△8去飽和酶及其在製備多不飽和脂肪酸中的用途的製作方法

2023-04-29 01:12:36 1

專利名稱：：△8去飽和酶及其在製備多不飽和脂肪酸中的用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
。更具體地講，本發明涉及編碼A8脂肪酸去飽和酶的多核苷酸序列的鑑定以及這些去飽和酶在製備長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)中的用途。
背景技術：
：現今，人們正研究包括植物、藻類、真菌、原生藻菌(stmmen叩iles)和酵母在內的多種不同宿主作為商業化PUFA生產的手段。基因工程已經證明，一些宿主(即便是天然受限於亞油酸(LA;18:200-6)或(1-亞麻酸(ALA;18:3w-3)脂肪酸產生的那些宿主)的天然能力可以被顯著改變，以導致高水平地產生多種長鏈co-3/w-6PUFA。因此，花生四烯酸(ARA;20:4co-6)、二十碳五烯酸(EPA;20:5w-3)和二十二碳六烯酸(DHA;22:6w-3)可能均需要表達A8去飽和酶。目前為止所筌定的△8去飽和酶既具有將二十碳二烯酸(EDA;20:2w-6)轉化成二高-Y-亞麻酸的(DGLA;20:3w-6)的能力又具有將二十碳三烯酸(ETrA;20:3w-3)轉化成二十碳四烯酸(ETA;20:4w-3)的能力(其中在與A5去飽和酶反應之後，DGLA和ETA隨後分別被合成ARA和EPA，但是DHA的合成需要後續表達額外的〇20/22延伸酶(elongase)禾口△4去飽和酶)。基於△8去飽和酶在合成例如ARA、EPA和DHA中的作用，已經付出了相當大的努力來鑑定和表徵來自多種來源的這些酶。最初的努力集中在分離和表徵來自小眼蟲(Euglenagracilis)的△8去飽和酶；並且已經報導了小眼蟲A8去飽和酶中的若干序列變體(參見，例如Wallis等人，Arch.Biochem.andBiophys.,365(2):307-316(1999);PCT公布WO2000/34439;美國專利6,825,017;PCT公布WO2004/057001)。另外，共同擁有的共同未決的美國專利申請11/166,003和美國專利7,256,033公開了小眼蟲△8去飽和酶的胺基酸序列和核酸序列。在其他文獻中，共同擁有的共同未決的專利申請美國專利申請11/635258和11/951697描述了來源於小眼蟲的通過合成工程化的突變型A8去飽和酶。美國公開2005/0273885公開了來自鹽生巴夫藻(Pavlovasalina)的△8去飽和酶的胺基酸序列和核酸序列，共同擁有的共同未決的專利申請美國專利申請11/737772/^開了來自路氏巴夫藻(Pavlovalutheri)(CCMP459)的△8去飽和酶的胺基酸序列和核酸序列，而美國專利申請11/876115公開了來自如下物種的A8去飽和酶的胺基酸序列和才玄酉吏序歹1]:TetruetreptiapomquetensisCCMP1491、Eutreptiellasp.CCMP389和Eutreptiellacf—gymnasticaCCMP1594。Sayanova等人(FEBSLett.,580:1946-1952(2006))描述了對來自自由生活的土壤變形蟲卡氏棘變形蟲(Acanthamoebacastellanii)的cDNA的分離禾口表4正，當在鼠耳芥屬(Arabidopsis)中表達時，該cDNA編碼具有C20A8去飽和酶活性的多肽。儘管有上面列出的公開內容，但仍需要另外的編碼具有A8去飽和酶活性的多肽的基因，以便僅通過遺傳變異就能使許多種宿主細胞的PUFA生產最優化。本申請人通過報導從Euglenaanabaena中分離出編碼△8脂肪酸去飽和酶的基因而解決了這裡所說的需要。
發明內容本發明涉及編碼具有△8去飽和酶活性的多肽的新的遺傳構建體，以及它們在藻類、細菌、酵母、類眼蟲、原生藻菌和真菌中的使用，用於產生PUFA。因此，本發明提供包含分離的多核苷酸的微生物宿主細胞，該多核苷酸包含(a)編碼具有A8去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於ClustalV比對方法在與選自下列的胺基酸序列進行比較時，該多肽具有至少80%的胺基酸同一性SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23和SEQIDNO:24;(b)編碼具有A8去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於BLASTN比對方法在與選自下列的核苦酸序列進行比較時，該核苷酸序列具有至少80%的序列同一性SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQidno:19、seqidno:20和seqidno:39;(c)編碼具有a8去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中該核苷seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20和seqidno:39;或(d)(a)、(b)或(c)的核普酸序列的互補序列，其中該互補序列與該核苷酸序列由相同數目的核苷酸組成並且100%互補。在另一個實施方案中，本發明提供用於產生二高-y-亞油酸的方法，該方法包括a)提供微生物宿主細胞，該微生物宿主細胞包含(i)編碼a8去飽和酶多肽的重組核苷酸分子，基於ClustalV比對方法在與具有選自下列的胺基酸序列的多肽進行比較時，該去飽和酶多肽具有至少80%的胺基酸同一性seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23和seqidno:24;和(ii)二十碳二烯酸源；b)使步驟(a)的微生物宿主細胞在使編碼a8去飽和酶多肽的核酸片段表達並使二十碳二烯酸轉化成二高-y-亞油酸的條件下生長；並且，^壬選回收步驟(b)的二高-y-亞油酸。類似地，本發明提供用於產生二十碳四烯酸的方法，該方法包括a)才是供孩i生物宿主細力包，該樣i生物宿主細力包包含(i)編碼a5去飽和酶多肽的重組核苷酸分子，基於ClustalV比對方法在與具有選自下列的胺基酸序列的多肽進行比較時，該去々包和酶多肽具有至少80%的胺基酸同一性seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23和seqidno:24;和(ii)二十碳三烯酸源；b)V吏步驟(a)的微生物宿主細胞在使編碼a8去々包和酶多肽的核酸片段表達並使二十碳三烯酸轉化成二十碳四烯酸的條件下生長；並且，c)4壬選回收步驟(b)的二十石友四烯酸。在另一個實施方案中，本發明提供如seqidno:39中示出的編碼△8去飽和酶的分離的核酸分子，在該序列中至少208個密碼子^c密碼子優化以便在耶氏酵母屬(Yarrowm)物種中表達。附圖簡述和序列表圖l是代表性的w-3和co-6脂肪酸生物合成途徑，該途徑提供了肉豆蔻酸經過多種中間產物向DHA的轉4t。圖2A示出了解脂耶氏酵母(Yarrowmlipolytica)菌抹Y4001U的發育，在總的脂質級分中產生了約17%的EDA。圖2B提供了pZKLeuN-29E3的質粒圖譜，而圖2C提供了pY116的質粒圖語。圖3示出了如實施例1中所述的Euglenaanabaena細l包提取物的脂質概況的色譜圖。圖4A、4B和4C示出了對EaD8Desl(SEQIDNO:21)、EaD8Des2(SEQIDNO:22)、EaD8Des3(SEQIDNO:23)和EaD8Des4(SEQIDNO:24)的△8去飽和酶序列與功能性變體小眼蟲A8去飽和酶胺基酸序列(EgD8;SEQIDNO:25;在PCT專利申請WO2006/012325中稱為Eg5)進行的ClustalV比對。圖5提供了下列質粒的質粒圖譜(a)pYl15(SEQIDNO:34);和(b)pY175(SEQIDNO:35)。圖6提供了表達pY175、pY176、pY177和pY178的解脂耶氏酵母的脂肪酸概況(參見實施例5)。圖7A和7B示出了EaD8Des3(SEQIDNO:19)和EaD8S(SEQIDNO:39)的核苷酸序列的比較。圖8提供了如下質粒的質粒圖譜(a)pEaD8S(SEQIDNO:41);和(b)pZUFmEaD8S(SEQIDNO:51)。根據下面的詳細描述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發明，下面的詳細描述和附帶的序列描述形成了本申請的一部分。下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825("對包含核苷酸序列和/或胺基酸序列公開內容的專利申請的要求-序列規則，，("RequirementsforPatentApplicationsContainingNuceotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRules")),並且符合世界智慧財產權組織(WorldIntellectualPropertyOrganization)(WIPO)ST.25標準(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規則5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208節和附錄C)。用於核苷酸和胺基酸序列數據的符號和才各式遵循在37C.F.R.§1.822中列出的規則。SEQIDNO:1、2、10、11、13-25和28-51為編碼基因或蛋白質(或其片段)或質粒的ORF,如表l中所示。表1tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10SEQIDNO:3是載體特異性引物pDonor222Eg5-l的核苷酸序列。SEQIDNO:4畫7分別對應簡併引物D8DEG3-1、D8DEG3-2、D8DEG3-3和D8DEG3-4，用於擴增來自EuglenaanabaenaUTEX373的△8去飽和酶基因的部分。SEQIDNO:8和9分別對應T7引物和引物M13-28Rev，用於對部分推定的△8去飽和酶cDNA片段進行測序。SEQIDNO:12是引物EaD8seq-l的核普酸序列，用於對euglcA8去々包和酶克隆進4亍全長插入序列測序。SEQIDNO:26和27分別對應引物EaD8-5和EaD8-3,用於擴增EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3和EaD8Des4的編碼序列。發明詳述本文中/>開了新的EuglenaanabaenaA8去々包和酶和編碼這種去々包和酶的基因，其可用於操縱產生健康的PUFA的生化途徑。PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或補充劑，尤其是嬰兒代乳品(formula),用於接受靜脈內營養法的患者或用來預防或治療營養不良。或者，可以將純化的PUFA(或其衍生物)摻入食用油、脂肪或調配的人造黃油中，以便食用者在正常使用中將獲得所需量的膳食補充。PUFA還可以摻入嬰兒代乳品、營養補充劑或其他食品中，並且可用作抗炎或降膽固醇劑。任選地，該組合物可以用於藥用(人藥或獸藥)。定義在本公開的上下文中，使用了大量術語和縮寫。給出了如下定義。"可讀框"縮寫為ORF。"聚合酶鏈反應"縮寫為PCR。"美國典型培養物保藏中心"縮寫為ATCC。"多不飽和脂肪酸"縮寫為PUFA。"三醯基甘油"縮寫為TAG。如本文所用，術語"發明"或"本發明"不旨在局限於本發明的任一具體實施方案，而是在一般情況下適用於如權利要求和說明書中所描述的本發明的任何實施方案和所有實施方案。本文所用的以及所附權利要求書中所用的單數形式"一個"、"一種"和"所述"包括複數指代，除非上下文中清楚地指明其他涵義。因此，例如，"一林植物"的涵義包括多抹此類植物，"一個細胞，，的涵義包括一個或多個細胞及其本領域的技術人員已知的等同物，等等。術語"脂肪酸"指不同鏈長的長鏈脂族酸(鏈烷酸)，鏈長為約C12至C22(儘管更長和更短鏈長的酸均是已知的)。主要的鏈長介於Cl6和C22之間。另外的關於"飽和脂肪酸"與"不飽和脂肪酸"、"單不飽和脂肪酸"與"多不飽和脂肪酸"(或"PUFA")以及"w-6脂肪酸"(co-6或n-6)與"o)-3脂肪酸"(w-3或n-3)之間的區別的詳細信息在美國專利7,238,482中有所提供。本文通過簡單的記號系統"X:Y，，來描述脂肪酸，其中X表示特定脂肪酸中碳(c)原子的總數，而Y為雙鍵的數目。脂肪酸名稱後面的數字表示從脂肪酸羧基端計數的雙鍵的位置，詞綴"c，，表示雙鍵的順式構型(例如，棕櫚酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1，9c)、巖芽酸(18:1，6c)、LA(18:2，9c,12c)、GLA(18:3,6c,9c,12c)和ALA(18:3,9c,12c,15c))。除非另外指明，18:1、18:2和18:3分別指油酸、LA和ALA脂肪酸。如果沒有另外明確地寫明，則認為雙鍵為順式構型。例如，18:2(9,12)中的雙鍵將被認為是順式構型。在本公開內容中用於描述PUFA的命名在下面的表2中示出。在標題為"簡化符號，，一欄中，oo-指代系統用於表明碳數目、雙鍵的數目和最接近co碳的雙鍵位置，雙鍵位置的計數從co碳開始(為此O)碳的編號為l)。該表的其餘部分匯總了co-3和w-6脂肪酸及其前體的俗名、將在整個說明書的其餘部分中使用的縮寫以及每種化合物的化學名稱。表2多不飽和脂肪酸和前體的命名俗名縮寫化學名稱簡化符號肉豆蔻酸—十四酸14:0棕櫚酸PA或棕櫚酸酯十六酸16:0棕櫚油酸—9-十六碳烯酸16:1硬脂酸一一十八酸18:0油酸——順式_9-十八碳烯酸18:1亞油酸LA順式-9,12-十八^暖二烯酸18:2w國6Y隱亞麻酸GLA順式-6,9,12-十八碳三烯酸18:3co-6二十碳二烯酸EDA順式-ll,14-二十碳二烯酸20:2co-6二高-y-亞麻酸DGLA順式-8,ll,14-二十碳三烯酸20:3co-6SciadonicSCI順式-5,ll,14-二十碳三烯酸20:3boo-6花生四烯酸ARA順式-5,8,ll,14-二十碳四烯酸20:4co-6oc-亞麻酸ALA順式-9,12,15-十八碳三烯酸18:3w隱3十/\^友四烯酸STA順式-6,9,12，15-十八碳四烯酸18:4w-3二十碳三烯酸ETrA或ERA順式-ll,14,17-二十碳三烯酸20:3w-3二十碳四烯酸ETA順式-8,ll,14,17-二十碳四烯酸20:4w-3Juniperonic了UP順式-5,ll,14，17-二十碳三烯酸20:4bw-3二十二碳三烯酸DRA順式-10,13,16-二十二碳三烯酸22:3w-6二十二碳四烯酸DTA順式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸22:4w-6二十二碳五烯酸DPAn陽6順式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸22:5co畫6二十碳五烯酸EPA順式-5,8,ll,14,17-二十碳五烯酸20:5w-3二十二碳五烯酸DPA順式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸22:5oo隱3二十二^_六烯酸DHA順式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸22:6co-3術語"三醯基甘油"、"油"和"TAG"指由與甘油分子酯化的三個脂肪醯殘基組成的中性脂質(並且這些術語在整個本公開內容中將可互換使用)。這些油可含有長鏈PUFA以及較短的飽和的和不飽和的脂肪酸以及較長鏈的飽和脂肪酸。因此，"油的生物合成"一般指細胞中TAG的合成。"總脂質和油級分中的PUFA百分比(％)"指PUFA相對於在那些級分中的總脂肪酸的百分比。術語"總脂質級分，，或"脂質級分"兩者均指含油生物內所有脂質(即中性和極性脂質)的總和，因此包括位於磷脂醯膽鹼(PC)級分、磷脂醯乙醇胺(PE)級分和三醯基甘油(TAG或油)級分中的那些脂質。然而，術語"脂質"和"油，，可在整個說明書中互換使用。