面，本發明涉及具有本發明的多聚核苷酸、載體或者細胞的組合物或試 劑盒，其用於治療或者預防感染性的、腫瘤、瘤的或者神經退行性的疾病。在另一方面，本發明涉及在生物系統中靶基因表達的體外或體內的轉錄後抑制的 非治療方法，包括將所述系統與具有本發明的多聚核苷酸、載體或者細胞的用於治療或者 預防感染性的、腫瘤、瘤的或者神經退行性的疾病的組合物或試劑盒接觸。


圖lRNAu抑制機制的代表示意圖。UlsnRNP分子的snRNA的5』端已被修飾，從而其序列與mRNA前體靶的3』端外顯 子的預選區域互補。當UlsnRNP分子通過鹼基配對結合到所述預選序列時，其導致靶RNA 聚腺苷酸化(PA)的抑制，從而，抑制其基因的表達。根據這個示意圖修飾的U1 snRNAs分 子也被稱為Uli。圖2使用強shRNA對於報告基因表達的抑制作用與用Uli對其表達的抑制作用具 有協同作用。使用全劑量或半劑量的表達抗螢光素酶靶序列158的shRNA的質粒(分別為 shRNA a Luc 158和shRNA a Lucl58/2)，全劑量或半劑量表達抗螢光素酶的Uli的質粒(分 別為 Uli a Luc 和 Uli a Luc/2)，以及半劑量的 shRNA a Luc 158 和半劑量的 Uli a Luc (shRNA a Lucl58/2+Uli a Luc/2)，計算用對照質粒轉染的細胞內的螢光素酶的活性。示出的抑制 係數是通過對照(非抑制的)細胞的螢光素酶活性除以從餘下的例子中獲取的螢光素酶活 性而得出的。誤差線代表9個獨立測量的標準偏差。圖3使用強shRNAs對於報告基因的表達的抑制作用與用Uli對其表達的抑制作 用具有協同作用。經對照質粒轉染的細胞內的螢光素酶活性通過全劑量或半劑量的表達抗螢光素 酶靶向序列1546的shRNA的質粒(分別為shRNA a Luc 1546和shRNA a Luc 1546/2)、全劑量 或半劑量的表達抗螢光素酶的Uli的質粒(分別為Uli a Luc和Uli a Luc/2)以及半劑量 的 shRNA a Luc 1546 和半劑量的 Uli a Luc (shRNA a Lucl546/2+Uli a Luc/2)進行計算。示 出的抑制係數是通過對照(非抑制)細胞的螢光素酶活性除以從餘下的例子中獲取的螢光 素酶活性而得出的。誤差線代表9個獨立測量的標準偏差。圖4使用中shRNAs對於報告基因表達的抑制作用與用Uli對其表達的抑制作用 具有協同作用。經對照質粒轉染的細胞的螢光素酶活性通過全劑量或半劑量的表達抗螢光素酶 靶向序列163的shRNA的質粒(分別為shRNA a Luc 163和shRNA a Luc 163/2)，全劑量或半 劑量的表達抗螢光素酶的Uli的質粒(分別為Uli a Luc和Uli a Luc/2)，以及半劑量的 shRNAa Lucl63 和半劑量的 Uli a Luc (shRNA a Lucl63/2+Uli a Luc/2)進行計算。示出的抑 制係數是通過對照(非抑制的)細胞的螢光素酶活性除以餘下例子中獲取的螢光素酶活性 的而得出的。誤差線代表9個獨立測量的標準偏差。圖5使用弱shRNAs對於報告基因表達的抑制作用與用Uli對其表達的抑制作用
7具有協同作用。經對照質粒轉染的細胞的螢光素酶活性通過全劑量或半劑量的表達抗螢光素酶 靶向序列154的shRNA的質粒(分別為shRNAa Lucl54和shRNA a Lucl54/2)，全劑量或半 劑量的表達抗螢光素酶的Uli的質粒(分別為Uli a Luc和Uli a Luc/2)，以及半劑量的 shRNAa Lucl54 和半劑量的 Uli a Luc (shRNA a Lucl54/2+Uli a Luc/2)進行計算。示出的抑 制係數是通過對照(非抑制的)細胞的螢光素酶活性除以餘下例子中獲取的螢光素酶活性 而得出的。誤差線代表9個獨立測量的標準偏差。圖6使用強shRNAs的協同作用的穩定性的分析經對照質粒轉染的細胞的螢光素酶活性通過減少劑量的(1、1/2，1/4，1/8，和 1/20)表達抗螢光素酶靶向序列1546的shRNA的質粒(1546)，減少劑量的(1、1/2、1/4、 1/8和1/20)的表達抗螢光素酶的Uli的質粒(Uli a Luc)，半劑量的Uli a Luc和減少劑量 的 shRNAa Lucl546 (1/2、1/4、1/8 禾口 1/20)以及半劑量的 shRNA a Lucl546 和減少劑量的 Uli a Luc (1/2、1/4、1/8和1/20)進行計算。示出的抑制係數是通過對照(非抑制的)細胞 的螢光素酶活性除以餘下例子中獲取的螢光素酶活性而得出的。誤差線代表9個獨立測量 的標準偏差。圖7使用中shRNAs的協同作用的穩定性的分析經對照質粒轉染的細胞的螢光素酶活性通過減少劑量的(1、1/2、1/4、1/8 和1/20)表達抗螢光素酶靶向序列163的shRNA的質粒(163)，減少劑量的(1/2、 1/4,1/8和1/20的表達抗螢光素酶的Uli的質粒，半劑量的Uli a Luc和減少劑量的 shRNA a Lucl63 (1/2、1/4、1/8 和 1/20)以及半劑量的 shRNA a Lucl63 和減少劑量的 Uli a Luc (1/2、1/4、1/8和1/20)進行計算。抑制係數是通過對照(非抑制的)細胞的螢光 素酶活性除以餘下例子中獲取的螢光素酶活性而得出的。誤差線代表9個獨立測量的標準 偏差。圖8使用shRNAs對於內源性基因的抑制作用與用Uli對它的表達的抑制作用具 有協同作用。A. HeLa細胞經兩倍劑量的表達抗Notchl靶向序列1或者2的shRNA的質粒(分 別為shRNAl a Notchlx2和shRNA2 a Notchlx2)，或者一倍劑量的表達shRNAs的質粒和一 倍劑量的表達Uli a Mock或Uli a Notchl的質粒的混合物轉染。在轉染後48小時收集細 胞提取物，通過Western blot.的方法來計算Notchl的量。B.如在A中所描述的細胞，或 經Uli a Mock轉染或由一倍劑量或兩倍劑量的Uli a Notchl轉染的細胞，在NF_ k B_依賴 型的啟動子下經表達螢光素酶的質粒共轉染。螢光素酶活性在相關單元中示出。誤差線代 表9個獨立測量的標準偏差。發明詳述本發明的發明人已經驚人地示出，對特定靶向基因具有特異性的UlsnRNAs和用 於相同靶向基因的基因表達沉默劑的聯合使用導致靶基因的表達的抑制作用大於分別使 用每種試劑時所觀察到的結果。不希望被任何理論約束，可以認為協同效應是由於mRNAs前體的加工過程中兩種 組分作用於不同的位點而造成的。因此當修飾的Uls在細胞核內通過抑制mRNA前體的多 聚腺苷酸化而起作用時，它們相應地阻止其輸出到細胞溶質中，基因表達沉默劑可在細胞溶質內起作用，其作用於在U1抑制劑的存在下成熟的mRNAs，導致其降解或抑制其翻譯。能 夠抑制靶mRNAs前體的多聚腺苷酸作用的修飾的Uls在此簡稱為Ulis。因此，本發明的第一方面涉及包括一個或多個容器的組合物或試劑盒部分，其包 括(i)第一組分，包括至少一個UlsnRNAs或編碼UlsnRNAs的多聚核苷酸，其中所述 UlsnRNA在其與內含子的5』末端的GU共有序列的結合序列內被修飾，使得其特異性的結合 到靶mRNA前體的3』末端外顯子的預選區域，並且其能夠抑制靶mRNA前體的成熟，和(ii)第二組分，包括至少一個特異性靶向於由mRNA前體的加工形成的mRNA的預 選區域的基因表達沉默試劑，該前體是⑴中所限定的UlsnRNA的靶標，並且其能夠導致所 述靶mRNA的沉默。由此本發明的組合物包括兩個組分，其可在一個相同的容器中一起找到或者物理 性隔離。而且，本發明還涉及包括上述組分(i)和(ii)的組合物。本發明的組合物的第一組分本發明的組合物或試劑盒的第一組分是編碼UlsnRNA的多聚核苷酸，該U1 snRNA 在其與內含子5』末端的GU共有序列的結合序列內被修飾，使得其特異性結合到靶mRNA前 體的3』末端外顯子的預選區域，阻止所述mRNA前體的3』末端的加工，3』末端的加工被認 為是從非聚腺苷酸mRNA前體到聚腺苷酸mRNA形成(共有聚腺苷酸位點的加工和聚(A) + 尾部的加成)的必要步驟之一。這些修飾的UlsnRNAs整合到相應的snRNP引起snRNPs的 修飾，其並未結合到mRNA前體的內含子加工位點內，而是根據在U1 snRNA的修飾區域的序 列特異性而結合到mRNA前體的特定區域內。這種相互作用引起聚腺苷酸化機制的一個停 頓，導致在細胞核內的mRNA前體的隔離、mRNA前體的成熟的降低以及編碼蛋白質的產量的 降低。基於修飾的U1 snRNAs具有抑制靶mRNA前體的表達的能力，這些修飾的Uls被稱為 Uli。然後U1的效果是降低或抑制基因表達。修飾的U1 snRNA的「內含子5』末端的⑶共有序列的結合序列」應理解為通過鹼 基配對與所謂的U1位點或5』加工位點(5』-剪接位點)相互作用的Uli的5』末端形成的 區域，所謂的U1位點或5』加工位點(5』-剪接位點)出現在內含子的5』區域內的mRNA前 體內，其特徵在於具有AG/GURAGU共有序列(其中R是嘌呤和/表示外顯子/內含子的邊 界)，允許mRNAs前體的加工機制定位外顯子-內含子的範圍。這個區域對應於U1 snRNA序 列的 5，末端的 1 到 11 位置的核苷酸(Zhuang，Y 和 Weiner，A.M :1986，Cell，46 :827_835)。結合到mRNA前體的U1位點的共有序列的「修飾」應理解為包含大量突變的共有 序列，使得U1 snRNA結合到mRNA前體的U1位點的能力大幅降低，同時，所述U1 snRNA獲 得一個新的互補，允許其在靶mRNA前體區域內的預選區域通過鹼基配對形成雙鏈。根據本 發明結合到修飾的U1位點的序列和靶mRNA的預選區域之間互補的程度在3和16個核苷 之間變化，優選在8和16個核苷之間變化，更優選在10和11個核苷之間變化。然而，當形 成U1位點的10-11個核苷已被修飾，使得它們與靶mRNA前體內的預選區域互補(參見圖 1)，可以觀察到靶基因表達抑制的最大效率。因此，Uli將優選在1到11或2到11的位置 的那些核苷內進行修飾，這樣所述區域將與在靶mRNA前體的預選區域內的11或10個連續 的核苷完全互補。本領域技術人員將認識到，為了產生Uli，只需要修飾天然U1中與靶序列 中出現的不同的核苷酸。