代謝途徑或生物合成途徑在生物化學意義上可以認為是發生於細胞內由酶催化的一系列化學反應，以實現細胞待使用的或待貯存的代謝產物的形成，或啟動另一代謝途徑(因而稱作流量產生步驟)。很多此類途徑都很精細，並涉及對起始物質的逐步修飾以使之形成具有期望的精確化學結構的產物。術語"PUFA生物合成途徑"指將油酸轉化成諸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DRA、DTA和DPAn-6之類的w-6脂肪酸和諸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之類的w-3脂肪酸的代謝過程。該過程在文獻中已有詳細的描述(如參見PCT7>布WO2006/052870)。簡而言之，該過程涉及通過添加石友原子來延長碳鏈和通過加入雙4建來《吏分子去飽和，這通過存在於內質網膜內的一系列特異性去飽和酶和延伸酶(即"PUFA生物合成途徑酶")進行。更具體地講，"PUFA生物合成途徑酶"指如下與PUFA生物合成相關的任何酶(以及編碼所述酶的基因)，包括A9延伸酶、(:14/16延伸酶、016/18延伸酶、C戱o延伸酶、C2。/22延伸酶、A4去4t和酶、A5去々包和酶、A6去々包和酶、A12去々包和酶、A15去々包和酶、A17去飽和酶、A9去々包和酶和/或A8去俯^和酶。術語"w-3/co-6脂肪酸生物合成途徑"指在合適條件下表達時編碼催化產生w-3和w-6脂肪酸二者之一或兩者的酶的一組基因。通常，參與w-3/co-6脂肪酸生物合成途徑的基因編碼PUFA生物合成途徑酶。圖1示出了代表性的途徑，提供了肉豆蔻酸經過多種中間產物向DHA的轉化，這展示了co-3和co-6脂肪酸兩者是如何可以從共同來源而產生。自然，該途徑分成兩部分，其中一部分將產生w-3脂肪酸而另一部分產生w-6脂肪酸。如本文關於oo-3/w-6脂肪酸生物合成途徑的上下文中所用，術語"功能性的，，指該途徑中的一些(或全部)基因表達活性酶，從而導致體內催化或底物轉化。應當理解，"co-3/w-6脂肪酸生物合成途徑"或"功能性co-3/co-6脂肪酸生物合成途徑"並不意味著所有的PUFA生物合成途徑酶基因均是必需的，因為許多脂肪酸產物將僅需要表達該途徑中的一亞組基因。術語"A6去飽和酶/A6延伸酶途徑"將指最低程度包括至少一種△6去飽和酶和至少一種ds/2Q延伸酶(也稱為△6延伸酶)的PUFA生物合成途徑，從而使得能分別從LA和ALA開始，以GLA和/或STA作為脂肪酸中間產物來生物合成DGLA和/或ETA。通過其他去飽和酶和延伸酶的表達，還可以合成ARA、EPA、DPA和DHA。術語"A9延伸酶/A8去飽和酶途徑"將指最低程度包括至少一種△9延伸酶和至少一種A8去飽和酶的PUFA生物合成途徑，從而使得能分別/人LA和ALA開始，以EDA和/或ETrA作為脂肪酸中間產物來生物合成DGLA和/或ETA。通過其他去々包和酶和延伸酶的表達，還可以合成ARA、EPA、DPA和DHA。術語"脂肪酸中間產物"指在脂肪酸代謝途徑中產生的任何脂肪酸，其可以通過其他代謝途徑酶的作用進一步轉化成本途徑的目的脂肪酸產物。例如，當利用A9延伸酶/A8去々包和酶途徑產生EPA時，可以產生EDA、ETrA、DGLA、ETA和ARA並被認為是"脂肪酸中間產物"，因為這些脂肪酸可通過其他代謝途徑酶的作用進一步轉化成EPA。術語"脂肪酸副產物，，指在脂肪酸代謝途徑中產生的既非該途徑的目的脂肪酸產物又非該途徑的"脂肪酸中間產物"的任何脂肪酸。例如，當利用A9延伸酶/A8去飽和酶途徑來產生EPA時，sciadonic酸(SCI)和jumperomc酸(JUP)也可通過A5去飽和酶分別作用於EDA或ETrA而產生。它們被認為是"脂肪酸副產物"，因為兩者均不能通過其他代謝途徑酶的作用進一步轉化成EPA。術語"去飽和酶"指可以在一種或多種脂肪酸中去飽和(即引入雙鍵)而產生所關注的脂肪酸或前體的多肽。儘管在整個說明書中使用w-指代系統來指代特定的脂肪酸，但使用A-系統從底物的羧基端計數來表示去飽和酶的活性更方便。本文尤其關注的是使脂肪酸在從該分子的羧基端計數的第8個和第9個碳原子之間去飽和並且可以(例如)催化EDA轉化成DGLA和/或催化ETrA轉化成ETA的△8去飽和酶。其他脂肪酸去飽和酶包括例如(1)△5去飽和酶，該去飽和酶催4匕DGLA轉化成ARA和/或催化ETA轉化成EPA;(2)△6去飽和酶，該去飽和酶催化LA轉化成GLA和/或催化ALA轉化成STA;(3)△4去飽和酶，該去飽和酶催化DPA轉化成DHA和/或催化DTA轉化成DPAn-6;(4)A12去飽和酶，該去飽和酶催化油酸轉化成LA;(5)△15去々包和酶，該去々包和酶催4tLA轉化成ALA和/或催化GLA轉化成STA;(6)△17去i包和酶，該去糹包和酶催化ARA轉化成EPA和/或催化DGLA轉化成ETA;以及(7)A9去飽和酶，該去飽和酶催化棕櫚酸轉化成棕櫚油酸(16:1)和/或催化硬脂酸轉化成油酸(18:1)。在本領域中，基於A15和A17去々包和酶將w-6脂肪酸轉化成它們的co-3對應物的能力(如分別將LA轉化成ALA和將ARA轉化成EPA),偶爾也將它們稱作"co-3去飽和酶"、"w-3去飽和酶"和/或"co-3去飽和酶"。在一些實施方案中，最理想的是，通過用脂肪酸去飽和酶的基因來轉化合適的宿主並測定它對該宿主脂肪酸相剋況的作用，/人而經-驗性地測定特定脂肪酸去飽和酶的特異性。術語"EaD8Desl"指從Euglenaanabaena分離的由本文中的SEQIDNO:17編碼的A8去飽和酶(SEQIDNO:21)。術語"EaD8Des2"指從E.anabaena分離的由本文中的SEQIDNO:18編碼的A8去飽和酶(SEQIDNO:22)。同樣，術語"EaD8Des3"指從E.anabaena分離的由本文中的SEQIDNO:19編碼的A8去飽和酶(SEQIDNO:23)。術語"EaD8Des4"指從E.anabaena分離的由本文中的SEQIDNO:20編碼的A8去飽和酶(SEQIDNO:24)。類似地，術語"EaD8S，，指來源於E.anabaena的、經密碼子最優化以便在解脂耶氏酵母屬中表達的合成的△8去飽和酶(即SEQIDNO:39和40)。術語"EgD8"指分離自小眼蟲的A8去飽和酶(其由SEQIDNO:2示出的核苷酸序列編碼)。EgD8與PCT乂A布WO2006/012325和WO2006/012326中所述的"Eg5"(即美國專利7,256，033的SEQIDNO:2)具有100%的同一性和功能等效性。術語"轉化效率，，和"底物轉化百分比"指特定酶(如去^fe和酶)能夠將底物轉化成產物的效率。轉化效率根據下面的公式測量([產物]/[底物+產物])*100,其中'產物，包括中間產物和該途徑中來源於它的所有產物。術語"延伸酶"指能延長脂肪酸碳鏈從而產生比該延伸酶作用於其上的脂肪酸底物長2個碳原子的酸的多肽。該延長過程在與脂肪酸合酶相關的多步驟機制中發生，如美國專利公開2005/0132442中所述。由延伸酶體系催化的反應的實例是將GLA轉化成DGLA、將STA轉化成ETA、將LA轉化成EDA、將ALA轉化成ETrA、將ARA轉化成DTA和將EPA轉化成DPA。通常，延伸酶的底物選擇性有些廣泛，4旦由鏈長度和不飽和程度兩者來區分。例如，C14/16延伸酶將會利用C14底物(如肉豆蔻酸)，C16/18延伸酶將會利用Cw底物(如棕櫚酸)，C18/2o延伸酶(也稱為A6延伸酶，兩個術語可以互換使用)將會利用C18底物(如GLA、STA),而C2o/22延伸酶將會利用C加底物(如ARA、EPA)。類似地，"△9延伸酶"能夠催化LA轉化成EDA和/或催化ALA轉化成ETrA。重要的是，須注意一些延伸酶具有廣泛的特異性並因而單個延伸酶可能能夠催化幾種延伸酶反應(如，從而既可作為(:16/18延伸酶又可作為C18/20延伸酶)。可能理想的是，通過用脂肪酸延伸酶的基因來轉化合適的宿主並測定它對該宿主脂肪酸概況的作用，^^而經-瞼性地測定脂肪酸延伸酶的特異性。術語"含油的"指那些往往以脂質形式貯存它們的能源的生物(Weete,FungalLipidBiochemistry,第二版，Plenum,1980)。在含油微生物內，細胞油或TAG含量通常符合S形曲線，其中脂質濃度增加，直至在對數生長晚期或穩定生長早期時它達到最高濃度，隨後在穩定生長晚期和死亡期期間逐漸下降(Yongrmamtchai和Ward,Appl.Environ.Microbiol.,57:419-25(1991))。含油微生物積累油超過它們的幹細胞重量的約25%的情形並不鮮見。術語"含油酵母，，指那些能夠產油並被歸類為酵母的微生物。含油酵母的實例包括但不限於如下屬耶氏酵母屬(Yarrowia)、々i絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidmm)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)和油脂酵母屬(Lipomyces)。優選用於本發明的是含油解脂耶氏酵母菌林。術語"棵藻綱(Euglenophyceae)"指生活在淡水環境、海洋環境、土壤環境和寄生環境中的一群單細胞的無色或光合鞭毛蟲("類眼蟲，，)。該綱的特徵為孤立的單細胞，其中大多數是自由遊動的並且具有從稱為儲存器的前內陷長出的兩條鞭毛(其中一條可能不露出)。光合類眼蟲含有一個至多個葉綠體，葉綠體從微小的盤狀至延伸的板狀或帶狀而不同。無色類眼蟲依賴於滲透營養或吞噬營養來進行營養同化作用。已經描述了約1000種物種並將它們分為約40個屬和6個目。一果藻綱的實例包括但不限於如下屬棵藻屬(Euglena)、Eutreptiella和Tetruetreptm。如本文所用，"核酸"是指多核普酸，並包括單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苦酸或核糖核苦酸鹼基聚合物。核酸也可以包括片段和經修飾的核苷酸。因此，術語"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或"核酸片段，，可互換使用，並且指作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸鹼基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因組DNA、合成DNA或它們的混合物的一個或多個片段構成。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)可以用如下它們的單字母名稱指代"A"表示腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別針對RNA或DNA),"C"表示胞苦酸或脫氧胞苷酸，"G"表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，"U，，表示尿苷酸，"T，，表示脫氧胸苷酸，"R"表示噪呤(A或G),"Y，，表示嘧啶(C或T),"K，，表示G或T,"H，，表示A或C或T，'T，表示月幾苷，"N"表示^壬何核苷酸。術語"保守結構域"或"基序"指進化上相關的蛋白質的比對序列中在特定位置處保守的一組胺基酸。雖然同源蛋白質之間在其他位置的胺基酸可以發生變化，但在特定位置高度保守的胺基酸表明對蛋白質的結構、穩定性或活性來說是必需的胺基酸。因為它們可通過它們在蛋白質同系物家族的比對序列中的高度保守來鑑定，所以它們可用作識別標籤或"籤名"來確定具有新的測定序列的蛋白質是否屬於以前鑑定的蛋白質家力i。術語"同源性"、"同源的"、"基本上類似的"和"基本上對應的"在本文中可互換使用。它們指這樣的核酸片段，即其中一個或多個核苦酸鹼基改變並不會影響該核酸片段介導基因表達或產生某種表型的能力。這些術語也指本發明的核酸片段的修飾(例如缺失或插入一個或多個核苷酸)，相對於初始的未經修飾的核酸片段，該修飾基本上不會改變所得核酸片段的功能特性。因此，正如本領域的技術人員應當理解的，本發明涵蓋的不僅僅是具體的示例性序列。此外，技術人員認識到，本發明所涵蓋的基本上類似的核苷酸序列也通過它們(在中等嚴格條件如0.5XSSC,0.1%SDS，60。C下)與本文分以及雜交至與本文所公^的任何核苷酸序列功能相當的序列的能I所限定。可以調節嚴格性條件以篩選中度相似的片段(例如來自遠緣生物的同源序列)，到篩選高度相似的片段(例如從近緣生物複製功能性酶的基因)。雜交後的洗滌可確定嚴格性條件。術語"選擇性雜交"包括指在嚴格雜交條件下，核酸序列與特定核酸靶序列以比其與非靶核酸序列的雜交更高的可^f企測程度(例如至少兩倍於背景)雜交，並指基本排除了非靶核酸。選擇性雜交的序列通常彼此具有約至少80%的序列同一性，或90%的序列同一性，最多並包括100%的序列同一性(即完全互補)。術語"嚴格條件"或"嚴格雜交條件"包括指探針將會選擇性雜交至其耙序列的條件。嚴格條件是序列依賴性的，並將因不同的環境而異。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑑定與探針100%互補的靶序列(同源探測)。或者，可調節嚴格條件以允許序列中的一些錯配，以便檢測到更低程度的相似性(異源探測)。通常，探針的長度少於約1000個核苷酸，任選長度少於500個核苷酸。通常，嚴格條件將是如下那些條件在pH7.0至8.3下鹽濃度低於約1.5M鈉離子，通常約0.01至l.OM鈉離子濃度(或其他鹽)，並且對於短探針(例如10至50個核苷酸)溫度為至少約30°C,而對於長的探針(例如多於50個核苦酸)溫度為至少約60°C。嚴格條件也可以通過加入諸如甲醯胺之類的去穩定劑來實現。示例性的低嚴格條件包括在37。C下於含30至350/。曱醯胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基疏酸鈉)的緩衝液中雜交，以及在50至55。C下用1X至2XSSC(20XSSC二3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)洗滌。示例性的中等嚴格條件包括在37。C下於40至45%曱醯胺、1MNaCl、P/。SDS中雜交，以及在55至60。C下用0.5X至IXSSC洗滌。示例性的高嚴格條件包括在37。C下於50%甲醯胺、1MNaCl、P/oSDS中雜交，以及在60至65°C下用0.1XSSC洗滌。特異性通常取決於雜交後洗滌，最終洗滌溶液的離子強度和溫度是關鍵因素。對於DNA-DNA雜交體，Tm可以用Memkoth等人，Anal.Biochem.,138:267-284(1984)中的等式估算Tm=81.5°C十16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M是單價陽離子的體積摩爾濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核普酸的百分比，。/。form是雜交溶液中甲醯胺的百分比，而L是以鹼基對表示的雜交體的長度。Tm指(在確定的離子強度和pH下)50%的互補靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。每出現1%的錯配，Tm降低約rC;因此，可調節Tm雜交和/或洗滌條件以與具有期望同一性的序列雜交。例如，如果要尋求具有>90%同一性的序列，則可將Tm降低l(TC。通常，在確定的離子強度和低約5。C二;而，極嚴格條件可採用在:匕熱解鏈溫度'(Tm)低:、2、3或4。C的溫度下雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可採用在比熱解鏈溫度(Tm)低6、7、8、9或1(TC的溫度下雜交和/或洗滌；而低嚴格條件可採用在比熱解鏈溫度(Tm)低11、12、13、14、15或20。C的溫度下雜交和/或洗滌。利用上述等式、雜交和洗滌組合物以及所需的Tm,—般技術人員將會理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的變化已經在本質上得以描述。如果所需的錯配程度導致Tm低於45。C(水溶液)或32。C(曱醯胺溶液)，則優選增加SSC的濃度以便能使用更高的溫度。對核酸雜交的詳盡指導可在以下文獻中找到Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分,第2章"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays",Elsevier,NewYork(1993》以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章,Ausubel等人編輯,GreenePublishingandWiley畫Interscience,NewYork(1995》雜交禾口/或洗滌條件可進行至少10、30、60、90、120或240分鐘。在核酸序列或多肽序列的上下文中，"序列同一性"或"同一性"指在特定比4交窗口上進4亍比對以尋求最大對應時兩個序列中相同的核酸石鹹基或胺基酸殘基。因此，"序列同一性百分比"指通過在比較窗口上比4支兩個最佳對齊的序列而測得的值，其中與參考序列(其不包括添加或缺失)進行比較，比較窗口中的多核普酸或多肽序列部分可包括添加或缺失(即缺口)以實現兩個序列的最佳比對。該百分比通過如下計算測定相同核酸減^基或胺基酸殘基在兩個序列中出現的位置的數目，以獲得匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗口中的總位置數目並將所得結果乘以100而獲得序列同一性百分比。序列同一性百分比的可用的實例包括但不限於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%,或50%至100%的任何整數百分比。這些同一性可以用本文描述的4壬何程序測定。序列比對和百分比同一性或相似性的計算可以用設計用於岸企測同源序列的多種比4交方法來確定，這些方法包括但不限於LASERGENE生物信息學計算軟體包(DNASTARInc.，Madison,WI)的MegAlignT、I序。在本專利申請的上下文中應當理解，使用序列分析軟體進行分析時，分析結果將基於所參考程序的"默認值，，，除非另外指明。在此所用的"默認值"將指在首次初始化軟體時軟體最初加載的任何值或參數集。"ClustalV比對方法，，對應於稱為ClustalV(在Higgins和Sha卬，CABIOS,5:151-153(1989);Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.,8:189-191(1992)中有所描述)並且可以在LASERGENE生物信息學計算軟體包(DNASTARInc.，Madison,WI)中的MegAlign程序中找到。對於多重比對，默:〖人值對應於缺口罰分(GAPPENALTY)=10和缺口長度罰分(GAPLENGTHPENALTY)=10。用ClustalV方法進行成對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默認參數為KTUPLE=1、缺口罰分=3、窗口(WINDOW)=5和DIAGONALSSAVED=5。對於核酸，這些參數為KTUPLE=2,缺口罰分=5,窗口=4和DIAGONALSSAVED=4。在用ClustalV程序進行序列比對後，有可能通過觀察相同程序中的"序列距離"表來獲得"百分比同一性"。"BLASTN比對方法"是由國家生物4支術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)提供的用以採用默認參數比較核苷酸序列的算法。本領域的技術人員非常清楚，多種程度的序列同一性可用於從其他物種中鑑定多肽，其中這類多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用的實例包括但不限於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%,或50%至100%的任何整悽t百分比。實際上，50%至100%的任何整數胺基酸同一性可用於描述本發明，例如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。而且，所關注的是這種分離的核苷酸片l爻的任何全長或部分互補的序列。"密碼子筒並性，，指允許核苷酸序列在不影響所編碼的多肽的胺基酸序列的情況下發生變化的遺傳密碼的性質。因此，本發明涉及編碼胺基酸序列的全部或基本部分的任何核酸片段，該胺基酸序列編碼在SEQIDNO:21、22、23和24中列出的本發明的類眼蟲多肽。技術人員非常了解具體宿主細胞在使用核苷酸密碼子以確定給定胺基酸時所表現出的"密碼子偏倚性，，。因此，當合成基因用以改善在宿主細胞中的表達時，希望對基因進行設計，使得其密碼子使用頻率接近該宿主細胞優選的密碼子使用頻率。"合成基因，，可由使用本領域技術人員已知的方法化學合成的寡核苷酸構件裝配而成。將這些構件進行連接並退火以形成基因節段，該基因節段隨後在酶促作用下裝配而構建成完整的基因。因此，基於最優化核苦酸序列以反映宿主細胞的密碼子偏倚性，可以定製基因用以最優化基因表達。如果密碼子使用偏向於宿主偏好的那些密碼子，則技術人員會理解成功的基因表達的可能性。優選的密碼子的確定可基於對來源於宿主細胞的基因(其中序列信息可獲得)的檢測。"基因"指表達特定蛋白質的核酸片段，並且該核酸片段可以指單獨的編碼區或可以包括位於編碼序列之前的調控序列(5'非編碼區)和之後的調控序列(3'非編碼區)。"天然基因"是指天然存在的具有其自己的調控序列的基因。"嵌合基因"是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情況下不是一起存在的調控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包括源於不同來源的調控序列和編碼序列，或者包括源於同一來源但以不同於天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。"內源性基因"指位於生物的基因組內它的天然位置的天然基因。"外來基因，，指正常情況下不存在於宿主生物中的基因，它通過基因轉移導入宿主生物內。外來基因可以包含插入到非天然生物內的天然基因，或嵌合基因。"轉基因"是已通過轉化方法導入基因組內的基因。"經密碼子最優化的基因"是其密碼子使用頻率經設計用以才莫仿宿主細胞優選的密碼子使用頻率的基因。"編碼序列"指編碼特定胺基酸序列的DNA序列。"調控序列"指位於編碼序列上遊(5'非編碼序列)、之內或下遊(3'非編碼序列)的核苷酸序列，並且該核苷酸序列影響相關編碼序列的摔爭錄、RNA加工或穩定性或翻譯。調控序列可包括但不限於啟動子、翻譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點和莖環結構。"啟動子"指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般來講，編碼序列位於啟動子序列的3'端。啟動子可整個源於天然基含合成的DNA片段。本領域內的技術人員應當理解，不同的啟動子可以在不同的組織或細胞類型中，或者在不同的發育階^:,或者響應不同的環境條件而引導基因的表達。導致基因在大部分時間內在大多數細胞類型中表達的啟動子通常稱為"組成型啟動子"。還應當認識到，由於在大多數情況下調控序列的確切邊界尚未完全確定，因此一些改變形式的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。啟動子序列可以由鄰近的和更遠處的上遊元件組成，後一類元件常稱為增強子。因此，"增強子"是能刺激啟動子活性的DNA序列，並且可以是啟動子的固有的元件或插入的異源元件，用以增強啟動子的水平或組織特異性。"翻譯前導序列"指位於基因的啟動子序列和編碼序列之間的多核苷酸序列。翻譯前導序列存在於翻i奪起始序列的經完全加工後的mRNA上遊。翻i,前導序列可影響mRNA的初級轉錄過程、mRNA穩定性或翻譯效率。已經描述了翻譯前導序列的實例(Turner,R.和Foster,G.D.，Mol.Biotechnol.,3:225-236(1995))。術語"3'非編碼序列"、"轉錄終止子，，和"終止序列，，指位於編碼序列下遊的DNA序列。這包括多腺苷酸化識別序列和編碼能影響mRNA加工或基因表達的調節信號的其他序列。多腺苷酸化信號通常表徵為影響多腺普酸片添加到mRNA前體的3'末端。3'區可影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性或翻i,。"RNA轉錄物"指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄所產生的產物。當RNA轉錄物與DNA序列拷貝完全互補時，它指初級轉錄物。當RNA轉錄物是來源於初級轉錄物的轉錄後加工的RNA序列時，它指成熟的RNA。"信使RNA，，或"mRNA"指無內含子並且可以由細胞翻i奪成蛋白質的RNA。"cDNA，，指與mRNA才莫板互補並用反轉錄酶/人mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈，或使用DNA聚合酶I的Klenow片段轉化成雙鏈。"有義，，RNA指包含mRNA並且能在細胞內或體外翻譯成蛋白質的RNA轉錄物。"反義RNA"指與靶初級轉錄物或mRNA的全部或部分互補並且可阻斷革巴基因的表達的RNA轉錄物(美國專利5,107,065)。反義RNA可以與特定基因轉錄物的任何部分，即5'非編碼序列、3'非編碼序列、內含子或編碼序列互補。"功能性RNA"指反義RNA、核酶RNA或其他不能翻譯但是對細胞過程有影響作用的RNA。術語"互補的"和"反向互補的"對mRNA轉錄來i兌可互換使用，並且用以定義信4吏反義RNA。術語"可操作地連接"指單個核酸片段上的核酸序列的關聯，使得其中一個核酸序列的功能受到另一個核酸序列的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達(即，該編碼序列受到該啟動子的轉錄控制)時，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以以有義或反義的取向可操作地連接至調控序列。術語"重組體"是指例如通過化學合成或通過用基因工程技術操縱分離的核酸片段而實現的兩個原本分離的序列片段的人工組合。如本文所用，術語"表達"指源於本發明的核酸片段的有義RNA(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定積聚。表達也可指mRNA翻i奪成蛋白質(其為前體蛋白或成熟蛋白)。"成熟，，蛋白指經翻譯後加工的多肽(即已經去除了存在於初始翻譯產物中的任何前肽或肽原的多肽)。"前體"蛋白質指mRNA的初級翻譯產物(即前肽和肽原仍然存在)。前肽和肽原可以是(但不限於)細月包內定^f立4言號。術語"質粒，，和"載體，，指通常攜帶有不屬於細胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件，並且常常是環狀雙鏈DNA片段的形式。這類元件可以是源自任何來源的自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核普酸序列(線性或環狀)，其中多個核苷酸序列已連接或重組為一種獨特構建體，該獨特構建體能夠將表達盒引入細月包中。術語"表達盒"指包含如下序列的DNA片段所選基因的編碼序列和所選基因產物表達所需的位於編碼序列之前(5'非編碼序列)和之後(3'非編碼序列)的調控序列。因此，表達盒通常由如下序列構成(l)啟動子序列；(2)編碼序歹'J(即ORF);和(3)3'非翻i奪區(即終止子)，在真核生物中其通常含有多腺苷酸化位點。表達盒通常包含於載體中以有利於克隆和轉化。可以將不同表達盒轉化進包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞在內的不同生物體中，只要能針對每種宿主使用正確的調控序列。"重組DNA構建體，，(在本文中也可互換地稱為"表達構建體"和"構建體")包含核酸片段(如在天然條件下不會一起存在的調控序列和編碼序列)的人工組合。因此，重組DNA構建體可以包含源於不同來源的調控序列和編碼序列，或源於相同來源但以不同於天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。此類構建體可獨自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決於本領域技術人員熟知的將要用於轉化宿主細胞的方法。例如可以使用質粒載體。技術人員十分了解必須存在於載體上以成功地轉化、選擇和繁殖含本發明任何分離的核酸片段的宿主細胞的遺傳元件。技術人員還將認識到，不同的獨立轉化事件將導致不同水平和才莫式的表達(Jones等人，EMBOJ.,4:2411-2418(1985);DeAlmeida等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86(1989)),因此，必須篩選多次事件以獲得顯示期望表達水平和模式的品系。這樣的篩選可以通過DNA的Southern印跡分析、mRNA表達的Northern印跡分析、蛋白表達的免疫印跡分析或表型分析等完成。術語"導入"指將核酸(例如表達盒)或蛋白質提供至細胞中。導入包括指將核酸整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸可以整合進細胞的基因組內，並包括指將核酸或蛋白暫時提供給細胞。導入包括指穩定的或瞬時的轉化方法以及有性雜交。因此，將核酸片^:(如重組DNA構建體或表達盒)插入細胞內的情況下的"導入"是指"轉染"或"轉化，，或"轉導，，，並且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸片段可以整合進細胞的基因組(如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)內、轉變成自主的複製子或瞬時表達(例如轉染的mRNA)。"穩定轉化"指將核酸片段轉移至宿主生物的基因組(包括核基因組和細胞器基因組)中，導致在遺傳上穩定遺傳。相反"瞬時轉化"指將核酸片段轉移至宿主生物的核中或包含DNA的細胞器中，導致基因表達而不整合或不穩定遺傳。含有轉化核酸片段的宿主生物被稱為"轉基因"生物或"重組"生物或"轉化"生物。如本文所用，"轉基因，，指其基因組內含有異源多核苷酸的細胞。優選的是，異源多核苷酸被穩定地整合進基因組中，使得該多核苷酸能傳遞至連續的世代。異源多核苷酸可以單獨地或作為表達盒的部分整合進基因組中。本文所用的轉基因包括因異源核酸存在而已經改變了基因型的任何細胞或細胞系，包括初始進行此類改變的那些轉基因以及從初始的轉基因通過有性雜交或無性繁殖而產生的那些。在此使用的術語"轉基因，，不涵蓋通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發突變之類的自然發生事件導致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。本文4吏用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域所熟知的並且在如下文獻中有更全面的描述Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989);Silhavy,T.J.、Bennan,M.L.和Enqmst，L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1984);以及Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版，Hoboken,NJ(1987)。轉化方法是本領域技術人員熟知的並且在下文中有描述"綜述脂肪酸和三醯基甘油的微生物生物合成"。通常，含油微生物的脂質蓄積是響應存在於生長培養基中的總的碳氮比而觸發。該過程(導致含油微生物中游離棕櫚酸(16:0)的從頭合成)在美國專利7,238,482中有詳細描述。棕櫚酸是長鏈飽和和不飽和脂肪酸衍生物的前體，這些脂肪酸衍生物通過延伸酶和去飽和酶的作用形成(圖1)。TAG(脂肪酸的主要貯存單位)通過涉及如下反應的一系列反應形成(1)一分子的醯基輔酶A和甘油-3-磷酸通過醯基轉移酶酯化而生成溶血磷脂酸；(2)第二分子的醯基輔酶A通過醯基轉移酶酯化而生成1,2-二醯基甘油磷酸(通常稱為磷脂酸)；(3)通過磷脂酸磷酸酶除去磷酸而生成1，2-二醯基甘油(DAG);以及(4)在醯基轉移酶的作用下加入第三個脂肪酸以形成TAG。廣譜的脂肪酸可淨皮整合進TAG中，包括々包和和不飽和脂肪酸以及短糹連和長《連脂肪酸。