本領域技術人員將認識到不同生物體的U1 snRNA序列是已知的。因此，一旦某個 U1 snRNA的序列是已知的，就有可能確定它是否對應於一個天然的U1 snRNA或者是否在與 內含子的5』末端相互作用的區域的一個或多個核苷內已被修飾。靶mRNA內預先選定的作為互補序列與已修飾的U1的5』區域結合的區域，定位 在相應的mRNA前體的末端外顯子內。靶序列到多聚腺苷酸位點的距離並不像Fortes et al. (supra)所顯示的特別相關，Fortes et al. (supra)中已顯示靶向作用於報告基因的 RNA的末端外顯子已修飾的Uls能夠導致所述RNA的降解，甚至當靶序列定位於距離多聚腺 苷酸序列大於1000個核苷處。倘若靶序列的最小優化長度是10個核苷，所述長度的序列的結合位點將每106核 苷任意出現一次，其意味著在人類基因組中它們將出現大約3000次。然而，倘若外顯子只 構成人類基因組的大約2%，且由已修飾的Uls通過snRNP介導的抑制作用需要配對到包含 多聚腺苷酸信號(AAUAAA)的轉錄物的末端外顯子的非結構區域，抑制作用的特異性大大 提高。優選的靶位點，其在生物體的3』末端外顯子內出現的次數最少，由此出現在其中進 行沉默的細胞。 經序列比對可確定可能的靶標出現的頻率。典型地，對於基因比對，一個序列作為 參照序列，用於與測試序列進行比較。當使用序列比對算法時，測試序列和參照序列都輸入 計算機，指定序列坐標，如有必要，設定序列算法程序參數。優選地，可使用默認程序參數， 或者指定替代參數。然後基於程序參數，序列比較算法計算測試序列相對於參照序列的百 分比的序列同一性。這裡使用的「比較窗口」包括選自下組中連續位置的任何一個數量的部分，選自從 19到600的組，通常為大約50至大約200的組，更通常為大約100到大約150組成的組， 其中兩個序列進行最佳排列後，連續位點的相同數目的參照序列與其進行比較。用於將序 列排列從而進行比較的方法在本領域是眾所周知的。可通過如下方法將序列排列優化從 而進行比較，例如，通過Smith和Watlerman，(Adv. Appl. Math. ,1981,2 482)的局部同源 性算法，通過Needleman和ffunsch (J. Mol. Biol.，1970，48 443)的同源性排列算法，通過 Pearson 和 Lipman，(Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1988,85 2444)的相似法的搜索，通過這些 算法(GAP, BESTFIT, FASTA，禾口 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575Science Dr.，Madison，WI)的計算機化的實施，或者通過人 工排列禾口目測{參見例如，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et ah, eds. 1995supplement))。優選的適用於確定序列同一性和序列相似性百分比的算法的實施例是BLAST和 BLAST 2. 0 算法，其在 ARschul 等人的論文(Nucl. Acids Res.，1977，25 :3389_3402)和 Altschul等人的論文(J. Mol. Biol.，1990，215 :403-410)中已經被分別描述。根據這裡所 描述的參數，BLAST和BLAST 2. 0用於確定序列同一性的百分比。用於執行BLAST分析的 軟體在 NCBI (National Center for Biotechnology Information)公開可用。這種算法包 括通過識別在查詢序列中W長度的短命令而首次識別高分的序列對(HSPs)，或者在資料庫 序列中用相同長度的命令比對時其匹配或滿足某些正值的閾值T。T指的是相鄰的命令的 分數閾值(Altschul等人，supra)。這些初始的相鄰命令的採樣數作為種子，用作啟動檢索 以找到包括它們的更長的HSPs。只要累積的比對數增加，該命令的採樣數沿著每個序列在
10兩個方向上各自延伸。對於核苷序列，使用參數M(作為匹配殘基的配對的反饋值；總是為 0)和N(不匹配殘基的損失值；總為0)計算累積的值。對於胺基酸序列，利用計分矩陣計算 累積值。當累積比對值由於數量X遠離最大值而下降；累積值由於一個或更多負值殘基比 對的累積到達0或更低；或到達任一個序列末端時，命令採樣數在各個方面的延伸被停止。 BLAST算法參數W，T和X確定靈敏度和比對的速度。BLASTN程序(用於核苷酸序列)的默 認值為11的命令長度(W)，10的期望值(E)，M = 5，N = -4和兩個鏈之間的比較。對於氨 基酸序列，BLASTP程序的默認值為命令長度為3，期望值(E)為10，BL0SUM62計分矩陣(參 見 Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 1989,89 :10915)比對值(B)為 50，期 望值(E)為10，M = 5，N = -4，兩個鏈的比對。優選地，選擇已修飾的U1 snRNAs用於本發明的組合物中，這樣它與內含子的5』 末端的GU共有序列結合的的結合序列，已根據靶mRNA前體的序列修飾，與靶位點相同或實 質上相同。在本文中的兩個或更多的核苷酸或多肽序列中，術語「同一的」或「同一性」百 分比，指的是兩個或更多的序列或亞序列，其是相同的(同一的)或者具有指定百分比的氨 基酸殘基或核苷，其與使用具有如上所述的默認值參數的BLAST或者BLAST2. 0序列比對算 法，或者通過人工比對和目測方法(參見，例如，NCBI網站或類似網站)測量而來的是相同 的(例如，當在比較窗口或指定區域上為了最大對應而比較和比對時，至少70%相同，優選 的 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或比 靶序列的指定區域具有更高的同一性)。這樣的序列稱為「實質上同一的」。在具有相關序列的蛋白質家族被沉默或者被沉默的mRNA的準確的特定的序列不 可知的情況下(例如，在顯示不同血清型的病毒蛋白的情況下)，可以設計允許多個蛋白質 同時沉默的U1抑制劑。為此，識別被沉默蛋白質家族的核苷酸序列內的保守序列是有必要 的。這可使用本領域技術人員眾所周知的算法(例如ClustalW算法，參見Cherma等人， 2003，Nucleic AcidsRes. ,31 =3497-3500)通過對序列進行多重比對來執行。一旦不同基 因之間的保守序列區域被識別，將設計一共有區域，其作為蛋白質家族設計特異性UlsnRNA 的靶標。5』序列靶向於家族不同成員之間的保守序列的U1抑制劑的設計，將導致家族幾個 成員的同時沉默。在家族成員顯示高度同一性和多個保守區域可選作用於設計U1抑制劑 的靶標的情況下，根據前段所述，將選擇那些生物體RNAs的3』末端的外顯子出現次數最少 的序列進行沉默。根據本發明的編碼U1 snRNA的聚核苷酸可有效的連結到啟動子上，其允許所述聚 核苷酸在表達Uli的細胞內進行轉錄。適用於執行本發明的啟動子包括，但不限於，結構 啟動子比如U1啟動子或源自真核細胞病毒基因組的啟動子，例如多瘤病毒、腺病毒、SV40、 CMV、鳥類肉瘤病毒、B型肝炎病毒，金屬硫蛋白基因啟動子、單純皰疹病毒的胸苷激酶基因 啟動子、逆轉錄酶病毒的LTR區域、免疫球蛋白基因啟動子、肌動蛋白基因啟動子、EF-1 a 基因啟動子，以及誘導型啟動子，其基因的表達依賴於附加的分子或外源信號，例如四環素 系統、NF-k (kappa)B/UV光系統、Cre/Lox系統，和熱休克基因啟動子、在W0/2006/135436 中所描述的可調型RNA聚合酶II啟動子、以及組織特異性啟動子(例如，W02006012221中 所描述的PSA啟動子)。在優選的實施方式中，啟動子是以構成性方式起作用的RNA聚合酶 II啟動子。在基因表達沉默的在組織中特異性表達的基因的情況下，使用組織特異性啟動子也是可能的-一個特異性胃啟動子，比如H/K-ATP酶0亞基啟動子、K19啟動子、金屬硫蛋白 基因啟動子、TFF1啟動子、TFF2啟動子、F0Xa/HNF2 y啟動子，-一個特異性胰腺啟動子，比如彈性蛋白酶啟動子、Pdx-1啟動子、胰島素啟動子 或者磷酸甘油酸激酶啟動子，-一個特異性肺啟動子，比如Clara細胞分泌型蛋白啟動子、表面活性蛋白C啟動 子，_ 一個特異性胸啟動子，比如鼠乳房腫瘤病毒啟動子或乳清酸性蛋白啟動子，-一個特異性皮膚啟動子，包括角蛋白啟動子或K14啟動子，-一個特異性食道啟動子，比如EBV啟動子12，-一個特異性肝臟啟動子，比如主要的尿蛋白啟動子或白蛋白啟動子，-一個特異性結腸啟動子，比如絨毛蛋白啟動子或FABP-TS4啟動子，-一個特異性前列腺啟動子，比如cryptidin-2啟動子、前列腺特異性抗原啟 動子、C(3)l啟動子、由具有94個胺基酸(PSP94)的前列腺分泌的蛋白的啟動子或者 probasin啟動子，-一個特異性腎臟啟動子，比如尿調節素啟動子、Tamm-Horsfall蛋白啟動子或1 型穀氨醯轉肽酶啟動子，-一個特異性膀胱啟動子，比如尿溶蛋白(uroplakin)啟動子或者urohingin啟動 子，-一個特異性子宮啟動子，比如子宮球蛋白啟動子。此夕卜,在由 Chen，X 等人(Nucleic Acids Res.，2006，34，Database Issue)所描述 的TiProD組織特異性啟動子資料庫中所述的任何組織特異性啟動子都可用於本發明的上 下文中。本發明組合物的第二組分根據本發明的組合物的第二組分是一基因表達沉默劑或者基因表達沉默劑的組 合，所述基因表達沉默劑對由靶mRNA前體的加工形成的mRNA具有特異性，針對該前體的是 形成本發明的第一組分的部分的Uli，並且該前體能夠導致所述靶mRNA的沉默。「基因表達沉默劑」應理解為引起靶mRNA降解或通過所謂的RNA幹擾過程(RNAi) 抑制靶mRNA翻譯的那些化合物。在加工過程中，雙鏈RNA(dsRNA)通過用核糖核酸酶III型 (剪切酶)將所述RNA轉化成siRNA，從而能夠使基因表達沉默。siRNA鏈中的一個鏈整合 進入被稱為RNA誘導沉默複合物(RISC)的核蛋白複合物中。RISC複合物使用單鏈RNA去 識別mRNA分子，mRNA分子至少部分與整合到RISC中的siRNA的RNA鏈互補，使其在翻譯 過程中被降解或被抑制。因此，整合到RISC中的siRNA鏈被稱為是導向鏈或反義鏈。被稱 作瞬時鏈或有義鏈的另一條鏈從siRNA消失，其部分地與靶mRNA同源。通過RISC複合物 的靶mRNA的降解導致所述mRNA表達水平的降低，由此導致相應編碼的蛋白含量減少。此 夕卜，RISC還可以通過抑制靶mRNA的翻譯，導致表達的降低。「能夠引起所述mRNA表達沉默」的試劑在本發明的上下文中應被理解為是這樣一 種試劑，其在細胞內時能夠為一個試劑編碼，該試劑能夠或者其自身能夠結合到包含預選 序列並導致其降解的靶mRNA。