oo脂肪酸的生物合成其中油酸轉化成co-3/w-6脂肪酸的代謝過程涉及通過添加碳原子使碳鏈延長和通過加入雙鍵使分子去飽和。這需要存在於內質網膜內的一系列特殊去飽和酶和延伸酶。然而，如圖1中看到的和如下所述的，通常存在多個用於產生特定co-3/oo-6脂肪酸的替代途徑。具體地講，所有途徑均需要最初通過A12去^:包和酶將油酸轉化成LA(第一種co-6脂肪酸)。然後，利用"A9延伸酶/A8去飽和酶途徑"並將LA用作底物來如下形成長鏈co-6脂肪酸(1)通過A9延伸酶將LA轉化成EDA;(2)通過△8去飽和酶將EDA轉化成DGLA;和(3)通過△5去々包和酶將DGLA轉化成ARA;(4)通過C2o/22延伸酶將ARA轉化成DTA;以及(5)通過A4去飽和酶將DTA轉化成DPAn-6。作為另外一種選才奪，"A9延伸酶/A8去飽和酶途徑"可以將ALA用作底物來如下產生長鏈oo-3脂肪酸(1)通過A15去飽和酶將LA轉化成ALA(第一種co-3脂肪酸)；(2)通過A9延伸酶將ALA轉化成ETrA;(3)通過A8去飽和酶將ETrA轉化成ETA;(4)通過A5去飽和酶將ETA轉化成EPA;(5)通過C2G/22延伸酶將EPA轉化成DPA;和(6)通過A4去飽和酶將DPA轉化成DHA。任選地，w-6脂肪酸可轉化成Go-3脂肪酸；例如，ALA可通過A15去々包和酶活性由LA生成；ETA和EPA可通過A17去飽和酶活性分別由DGLA和ARA生成。用於o)-3/00-6脂肪酸生物合成的替代途徑利用A6去々包和酶和C^/2。延伸酶(即"A6去飽和酶/A6延伸酶途徑")。更具體地講，LA和ALA可通過A6去飽和酶分別轉化成GLA和STA;然後，C化/2。延伸酶將GLA轉化成DGLA和/或將STA轉化成ETA。隨後如上所述形成下遊PUFA。預期需要導入特定宿主生物中用以產生w-3/co-6脂肪酸的特定功能將取決於宿主細胞(及其天然的PFUA概況和/或去飽和酶/延伸酶概況)、底物的可利用性和所需終產物。例如，在一些實施方案中，優選的是A9延伸酶/A8去飽和酶途徑的表達，而不是A6去飽和酶/A6延伸酶途徑的表達，因為通過前面的途徑產生的PUFA無GLA和/或STA。本領域技術人員將能夠鑑定多種編碼oo-3/w-6脂肪酸生物合成所需的每種酶的候選基因。可用的去飽和酶和延伸酶序列可源自任何來源，例如，分離自天然來源(來自細菌、藻類、真菌、植物、動物等)、經由半合成途徑產生或從頭合成。儘管導入宿主的去飽和酶和延伸酶基因的具體來源不是關鍵的，但選擇具有去飽和酶或延伸酶活性的特定多肽的考慮事項包括(1)多肽的底物特異性；(2)多肽或其組分是否為限速酶；(3)去飽和酶或延伸酶是否是合成所需PUFA所必需的；(4)多肽所需的輔因子；和/或(5)多肽在其產生後是否被修飾(例如，通過激酶或異戊烯轉移酶^f奮飾)。表達的多肽優選具有與它在宿主細月包中的位置的生化環境相容的參數(參見美國專利7,238,482)。考慮每種特定的去飽和酶和/或延伸酶的轉化效率也將是有用的。由於每種酶才及少能以100%的效率將底物轉化成產物，宿主細力包所產生的未純化的油的最終脂質概況通常將是由期望的03-3/oo-6脂肪酸及多種上遊PUFA中間產物組成的多種PUFA的混合物。因此，當4吏所需脂肪酸的生物合成最優化時，必須考慮每種酶的轉換效率。考慮到上述各個考慮事項，具有合適去飽和酶和延伸酶活性(如A6去飽和酶、d8/2o延伸酶、A5去飽和酶、A17去飽和酶、A15去飽和酶、A9去々包和酶、A12去々包和酶、d4A6延伸酶、。16/18延伸酶、A9延伸酶、A8去飽和酶、A4去飽和酶和C2o/22延伸酶)的候選基因可根據可公開獲得的文獻(如GenBank)、專利文獻和對具有產生PUFA的能力的生物的實驗分析來鑑定。這些基因將適用於導入到特定的宿主生物中，以4吏該生物能合成PUFA或增強生物的PUFA合成。在本發明中，已經從Euglenaanabaena中分離出編碼△8去飽和酶的核苷酸序列，匯總於下面的表3中。41Euglenaanabaena△8去々包和酶的匯總縮寫核苷酸SEQIDNO胺基酸SEQIDNOEaD8Desl1721EaD8Des21822EaD8Des31923EaD8Des42024EaD8S3940*注意SEQIDNO:40與SEQIDNO:23的序列相同。因此，本發明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸包含(a)編碼具有A8去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於ClustalV比對方法在與SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24中示出的胺基酸序列進行比4交時，該多肽具有至少80%的胺基酸同一性；(b)編碼具有A8去飽和酶活性的多肽的核苦酸序列，其中基於BLASTN比對方法在與SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:39中示出的核苷酸序列進行比較時，該核苷酸序列具有至少80%的序列同一性；或者(c)(a)或(b)的核苷酸序列的互補序列，其中該互補序列和該核苷酸序列由相同數量的核苷酸組成並且100%互補，並且宿主細月包包含該互^卜，歹'J。在另一個方面，本發明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼具有△8去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於BLASTN比對方法在與SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:39中示出的核苦酸序列進行比較時，該核苦酸序列具有至少90%的序列同一性。具有至少約80%-90%同一性的更優選的胺基酸片段是特別合適的，並且具有至少約90%-95%同一性的那些序列是最優選的。類似地，對應本發明ORF的編碼A8去々包和酶的優選核酸序列是編碼活性蛋白的那些序列並且其具有至少約80%-90%的同一性；具有至少約90%-95%同一性的那些序列是最優選的。在備選的實施方案中，本發明的EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3和/或EaD8Des4去飽和酶序列可以經密碼子最優化以便在特定的宿主生物中表達。通常，宿主優選的密碼子可在所關注的具體宿主物種中通過檢查蛋白質(優選那些最大量表達的蛋白質)中的密碼子使用以及確定哪些密碼子的使用頻率最高來測定。然後，可利用宿主物種中優選的密碼子整個或部分地合成具有(例如)去飽和酶活性的所關注的多肽的編碼序列。也可以合成DNA的全部(或部分)以去除將存在於轉錄的mRNA中的二級結構的任何去穩定序列或區域。也可以合成DNA的全部(或部分)以將鹼基組成改變成期望宿主細胞中更優選的鹼基組成。在本發明的一個實施方案中，EaD8Des3(SEQIDNO:19)經密碼子最優化以便在解脂耶氏酵母屬中表達。基於先前對解脂耶氏酵母密碼子使用概況的確定、對那些優選的密碼子的鑑定以及對'ATG，起始密碼子周圍的共有序列的確定(參見美國專利7,238,482和美國專利7,125,672,將這兩篇專利以引用方式併入本文)，這是可能的。所得的合成基因稱為EaD8S(SEQIDNO:39)。由經密碼子最優化的A8去飽和酶基因編碼的蛋白質序列(即SEQIDNO:40)與野生型蛋白質序列(即SEQIDNO:23)相同。可以利用類似的技術來產生源自EaD8Desl、EaD8Des2和/或EaD8Des4的合成的A8去飽和酶，以用於在解脂耶氏酵母屬中表達。基於野生型EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3和/或EaD8Des4序列，本領域的技術人員應當能夠利用本文中的教導內容來產生多種適用於在候選宿主中最佳表達的其他經密碼子最優化的A8去飽和酶蛋白。因此，本發明涉及任何經密碼子最優化的A8去飽和酶蛋白，該去飽和酶蛋白源自野生型核苷酸序列EaD8Desl(SEQIDNO:17)、EaD8Des2(SEQIDNO:18)、EaD8Des3(SEQIDNO:19)或EaD8Des4(SEQIDNO:20)。這包括但不限於SEQIDNO:39中示出的核普酸序列，該核苷酸序列編碼經密碼子最優化以便在解脂耶氏酵母屬中表達的合成的A8去飽和酶蛋白(即EaD8S)。在備選的實施方案中，期望修飾編碼EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3和/或EaD8Des4的密碼子的部分，以增強基因在宿主生物包括但不限於植物或植物部分中的表達。同源物的鑑定和分離任何本發明的去飽和酶序列(即EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3、EaD8Des4、EaD8S)或其部分均可用於利用序列分析軟體來搜索相同或其他細菌、藻類、真菌、類眼蟲或植物物種中的A8去飽和酶同源物。通常，這種計算機軟體通過將同源程度賦予多種置換、缺失和其他修飾來匹配相似的序列。作為另一種選擇，也可將任何本發明的去飽和酶序列或其部分用作雜交試劑用以鑑定A8去飽和酶同源物。核酸雜交試驗的基本組成包括探針、懷疑含有所關注的基因或基因片段的樣品及特定的雜交方法。本發明的探針通常是與待檢測核酸序列互補的單鏈核酸序列。探針與待檢測的核酸序列是"可雜交的"。儘管探針的長度可在5個鹼基到數萬個鹼基之間變化，但通常約15個鹼基到約30個鹼基的探針長度是合適的。只需要探針分子的部分與待檢測的核酸序列互補。另外，探針和靶序列之間不需要完全互補。雜交確實可以在並不完全互補的分子之間發生，結果是雜交區內的一定比率的鹼基未與正確的互補鹼基配對。雜交方法是非常確實的。通常探針和樣品必須在允許核酸雜交的條件下混合。這涉及在正確濃度和溫度條件下在存在無機或有一幾鹽時4吏4果針和樣品接觸。探針和樣品核酸必須接觸足夠長的時間，使探針和樣品核酸之間的任何可能的雜交均可發生。混合物中的探針或標記的濃度將決定雜交發生所需的時間。探針或靶標的濃度越高，所需的雜交孵育時間就越短。任選地，可以加入離液劑(如氯4匕胍、石克氰酸胍、石克氰酸鈉、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀和三氟乙酸銫)。如果需要，可以將甲醯胺加入到雜交混合物中，通常為30-50%(v/v)。可以採用多種雜交溶液。通常，這些雜交溶液包含約20%至60%體積，優選30%體積的極性有機溶劑。普通的雜交溶液採用約30-50%v/v曱醯胺、約0.15至1M氯化鈉、約0.05至O.IM多爰衝液(如檸檬酸鈉、Tns-HCl、PIPES或HEPES(pH範圍約6-9))、約0.05至0.2%去汙劑(如十二烷基碌^酸鈉)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(PharmaciaInc.)(約300-500千道爾頓)、聚乙烯吡咯烷酮(約250-500千道爾頓)和血清白蛋白。一般的雜交溶液還將包含約0.1至5mg/mL未經標記的載體核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鮭精DNA或酵母RNA),以及任選約0.5%至2%重量/體積的甘氨酸。還可以包含其他添加劑，例如包括多種極性水溶性或可膨脹試劑(如聚乙二醇)、陰離子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚曱基丙烯酸酯)和陰離子糖類聚合物(如硫酸葡聚糖)在內的體積排阻劑。核酸雜交可適用於多種測定形式。最合適的形式之一是夾心測定形式。夾心測定尤其適用於在非變性條件下雜交。夾心型測定的主要成分是固體支持體。固體支持體具有吸附或共價連接至其上的固定核酸探針，該糹果針未經標記並且與序列的一部分互補。在另外的實施方案中，本文描述的任何A8去飽和酶核酸片段(或其經鑑定的任何同源物)均可用於從相同的或其他細菌、藻類、真菌、類眼蟲或植物物種中分離編碼同源蛋白質的基因。使用序列依賴性規程分離同源基因是本領域熟知的。序列依賴性規程的實例包括但不限於(l)核酸雜交方法；(2)DNA和RNA擴增方法，這可通過核酸擴增技術的多種用法來舉例說明[如聚合酶鏈反應(PCR),Mullis等人，美國專利4，683,202;連接酶鏈反應(LCR),Tabor,S.等人，Proc.Acad.Sci.U.S.A.,82:1074(1985);或鏈置換擴增(SDA),Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:392(1992)];和(3)文庫構建和互補篩選方法。例如，編碼與本文描述的A8去飽和酶相似的蛋白質或多肽的基因可以用本領域技術人員熟知的方法，通過將本發明的核酸片段的全部或部分用作DNA雜交探針來篩選來自例如任何期望的酵母或真菌(其中那些產生DGLA和/或ETA的生物將是優選的)的文庫而得以直接分離。基於本發明核酸序列的特異性，寡核苷酸探針可通過本領域已知的方法(Mamatis,同上)設計和合成。而且，整個序列可直接用於通過熟練技術人員已知的方法(如隨機引物DNA標記、切口平移或末端標記技術)合成DNA探針，或使用可獲得的體外轉錄體系合成RNA探針。另外，可設計特異性引物並將其用於擴增部分(或全長)的本發明序列。所得的擴增產物可在擴增反應過程中直接標記或在擴增反應後標記，並用作探針來在合適的嚴格條件下分離全長的DNA片段。通常，在PCR類型的擴增技術中，引物具有不同的序列而且彼此之間不互補。取決於所需的檢測條件，應該設計引物序列以提供既有效又可靠的把核酸的複製。PCR引物設計方法是本領域常見且熟知的(Thein禾口Wallace,"TheuseofoligonucleotideasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders"，HumanGeneticDiseases:APracticalApproach,K.E.Davis編輯，(1986)第33-50頁，IRL:Herndon,VA;以及Rychlik,W.,MethodsinMolecularBiology，White,B.A.編輯，(1993)Vol.15,笫31-39頁，PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications.Humania:Totowa,NJ)。或RNA擴增編碼同源基因的更長的核酸片段。PCR也可以用克隆的核酸片段的文庫進行，其中一個引物的序列源自本發明的核酸片段，而另一個引物的序列利用編碼真核基因的mRNA前體3'端的多腺苷酸尾的存在。備選地，第二個引物序列可以基於來源於克隆載體的序列。例如，技術人員可以按照RACE規程(Frohman等人，Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.,85:8998(1988)),通過用PCR擴增在轉錄物內單個位點與3'或5'端之間的區域的拷貝來產生cDNA。以3'和5'方向取向的引物可用本發明的序列設計。使用可商業獲得的3'RACE或5'RACE體系(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)可以分離特異性的3'或5'cDNA片段(Ohara等人，Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.,86:5673(1989);Loh等人，Science,243:217(1989))。在其他實施方案中，任何本文所述的A8去飽和酶核酸片段(或其經鑑定的任何同源物)均可用於產生新的和/或改良的脂肪酸去飽和酶。如本領域所熟知的，體外誘變和選擇、化學豫變、"基因改組(geneshuffling)"法或其他手段可用於獲得天然存在的去飽和酶基因的突變(其中這種突變可以包括缺失、插入和點突變或它們的組合)。這將使得能分別在體內產生具有去飽和酶活性的多肽，該多肽在宿主細胞內具有更佳的物理參數和動力參數，例如更長的半衰期或更高的所需PUFA的產生速率。如果需要，可以通過常規誘變、所得突變多肽的表達及其活性的測定來確定所關注的多肽(即A8去飽和酶)對酶活性重要的區域。這些技術的綜述在美國專利7,238,482中有描述。源自EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3、EaD8Des4和EaD8S的所有這類突變蛋白和編碼它們的核苷酸序列均在本發明的範圍內。備選地，改良的脂肪酸可以通過結構域交換合成，在該方法中將來自本文所述的任何△8去飽和酶核酸片段的功能結構域與備選的去飽和酶基因的功能結構域交換，從而產生新的蛋白質。如本文所用，"結構域"或"功能結構域"指能夠引起植物或酵母中的生物學應答的核酸序列。用於產生多種co-3和/或oo-6脂肪酸的方法預計引入編碼本文所述的A8去飽和酶(即EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3、EaD8Des4、EaD8S或其他突變酶、經密碼子最優化的酶或它們的同源物)，處於合適的啟動子控制下，將會導致DGLA和/或ETA在轉化的宿主生物中的產生增加。就這一點而論，本發明包含用於直接產生PUFA的方法，該方法包括將脂肪酸底物(即EDA和/或ETrA)暴露糹會本文所描述的去々包和酶(例如，EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3、EaD8Des4或EaD8S),^吏得該底物轉化成所需的脂肪酸產物(即分別為DGLA和/或ETA)。更具體地講，本發明的目的是提供用於在微生物宿主細胞(如酵母、藻類、細菌、類眼蟲、原生藻菌和真菌)中產生DGLA的方法，其中微生物宿主細力包包含a)編碼A8去々包和酶多肽的重組核苷酸分子，基於ClustalV比對方法在與具有選自下列的胺基酸序列的多肽進行比較時，該去飽和酶多肽具有至少80%的胺基酸同一性SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23和SEQIDNO:24;和b)EDA源；其中使微生物宿主細胞在使編碼△8去々包和酶的核酸片li表達並4吏EDA轉化成DGLA的條件下生長，而且其中可任選回收DGLA。在本發明的備選實施方案中，A8去飽和酶可用於將ETrA轉化成ETA。因此，本發明提供用於產生ETA的方法，其中微生物宿主細J包包含a)編碼A8去飽和酶多肽的重組核苷酸分子，其中基於ClustalV比對方法在與具有選自下列的胺基酸序列的多肽進行比較時，該去飽和酶多肽具有至少80%的胺基酸同一性SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23和SEQIDNO:24;和b)ETrA源；其中使微生物宿主細胞在使編碼A8去飽和酶的核酸片段表達並使ETrA轉化成ETA的條件下生長，而且其中可任選回收ETA。作為另一種選擇，本文描述的每種A8去飽和酶基因及其相應的酶產物可間接用於產生多種w-6和oo-3PUFA(參見圖1和美國專利7，238,482)。如果脂肪酸底物經由中間步驟或途徑中間產物間接轉化成所需的脂肪酸產物，則間接產生了w-3/co-6PUFA。因此，預期可將本文描述的△8去々包和酶(即EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3、EaD8Des4、EaD8S或其他突變酶、經密碼子最優化的酶或它們的同源物)與另外的編碼PUFA生物合成途徑的酶(如A6去々包和酶、(:18/20延伸酶、A17去々包和酶、A8去々包和酶、A15去々包和酶、A9去々包和酶、△12去々包和酶、(:14/16延伸酶、d6A8延伸酶、A9延伸酶、A5去飽和酶、A4去飽和酶、C20/22延伸酶)的基因結合表達以導致更高水平地產生長鏈co-3/co-6脂肪酸(如ARA、EPA、DTA、DPAn-6、DPA和/或DHA)。在優選的實施方案中，本發明的A8去飽和酶將與A9延伸酶(例如，來自綠光等鞭金藻(Isochrysisgalbana)的延伸酶[PCT公布WO2002/077213];來自小眼蟲的延伸酶[PCT公布WO2007/061845];以及來自Eutreptiellasp.CCMP389的延伸酶[PCT公布WO2007/061742])最低程度地一道表達。然而，包含於具體表達盒中的具體基因將取決於宿主細胞(及其PUFA概況和/或去飽和酶/延伸酶々既況)、底物的可利用性和所需的終產物。在一些實施方案中，表達不止一種A8去飽和酶(即相同或不同的△8去飽和酶)以使脂肪酸副產物最少是有用的。可以通過增加總的△8去飽和酶活性來減少脂肪酸副產物的相對豐度。使脂肪酸副產物最少的一個途徑是表達不止一種A8去飽和酶。例如，sciadomc酸(SCI)和/或jumperomc酸(JUP)[通常存在於棵子植物的種子脂質中(Wolff等人，Lipids,35(1):1-22(2000)),例如屬於松科(Pmaceae)(松)的那些]的存在可認為是A6去飽和酶/A6延伸酶途徑或A9延伸酶/A8去飽和酶途徑的脂肪酸副產物。儘管這些脂肪酸被認為本身具有多種增進健康的特性(Nakane等人，Biol.Pharm.Bull.,23:758-761(2000)),但肪酸。例如，A6延伸酶通常將GLA轉化成DGLA,但一些△6延伸酶還可以將諸如LA或ALA之類的非預期的底物分別轉化成EDA或ETrA。在A6去^:包和酶/A6延伸酶途徑中，EDA和ETrA被認為是"脂肪酸副產物"。將A8去飽和酶加入到△6去飽和酶/A6延伸酶途徑中將會提供將"脂肪酸副產物"EDA和ETrA分別轉化回"脂肪酸中間產物"DGLA和ETA的手段。微生物表達系統、表達盒和載體本文描述的A8去飽和酶基因和基因產物(即EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3、EaD8Des4、EaD8S或其他突變酶、經密碼子最優化的酶或其同源物)可以在異源微生物宿主細胞中表達，特別是在含油酵母(例如解脂耶氏酵母)的細胞中表達。含有引導外來蛋白質高水平表達的調控序列的微生物表達系統和表達載體是本領域技術人員熟知的。這些表達系統和表達載體的任一種均可用於構建用於產生本發明序列的任何基因產物的嵌合基因。然後可高水平表達。土、、'、，、'-、-.、用於轉化合適的微生物宿主細胞的載體(如構建體、質粒)和DNA表達盒是本領域熟知的。存在於構建體中的序列的具體選擇取決於所需的表達產物(同上)、宿主細胞的性質以及提出的相對於未轉化細胞分離轉化細胞的手段。然而，通常載體含有至少一個表達盒、選擇標記和允許自主複製或染色體整合的序列。合適的表達盒包含基因控制轉錄的5'區(如啟動子)、基因編碼序列和控制轉錄終止的DNA片段3'區(如終止子)。最優選的是，這兩個控制區均來源於來自轉化的微生物宿主細胞的基因，但應該了解這種控制區不必源自選作生產宿主的特定物種的天然基因。用於驅動本發明的A8去飽和酶ORF在期望的微生物宿主細胞中表達的轉錄控制區(也稱為起始控制區或啟動子)有許多並且是本領域技術人員所熟悉的。事實上，能夠引導這些基因在所選宿主細胞中表達的任何啟動子(即天然的、合成的或嵌合的啟動子)均適用於本發明，但來自宿主物種的轉錄和翻譯區是尤其有用的。在微生物宿主細胞中的表達可以誘導型或組成型的方式實現。誘導型表達可通過誘導可操作地連接至所關注的基因的可調節啟動子的活性來完成，而組成型表達可通過利用可操作地連接至所關注的基因的組成型啟動子來實現。舉例來講，當宿主細胞為酵母時，則提供在酵母細胞中起作用的轉錄和翻譯區，尤其是來自宿主物種的轉錄區和翻譯區(例如，對於在解脂耶氏酵母中使用的優選的轉錄起始調節區，參見專利公開US-2006-0115881-A1)。可以使用許多調控序列的任意一種，這取決於是期望組成型轉錄還是誘導型轉錄、啟動子在表達所關注的ORF中的效率、構建的容易性等。已經發現圍繞翻譯起始密碼子'ATG'的核苷酸序列影響酵母細胞的表達。如果所需多肽在酵母中表達差，則可以修飾外源基因的核苷酸序列以包括有效的酵母翻譯起始序列來獲得最佳的基因表達。對酵母中的表達而言，這可以通過使無效表達基因框內融合至內源酵母基因(優選高度表達的基因)而使其定點誘變來完成。作為另外一種選擇，可以測定宿主中的共有翻譯起始序列並將該序列引入異源基因中，以便它們在所關注宿主中最優化表達。終止區可源於起始區從其獲得的基因的3'區或源於不同的基因。大量的終止區是已知的並且(在用於與它們源自的屬和物種相同和不同的屬和物種兩者時)在多種宿主中發揮的功能令人滿意。終止區的選擇通常更多是為了方便而不是因為任何特殊的性質。終止控制區也可以源於優選宿主的天然的多種基因。在備選的實施方案中，3'-區也可以是合成的，因為本領域的技術人員可利用可用的信息來設計和合成用作轉錄終止子的3'-區序列。任選地，終止位點可以是非必需的；然而，如果包括則是最優選的。如本領域技術人員所意識到的，僅僅將基因插入到克隆載體中不能保證它將被成功地以所需要的水平表達。根據對高表達率的需要，通過操作許多控制轉錄、翻譯、蛋白質穩定性、氧限制和從微生物宿主細胞分泌方面的不同遺傳元件，已經建立了許多專用的表達載體。更具體地講，已經被操作以控制基因表達的一些分子特徵包括相關轉錄啟動子和終止子序列的性質；所克隆基因的拷貝數目(其中可以在單個表達構建體中克隆另外的拷貝和/或將另外的拷貝通過增加質粒拷貝數或通過將克隆基因多次整合進基因組中來引入宿主細胞中)；基因是質粒攜帶的還是整合進了宿主細胞的基因組中；所合成的外來蛋白質的最終細胞定位；蛋白質在宿主生物內的翻譯和正確摺疊的效率；所克隆基因的mRNA和蛋白質在宿主細胞內的固有穩定性；以及所克隆基因中的密碼子使用，使得其頻率與宿主細胞的優選密碼子使用頻率接近。這些類型的修飾的每一種均包含在本發明中，作為進一步最優化本文所述的△8去飽和酶的表達的手段。微生物宿主細胞的轉化獲得了適用於在合適的微生物宿主細胞中表達的DNA盒(例如包含啟動子、ORF和終止子的嵌合基因)之後，則將其置於能夠在宿主細胞中自主複製的質粒載體中，或將其直接整合進宿主細胞的基因組中。表達盒的整合可以在宿主基因組中隨機地發生或者可以通過使用這樣的構建體來靶向，即該構建體含有足以靶向宿主基因座中的重組的與宿主基因組同源的區。如果構建體靼向內源性基因座，則轉錄和翻譯調控區的全部或某些可以由內源性基因座提供。如果兩個或更多個基因從獨立的複製載體表達，則希望每個載體具有不同的選擇手段並且應該缺乏與其他構建體的同源性以便維持穩定表達和防止元件在構建體之間重酉己(reassortment)。可用實-驗方法確定對調控區、選擇手^:和所引入的構建體的增殖方法的正確選"^,以便所有導入的基因均以需要的水平表達從而提供所需產品的合成。包含所關注的基因的構建體可以通過任何標準技術導入微生物宿主細月包中。這些4支術包4舌轉化(如醋酸鋰專爭化[MethodsmEnzymology,194:186-187(1991)])、原生質體融合、基因槍轟擊(bolisticimpact)、電穿孔、顯微注射或將所關注的基因引入宿主細胞中的任何其他方法。為方便起見，已通過任何方法操縱來吸收DNA序列(如表達盒)的宿主細胞在本文中將稱為"轉化的"、"轉化體"或"重組體"。轉化的宿主將具有至少一個拷貝的表達構建體，而且可以具有兩個或更多個拷貝，這取決於該表達盒是整合進基因組內還是存在於具有多拷貝數的染色體外元件上。轉化的宿主細胞可以通過多種選擇技術來鑑定，如美國專利7,238,482和7,259,255以及PCT公布WO2006/052870中所述。轉化後，適用於本發明的A8去飽和酶(以及任選在宿主細胞中共表達的其他PUFA酶)的底物可以由宿主自然產生或通過轉基因產生，或者它們可以由外部來源提供。用於重組表達的優選的微生物宿主細月包用於表達本發明的基因和核酸片段的微生物宿主細胞可以包括在多種原料(包括簡單或複雜的碳水化合物、脂肪酸、有機酸、油和醇和/或碳氫化合物)上於寬的溫度和pH值範圍內生長的宿主。本發明描述的基因已經在含油酵母(含油解脂耶氏酵母菌抹)中表達；然而預期的是，由於轉錄、翻譯和蛋白質生物合成結構是高度保守的，因此任何細菌、酵母、藻類、類眼蟲、原生藻菌和/或真菌都將是用於表達本發明的核酸片段的合適微生物宿主。優選的微生物宿主是含油生物體，例如含油酵母。這些生物天然能夠合成並積聚油，其中油可構成超過約25%的細胞乾重，更優選超過約30%的細胞乾重，而最優選超過約40%的細胞乾重。通常鑑定為包括含油菌抹的屬包括但不限於耶氏酵母屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。更具體地講，示例性的油合成酵母包括圓紅冬孢酵母、斯達氏油脂酵母、產油油脂酵母、拉可夫氏假絲酵母、鐵紅假絲酵母、熱帶假絲酵母、產朊假絲酵母、茁芽絲孢酵母、皮狀絲孢酵母、膠粘紅酵母、牧草紅酵母和解脂耶氏酵母(以前歸類為解脂々￡絲酵母(Candidalipolytica))。在備選的實施方案中，可以通過基因工程進行油的生物合成，使得微生物宿主細胞(如酵母)產生多於25%細胞乾重的油，從而被認為是含油的。優選的含油酵母是含油解脂耶氏酵母菌株，其中特別優選的是稱為ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944、ATCC#76982和/或LGAMS(7)1的解脂耶氏酵母菌抹(PapamkolaouS.和AggelisG.,Bioresour.Technol.,82(1):43-9(2002))。適用於轉化含油酵母(即解脂耶氏酵母)的具體教導內容包括美國專利4,880,741、美國專利5,071,764,以及Chen,D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.,48(2):232-235(1997))。可用於在解脂耶氏酵母中工程化生產ARA、EPA和DHA的具體教導內容分別在美國專利申請11/264784、美國專利申請11/265761和美國專利申請11/26473738中提供。在這種酵母中表達基因的優選方法是將線性DNA整合到宿主的基因組中；而且，當期望基因高水平表達時，則整合到基因組中的多個位置是尤其有用的[如在Ura3基因座(基因庫編號(GenBankAccessionNo)AJ306421)、Leu2基因座(基因庫編號AF260230)、Lys5基因座(基因庫編號M34929)、Aco2基因座(基因庫編號AJ001300)、Pox3基因座(Pox3:基因庫編號XP—503244或Aco3:基因庫編號AJ001301)、△12去飽和酶基因座(美國專利7,214,491)、Lipl基因座(基因庫編號Z50020)、Lip2基因座(基因庫編號AJ012632)和/或PexlO基因座(基因庫編號CAG81606)]。用於解脂耶氏酵母的優選選擇方法是對卡那黴素、潮黴素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸或組氨酸的培養基上生長的能力。另外，5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；"5-FOA")可用於選擇酵母Ura-突變體。該化合物對具有編碼乳清酸苦5'-單磷酸脫羧酶(OMP脫羧酶)的功能性URA3基因的酵母細胞有毒性，並且由於這種毒性，5-FOA特別可用於選擇和鑑定Ura-突變型酵母菌才朱(Bartel,P丄.和Fields,S.,Yeast2-HybndSystem,OxfordUniversity:NewYork,v.7,第109-147頁，1997;對於5-FOA在耶氏酵母中的使用還可參見PCT公布WO2006/052870)。用於耶氏酵母的備選的優選選4奪方法依賴於用於解脂耶氏酵母的基於磺醯脲(氯嘧磺隆；E.I.duPontdeNemours&Co.，Inc.,Wilmington,DE)抗性的顯性非抗生素標記。更具體地講，該標記基因是具有單個胺基酸改變(W497L)的天然乙醯羥酸合酶(AHAS或乙醯乳酸合酶；E.C.4.1.3.18),從而賦予了磺醯脲除草劑抗性(PCT公布WO2006/052870)。AHAS是用於生物合成支鏈胺基酸(即纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)的途徑中的第一常用酶，並且它是石黃醯脲和咪唑啉酮除草劑的靶標。其他優選的微生物宿主包括含油的細菌、藻類、類眼蟲、原生藻菌和其他真菌，它們中的許多可以進行基因工程改造以用於產生w-3脂肪酸。因此，例如，用處於誘導型或調節型啟動子控制下的任何本發明的A8去飽和酶基因轉化高山被孢黴(其在商業上用於生產ARA)可以產生能夠合成增加量的DGLA的轉化體。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.,66:4655(2000))描述了轉化高山被孢黴的方法。