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沉默劑誘導抗靶mRNA的RNAi應答，其可以結合到本發明的第二組分中，包括(i)siRNA(ii)shRNA(iii)miRNA(iv)編碼根據⑴、(ii)、(iii)的試劑的聚核苷酸，和(v) 一個或幾個根據(i)至(iv)的試劑的組合物其中試劑⑴、(ii)和(iii)基於RNA，組合物(iv)基於DNA。(i)siRNAsiRNA是能夠通過RNA幹擾抑制靶基因表達的試劑。siRNA能夠化學合成或者通 過體外轉錄獲取。siRNA典型的由具有15至40個核苷酸長度的雙鏈RNA組成，並且包含 具有1到6個核苷酸的3』和/或5』突出區域。這個突出區域的長度與siRNA分子的總長 度無關。siRNA通過降解作用或靶信使的轉錄後沉默起作用。本發明的siRNA大體上與靶 mRNA的預選區域同源。「大體上同源」應理解為它們具有與靶mRNA的充分互補或相似的序 列，使得siRNA通過RNA幹擾能夠引起其降解。大體上同源可能意味著如上所述的實質同 一性。適合於引起所述幹擾的siRNA包括由RNA形成的siRNAs，以及包括不同的化學修飾 的siRNAs，比如-siRNAs，其中核酸之間形成的鍵不同於那些在自然狀態下形成的鍵，比如磷硫醯 鍵，-具有功能試劑的siRNA鏈的偶聯物，比如螢光團，-siRNA鏈末端的修飾，尤其在3』末端，通過位置2』的羥基的不同功能基團的修 飾，-具有修飾糖基的核苷酸，比如在位置2』的0-烷基基團，比如2』-0-甲基核糖對 2』 -0-氟基核糖，-具有修飾鹼基的核苷酸，比如滷化基團(例如5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶)，烷 基化鹼基(例如7-甲基鳥苷)。本發明的siRNA可使用本領域技術人員眾所周知的一系列技術獲得。例如，siRNA 可以在傳統的DNA/RNA的合成器中從由亞磷醯胺基團保護的核糖核苷開始進行化學合成。(ii)shRNA在另一個方法中，本發明的第二組分是shRNA(短髮夾RNA)。在本發明的上下文 中，shRNA應理解為由兩個反平行鏈形成的RNA分子，其中兩個反平行鏈通過一個髮夾區域 連接，反平行鏈的其中一個的序列與靶mRNA的預選區域互補。shRNAs是由短反義序列(具 有19至25個核苷酸)形成的，伴隨帶有有義鏈的5至9個核苷酸的環。shRNAs可以在傳 統的DNA/RNA合成器裡由經亞磷醯胺基團保護的核糖核苷開始進行化學合成，或者它們可 通過體外轉錄由聚核苷酸獲取。shRNAs由核糖核酸Dicer酶(RNase Dicer)在細胞內加 工，消除髮夾區域，產生如上所述的siRNAs。shRNAs還可以包含如在siRNAs的例子中所述 的不同的化學修飾。(iii)miRNAmiRNA或者microRNA是天然出現在細胞內的小RNA分子，其負責通過調控mRNA的 降解和翻譯而控制基因表達的特異性。miRNAs是具有22個核苷的單鏈RNA分子，其合成類似大的初級轉錄體(pri-mRNA)，其通過Drosha核糖核酸酶III型(Drosha RNase type III)在細胞核內加工產生60個鹼基對的「髮夾」前體(miRNA前體)。這些分子被運輸到細 胞質中，由第二核酸酶(Dicer)加工以產生成熟形式(miRNA)。miRNAs整合到核糖核蛋白 RISC複合物中，它們通過在成熟的mRNA-RISC複合物和靶mRNA的同源區域之間的配對引起 靶mRNA的降解而發揮作用，尤其是在miRNA鏈的所謂的「種子」區域之間(5』末端的2至7 個核苷酸)，導致mRNA的降解和/或翻譯弱化。即使miRNAs是通過調節mRNA細胞的半衰 期而起作用的內源性分子，已經示出了內源性的mRNA的結構(例如，miR-30)可被改變成包 括編碼siRNAs的序列，所述修飾的miRNA可用於引起內源性靶基因的降解(W003093441)。 還示出了 siRNA序列作為RNAi效應物被整合到mir-26a莖區工作，引起同源性的mRNAs的 降解(McManus，M. T.等人，2002，RNA，8 :842_850)。在兩種情況下，引入到miRNA莖的核苷 酸序列顯示出與靶基因具有100%的同一性。適合在本發明的組分中使用的miRNAs由19至大約24個核苷酸組成，優選21或 22個核苷酸。miRNAs可被設計成與具有高度特異性的RNA轉錄物雜交。miRNA優選設計成 與靶mRNA具有100%同一性或具有實質上的同一性(例如允許至少1個、至少2個、至少3 個或更多的不匹配)，只要僅一個非互補的核苷酸可以根據其在miRNA鏈中的位置而降低 抑制水平。miRNAs可被設計成它們靶向於非翻譯的5』區域，靶mRNA的3』區域的編碼區 域。miRNAs來自包括莖環區域的miRNAs前體的加工。這種結構可被設計成由核糖核 酸酶識別，優選通過類似Dicer的核糖核酸酶III型識別，從而形成成熟miRNA。莖環結構 可具有40至100個核苷酸，優選具有50至70個核苷酸，更優選具有20至30個核苷酸。莖 可包括完全互補的雙鏈或可在形成雙鏈的至少一個鏈內包含額外的非互補區。優選的，所 述非互補區尺寸不是非常大的(例如，1、2或3)，由3個或更少的核苷酸組成。環末端可包 括4個或更多核苷酸(優選不多於25個)。環的尺寸優選為6至15個核苷酸。典型的僅當所述miRNA具有特定結構需求時，miRNA能夠有效加工和運作，例如 Zeng等人所述的(RNA，2003，9 :112_123)。本發明的miRNAs優選基於mirR-30結構，其中 莖區域被預選的mRNAs的靶序列取代。miR-30在環形區域的存在雖然是需要的，但也並非 絕對必要，因為它可以承受特定改變，這樣環形區域與出現在miR-30的環形序列具有大於 70%，優選大於79%，更優選大於86%，甚至更為優選大於93%的同一性。同一性百分比的 確定可以使用前述提到的任何方法進行測定。適用於執行本發明的miRNAs對應於那些基於如在W003093441中描述的內源性的 miR-30miRNA,或那些基於如在W003029459所描述的內源性的miRNAs。(iv)編碼siRNA、shRNA、或者miRNA的多聚核苷酸本發明的第二組分可作為多聚核苷酸提供，其轉錄產生前述的siRNA、shRNA、和/ 或者miRNAs。在編碼shRNA或者miRNA的多聚核苷酸的情況下，它們包括調控序列轉錄的 單一啟動子區域，所述序列包括通過髮夾或莖環區域連接的shRNAs和miRNAs的有義鏈或 反義鏈。理論上，任何啟動子都可用於shRNAs和miRNAs的表達，只要所述的啟動子與其中 將表達siRNAs的細胞可兼容。因此，適用於執行本發明的啟動子包括如前所述的用於Uli 表達的啟動子。在優選的實施方式中，啟動子是RNA聚合酶III啟動子，其構成性地發揮作 用。RNA聚合酶III啟動子出現在有限數量的基因中，比如5S RNA.tRNA.RNA 7SL和snRNA
14U6。另外，編碼siRNAs的多聚核苷酸包括兩個轉錄單位，每個均由調控形成在siRNA 中的雙鏈(有義鏈和反義鏈)之一的轉錄的啟動子形成。編碼siRNAs的多聚核苷酸可以 包含收斂的和發散的轉錄單位。在發散的轉錄多聚核苷酸中，編碼形成siRNA的每個DNA 鏈的轉錄單位串聯定位於多聚核苷酸內，這樣每個DNA鏈的轉錄依賴於其自身的啟動子， 啟動子可以是相同的或者不同的(Wang，J.et al.，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 5103-5106and Lee，N.S.，et al.，2002，Nat. Biotechnol.，20 :500_505)。在收斂的轉錄多 聚核苷酸中，產生siRNAs的DNA區域形成DNA區域的有義鏈和反義鏈，其側面是兩個反向 的啟動子。在有義RNA鏈和反義RNA鏈轉錄後，它們將形成對應於功能siRNA的雜交鏈。適 用於包含反轉錄單位的多聚核苷酸啟動子的組合，包括2TO啟動子(Tran，N.et al. ,2003, BMCBiotechnol.，3 :21)、鼠 U6 啟動子和人 HI 啟動子(Zheng，L.，et al. ,2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 :135-140 和 W02005026322)和人 U6 啟動子和鼠 HI 啟動子(Kaykas， A. Moon, R. ,2004, BMC Cell Biol.，5:16)。在優選的實施例中，通過不同的啟動子調控有 義siRNA鏈和反義siRNA鏈。在更優選的實施例中，兩個轉錄單位以收斂的方式取向。在 優選的實施例中，RNA聚合酶III型啟動子是源自人類和鼠的HI和TO基因的啟動子。在 更為優選的實施方式中，啟動子是源自人類或鼠的2TO啟動子，鼠U6啟動子和人HI啟動子 或人U6啟動子和鼠HI啟動子。(v) 一個或多個siRNAs、shRNAs.miRNAs和/或編碼它們的多聚核苷酸的組合物本發明的第二組分可由一個或多個在(i)、(ii)、(iii)和(iv)中說明的組分形 成。因此本發明意在一個或多個siRNAs、一個或多個shRNAs、一個或多個miRNAs和/或一 個或多個編碼所述多聚核苷酸的多聚核苷酸的聯合使用。不同的沉默劑可以靶標於一個 mRNA和相同的mRNA的不同區域。在優選的實施方式中，本發明一部分的組合物或試劑盒的組分(ii)是包括了編 碼至少一個shRNA的序列的多聚核苷酸。本發明的載體和基因結構編碼本發明的第一組分的多聚核苷酸，以及編碼siRNAs、miRNAs和/或shRNAs並 形成本發明第二組分的多聚核苷酸，可以單獨的找到，或者形成載體的一部分，允許所述多 聚核苷酸在合適的宿主細胞內的繁殖。適用於插入所述多聚核苷酸的載體是來自原核生物 細胞內的表達載體，比如 pUC18、pUC19、Bluescript 及其衍生物，mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、 ColEl、pCRl、RP4、噬菌體和「穿梭」載體比如pSA3和pAT28，在酵母中的表達載體比如2微 米質粒型的載體、整合質粒載體、YEP載體、著絲粒質粒載體和類似物、在昆蟲細胞內的表 達載體比如pAC系列和pVL的載體、和植物中的表達載體比如pIBI、pEarleyGate、pAVA、 pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列和其類似物，以及真核細胞內的表達載體，包括 利用任何市售的杆狀病毒系統去轉染昆蟲細胞的杆狀病毒。