39類似地，用於轉化破嚢壺菌目(Thmustochytriales)微生物(例如破嚢壺菌(Thraustochytrium)、裂殖壺菌(Schizochytrium))的方法在U.S.7,001,772中公開。不論選擇哪種宿主用於表達本文描述的A8去飽和酶，均需要篩選多個轉化體以獲得顯示期望表達水平和模式的菌抹。這種篩選可以通過DNA印跡的Southern分析(Southern,J.Mol.Biol.,98:503(1975))、mRNA表達的Northern分鬥斤(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.,618(1-2):133-145(1993))、蛋白質表達的Western和/或Elisa分析、PUFA產物的表型分析或GC分析來完成。因此，本發明的範圍包括分別產生DGLA或ETA的方法，該方法包括(a)提供含油酵母(例如解脂耶氏酵母)，其包含(i)編碼A8去飽和酶多肽的第一重組核普酸分子，該核苷酸分子可操作地連接至至少一個調控序列；和(ii)分別由EDA和/或ETrA組成的去々包和酶底物源；以及(b)在存在合適的可發酵碳源的情況下使步驟(a)的酵母生長，其中編碼A8去飽和酶多肽的基因得以表達而且分別將EDA轉化成DGLA和/或將ETrA轉化成ETA;以及(c)任選地分別回收步驟(b)中的DGLA和/或ETA。可能需要供給底物。編碼A8去飽和酶的基因的核苷酸序列可選自SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在備選的實施方案中，編碼A8去飽和酶多肽的基因的核苷酸序列在SEQIDNO:39中示出(其中相對於SEQIDNO:19,至少208個密碼子已經;波最伏z化以^更在耶氏酵母屬中表達)。由於含油酵母中天然產生的PUFA^f又限於18:2脂肪酸(即LA)和通常較少的18:3脂肪酸(即ALA),因此除了本文所述的A8去飽和酶之外，還將對含油酵母進行基因工程改造以表達多種對長鏈PUFA生物合成所必需的酶(由此^f吏得能產生(例如)ARA、EPA、DPA和DHA)。具體地講，在本發明的一個實施方案中涉及的含油酵母包含(a)包含分離的多核苷酸的第一重組DNA構建體，該多核苷酸編碼A8去飽和酶多肽，並被可操作地連接至至少一個調控序列；和(b)至少一個另外的重組DNA構建體，該構建體包含可操作地連接至至少一個調控序列的分離的多核苷酸，其編碼的多肽選自如下酶△4去飽和酶、A5去々包和酶、A6去々包和酶、A9去々包和酶、△12去々包和酶、A15去飽和酶、A17去々包和酶、A9延伸酶、d4A6延伸酶、C16/18延伸酶、ds/2。延伸酶和C2/22延伸酶。在特別優選的實施方案中，至少一個另外的重組DNA構建體編碼具有△9延伸酶活性的多肽。微生物中的w-3和/或co-6脂肪酸生物合成的代謝工程有關本發明的△8去飽和酶序列的知識將可用於操縱多種宿主細胞中的oo-3和/或w-6脂肪酸的生物合成。才喿縱生化途徑的方法是本領域的技術人員所熟知的；而且，預計很多操縱方法將可能使含油酵母並且尤其是解脂耶氏酵母中的w-3和/或co-6脂肪酸的生物合成達到最大程度。這種操縱可能需要直接在PUFA生物合成途徑中進行代謝工程改造，上調期望的生化途徑和下調不期望的生化途徑的方法是本領域技術人員熟知的。例如，與w-3和/或oo-6脂肪酸生物合成途徑竟爭能量或碳的酶可以通過基因破壞來去除或通過其他手段(如反義mRNA)來下調。在PUFA生物合成途徑中作為增加ARA、EPA或DHA的手l殳的才喿縱(及其相關技術)的詳細討論分別在美國專利公開2006-0094092-A1、美國專利公開2006-0115881-A1和美國專利公開2006-0110806-A1中給出，在TAG生物合成途徑和TAG降解途徑中的理想的操縱(及其相關技術)也在其中給出。在本發明的上下文中，通過上述策略中的任意一種來調節脂肪酸生物合成途徑的表達都可能是有用的。例如，本發明提供了方法，通過該方法，將編碼A9延伸酶/A8去飽和酶生物合成途徑中的關鍵酶的基因引入含油酵母中用以產生w-3和/或w-6脂肪酸。利用對宿主生物進行代謝工程改造的多種手段，使本發明的A8去飽和酶基因在天然條件下不具有w-3和/或oo-6脂肪酸生物合成途徑的含油酵母中表達並協調這些基因的表達，以最大程度地產生優選的PUFA產物將是特別有用的。用於PUFA生產的微生物發酵過程使轉化的微生物宿主細胞在使嵌合的去飽和酶和延伸酶基因的表達最優化而且產生的所需PUFA的產率最大且最經濟的條件下生長。通常，可以被優化的培養基條件包括碳源的類型和量、氮源的類型和量、碳氮比、不同礦物離子的量、氧水平、生長溫度、pH、生物量生產期的時長、油積聚期的時長以及細胞收穫的時間和方法。使所關注的微生物(例如含油酵母，如解脂耶氏酵母)通常在複合培養基(例如酵母提取物-蛋白腖-葡萄糖肉湯培養基(YPD))或缺乏生長所必需的成分並由此強迫選擇所需表達盒的確定成分的基本培養基(如YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,MI))中生長。本發明的發酵培養基必須含有合適的碳源。美國專利7,238,482中教導了合適的碳源。儘管預期本發明中利用的碳源可以涵蓋許多種含碳源，但優選的碳源是糖類、甘油和/或脂肪酸。最優選的碳源是葡萄糖和/或包含介於10-22個石友之間的脂肪酸。氮可以由無機源(如(NH4)2S04)或有機源(如尿素或穀氨酸)提供。除了合適的碳源和氮源，發酵培養基還必須含有合適的礦物質、鹽、輔因子、緩衝液、維生素和本領域技術人員已知的適合含油宿主生長並促進PUFA產生所必需的酶促途徑的其他組分。要特別注意促進脂質和PUFA合成的幾種金屬離子(如Fe"、Cu+2、Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)(Nakahara,T.等人，Ind.Appl.SingleCellOils,D.J.Kyle和R.Colin(編輯)，第61-97頁(1992))。本發明中優選的生長培養基是普通的商業製備的培養基，例如YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,MI)。也可以4吏用其他確定成分的生長培養基或合成的生長培養基，適於轉化宿主細胞生長的培養基對微生物學或發酵科學領域的技術人員來說將是已知的。適於發酵的pH範圍通常介於約pH4.0至pH8.0之間，其中優選將pH5.5至pH7.5作為初始生長條件的範圍。發酵可以在有氧或厭氧條件下進行，其中優選為微氧條件。通常，在含油酵母細胞中積聚高水平的PUFA需要一個包括兩個階段的過程，因為代謝狀態必須在生長和脂肪的合成/貯存之間達到"平衡，，。因此，最優選的是，包括兩個階段的發酵過程是在含油酵母(如解脂耶氏酵母)中產生PUFA所必需的。這種方法在美國專利7,238,482中有所描述，其也描述了多種合適的發酵工藝設計(即分批式、補料分批式和連續式)和生長過程中的注意事項。PUFA油的純4t和處理PUFA可能以游離脂肪酸或以酯化的形式(例如醯基甘油、磷脂、硫脂或糖脂)存在於宿主微生物中，並且可以通過本領域熟知的多種手段從宿主細胞中提取。關於酵母脂質的提取技術、質量分析和可接受標〉焦d々一篇糹宗述是Z.Jacobs(CriticalReviewsinBiotechnology,12(5/6):463-491(1992))的綜述。有關下遊加工的簡述也可由A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.,45:271-312(1997))提供。通常，用於純化PUFA的手段可包括用有機溶劑萃取(例如，美國專利6,797,303和美國專利5,648,564)、超聲處理、超臨界流體萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段(例如擠壓)，或它們的組合。另外的詳細信息可參考美國專利7，238，482的教導內容。含PUFA的油在食品、保健食品、藥物和動物祠料中的用途市場目前支持各種摻入了w-3和/或w-6脂肪酸(尤其是例如ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA)的食物和飼4牛產品。預期包含長《連PUFA的孩i生物量、部分純化的包含PUFA的微生物量、純化的包含PUFA的微生物油和/或純化的PUFA將在食物和飼料產品中起作用以賦予該製劑健康益處。更具體地講，本發明的含有w-3和/或w-6脂肪酸的油將適用於多種食物和伺料產品，包括但不限於食物模擬物、肉產品、穀類產品、烘焙食物、小吃和乳製品(關於詳細內容參見專利公開US-2006-0094092)。此外，本發明的組合物可用於製劑中以在醫療食物(包括醫療營養品、膳食補充劑、嬰兒代乳品以及藥物產品)中賦予健康益處。食物加工和食物配製領域的技術人員將了解所述各種油的量和組成如何加入食物或飼料產品中。該量在本文中將稱為"有效"量並將取決於食物或飼料產品、期望補充該產品的膳食或醫療食物或醫療營養品旨在糾正或治療的醫學狀況。實施例43本發明將在下面的實施例中得以進一步說明，其中份數和百分比是以重量計並且度數是攝氏度，除非另外說明。應當理解，儘管這些實施例說明了本發明的優選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據上面的論述和這些實施例，本領域的技術人員可確定本發明的基本特徵，並在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可對本發明做出多種改變和修飾，以使其適用於多種用途和條件。因此，除了本文所示和描述的那些之外，根據前文所述，本發明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。這些修改形式也旨在涵蓋於所附權利要求書的範圍內。一般方法實施例中使用的標準重組DNA技術和分子克隆技術是本領域所熟知的並且在如下文獻中有所描述1.)Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis，T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989)(Maniatis);2.)T.J.Silhavy,M丄.Bennan和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1984);和3.)Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,由GreenePublishingAssoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken,NJ(1987)。適用於微生物培養物的維持和生長的材料和方法是本領域熟知的。適用於下面實施例的4支術可在ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips編輯),AmericanSocietyforMicrobiology:Washington,D.C.(1994));或ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第2版，SinauerAssociates:Sunderland,MA(1989)的描述中找到。用於微生物細胞的生長和維持的所有試劑、限制性內切酶和材4牛均獲自AldnchChemicals(Milwaukee,WI)、DIFCOLaboratories(Detroit,MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD)或SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO),除非另外說明。通常於37。C下在LunaBertam(LB)平板上培養大腸桿菌菌抹。一般的分子克隆根據標準方法(Sambrook等人，同上)來完成。44DNA序列是在ABI自動測序儀上採用染料終止劑技術(美國專利5，366,860;EP272,007)-使用載體和插入片段特異性引物的組合來產生的。序歹寸編4辱是在Sequencher(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)中進行。所有序列在兩個方向上覆蓋至少兩次。基因序列的比較是使用DNASTAR軟體(DNAStarInc.,Madison,WI)來完成的。縮寫的含義如下"sec"表示秒，"mm"表示分鐘，"h"或"hr"表示小時，"d"表示天，"mL"表示微升，"mL"表示毫升，"L"表示升，'VM，，表示微摩爾，"mM"表示毫摩爾，"M"表示摩爾，"mmol"表示毫摩爾，>mole"表示微摩爾，"g"表示克，"fig"表示微克，"ng"表示納克，"U"表示單位，"bp"表示鹼基對並且"kB"表示千鹼基。表達盒的命名表達盒的結構將通過簡單的記號系統"X::Y::Z"表示，其中X描述啟動子片段，Y描述基因片段而Z描述終止子片段，它們均彼此可操作地連接。解脂耶氏酵母的轉化和培養ATCC登錄號為#20362、#76982和#90812的解脂耶氏酵母菌4朱可購自美國典型培養物保藏中心(Rockville,MD)。解脂耶氏酵母菌抹通常是在根據下面所示的配方的數種培養基中於28-3(TC下培育。根據標準方法，按需要通過將20g/L瓊脂添加到每種液體培養基中來製備瓊脂平板。YPD瓊脂培養基(每升)10g酵母提取物[Difco],20g細菌用蛋白腖[Difco];以及20g葡萄糖。基本培養基(MM)(每升)20g葡萄糖；1.7g無胺基酸的酵母氮源基礎；1.0g脯氨酸；並且pH為6.1(未調節)。基本培養基+亮氨酸(MM+亮氨酸或MMLeu)(每升)如上製備MM培養基並添加O.lg亮氨酸。基本培養基+亮氨酸+尿嘧啶(MMLeuUra)(每升)如上製備MM培養基並添加O.lg亮氨酸、O.lg尿嘧啶和O.lg尿苷。基本培養基+5-氟乳清酸(MM+5-FOA)(每升)20g葡萄糖、6.7g酵母氮源基礎、75mg尿嘧啶、75mg尿苷，並且基於對一系列100mg/L至1000mg/L的濃度的FOA活性試驗(因為供應商提供的每批料中會發生改變)來選用適量的FOA(ZymoResearchCorp.,Orange,CA)。高糖培養基(HGM)(每升)80葡萄糖、2.58gKH2P04和5.36gK2HP04,pH7.5(不需要調節)。解脂耶氏酵母的轉化是根據Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，48(2):232-235(1997))的方法來實施,除非另外指明。簡而言之，將耶氏酵母劃線接種到YPD平板上，並在30。C下培育大約18小時。從平板上刮掉數個大環量的細胞並將其重懸浮於lmL含有如下成分的轉化緩沖液中2.25mL50%的PEG,平均分子量為3350;0.125mL2M的醋酸鋰，pH6.0;0.125mL2M的DTT;以及(可任選)50pg已剪切的鮭精DNA。然後，將大約500ng線性化的質粒DNA(或100ng環狀質粒)在100pL重懸浮的細胞中孵育，並將其在39。C下保持1小時，每間隔15分鐘進行渦旋混合。將細胞鋪在選擇培養基平板上並在30。C下保持2至3天。解脂耶氏酵母的脂肪酸分析除非另外指明，為了進行脂肪酸分析，將細胞通過離心收集並如Bligh,E.G.&Dyer,W.丄(Can.J.Biochem.Physiol.,37:911-917(1959))中所述提取脂質。通過將脂質提取物與曱醇鈉進行酯交換反應而製備脂肪酸甲酯(Roughan,G.和NishidaI.,ArchBiochemBiophys.,276(l):38-46(19卯))並隨後將其用配有30mx0.25mm(內徑)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890氣相色譜儀(GC)進行分析。烘箱溫度以3.5。C/分鐘從170°C(保持25分鐘)升到185°C。為了進行直接的鹼催化酯交換反應，收穫耶氏酵母培養物(3mL),在蒸鎦水中洗滌一次，並在Speed-Vac中在真空下乾燥5-10分鐘。將甲醇鈉(lOOpL,1%)加入樣品中，然後將樣品渦旋振蕩20分鐘。在加入3滴1M氯化鈉和400^L己烷後，渦旋樣品並離心。移出上層並如上所述用GC進行分析。解脂耶氏酵母菌抹Y4001U的構建將解脂耶氏酵母菌枒、Y4001U在下文的實施例7中用作宿主。