真核細胞的載體包括優選的病 毒載體(腺病毒，與腺病毒有關的病毒，比如逆轉錄病毒，尤其是慢病毒)以及非病毒載體 比如 pSilencer 4. 1-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3. 1/hyg、pHMCV/Zeo、pCR3. l、pEFI/His、 pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5_Hi s、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL 和 PKSV-10、pBPV-1、pML2d和 pTDTl。在優選的實施方式中，編碼UliRNA的多聚核苷酸和編碼siRNA、shRNA或者miRNA的多聚核苷酸組成相同載體的部分。在另一個優選的實施方式中，編碼UliRNA的多聚核苷 酸和編碼siRNA、shRNA或者miRNA的多聚核苷酸組成單個載體的部分。載體優選包括一個報告基因或者標記基因，在細胞與其接觸後，能夠識別那些整 合到載體的細胞。在本發明的上下文中有用的報告基因包括lacZ、螢光素酶、胸苷激酶、 GFP等。在本發明的上下文中有用的標記基因包括，例如，新黴素抗性基因，其對氨基糖苷 G418具有抗性；潮黴素磷酸轉移酶基因，其對潮黴素具有抗性；0DC基因，其對鳥氨酸脫羧 酶(2-二氟甲基-DL-鳥氨酸(DFM0)的抑制劑具有抗性；二氫葉酸還原酶基因，其對甲氨蝶 呤具有抗性；嘌呤黴素-N-乙醯轉移酶基因，其對嘌呤黴素具有抗性；ble基因，其對博來黴 素具有抗性；腺苷脫氨酶基因，其對9-3-D-木糖呋喃腺嘌呤具有抗性；胞核嘧啶脫氨酶基 因，其允許細胞在存在N-膦乙醯基-L-天冬氨酸鹽的情況下生長；黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核 糖轉移酶基因，其允許細胞在有黃嘌呤並且沒有鳥嘌呤的存在下生長；大腸桿菌的trpB基 因，其允許細胞在吲哚而不是色氨酸存在的情況下生長；大腸桿菌的hisD基因允許細胞使 用組氨醇代替組氨酸。選擇基因被整合到質粒中，其可額外包括適合於所述基因在真核細 胞內表達的啟動子(例如，CMV或SV40啟動子)，優化的翻譯起始位點(例如，根據所謂的 Kozak規則和IRES的位點)，多聚腺苷酸位點例如SV40多聚腺苷酸或磷酸甘油酯激酶位 點，內含子例如球蛋白基因內含子。可選的，可以在相同載體內同時使用報告基因和標 記基因。在優選的實施方式中，載體是病毒載體。在更優選的實施方式中，用於本發明第一 組分或第二組分的表達的載體(假設其基於DNA)是病毒載體，其選自於由腺病毒、腺相關 的病毒、逆轉錄酶病毒、慢病毒、皰疹病毒、SV40和a病毒構成的組中。作為設計siRNAs的基礎的靶mRNA的區域是不受限制的，可包含編碼序列的區域 (在起始密碼子和終止密碼子之間)，或者，可選的，它可以包含非翻譯的5』區域或3』區域 的序列。優選的，其具有在21至50個核苷酸之間的長度。用於設計siRNAs、ShRNAS和miRNAs的標準是本領域技術人員眾所周知的(例如， Birmingham, A. et al. ，2007， Nature Protocols, 2 :2068-2078, Ladunga, I. ,2006,
Nucleic Acids Res. 35 :433_440 和 Martineau，H.，Pyrah,I.，2007，Toxicol. Pathol.，35 327-336and Pei 禾口 Tuschl，2006，Nature Methods, 3 -.670-676)。設計適用於抑制靶基因表達的Ulis的標準已經在上面解釋過(參見Fortes，P. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003，100 :8264_8269and Sajic, R. et al.，2006，Nucleic Acids Res. ,35 =247-255) 0優選的，作為設計Ulis的基礎的靶mRNA前體的區域僅包括3， 末端區域，如由Fortes等人(supra)所示的那樣。在優選的實施方式中，本發明的組合物或試劑盒部分的組分⑴包括多個 UlsnRNAs或者多個編碼不同的Ulis的多聚核苷酸，它們全部都靶標於一個相同的靶mRNA 的不同區域。以這種方式，可獲得Ulis的協同抑制效應，如由Fortes等人(supra)和Sajic 等人(supra)所示的那樣。在另一個優選的實施方式中，本發明的組合物或試劑盒部分的組分(ii)包括特 異性靶標於由mRNA前體加工而來的mRNA的不同的預選區域的多個基因表達沉默劑，其是 如(i)中所定義的U1 snRNAs的靶標，並且能夠引起所述靶mRNA在體內的沉默。在還一更優選的實施方式中，本發明的組合物或試劑盒部分的組分(i)包括多
16個U1 snRNAs或者多個編碼在其與內含子5』端的GU共有序列結合的序列內被修飾的U1 snRNAs的核苷酸，使得它們特異性地結合到相同靶mRNA前體不同的預選區域，試劑盒部分 或組合物的組分(ii)包括多個基因表達沉默劑，該沉默劑特異性靶向於由mRNA前體加工 而來的mRNA的不同的預選區域，其是如在(i)中定義的U1 snRNAs的靶標，並且能夠引起 所述靶mRNA的體內沉默。本發明的組合物可將兩種組分容納在單個容器內，或者兩個成分物理隔離地放置 在不同的容器內，在這種情況下，組合物被認為是「本發明的試劑盒」。在本發明的上下文 中，試劑盒應理解為一種產品，其包含本發明的組合物的不同組分，允許包裝後運輸和儲 存。適用於包裝試劑盒組分的材料包括玻璃、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶子、小 瓶、紙、信封等。另外，本發明的試劑盒可包括同時的、連續的或單獨使用試劑盒中組分的說 明書。所述說明書可以採用印刷材料的形式，或採用電子支持的形式，該電子支持能夠能夠 存儲說明書，從而其可被一個主體讀取，例如電子存儲介質(磁碟、磁帶和類似物)、光學介 質(⑶-R0M，DVD)等等。另外地或可選地，介質可包括提供所述說明書的網址。本發明的雙功能多聚核苷酸本發明的作者建議，當本發明的第二組分基於DNA並由編碼siRNA、shRNA或miRNA 的序列組成時，它可以合併在具有本發明第一組分的序列的編碼Uli的單個多聚核苷酸 中，其允許將待處理的生物體接觸必要的兩個組分，通過單獨給藥方式獲取同時的協同效 應。因此，在另一方面，本發明涉及一種多聚核苷酸(本發明後文中的雙功能多聚核苷酸)， 其包括(i)編碼至少一個U1 snRNA的序列，所述U1 snRNA在其與內含子的5』端的⑶共 有序列的結合序列中被修飾，使得其可特異性結合到靶mRNA前體的3』末端外顯子的預選 區域，並且其能夠抑制靶mRNA前體的加工，和(ii)編碼沉默試劑的序列，該沉默試劑特異性的靶標於由mRNA前體加工而來的 mRNA的預選區域，其是由如(i)中所定義的多聚核苷酸編碼的U1 snRNAs的靶，能夠引起所 述靶mRNA在體內的沉默。在優選的實施方式中，本發明的雙功能多聚核苷酸包括至少一個siRNA的有義鏈 或反義鏈，編碼至少一個miRNA前體或編碼至少一個shRNA。在另一方面，本發明涉及一種多聚核苷酸，其包括(i)編碼U1 snRNA的序列，所述U1 snRNA在其與內含子的5』末端的⑶共有序列 的結合序列上被修飾，使得其特異性的結合於靶mRNA前體的3』末端外顯子的預選區域，並 且其能夠抑制靶mRNA前體的成熟，和(ii)編碼至少一個siRNA的有義鏈和反義鏈、編碼至少一個miRNA前體、或者編碼 至少一個shRNA的序列，其中所述siRNA、miRNA前體和/或shRNA特異性地結合到由mRNA 前體加工而來的mRNA的預選區域，其中mRNA前體是由在(i)中定義的多聚核苷酸編碼的 U1 snRNA的靶標，能夠引起所述靶mRNA在體內的沉默。本發明的雙功能多聚核苷酸通常結合到調控它們表達的區域，其可以與編碼Uli 的序列、編碼沉默試劑的序列相同或不同。用於所述多聚核苷酸表達的合適的啟動子與之 前所提到的用於Ulis的表達的是相同的(構成性、可調控和組織特異性)。類似的，本發明的雙功能多聚核苷酸可以形成表達載體的部分。因此在另一方面，本發明涉及包括本發明的雙功能多聚核苷酸的表達載體。用於本發明的多聚核苷酸的克 隆和增殖的合適的載體實質上與之前提到的用於編碼Ulis的多聚核苷酸或編碼siRNAs、 shRNAs和/或miRNAs的多聚核苷酸的表達的載體是相同的。優選的，本發明多聚核苷酸的 表達載體是病毒載體、更優選的載體選自於腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄酶病毒、慢病毒、皰 疹病毒、SV40和a病毒的組中。在另一方面，本發明涉及包括本發明的雙功能多聚核苷酸的細胞或者包括本發明 雙功能多聚聚核苷酸的載體。適合本發明的組合物的表達的宿主細胞包括但不限於哺乳動 物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞和細菌細胞。細菌細胞包括但不限於革蘭氏陽性菌 細胞比如芽孢桿菌、鏈黴菌和葡萄球菌屬，以及革蘭氏陰性菌細胞比如埃希氏菌屬和假單 胞菌屬的細胞。真菌細胞優選包括酵母細胞比如酵母屬、畢赤酵母和多形漢遜酵母。昆蟲 細胞包括但不限於果蠅細胞和Sf9細胞。植物細胞中包括，農作物比如穀類、藥用植物、觀 賞植物或者鱗莖植物。所述細胞通過已知技術轉染本發明的雙功能多聚核苷酸，比如農杆 菌介導基因轉移、葉盤轉化法、聚乙二醇誘導的轉化法、電穿孔法、超聲降解法、顯微注射法 和基因槍轉化法。適用於插入本發明的雙功能多聚核苷酸的哺乳動物細胞包括CH0(中國 倉鼠卵巢)細胞、COS細胞、81 細胞、拖1^細胞、911、六11080、六549、293或者PER. C6。在另一個實施方式中，本發明涉及非人類的轉基因動物，其包括集成到其基因組 中的根據本發明的雙功能多聚核苷酸。當本發明的雙功能多聚核苷酸插入到幹細胞的基因組中時，才可執行獲取非人類 動物的方法，其中幹細胞可分化成所有類型的細胞，包括生殖細胞。這些是胚細胞(ECs)或 胚胎生殖細胞(EGCs)。胚胎幹細胞(ESCs)是由移植之前的囊胚階段中的胚胎內部細胞團 衍生而來的。鼠和人胚胎幹細胞的幾個類型是已知的並已建立起來，例如，鼠的ESC、TBV2、 R1和D3細胞。這些細胞在未分化階段在合適的培養條件下體外進行培養，並保留其與囊胚 結合併被植入代孕母親的子宮內繼續正常體內發育的能力。胚胎生殖細胞(EGCs)衍生自 由生殖胎兒脊培養而來的原生殖細胞(PGCs)。通常，本發明的攜帶經修飾的GDNF基因座的 ESC細胞和EGC細胞被注入到宿主囊胚中，即宿主囊胚的囊胚腔，或者直至桑椹胚階段與八 細胞胚珠共同培養，即，自由區桑椹胚(zone-free morula)，經修飾的ESC細胞優選結合到 正在發育的胚胎的內部細胞團中。隨著向囊胚的注入，轉基因幼仔被稱為嵌合體，由於它的細胞中某些從宿主囊胚 衍生而來，某些從修飾的ESC細胞衍生而來。為了繼續發育，宿主胚胎被轉移到替代的假孕 母體或者中間宿主中。因此，該程序將給嵌合動物提供體細胞株和生殖細胞株組織，其中包 括衍生自經基因工程獲得的ESC細胞和受體囊胚的混合物。通常，幹細胞和囊胚從具有不 同皮膚著色的動物獲得，這樣嵌合動物具有不同顏色的斑點。因此，這些嵌合動物再次與它 們的同胞雜交，直至獲得生殖細胞株中的轉基因動物，即，在該動物的生殖細胞內存在經修 飾的轉基因的動物，該性狀可通過繁殖傳遞給動物幼仔。在生殖細胞株中的轉基因動物可 被識別，例如，通過觀察幼仔確定性狀的存在，或通過檢測轉基因動物的生殖細胞從而確定 轉基因的存在，其以遺傳性相容的方式整合。這些動物與其它動物雜交，從而獲得具有所需 形狀的單卵的動物，但其不再顯示鑲嵌性。應當理解，此處所描述的非人類的轉基因動物可通過不同於上述的ESC細胞方法 的方法生產，例如，通過前核注射方法把靶結構注射到單細胞胚胎的前核中，或者其它不基於轉染的ESC細胞的基因靶向方法。任何合適的非人類哺乳動物可用於生產這裡所述的非人類轉基因哺乳動物。例 如，合適的哺乳動物可以是齧齒動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、沙鼠)、兔、豬、綿羊、山 羊、牛、貓、狗、豬或靈長類，只要選擇動物的特定株以獲取良好的普遍健康、良好的胚胎性 能、在胚胎內良好的原核可見性和良好的繁殖能力。在優選的實施方式中，動物是小鼠。經 常使用的品種例如為C57BL/6株或者C57BL/6x DBA/2FH株，或者FVB株(可從Charles River Labs. , Boston, Mass. ,The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME or Taconic Labs 購買)。優選的品種為129sv品種，以及那些具有H2b、H_26或者H_2q單倍體型的品種，比 如 C57BL/6 或者 DBA/1。本發明的組合物的醫藥用塗本發明的發明人已經展示了本發明的組合物能夠以協同方式抑制靶基因的表達， 即比其中每一個組分的單獨使用更有效率。這允許組合物作為涉及病理學的醫藥產品使 用，其中組分靶向作用於蛋白質的RNA。因此另一方面，本發明涉及本發明的組合物和如上 所述的本發明的雙功能多聚核苷酸作為醫藥或藥物的應用。本領域技術人員將預期到該組 合物可用於治療所有那些由特定基因的過渡表達導致的或者需要給定基因的表達降低的 疾病或病徵。技術人員可預期到本發明的組合物進行給藥時，存在不同的可能性。組合物的兩 個組分可以以單獨分子或者相同分子的形式給藥。而且，第一組分和第二組分可作為抑制性分子給藥，比如，即組分(i)可以以 UlsnRNA的形式給藥，組分(ii)可以作為以RNA為基礎的沉默劑給藥，比如siRNA、miRNA、 shRNA。可選的，提供編碼UlsnRNAs的多聚核苷酸作為第一組分，和/或第二組分可基於 DNA,即，其包括編碼沉默劑的多聚核苷酸。在後面的情況下，可以將多聚核苷酸作為包括組 分(i)和組分(ii)的單個聚核苷酸進行給藥，或者作為單獨的多聚核苷酸同時、分別或者 連續給藥。因此本發明闡明的給藥方案的不同組合將由醫生根據情況來確定。-同時給藥o組分⑴是U1 snRNA,組分(ii)是基於RNA的沉默劑。o組分⑴是U1 snRNA,組分(ii)基於DNA的，即，它包括編碼沉默RNA分子的多 聚核苷酸。o組分⑴是編碼U1 snRNA的多聚核苷酸，組分(ii)是基於RNA的沉默劑。o組分⑴是編碼U1 snRNA的多聚核苷酸，組分(ii)是基於DNA的沉默劑，S卩，它 包括編碼沉默RNA分子的多聚核苷酸。在這個情況下，兩個多聚核苷酸可形成相同的多聚 核苷酸的部分或以單獨的多聚核苷酸提供。_單獨的或連續的給藥o組分⑴是U1 snRNA,組分(ii)是基於RNA的沉默劑。o組分(i)是U1 snRNA，組分(ii)基於DNA，S卩，它包括編碼沉默試劑的多聚核苷酸。o組分⑴是編碼U1 snRNA的多聚核苷酸，組分(ii)是基於RNA的沉默劑。o組分(i)是編碼U1 snRNA的多聚核苷酸，組分(ii)基於DNA，即，它包括編碼沉
19默試劑的多聚核苷酸。在這個情況下，兩個多聚核苷酸必須作為單獨的多聚核苷酸提供。本領域技術人員能夠認識到，第一組分和第二組分都將以DNA的形式應用，即作 為編碼活性RNA分子的多聚核苷酸，可在載體內提供相應的多聚核苷酸。在單獨的或者連 續的遞送的情況下，每個多聚核苷酸將形成不同載體的部分。在同時給藥的情況下，可在不 同的載體內提供兩個多聚核苷酸或者在單獨的一個載體內包含兩個多聚核苷酸。為設計本發明的組合物，可用作靶標的基因的例子包括，但不限於，致癌基因、編 碼轉錄因子、受體、酶、結構蛋白質、細胞因子、細胞因子受體、凝集素、選擇素、免疫球蛋白、 激酶、磷酸酶、朊病毒、促血管生成多肽、涉及細胞凋亡過程的蛋白酶和蛋白質的基因、編碼 粘附分子的基因、編碼表面受體的基因、編碼涉及腫瘤細胞的轉移或者侵入過程的蛋白質 的基因、編碼生長因子的基因、多重藥物耐藥基因(MDR1)、編碼淋巴因子、細胞因子、免疫球 蛋白、T細胞受體、MHC抗原、DNA和RNA聚合酶的基因、涉及代謝過程比如胺基酸和核酸合 成的基因、腫瘤抑制基因、5-脂氧化酶、磷脂酶A2、蛋白激酶C、p53、pl6、p21、MMAC1、p73、 zacl、C-CAM、BRCAl、Rb、Harakiri、Ad E1B、蛋白酶 ICE-CED3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、TNF、GMCSF、幹擾素、CFTR、 EGFR、VEGFR、IL-2 受體、雌激素受體、Bcl-2 家族的成員(Bcl-2 或者 Bcl-xL)，ras，myc, neu, raf erb, src, fins, jun, trk, ret, gsp, hst 禾口 abl,澱粉樣蛋白前體、血管才屯制素、內 皮生長抑制素、METH-l、METH-2、因子IX、因子VIII、膠原蛋白、周期素依賴性蛋白激酶、細 胞周期蛋白 D1，細胞周期蛋白 E、WAF 1、cdk4 抑制劑、MTS1、IL-1、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10, IL-11、IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16、IL-17、促紅細 胞生成素、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、SCF、促血小板生成素、BNDF、BMP、GGRP、EGF、FGF、⑶NF、 GGF、HGF、IGF-1、IGF-2、KGF、肌侵蛋白、NGF、OSM、PDGF、生長激素、TGF- 3、TGF- a、VEGF、 TNF-a、TNF-0、組織蛋白酶K、細胞色素P-450、法尼基轉移酶、穀胱甘肽_S轉移酶、肝素 酶、HMG CoA合成酶、n-乙醯轉移酶、苯丙氨酸羥化酶、磷酸二酯酶、ras羧基末端蛋白酶、 Notch、端粒酶、TNF轉化酶、鈣粘蛋白E、鈣粘蛋白N、選擇素、⑶40、ANF、降鈣素，促腎上腺皮 質激素釋放因子、胰高血糖素、促性腺激素、促性腺激素釋放激素、生長激素、生長激素釋放 因子、促生長素、胰島素、瘦素、促黃體激素、促黃體激素釋放激素、PTH、甲狀腺激素、促甲狀 腺激素、免疫球蛋白CTLA4、血凝素、MHC、VLA-4、激肽釋放酶-激肽原-激肽⑶4系統、sis、 hst、ras、abl、mos、myc、fos、jun、H_ras、ki—ras、c—fins、bcl_2、L_myc、c_myc、gip、gsp、 HER-2、蛙皮素受體、GABA受體、EGFR、PDGFR、FGFR、NGFR、白介素受體、離子通道受體、白細 胞三烯受體拮抗劑、脂蛋白受體、阿片受體、P物質受體、視黃酸和類視黃醇受體、類固醇受 體、T細胞受體、甲狀腺激素受體、TNF受體、tPA受體、鈣泵、質子泵、鈉/鈣交換劑、MRP 1、 MRP2、P170、LRP、cMOAT、轉鐵蛋白、APC、brcal、brca2、DCC、MCC、MTS1、NF1、NF2、nm23、p53 和Rb。本發明的組合物能夠靶向作用於涉及傳染病、腫瘤、癌症或神經退行性疾病的基 因。相應的，在另一方面，本發明提供了用於治療或預防感染病、腫瘤、癌症或神經退行性疾 病的本發明的組合物或試劑盒、本發明的雙功能多聚核苷酸或者包括雙功能多聚核苷酸的 載體或者細胞。在還一方面，本發明提供了本發明的組合物或者試劑盒、雙功能多聚核苷酸或者 包括本發明雙功能多聚核苷酸的載體或細胞在藥物製備中的應用，所述藥物用於治療或預防感染病、腫瘤、癌症或神經退行性疾病。在還一方面，本發明提供了一種治療感染病、腫瘤、癌症或神經退行性疾病的方 法，包括給需要的患者給藥本發明的組合物或試劑盒、本發明的雙功能多聚核苷酸或者包 括本發明的雙功能多聚核苷酸的載體或者細胞。在一個優選的實施方式中，本發明的組合物可以靶向於所述微生物的致病性所必 要的病原微生物的基因，以及靶向於病原體與所述宿主相互作用所必須的宿主基因。在這 種情況下，該組合物適用於治療感染病，包括病毒和細菌的感染。因此在另一個方面，本發 明涉及具有本發明的雙功能多聚核苷酸的、具有用於治療或預防感染病的本發明的載體或 細胞的本發明的組合物或試劑盒。在另一個方面，本發明涉及具有本發明的雙功能多聚核 苷酸的、本發明的載體或細胞的本發明的組合物或試劑盒在治療或預防感染病的藥物的制 備中的應用。可以用本發明的組合物治療的病毒性疾病包括，但不限於，與造成嚴重急性呼吸 系統綜合症(SARS)的冠狀病毒相關的病症或疾病、單純性皰疹病毒(HSV)、B型肝炎病毒 (HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、1型和2型人類T細胞淋巴病毒(HTLV)、1型和2型人類免疫 缺陷病毒(HIV)、巨細胞病毒、乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、EB(印stein-barr)病毒、痘 病毒、流感病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、t仙臺病毒、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、鼻病毒、 呼吸道腸道病毒和風疹病毒。