下面描述的是對構建菌抹Y4001U的概述，該菌抹源自解脂耶氏酵母ATCC#20362,能夠通過A9延伸酶/A8去飽和酶途徑的表達產生相對於總脂質為約17%的EDA並且具有Leu-和Ura-表型(圖2A)。開發Y4001U菌株需要構建Y2224菌抹(野生型耶氏酵母菌才朱ATCC#20362的Ura3基因自發突變而產生的FOA抗性突變體)和Y4001菌株(產生17%的EDA,具有Leu-表型)。菌抹Y2224的產生菌抹Y2224以如下方式分離將來自YPD瓊脂平板的解脂耶氏酵母ATCC#20362細胞劃線接種至含有250mg/L5-F0A(ZymoResearch)的MM平板(尿嘧啶和尿苷各75mg/L、6.7g/L具有闢u酸4妄且無胺基酸的YNB,以及20g/L葡萄糖)上。將平板在28°C下孵育並將四個得到的菌落分別貼在含有200mg/mL5-FOA的MM平板上和無尿嘧啶和尿苷的MM平板上以確定尿嘧咬Ura3營養缺陷型。產生菌抹Y4001以生產佔總脂質約17%的EDA:菌抹Y4001通過整合構建體pZKLeuN-29E3(圖2B)產生。將含有四種嵌合基因(即A12去飽和酶、d6m延伸酶和兩種A9延伸酶)的該構建體整合進菌才朱Y2224的Leu2基因座中，由此使得能夠產生EDA。構建體pZKLeuN-29E3含有下表4所示的組分。表4質粒pZKLeuN-29E3(SEOIDNO:42)的描述SEQIDNO:42片段和嵌合基因組分的描述內的RE位點和核苷酸BsiWI/AscI耶氏酵母Leu2基因(基因庫編號AF260230)的788(7797-7002)bp的3'部分SphI/PacI耶氏酵母Leu2基因(基因庫編號AF260230)的(4302-3591)703bp的5'部分SwaI/BsiWIGPD::FmD12::Pex20,包含(10533-7797)GPD:解脂耶氏酵母GPD啟動子(美國專利7,259,255);FmD12:串珠鐮孢A12去々包和酶基因(SEQIDNO:43)(在圖中標記為"F.D12";PCT公布WO2005/047485);Pex20:來自耶氏酵母Pex20基因(基因庫編號AF054613)的Pex20終止子序列47BglII/SwaI(12559-10533)EXPl::EgD9eS:丄ipl，包含EXP1:解脂耶氏酵母輸出蛋白(EXP1)啟動子(在圖中標記為"Exppro";PCT公布WO2006/052870和美國專利申請11/265761);EgD9eS:源於小眼蟲的經密碼子最優化的A9延伸酶(SEQIDNO:45)(在圖中標記為"EgD9E";PCT公布WO2007/061742);Upl:來自耶氏酵母Lipl基因(基因庫編號Z50020)的Lipl終止子序列PmeI/ClaI(12577-1)FBAINm::EgD9eS::Lip2,包含FBAINm:解脂耶氏酵母FBAINm啟動子(美國專利7，202,356);EgD9eS:源於小眼蟲的經密碼子最優化的△9延伸酶(SEQIDNO:45)(在圖中標記為"EgD9ES";PCT公布WO2007/061742);Lip2:來自耶氏酵母Lip2基因(基因庫編號AJ012632)的Lip2終止子序列ClaI/EcoRI(1-1736)LoxP::Ura3:丄oxP,包含LoxP序列(SEQIDNO:47);耶氏酵母Ura3基因(基因庫編號AJ306421);LoxP序列(SEQIDNO:47)EcoRI/PacI(1736-3591)YATl::ME3S::Pex16,包含YAT1:解脂耶氏酵母YAT1啟動子(在圖中標記為"YAT";專利/>開U.S.2006/0094102-A1);ME3S:源於高山被孢黴的經密碼子最優化的Cwm延伸酶基因(SEQIDNO.-48)(PCT公布WO2007/046817)jPexl6:耶氏酵母Pex16基因(基因庫編號U75433)的Pexl6終止子序列將質粒pZKLeuN-29E3用AscI/SphI消化，然後根據"一般方法"將其用於轉化解脂耶氏酵母菌抹Y2224(即ATCC#20362Ura3-)。將轉化細胞鋪在MMLeu培養基平板上並在30°C下保持2至3天。挑取菌落並劃線到MM和MMLeu選擇平一反上。將在MMLeu平糹反上生長〗旦不在MM平板上生長的菌落選作Leu-菌抹。然後將Leu-菌林的單菌落在30°C下接種到液體MMLeu中並以250rpm/mm搖動2天。離心收集細胞，提取脂質，通過酯交換反應製備脂肪酸甲酯，並隨後用Hewlett-Packard6890GC進4亍分衝斤。GC分析顯示，EDA存在於含有pZKLeuN-29E3的4種嵌合基因的轉化體中，但不存在於耶氏酵母Y2224對照株中。所選的36個Leu-菌抹中大部分產生佔總脂質約12%至16.9%的EDA。有3個菌抹(即菌才朱#11、#30和#34)產生佔總脂質約17.4%、17%和17.5%的EDA;這三個菌抹分別稱為菌抹Y4001、Y4002和Y4003。然後將Y4001、Y4002和Y4003菌抹的單菌落在30。C下接種到液體MMLeu中並以250rpm/min搖動2天。通過離心收集細胞，將其重懸浮於高糖培養基中，然後以250rpm/min搖動5天。離心收集細胞，提取脂質，通過酯交換反應製備脂肪酸曱酯，並隨後用Hewlett-Packard6890GC進行分析。GC分析顯示，Y4001、Y4002和Y4003菌株產生了佔總脂質約24%的EDA。菌株Y4001U(Leu-、Ura-)的產生通過在菌抹Y4001中暫時表達質粒pY116(圖2C)中的Cre重組酶以產生Leu-和Ura-表型來產生菌抹Y4001U。構建體pY116含有如下組分表5tableseeoriginaldocumentpage49tableseeoriginaldocumentpage50根據"一般方法"將質粒pY116用於轉化新鮮培育的Y4001細胞。將轉化細胞鋪至含有280pg/mL磺醯脲(氯嘧磺隆，E.I.duPontdeNemours&Co.,Inc.,Wilmington,DE)的MMLeuUra平一反上並在30°C下保持3至4天。挑取四個菌落，將其在30。C下接種至3mL液體YPD培養基中並以250rpm/min搖動1天。將培養物用液體MMLeuUra培養基稀釋至1:50,000,將lOO^L鋪至新的YPD平板上並在3(TC下保持2天。挑取菌落並劃線至MMLeu和MMLeuUra選擇平板上。選擇在MMLeuUra平板上生長但不在MMLeu平板上生長的菌落並通過GC分析來確定C20:2(EDA)的存在。具有Leu-和Ura-表型的數個菌才朱產生了佔總脂質約17%的EDA，將它們統稱為Y4001U;將這些菌抹中的其中之一稱為Y4001U1。實施例1-來自EudenaanabaenaUTEX373的cDNA文庫的合成本實施例描述了來自EuglenaanabaenaUTEX373的cDNA文庫的合成。該工作包括製備RNA、合成cDNA和產生cDNA文庫。EuglenaanabaenaUTEX373的培育和RNA製備EuglenaanabaenaUTEX373可從密西根州立大學RichardTriemer博士的實-瞼室(EastLansing,MI)來獲得。移出約2mL培養物用於液體分析，將其以l,800xg離心5分鐘。用水洗滌沉澱一次並再次離心。將所得沉澱真空乾燥5分鐘，重懸浮於100(iL三曱基氫氧化硫(TMSH)中，在室溫下搖動孵育15分鐘。該步驟後，加入0.5mL己烷並將該小弁瓦在室溫下搖動孵育15分鐘。4吏用配有Omegawax320熔融石英毛細柱的Hewlett-Packard6890氣相色鐠(SupelcoInc.,CatalogNo.24152)對脂肪酸曱酯(從己烷層取5^lL注射進樣)進行分離和定量。用程序控制烘箱溫度在17(TC保持1.0分鐘，以5。C/分鐘上升到240°C,然後另外保持1.0分鐘。載氣通過Whatman氫發生器供應。將保留時間與那些市售的曱酯標準樣品(Nu-ChekPrep,Inc.，CatalogNo.U-99-A)的保留時間進行比較，所得色譜圖在圖3中示出。脂肪酸概況中存在EDA、ERA、EPA和DHA且不存在GLA和STA表明，Euglenaanabaena採用△9延伸酶/A8去飽和酶途徑來用於長鏈(LC)PUFA的生物合成，並且將會是LC-PUFA生物合成基因(例如但不限於A8去飽和酶)的良好來源。將剩餘的5mL活3夭生長的培養物轉移至125mL玻璃燒瓶中的25mLAF-6培養基(Watanabe&Hiroki，NIES畫CollectionListofStrains,第5版，NationalInstituteforEnvironmentalStudies,Tsukuba,第127頁(2004))中。採用16小時光照8小時黑暗周期並進行非常輕微的攪動，使小眼蟲培養物在22°C下生長2周。2周後，將培養物(25mL)轉移至500mL玻璃瓶中的lOOmLAF-6培養基中，如上所述使培養物生長1個月。在這之後，將兩份50mL的等份試樣轉移進兩個分開的裝有250mLAF-6培養基的500mL玻璃瓶中，如上所述使培養物生長2個月(得到總共約600mL的培養物)。接下來，以1,800xg離心10分鐘獲得培養物的沉澱顆粒，將其用水洗滌一次並再次離心。使用RNASTAT-6(T試劑(TEL-TEST,Inc.,Friendswood,TX),按照製造商規程(使用5mL試劑，將RNA溶解於0.5mL水中)從一份所得沉澱中提取總RNA。這樣，從沉澱中獲得340|ig的總RNA(680ug/mL)。將剩餘的沉澱在液氮中冷凍並在-8(TC下保存。使用mRNA純化試劑盒(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ),按照製造商規程從340pg總RNA中分離mRNA。這樣，獲得9.0figmRNA。EuglenaanabaenacDNA的製備和cDNA文庫euglc的產生使用CloneminerTMcDNA文庫構建試劑盒(CatalogNo.18249-029,InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA),按照製造商規程(VersionB,25-0608)產生cDNA文庫。使用非放射標記方法，從5.12figmRNA(上文所述的mRNA)中用生物素-attB2-01igo(dT)引物合成cDNA。在合成第一鏈和第二鏈後，加入attBl銜接子進行連接，並用柱色語對cDNA按照大小進行分級。將來自級分的DNA濃縮，重組進pDONR222中，並轉化進大腸桿菌ElectroMAXDH10BTl噬菌體抗性細J包(InvitrogenCorporation)中。將該Euglenaanabaena文庫命名為euglc。將cDNA文庫euglc鋪在LB+卡那黴素平板(約100,000個菌落)上，刮下菌落，<吏用QIAprepSpinMimprepKit(QiagenInc.,Valencia,CA)按照製造商規程分離DNA。這樣，獲得來自euglc的質粒DNA子文庫。實施例2從EuglenaanabaenaUTEX373中分離編碼A8去飽和酶的部分的cDNA片段本實施例描述了基於cDNA文庫的PCR擴增，對編碼來自EuglenaanabaenaUTEX373的△8去飽和酶的部分的cDNA片段(SEQIDNO:1)進行的鑑定，所述的PCR擴增是使用基於小眼蟲A8去飽和酶序列(SEQIDNO:2)的簡併寡核普酸進4亍的。編碼部分推定的△8去飽和酶的cDNA片段的鑑定使用基於小眼蟲A8脂肪酸去飽和酶(SEQIDNO:2;在PCT公布WO2006/012325中稱為Eg5)的核苷酸序列的簡併引物和載體特異性引物pDonor222Eg5-l(SEQIDNO:3),將實施例1中描述的質粒DNA子文庫用作模板用於筒並PCR。使用的4種筒並引物在表6中示出。表6用於擴增來自EuglenaanabaenaUTEX373的△8去飽和酶基因的部分的簡併寡核苷酸引物核苷酸序列SEQIDNOD8DEG3-1RTTRTGNCKATCTTTCCACCASEQIDNO4D8DEG3-2RTTRTGNCKGTCTTTCCACCASEQIDNOD8DEG3-3RTTRTGNCKATCCTTCCACCASEQIDNO6D8DEG3國4RTTRTGNCKGTCCTTCCACCASEQIDNO7對於cDNA樣品而言，總共設置5份反應物。反應混合物含有1cDNA、lpL每種載體特異性引物和簡併引物(20pM)以及PhusioiT高52保真性DNA聚合酶(CatalogNo.F553S,FinnzymesOy，Finland)。PCR按照製造商規程進行。用ZeroBluntPCR克隆試劑盒(InvitrogenCorporation),按照製造商規程將得到的DNA片段克隆進pCR-Blunt克隆載體中。使用QIAprepSpinMmiprep試劑盒(QmgenInc.),按照製造商規程將來自所得的克隆的質粒DNA進行純化，使用載體引發的T7引物(SEQIDNO:8)和M13rev-28引物(SEQIDNO:9)以及ABIBigDyeversion3Prism測序試劑盒，在384孔平板中對DNA插入物進行末端測序。對於測序反應，使用100-200ng才莫板和6.4pmol引物，重複以下反應條件25次96°C10秒，50°C5秒，60°C4分鐘。在基於乙醇的純化後，將循環測序反應的產物在Perkm-ElmerABI3700自動測序4義上分離並衝企測。從獲得的各序列來裝配共有序列，並選擇一個具有與共有序列相同的序列的代表性克隆(稱為pHD23-l(SEQIDNO:10))用於進一步的研究。pHD23-l中的部分cDNA插入物(SEQIDNO:1)筌定為部分A8去飽和酶是用BLAST(基本的局部比對搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool);Altschul等人，J.Mol.Biol.,215:403-410(1993)),搜索與BLAST"nr"資料庫(包括所有非冗餘GenBankCDS翻譯物、來源於3-維結構BrookhavenProteinDataBank的序列、SWISS-PROT蛋白質序列資料庫的最新的主要公開版本、EMBL和DDBJ資料庫)中所包含的序列的相似性來證實。將獲得的部分cDNA序列(SEQIDNO:1)在所有的可讀框內翻譯，並用由NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States,Nat.Genet,3:266-272(1993)),採用默認參數且關閉過濾器，來比較與包含在"nr"資料庫中的所有可公開獲得的蛋白質序列的相似性。為方便起見，由BLAST計算所得的、觀察到cDNA序列與所搜索資料庫中包含的序列僅偶然匹配的P值(概率)在本文中報導為"pLog"值，該值代表了所報導的P值的負對數。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST的"命中序列"代表同源蛋白的可能性就越大。使用來自pHD23-l的核苷酸序列插入物進行的BLASTX搜索揭示了由部分cDNA(SEQIDNO:1)編碼的蛋白質與小眼蟲△8去飽和酶胺基酸序列(SEQIDNO:11)(NCBI登錄號AAD45877(GI5639724)、基53因座AAD45877、CDSAF139720;Wallis和Browse,Arch.Biochem.Biophys.365:307-316(1999))的相似性，得到pLog值為63.4(E值為4e-63)。實施例3從EuglenaanabaenaUTEX373中分離全長A8去飽和酶將cDNA文庫euglc的大約17,000個克隆鋪在三個大的正方形(24cmx24cm)Petri平板(Coming,Coming,NY)上，每個平板裝有LB+50pg/mL卡那黴素瓊脂培養基。使細胞在37。C下生長過^^,然後使平板冷卻至室溫。菌落轉移將BiodyneB0.45(im月莫(CatalogNo.60207,PallCorporation,Pensacola,FL)修剪成大約22cmx22cm,並將該膜小心地鋪放在瓊脂上面以避免氣泡。在室溫下孵育2分鐘後，將膜標記取向，用鑷子將膜提起並將菌落面朝上放在用0.5M氪氧化鈉和1.5M氯化鈉浸溼的濾紙上。變性4分鐘後，通過將膜置於用0.5MTns-HCL(pH7.5)和1.5M氯化鈉浸溼的濾紙上4分鐘來中和氬氧化鈉。重複該步驟，將膜在2XSSC緩衝液(20XSSC是3M的氯化鈉、0.3M的檸檬酸鈉；pH7.0)中簡單衝洗並在濾紙上風乾。