可以用本發明的組合物治療的細菌疾病(為了簡單起見，也包括酵母和真菌的病 症和疾病)包括，但不限於，與不動桿菌、嗜水氣單胞菌、糞產鹼菌、蠟樣芽胞桿菌、脆弱擬 桿菌、卵形擬桿菌、解脲擬桿菌、普通擬桿菌、伯氏疏螺旋體、奮森氏螺菌、流產布魯氏桿菌、 馬爾他布魯氏桿菌、豬布魯氏菌、胎兒彎曲菌(弧菌)、空腸彎曲菌、衣原體屬、差異檸檬酸 桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、傑氏棒桿菌、肉毒芽孢桿菌、艱難梭菌、產氣莢膜梭菌、多枝梭菌、生 孢梭菌、梭狀芽孢菌、破傷風梭菌、白喉棒狀桿菌、遲鈍愛德華氏菌、產氣腸桿菌、陰溝腸杆 菌、糞腸球菌、大腸桿菌、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血桿菌、幽門螺桿菌、產酸克雷伯氏菌、臭 鼻克雷伯氏桿菌、肺炎克雷伯氏菌、鼻硬結克雷伯氏桿菌、出血性黃痘鉤端螺旋體、結核杆 菌、支原體屬、淋病奈瑟球菌、腦膜炎奈瑟菌、厭氧消化鏈球菌、不解糖消化鏈球菌、大消化 鏈球菌、卡氏肺囊蟲、二路普雷沃爾菌和產黑普氏菌、綠膿桿菌、螢光假單胞菌、施氏假單胞 菌、普氏立克次體、恙蟲病立克次氏體、鼠傷寒沙門菌、痢疾志賀菌、弗氏志賀菌、索氏志賀 菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、C群鏈球菌、G群鏈球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、 模仿葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、嗜麥芽寡養單胞菌、無乳鏈球菌、牛鏈球菌、 馬腸鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、化膿性鏈球菌、剛地弓形蟲、品他病密螺旋體、梅 毒螺旋體、細弱密螺旋體、霍亂弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、鼠疫耶爾森菌和假結核耶爾森 菌有關的疾病。在另一個實施方式中，本發明的組合物和試劑盒以及本發明的雙功能多聚核苷酸 靶向於涉及腫瘤和/或腫瘤過程的基因，因此導致活性組合物針對腫瘤過程和不同類型的 癌症，比如血液癌症(例如白血病或者淋巴瘤)、神經瘤(例如星細胞瘤或者膠質母細胞 瘤)、黑色素瘤、乳癌、肺癌、頭頸部癌症、胃腸腫瘤(例如胃癌、胰腺癌或者結腸癌)、肝癌、 腎細胞癌、泌尿生殖系的腫瘤(例如卵巢癌、陰道癌、宮頸癌、膀胱癌、睪丸癌和前列腺癌)、 骨瘤和血管瘤。因此，在另一個方面，本發明涉及具有本發明的雙功能多聚核苷酸、具有本
21發明的載體或細胞的用於治療或預防腫瘤或成瘤疾病的本發明的組合物或試劑盒。在另一 個實施方式中，本發明涉及具有本發明的雙功能多聚核苷酸的、具有本發明載體或細胞的 組合物或試劑盒的用於治療或預防腫瘤疾病或成瘤疾病的藥物的製備中的應用。在另一個實施方式中，本發明的組分和雙功能多聚核苷酸靶向於涉及神經退行性 過程的基因，比如色素性視網膜炎、亞歷山大病、阿爾珀斯病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側 索硬化、共濟失調毛細血管擴張症、巴藤病、牛海綿狀腦病(BSE)、卡納萬病、科克恩綜合症、 皮質基底核退化症、克-雅病、享廷頓病、與HIV關聯的痴呆、甘迺迪病、克拉伯病、路易氏 體痴呆、馬查多_約瑟夫病(脊髓小腦性共濟失調3型)、多發性硬化、多系統萎縮症、神經 螺旋體病、帕金森病、佩-梅病、皮克氏病、原發性脊側索硬化、朊病毒病、雷夫敘姆病、山德 霍夫氏病、希爾德病、精神分裂症、Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病(也已知為巴藤 病))、脊髓小腦性共濟失調、脊髓肌肉萎縮症、Steele-Richardson-Olszewski病、脊髓癆 和類似的疾病。因此，在另一個方面，本發明涉及具有本發明的雙功能多聚核苷酸、具有本 發明的載體或細胞的本發明的組合物或試劑盒，其用於治療或預防神經退行性疾病。在另 一個實施方式中，本發明涉及具有本發明的雙功能多聚核苷酸、具有本發明的載體或細胞 的組合物或試劑盒在用於治療或預防神經退行性的藥物的製備中的應用。在另一個方面，本發明涉及藥物製劑，其包括本發明的組合物或本發明的雙功能 多聚核苷酸與一個或多個藥物學上可接受的載體。藥學上有效的載體可以是固體或液體 的。固相載體可包括一個或多個物質，其還可作為調味劑、潤滑劑、增容劑、懸浮劑、填充劑、 滑動劑、壓縮劑、粘合劑或藥片分解劑；它們還可以是膠囊材料。在粉末中，載體是精細分割 的固體，其與精細分隔的活性成分混合在一起。在藥片中，活性成分以適合的比例與具有必 要的壓縮特性的載體混合，並被壓縮成理想的形狀和尺寸。粉末和藥片可包含最多99%的 活性成分。合適的固相載體包括，例如，磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、澱粉、明膠、 纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、低熔點蠟和離子交換樹脂。液相載體可用於製備溶液、懸浮液、乳濁液、糖漿、酏劑和受壓組合物。活性成分可 以被溶解或懸浮在藥物學上可接受的液相載體中，比如水、有機溶劑、兩者的混合物、或藥 物學上可接受的油或脂。液相載體可包含其它藥物學上合適的添加劑比如增溶劑、乳化劑、 表面活性劑、緩衝液、防腐劑、甜味劑、調味劑、懸浮劑、增稠劑、染色劑、粘度調節劑、穩定劑 或滲透壓調節劑。用於口服或注射給藥的合適的液相載體的例子包括水(部分地包含根據 前述的添加劑，例如，纖維素衍生物、可能為羧甲基纖維素鈉溶液)、酒精(包括單羥基的和 多羥基的酒精，例如，乙二醇)及其衍生物，和油(例如，分餾椰子油和花生油)。對於注射 給藥，載體還可以是酯油，比如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯。無菌液相載體在用於注射給藥 的液相形式的無菌的組分中是有用的。用於壓縮組分的液相載體可以是滷代烴或者其他藥 物學上適用的推進劑。液體藥物組合物可以是無菌溶液或懸液，其適於肌肉注射、腹膜內注射和皮下注 射。無菌溶液還可以靜脈給藥。化合物還可以以液體或固體組合物的形式口服給藥。肺部 給藥也是可想到的。藥物組合物可以以劑量單元的形式存在，例如，作為藥片或膠囊。在所述形式中， 該組合物被細分成包括適量的活性成分的劑量單元。劑量單元的形式可以是包裝好的組合 物，例如，封裝的粉末、小瓶、水泡、預裝填的注射器或包含液體的小袋。劑量單元的形式可以是，例如，膠囊或藥片自身、或者它可以是適量的那些包裝形式的任何組分。在治療中必 須使用的劑量必須由醫生主觀確定。此外，本發明的化合物可以通過藥物學上可接受的容器，通過劑型以溶液、乳膏或 洗液的形式應用並施加於受影響的區域。進一步的，本發明預期的藥物組合物，其尤其製備用於形成本發明第一和第二組 分的核酸的給藥，或者用於本發明雙功能多聚核苷酸的給藥。藥物組合物都包括第一組分 和第二組分，若其基於DNA和RNA，則以裸露形式存在，即，沒有化合物保護核酸免於為生物 體的核酸酶降解，其優點在於可消除與用於轉染的試劑有關的毒性。合適的裸露的化合物 的給藥途徑包括血管內給藥、瘤內給藥、顱內給藥、腹膜內給藥、脾內給藥、肌內給藥、視網 膜下給藥、皮下給藥、粘液給藥、局部給藥或口服給藥(Templeton，2002，DNACell Biol.， 21 :857-867)。當Heidel等人調查研究裸露的化合物給藥(Nat. Biotechnol.，2004，22 1579-1582)時，開始關注有關這些化合物誘導免疫反應的能力。在siRNAs的腹膜內給藥 和靜脈內給藥之後，通過確定血漿白介素和幹擾素水平，未觀察到免疫應答，同時，觀察到 siRNA的系統內給藥具有良好的耐受性。在另一個實施方案中，本發明的組合物和多聚核苷酸是通過所謂的「流體力學給 藥」的方式給藥的，其中組合物是在高速度和高容量下在血管內被引入到生物體中，其導 致具有更高擴散分配的轉染水平。這個技術的改良版本使得通過在多個器官內的外源基 因(Lewis et al.，2002，Nat. Gen. ,32 107-108 ；McCaffrey et al.，2002，Nature,418 38-39)和內源基因(Song et al.，2003，Science，Nat. Med.，9 :347_351)的裸露的 siRNAs 而獲取對於沉默的陽性結果變為可能。研究表明在細胞間進入的效率直接依賴於給藥的液 體量和注射的速度(Liu et al.，1999，Science，305 1437-1441)。在小鼠內，給藥量已經優 化為在 3-5 秒期間內的值為 lmL/10g 體重(Hodges, et al.，2003，Exp. Opin. Biol. Ther.， 3 91-918)。關於允許在它們的流體動力學給藥之後允許siRNAs的體內細胞轉染的精確 的機制尚未完全了解。在小鼠的例子中，一般以超過心率的速度通過尾靜脈給藥，所給藥液 累積在上腔靜脈。這個液體隨後進入器官內的血管，之後通過所述血管中的開窗術，進入 血管外空間。以這種方式，siRNA在它與血液混合之前與靶向機體的細胞接觸，從而減少通 過核酸酶降解的可能性。在優選的實施方式中，形成本發明組合物第一組分的Uli和基於 RNA形成本發明組合物的第二組分的組分都可以包含它們結構內的修飾，這有助於提高它 們的穩定性。降低對核酸酶的敏感性的合適的修飾包括2』 -0-甲基(Czauderna et al., 2003，Nucleic Acids Res. ,31 :2705_2716)，2，-氟嘧啶(Layzer et al.，2004，RNA, 10 766-771)。本發明的組合物和多聚核苷酸可以給藥，形成脂質體的部分進行，偶聯到膽固醇 或者偶聯到能夠導致通過細胞膜遷移的化合物，比如TAT肽、衍生自HIV-1TAT蛋白、黑腹 果蠅觸角足蛋白的同源異型域的第三螺旋、單純皰疹病毒的V22蛋白、精氨酸低聚物和肽， 比如那些在 W007069090(Lindgren，A. et al.，2000，Trends Pharmacol. Sci. ,21 :99_103 ； Schwarze, S. R. etal. ,2000, Trends Pharmacol. Sci.,21 :45_48, Lundberg, M. et al., 2003，Mol. Therapy, 8 :143—150 禾口 Snyder，E. L.禾口 Dowdy，S. F.，2004，Pharm. Res. ,21 389-393)中所描述的。可選的，本發明的第二組分，當它基於DNA時，可以給藥，形成質粒載 體的或病毒載體的部分，優選的那些基於腺病毒、基於腺有關的病毒或者逆轉錄酶病毒，特
23別是基於鼠白血病的病毒(MLV)或者慢病毒(HIV、FIV、EIAV)。在另一個實施方式中，在藥物組合物由第一組分和由第二組分形成的情況下，所 述組合物可包括本發明組合物的第一組分和第二組分的同時的、連續的或者分別使用的說 明書。因此在另一個方面，本發明涉及本發明的組合物或試劑盒，其包括組合物的第一組分 和第二組分同時的、連續的或者分別的使用的說明書。在還一個方面，本發明涉及作為用於 同時的、分別的或者連續的使用的聯合製劑的本發明的組合物或者試劑盒。本領域技術人員將會意識到給藥方案和待治療的相應的患者可根據本發明來確 定。推薦劑量在產品標籤上說明，能夠使開處方的人根據具體情況下的患者預測劑量調整， 根據這些信息，能夠防止對於錯誤的患者開出錯誤劑量的錯誤藥物的處方。給藥方案將由醫生和其它臨床因素決定，優選的根據在先所描述的方法決定。眾 所周知在醫學科學中，任何患者的劑量取決於許多因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、 對於他或者她將施用的特定化合物、性別、給藥的時間和途徑、一般健康狀況和是否在相同 時間施用其它藥物。可通過定期評估觀察進展。本發明的組合物可以以少於每千克體重10mg的量給藥，優選的少於每千克體重 5、2、1、0. 5,0. 1,0. 05,0. 01,0. 005,0. 001,0. 0005,0. 0001,0. 00005 或者 0. OOOOlmg,少於 200nmol的RNA劑，也就是，每千克體重大約4. 4xl016份數或者少於每千克體重1500、750、 300、150、75、15、7. 5,1. 5,0. 75,0. 15或0. 075nmol。單位劑量可通過注射、吸入或者局部給 藥而給藥。本發明的組合物和雙功能核苷酸可直接給藥到表達靶mRNA的器官，在這種情 況下，給藥的劑量為每個器官的劑量在0. OOOOlmg和3mg之間，優選的每個器官的劑量在 0. OOOlmg和0. OOlmg之間，每器官大約在0. 03和3. Omg之間，每個器官大約在0. 1和3. Omg 之間，或者每個器官在0. 3和3. Omg之間。劑量取決於待治療病症的嚴重性和反應，可在幾天和幾個月之間變化或者直到觀 察到症狀減輕。優化的劑量可通過對患者的器官的藥劑濃度實施定期檢查來確定。優化的 劑量可通過之前在動物模型中的體外的或體內的試驗所獲得的的EC50值來確定。單位劑 量的給藥可以為每天一次或小於每天一次，優選的小於每2、4、8或30天一次。可選的，初 始劑量的給藥後可使用一次或幾次的通常小於初始劑量的更小數量的維持劑量。維持方案 可涉及採用在0. 01 u g和1. 4mg每千克體重每天之間的的劑量來治療患者，例如10、1、0. 1、 0. 01、0. 001或0. OOOOlmg每千克體重每天。維持劑量優選至多每5、10或30天給藥。治療 必須持續一段時間，其根據患者所經受的的變化的類型、它的嚴重性和患者的症狀而改變。 而治療後，必須監測患者的進展以確定在疾病對於治療沒有反應的情況下是否增加劑量， 或者若觀察到疾病的改善或若觀察到不理想的負作用時是否減少劑量。根據特定的狀況，給藥的每日劑量可以是單份劑量或者兩份或更多的劑量給藥。 如果需要重複給藥或者頻繁給藥，建議植入給藥裝置比如泵、半永久性導管(靜脈的、腹膜 內的、腦池內的、囊內的)或者存儲器。在另一個方面，本發明涉及針對靶基因表達的轉錄後抑制的體外的和體內的非治 療方法，其包括使本發明的組合物或雙功能核苷酸接觸生物模型。生物模型優選為細胞培 養或動物。當組合物和多聚核苷酸適合應用於細胞培養物時，存在不同的程序使多聚核苷酸 進入細胞的內部。在一方面，可將細胞與裸露的的與聚核苷酸接觸。將細胞與多聚核苷酸接觸，雖然它允許進入細胞漿質隔間，但是不允許其進入處於功能狀態的細胞質(Lingor， P.et al. , 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun.，315 :1123-1133)。因此，多聚核苷酸優選 通過微注射或電穿孔給藥。可選的，可使用利用合適試劑的化學轉染用於DNA和RNA多聚核 苷酸的轉染，尤其是，陽離子脂質體、滲入膜的肽、去端肽膠原、聚天冬氨酸聚氧乙烯與磷酸 鈣的聚合物形成的有機-無機雜交的納米粒子(Kakizawa et al.，2004 ;J. Control Rel.， 97345-356 ；Minakuchi et al. ,2004, Natl. Acids Res. ,32 109 and Muratovska and Eccles，2004，Fed. Euro. Biochem. Soc. Lett.，558 :63_68)。在另一個實施方式中，本發明的 多聚核苷酸可使用載體表達給藥。明顯的，這個方法是僅僅當本發明組合物的第二組分是 基於DNA時是可行的。可選的，形成本發明的組合物的試劑可用能提高它們被細胞捕獲的化學組成部分 修飾。因此形成發明的試劑可與不同類型的化合物偶聯，比如肽和有機化合物。偶聯可通 過本領域技術人員已知的方法實施，包括Lambert等人的方法(Drug Deliv. ,2001, Rev. 47 :99-112)，其中核酸結合到聚氰基丙烯酸烷酯(PACA)的納米粒子上；Fattal等人的方法 (J. Control Release 1998，53 137-143)，其中描述了聯結到納米粒子上的核酸；Schwab 等人的方法(Ann. Oncol. ,1994, 5Supp 1. 4 55-58)，其中核酸獨特地聯結到插層劑、疏水 基團、聚陽離子或者PACA納米粒子；和Godard等人的方法(Eur. J. Biochem. ,1995,232 404-410)，其描述了聯結到納米粒子上的核酸。在另一個實施方式中，本發明聯結的製劑可結合到親脂性基團，其包括陽離子基 團，並且與表達沉默劑的單鏈或雙鏈連接。合適的親脂性製劑包括膽固醇、維生素E、維生 素K、維生素A、葉酸、陽離子著色劑(例如Cy3)、膽酸、醋酸金剛硼、1-芘丁酸、二氫睪酮、1， 3-雙-0-(十六烷基)甘油、香葉氧己基官能團、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3_丙二醇、 十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、03-(油醯)石膽酸、03-(油醯)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或 者吩噁嗪。通過檢測表型變化或通過應用生物化學技術觀察沉默效應，其中生物化學技術 允許檢測特定mRNA或者其編碼的蛋白質的表達水平的變化，比如RNA雜交、核酸酶保護、 Northern雜交、通過DNA微陣列的基因表達的監視、免疫印跡、RIA、ELISA和FACS。在動物 或培養細胞的模型中，可以檢測到報告基因的表達的修飾或者對於有毒製劑具有抗性的產 品易於檢測的基因。合適的報告基因包括乙醯乳酸合成酶(AHAS)、鹼性磷酸酶(AP)、3 -牛 乳糖(lacZ)、葡萄糖苷酸酶(GUS)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、綠色螢光蛋白(GFP)、辣 根過氧化物酶(HRP)、螢光素酶(Luc)、胭脂鹼合成酶(N0S)、章魚鹼合成酶(0CS)及其衍生 物。合適的選擇標記物包括編碼耐受氨苄青黴素、博萊黴素、氯黴素、慶大黴素、潮黴素、卡 那黴素、林肯黴素、氨甲蝶呤、膦絲菌素、嘌呤黴素和四環素的基因。可選的，轉錄後基因表達沉默的非治療方法可應用於動物模型中，其中對於表達 的基因其表達將被沉默。在這種情況下，基因表達沉默劑需要進入動物的組織或器官，其中 將導致基因表達的轉錄後沉默。為此，可給患者使用任何本發明的試劑的治療性給藥的上 述方法。在優選的實施方式中，本發明預期給藥的組合物靶向作用於編碼涉及不同功能途 徑的蛋白質的不同靶mRNAs。功能途徑可以是通過本發明的組合物聯合使用的抑制目標， 包括但不限於，糖酵解、糖質新生、克雷伯氏循環、磷酸戊糖途徑、糖元合成、卡爾文循環、三 醯基甘油酯的降解、脂肪酸的活化、氧化作用、脂肪酸的從頭合成、膽固醇的合成、尿素循環、莽草酸途徑、胺基酸合成、氧化磷酸化作用、光合作用、嘌呤合成、嘧啶合成、組氨酸代 謝、P卜啉代謝、肌醇代謝等。本領域技術人員將認識到前面提到的途徑的不同步驟與負責所 述步驟的每步的酶是已知的，因此，如果上述在RNAms前體和RNAms中選擇靶序列的標準具 有被Ulis或者相似的沉默試劑識別的較大可能性，可通過常規試驗執行Ulis和其它針對 一個或幾個涉及所述過程的步驟中的基因具有特異性的表達沉默劑的發展。基因治療，其通過體外或體內技術，以將治療性基因插入到細胞中為基礎，是 基因轉移的最重要應用之一。在文獻中已經描述了合適的載體和方法，其用於已描 述的並為本領域技術人員已知的體外或體內基因治療；參見例如，Giordano, Nature Medicine 2(1996), 534-539 ；Schaper, Circ. Res 79(1996), 911-919 ；Anderson, Science 256 (1992)，808-813 ；Isner, Lancet 348 (1996)，370-374 ；Muhlhauser, Circ. Res 77 (1995)，1077-1086 ；Wang，NatureMedicine 2(1996)，714-716 ；W094/29469 ；W097/00957 或者 Schaper，生物技術的最新觀點(Current Opinion in Biotechnology) 7 (1996)， 635-640和在這裡提到的參考文獻。基因可設計為直接插入或通過在細胞中的脂質體或病 毒載體插入(例如，腺病毒載體、逆轉錄病毒載體)。優選的，所述細胞是非人的生殖細胞 株、非人的胚細胞或非人的卵細胞或由此衍生的細胞。更優選的，所述細胞為在成體幹細胞 或非人的胚胎幹細胞。如前所述可清楚看到，在本發明的使用中，優選核酸序列可操作的結 合到調控元件，允許本發明的多肽在特異性細胞內的的表達和/或整合。根據本發明可使 用的合適的基因分配系統包括脂質體、受體_介導分散系統、裸露的DNA和病毒載體比如 其中包括皰疹病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺有關的病毒。核酸在基因治療的體內的特異性 位點的分布還可以用基因槍分布系統來實現，比如Williams所描述的(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 (1991)，2726-2729)。用重組DNA轉染細胞的標準方法是分子生物學領域的技 術人員眾所周知的，參見，例如，W094/29469 ；同樣參見supra。基因治療可通過如下方法進 行直接給患者施用本發明的重組DNA分子或載體，或體外用本發明的多聚核苷酸或載體 轉染細胞，並將轉染的細胞施用給患者。本發明的上下文中的特別優選的基因治療載體是微小病毒載體。因此，在該優選 的方面，本發明涉及動物微小病毒的使用，尤其是依賴病毒比如感染性的人類或猿AAV，及 其組分(例如動物微小病毒基因組)，其用做用於本發明的試劑盒的組合物的導入和/或表 達的載體。微小病毒家族的病毒是小DNA動物病毒。微小病毒家族可分為兩個亞科感染脊 椎動物的微小病毒亞科，感染昆蟲的濃核病毒亞科。微小病毒亞科的成員在此指的是微小 病毒，包括依賴病毒屬。正如從它們的屬的名稱可以推斷出的，依賴病毒的成員是獨特的， 因此它們通常需要與輔助病毒比如腺病毒或者皰疹病毒共感染，使得其在細胞培養基中產 生感染。依賴病毒屬包括AAV，其通常感染人類(例如，血清型2、3A、3B、5和6)或靈長類 (例如，血清型1和4，其被認為起源於猴，但也感染人類)，以及感染其它恆溫動物的相關 病毒(例如，牛、犬、馬、和綿羊的腺有關病毒)。有關AAV血清型和有關衍生自AAV血清型 的雜交AAV載體的工程的戰略的進一步的信息可參見Wu等人(2006，Molecular Therapy 14 316-327)的描述。應該理解的是本發明不限於AAV，但同樣可以應用於衍生自兩個或者 更多不同的AAV血清型的雜交AAV載體和應用於其它微小病毒和其雜交體。在基因治療中 有關使用AAV載體的技術已經有描述，例如參見W02007/046703和W02007/148971。
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本發明的組合物或者多聚核苷酸可以用「重組微小病毒或者AAV載體」("rAAV載 體」)傳遞，這裡指的是這樣一種載體，其包含一個有關的本發明序列的多聚核苷酸，其側面 有至少一個微小病毒或AAV反向末端重複序列(ITRs)。本發明的組合物可以用兩個rAAV 載體傳遞，每個rAAV載體編碼這樣的組合物中的一個組分。當存在於表達AAV重複(rep) 和帽(cap)基因產品(也就是，AAV重複(R印)和帽(Cap)蛋白質)的昆蟲宿主細胞內時， 適用於在本發明中使用的rAAV載體可被複製和包裝到感染性病毒顆粒中。當rAAV載體被 整合到較大的核酸結構(例如，在染色體中或者在另一個載體中，比如用於克隆或轉染的 質粒或杆狀病毒)，然後rAAV載體典型的被認為是「前載體(pro-vector) 」，其可在AAV組 裝功能和必要的輔助功能存在下通過複製和衣殼化而被「營救」。通過以下實施例描述本發明，其僅僅是示意性的，而絕不是對本發明的範圍的限 制。
具體實施例實施例11.1 試劑在試驗中使用的shRNAs/miRNAs的列表
權利要求
一種包括一個或多個容器的組合物或者一個試劑盒部分，其包括(i)第一組分，其包括至少一個U1 snRNA或者編碼U1 snRNA的多聚核苷酸，其中所述U1 snRNA在其與內含子的5』末端的GU共有序列的結合序列內被修飾，使得其特異性結合到靶mRNA前體的3』末端外顯子的預選區域，並能夠抑制所述靶mRNA前體的加工；和(ii)第二組分，其包括至少一個基因表達沉默劑，該沉默劑特異性靶向於由mRNA前體加工而來的mRNA的預選區域，mRNA前體是(i)中所定義的U1 snRNA的靶標，並且能夠導致所述靶mRNA在體內的沉默。
2.根據權利要求1所述的組合物或試劑盒，其中包括在第二組分內的沉默劑選自於以 下組中⑴siRNA(ii)miRNA(iii)shRNA(iv)編碼根據(i)、(ii)、(iii)的試劑的多聚核苷酸，和(ν)根據(i)到(iv)的一個或多個試劑的組合。
3.根據權利要求2所述的組合物或試劑盒，其中組分(ii)是包括編碼至少一個shRNA 序列的多聚核苷酸。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的組合物或試劑盒，其中，組分(i)包括多個編 碼Ul snRNA的多聚核苷酸，該Ul snRNA在其與內含子的5』末端的GU共有序列的結合序 列內被修飾，使得其特異性結合到相同靶mRNA前體的不同的預選區域，和/或組分(ii)包 括多個基因表達沉默劑，所述沉默劑特異性靶向作用於來自mRNA前體的加工的mRNA的不 同的預選區域，該mRNA前體是(i)中所定義的UlsnRNA的靶標，並能夠導致所述靶mRNA的 體內沉默。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的組合物或試劑盒，其中第二組分是編碼沉默 劑的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸和形成第一組分的多聚核苷酸形成單個載體的一部 分。
6.根據權利要求5所述的組合物或試劑盒，其中所述單個載體是病毒載體。
7.根據權利要求6所述的組合物或試劑盒，其中病毒載體選自由腺病毒、腺有關病毒、 逆轉錄酶病毒、慢病毒、皰疹病毒、SV40和α病毒組成的組中。
8.一種多聚核苷酸，其包括(i)編碼至少一個UlsnRNA的序列，Ul snRNA在它與內含子的5』末端的⑶共有序列 的結合序列內被修飾，使得其特異性的結合到靶mRNA前體的3』末端外顯子的預選區域，且 其能夠抑制靶mRNA前體的加工，和(ii)編碼沉默劑的序列，該沉默劑特異性靶向作用於由mRNA前體的加工而來的預選 區域，mRNA前體是由(i)中所定義的多聚核苷酸編碼的UlsnRNA的靶標，並能夠導致所述 靶mRNA的體內沉默。
9.根據權利要求8所述的多聚核苷酸，其中編碼沉默劑的序列包括至少一個siRNA的 有義鏈和反義鏈，編碼至少一個miRNA前體或者編碼至少一個shRNA。
10.根據權利要求8或9所述的多聚核苷酸，其中序列(i)和(ii)可操作的連接到表 達調控區域。
11.根據權利要求10所述的多聚核苷酸，其中序列(i)和(ii)的表達調控序列是不同的。
12.一種包括根據權利要求8至11中任一項所述的多聚核苷酸的表達載體。
13.根據權利要求12所述的載體，其中表達載體是病毒載體。
14.根據權利要求13所述的載體，其中病毒載體選自由腺病毒、腺有關的病毒、逆轉錄 酶病毒、慢病毒、皰疹病毒、SV40和α病毒組成的組中。
15.一種包括根據權利要求12至14所述的載體的細胞。
16.一種非人的轉基因動物，其包括整合到其基因組內的根據權利要求8至11中任一 項所述的多聚核苷酸、根據權利要求12至14中任一項所述的載體或根據權利要求15所述 的細胞。
17.根據權利要求1至7中任一項所述的組合物或試劑盒，根據權利要求8至11中任 一項所述的多聚核苷酸，根據權利要求12至14中任一項所述的載體或根據權利要求15所 述的細胞在醫藥中的用途或作為藥物的用途。
18.根據權利要求1至7中任一項所述的組合物或試劑盒，根據權利要求8至11中任 一項所述的多聚核苷酸，根據權利要求12至14中任一項所述的載體或根據權利要求15所 述的細胞用於治療或預防感染病、腫瘤、成癌的或者神經退行性疾病。
19.根據權利要求1至7中任一項所述的組合物或試劑盒，根據權利要求8至11中任 一項所述的多聚核苷酸，根據權利要求12至14中任一項所述的載體或根據權利要求15所 述的細胞在用於治療或預防感染病、腫瘤、成癌的或者神經退行性疾病的藥物的製備中的 用途。
20.一種用於治療感染病、腫瘤、成癌的或者神經退行性疾病的方法，包括向需要的患 者給藥根據權利要求1至7中任一項所述的組合物或試劑盒，根據權利要求8至11中任一 項所述的多聚核苷酸，根據權利要求12至14中任一項所述的載體或根據權利要求15所述 的細胞。
21.根據權利要求18所述的組合物或試劑盒，根據權利要求19所述的用途或者根據權 利要求20所述的方法，其中感染病為由病毒引起的感染性疾病。
22.根據權利要求21所述的組合物、試劑盒或方法，其中由病毒引起的感染病是由 HBV、HCV或HIV引起的感染。
23.一種藥物組合物，包括根據權利要求1至7中任一項所述的組合物或試劑盒、根據 權利要求8至11中任一項所述的多聚核苷酸、根據權利要求12至14中任一項所述的載體 或根據權利要求15所述的細胞和藥物學上可接受的載體。
24.根據權利要求1至7中任一項所述的組合物或試劑盒，其包括第一組分和第二組分 同時的、連續的或分別的使用的說明書。
25.根據權利要求1至7中任一項所述的組合物或試劑盒，其作為用於同時的、連續的 或分別的使用的聯合製劑。
26.一種非治療的方法，其用於在生物系統中的靶基因表達的體內或體外的轉錄後抑 制，其包括將所述系統與權利要求1至7中任一項所述的組合物、權利要求8至11中任一 項所述的多聚核苷酸、權利要求12至14中任一項所述的載體或權利要求15所述的細胞接 觸。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述生物模型是動物模型。
28.根據權利要求26或27所述的方法，其中轉錄後抑制包括涉及相同功能途徑的兩個 或更多的靶mRNAs的抑制。
全文摘要
本發明涉及用於基因表達的轉錄後抑制的組合物，其通過經修飾的靶向作用於靶mRNA前體的預選區域的U1snRNA和siRNA、shRNA和/或miRNA型的基因表達沉默劑的聯合使用，以及所述組合在由蛋白質的多餘的過量表達所引起的疾病的治療中的應用。
文檔編號C12N15/113GK101981189SQ200980111803
公開日2011年2月23日 申請日期2009年1月29日 優先權日2008年1月29日
發明者哈比爾·阿瓦德略雷特, 瑪麗亞普裡菲卡西·福特斯阿隆索 申請人:西馬生物醫學計劃公司