雜交將膜在200mL雜交溶液中於65。C下預雜交2小時。雜交溶液含有6XSSPE(20XSSPE是3M的氯化鈉、0.2M的石壽酸鈉、20mM的EDTA;pH7.4)、5XDenhardt試劑(100XDenhardt試劑是2%(w/v)Ficoll、2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、2%(w/v)乙醯化的牛血清白蛋白)、0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)、100pg/mL已剪切的鮭精DNA和5%硫酸葡聚糖。用來自pHD23-l(實施例2)的經瓊脂糖凝膠純化的EcoRIDNA片段(其含有EuglenaanabaenaA8去飽和酶的部分DNA片段)來製備DNA探針，使用RadPrimeDNA標記系統(CatalogNo.18428-011,Invitrogen,Carlsbad,CA)按照製造商的說明書用P32dCTP標記該DNA片段。使用NICK柱(CatalogNo.17-0855-02,AmershamBiosciences,Piscataway,NJ),按照製造商的說明書分離未整合的P32dCTP。將探針在IO(TC下變性5分鐘，置於冰上3分鐘，並將其一半加入到雜交溶液中。將膜在65。C下與探針輕微搖動地雜交過夜，然後在次日用含0.5%SDS的2XSSC洗滌兩次(每次5分鐘)，並用含0.1%SDS的0.2XSSC洗滌兩次(每次15分鐘)。洗滌後，將hyperfilm(CatalogNo.RPN30K，AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)在-80。C下暴露於該膜過夜。根據將平板與暴露的hyperfilm對齊，用巴斯德吸管的鈍頭將陽性菌落挑起放入lmL水中並進行渦旋。製備數份稀釋液，並將其鋪在裝有LB培養基和50fig/mL卡那黴素的小圓形培養皿(82mm)上以在單個平板上獲得約IOO個分離得很好的菌落。如上所述進行轉移，不同的是使用NytranN月莫圓片(membranecircles)(CatalogNo.10416116,Schleicher&Schuell,Keene,NH)並且用剩餘的經放射標記過的^採4十在lOOmL雜交溶液中雜交。以這種方式，確認了陽性克隆。使各陽性克隆在LB+50)Lig/mL卡那黴素液體培養基中於37。C下生長，用QIAprepSpinMimprep試劑盒(QmgenInc.)按照製造商規程來純化質粒。如實施例2中所述，使用載體引發的T7引物(SEQIDNO:8)、載體引發的M13rev-28引物(SEQIDNO:9)和聚腺苷酸尾引發的WobbleT寡核苷酸，用ABIBigDyeversion3Prism測序試劑盒對質粒插入物進行測序。簡而言之，WobbleT引物是21mer聚(T)A、聚(T)C、和聚(T)G的克分子數相等的混合物，用於對cDNA克隆的3'末端進行測序。基於最初的序列數據，可用寡核苷酸EaD8s叫-l(SEQIDNO:12)以類似的方式獲得另外的內部片段序列。以這樣的方式，獲得了euglcA8去飽和酶克隆的全長插入序列。使用Sequencher(版本4.2,GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)對序列進行比對和比較，這樣，基於插入序列可以將克隆歸類為四種不同組中的一種(稱為EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3或EaD8Des4)。選擇含有每一類序列的cDNA的代表性克隆用於進一步的研究，每種代表性質粒(即pLF118-l、pLF118-2、pLFl18-3和pLFl18-4)的序列分別在SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16中示出。用一串NNNN表示的序列表示未進行測序的聚腺苷酸尾區域。EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3和EaD8Des4的編碼序列分別在SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20中示出。EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3和EaD8Des4的相應胺基酸序列分別在SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23和SEQIDNO:24中示出。EaD8Desl、EaD8Des2、EaD8Des3和EaD8Des4總稱為EaD8Des基因。實施例4EudenaanabaenaUTEX373的△8去飽和酶序列的一級序列分析和與小眼蟲A8去飽和酶序列的比較使用ClustalW方法(採用LASERGENE生物信息學計算軟體包(DNASTARInc.)的MegAlignv6.1程序，採用用於多重比對的默認參數缺口罰分=10、缺口長度罰分=0.2、延遲發散序列(DelayDivergenSeqs)(%)=30、DNA轉換權重(DNATransitionWeight)=0.5、蛋白質權重矩陣(ProteinWeightMatrix)=GonnetSeries、DNA權重矩陣(DNAWeightMatnx)=IUB)對EaD8Desl(SEQIDNO:21)、EaD8Des2(SEQIDNO:22)、EaD8Des3(SEQIDNO:23)和EaD8Des4(SEQIDNO:24)的胺基酸序列進行比較。與EaD8Desl(SEQIDNO:21)比較，EaD8Des2(SEQIDNO:22)具有3個胺基酸置換(即，基於EaD8Desl的編號，110位的T被置換為S、223位的M被置換為I,251位的K被置換為T),EaD8Des3(SEQIDNO:23)具有2個胺基酸置換(即110位的T被置換為S,251位的K被置換為T),而EaD8Des4(SEQIDNO:24)具有1個胺基酸置換(即IIO位的T被置換為S)。通過BLASTP(基本的局部比對搜索工具；Altschul等人，J.Mol.Biol.,215:403-410(1993))搜索與包含在BLAST"nr"資料庫(同上，實施例2)中的序列的相似性(採用默認參數並關閉過濾器)對EaD8Desl(SEQIDNO:21)、EaD8Des2(SEQIDNO:22)、EaD8Des3(SEQIDNO:23)和EaD8Des4(SEQIDNO:24)的胺基酸序列進行評估。為方便起見，由BLAST所計算的、觀察到cDNA序列與所搜索資料庫中包含的序列僅偶然匹配的P值(概率)在本文中報導為"pLog"值，該值代表了所報導的P值的負對數。當與"nr"資料庫進行比較時，相對於小眼蟲A8去飽和酶胺基酸序列(SEQIDNO:11)(NCBI登錄號AAD45877(GI5639724),基因座AAD45877、CDSAF139720;Wallis和Browse,Arch.Biochem.Biophys.,365:307-316(1999)),所有這四種序列均產生了為177的pLog值(P值為e-177)。BLAST打分和概率表明，本核酸片段編碼整個EuglenaanabaenaA8脂肪酸去々包和酶。然後使用BlastP(默認參數，關閉過濾器)、ClustalV和JotunHem序列比4交方法，將EaD8Desl(SEQIDNO:21)、EaD8Des2(SEQIDNO:22)、EaD8Des3(SEQIDNO:23)和EaD8Des4(SEQIDNO:24)的胺基酸序列與功能性變體小眼蟲A8去飽和酶胺基酸序列(本文中稱為EgD8,如SEQIDNO:25所示；在PCT專利申請WO2006/012325中稱為Eg5)進行比較，用每種方法確定的百分比同一性在表7中示出。用ClustalV方法(Higgins,D.G.禾口Sharp,P.M.,Comput.Appl.Biosci.,5:151-153(1989);Higgins等人，Comput.Appl.Biosci.,8:189-191(1992))進行的序列百分比同一性計算是通過LASERGENE生物信息學計數軟體包(DNASTARInc.,Madison,WI)的MegAlignv6.1程序來完成的，該程序採用用於成對比對的默認參數(KTUPLE=1,缺口罰分=3,窗口=5,DIAGONALSSAVED=5,缺口長度罰分=10)。用JotunHein方法(Hem,J.J.,Meth.Enz.,183:626-645(1990))進行的序列百分比同一性計算是用LASERGENE生物信息學計算軟體包(DNASTARInc.,Madison,WI)的MegAlignv6.1程序來完成的，該程序採用用於成對比對的默認參數(KTUPLE=2)。表7EaD8Desl(SEQIDNO:21)、EaD8Des2(SEQIDNO:22)、EaD8Des3(SEQIDNO:23)和EaD8Des4(SEOIDNO:24)與EgD8(SEQIDNO:25)的序列比4支_去飽和酶通過BLASTP確定的與EgD8(SEQIDNO:25)的％同一性通過JotunHein方法確定的與EgD8(SEQIDNO:25)的％同一性通過ClustalV方法確定的與EgD8(SEQIDNO:25)的％同一性EaD8Desl73%74.4%72.1%EaD8Des273%74.2%71.9%EaD8Des373%74.2%71.9%EaD8Des473%74.2%71.9%57這五種胺基酸序列的ClustalV比對可以在圖4A、4B和4C中看到。下面的表8示出了圖4A、4B和4C中列出的這五種A8去飽和酶序列之間的百分比同一性的比較(在三角形上半部分中示出)和百分比趨異性的比較(在三角形下半部分中示出)。表8EaD8Desl(SEOIDNO:21)、EaD8Des2(SEOIDNO:22)、EaD8Des3(SEOIDNO:23)、EaD8Des4(SEOIDNO:24)和EgD8(SEQIDNO:25)之間的百分比同一性和百分比趨異性_tableseeoriginaldocumentpage58實施例5解脂耶氏酵母中EuglenaanabaenaUTEX373A8去飽和酶的功能分社本實施例描述了對解脂耶氏酵母中的EaD8Desl(SEQIDNO:21)、EaD8Des2(SEQIDNO:22)、EaD8Des3(SEQIDNO:23)和EaD8Des4(SEQIDNO:24)的功能分析。該工作包括如下步驟(1)對具有合適的限制位點的每種A8去飽和酶進行PCR擴增，以從實施例2中描述的質粒進行克隆；(2)將EaD8DesPCR產物克隆進克隆載體pCR-Blunt(InvitrogenCorporation)中，以產生pY120-l、pY120-2、pY120-3和pY120-4;(3)將EaD8Des基因克隆進耶氏酵母表達載體pYl15中，以產生pY175、pY176、pY177和pY178;以及(4)在供給底物後，比較包含pY175、pY176、pY177和pY178的轉化生物內的脂質概況。EuglenaanabaenaA8去々包和酶基因的PCR擴增為了在該編碼序列的5'端引入Notl和Ncol限制位點以及在該編碼序列的3，端引入NotI位點，對每種EaD8Des基因進行PCR擴增。使用PhusioiT高保真DNA聚合酶(CatalogNo.F553S,FmnzymesOy，Finland),按照製造商規程，用寡核苷酸引物EaD8-5(SEQIDNO:26)和EaD8-3(SEQIDNO:27)分別從pLFl18-1(SEQIDNO:13)、pLFl18-2(SEQIDNO:14)、pLFl18-3(SEQIDNO:15)和pLFl18-4(SEQIDNO:16)擴增EaD8Desl(SEQIDNO:17)、EaD8Des2(SEQIDNO:18)、EaD8Des3(SEQIDNO:19)和EaD8Des4(SEQIDNO:20)的編碼序列。使用ZeroBluntPCR克隆試劑盒(InvitrogenCorporation),按照製造商規程將得到的DNA片段克隆進？01-81111^@克隆載體中，以分別產生pLF120-l(SEQIDNO:28)、pLF120-2(SEQIDNO:29)、pLF120-3(SEQIDNO:30)和pLF120-4(SEQIDNO:31)。構建耶氏酵母表達載體pY115、PY175、PY176、PY177和pY178質粒pY5-30(在美國專利7,259,255中描述)是既可在大腸桿菌中複製又可在解脂耶氏酵母中複製的穿梭質粒。質粒pY5-30包含如下組分耶氏酵母自主複製序列(ARS18);ColEl質粒的複製起點；用於在大腸桿菌中選擇的氨節青黴素抗性基因(AmpR);用於在耶氏酵母中選擇的耶氏酵母LEU2基因；以及TEF::GUS::XPR嵌合基因。質粒pDMW263(SEQIDNO:32)由pY5-30產生，這通過使用本領域技術人員所熟知的技術將TEF啟動子替換為解脂耶氏酵母FBAINm啟動子(美國專利7,202,356)而實現。簡而言之，該啟動子指經Y奮飾的啟動子，其位於由fbal基因編碼的果糖二磷酸醛縮酶(E.C.4.1.2.13)的'ATG，翻譯起始密碼子前面的5，上遊非翻譯區，並且該啟動子加上具有內含子的5，編碼區部分是表達所必需的，其中FBAINm在ATG翻譯起始密碼子與FBAIN啟動子的內含子之間具有52bp的缺失(從而只包含N端的22個胺基酸)，並且在內含子後面具有新的翻譯共有基序。表9概述了pDMW263(SEQIDNO:32)的組分。59表9質粒pDMW263的組分tableseeoriginaldocumentpage60將來自pDMW263(SEQIDNO:32)的Ncol/SallDNA片段(含有解脂耶氏酵母FBAINm啟動子)克隆進pDMW237(SEQIDNO:33)的NcoI/SalIDNA片段中以產生pY115(SEQIDNO:34;FIG.5A),該pDMW237此前在PCT公布WO2006/012325中有描述(該專利的內容以引用的方式併入)，含有來源於綠光等鞭金藻的經密碼子最優化以便在解脂耶氏酵母屬中表達的合成的A9延伸酶基因。在圖5A和圖5B中，經修飾的FBAINm啟動子標記為FBA1+內含子。將來自pLF120-l(SEQIDNO:28)、pLF120-2(SEQIDNO:29)、pLF120隱3(SEQIDNO:30)和pLF120-4(SEQIDNO:31)的NcoI/NotIDNA片段(含有各自的EaD8Des)克隆進來自pYl15的NcoI/NotIDNA片段(含有解脂耶氏酵母FBAINm啟動子)中，以分別產生pY175(SEQIDNO:35;圖5B)、pY176(SEQIDNO:36)、pY177(SEQIDNO:37)和pY178(SEQIDNO:38)。解脂耶氏酵母菌抹Y2224中EuglenaanabaenaA8去飽和酶基因的功能分析如在"一般方法，，中所述，用pY175(SEQIDNO:35)、pY176(SEQIDNO:36)、pY177(SEQIDNO:37)和pY178(SEQIDNO:38)來轉化菌抹Y2224(參見"一般方法，，)。使包含pY175、pY176、pY177和pY178的解脂耶氏酵母轉化抹的單菌落在3mL基本培養基中於3(TC下生長1天，該培養基補充有0.2%的tergitol,不含尿嘧。定。之後，將0.1mL轉移至3mL補充有0.175mM的EDA(20:2(11,14))或ETrA(20:3(11,14,17))的相同培養基中。將這些培養物在30。C下以250rpm孵育16小時，然後通過離心獲得沉澱顆粒。將細胞用水洗滌一次，通過離心沉澱並風乾。在5CTC下用500pL1%的甲醇鈉對該沉澱進4亍酯交4灸反應(Roughan,G.和Nishida,I.,Arch.Biochem.Biophys.,276(1):38-46(1990))30分鐘，之後加入500pL1M的氯化鈉和100pL庚烷。在徹底混合併離心後，通過GC分析脂肪酸曱酯(FAME)。<吏用配有Omegawax320熔融石英毛細柱的Hewlett-Packard6890氣相色傳(CatalogNo.24152,SupelcoInc.)對FAME(從己烷層取5pL注射上樣)進行分離和定量。用程序控制烘箱溫度在220。C並保持2.6分鐘，以20。C/分鐘升溫至24(TC,然後另外保持2.4分鐘。載氣通過Whatman氳發生器供應。將保留時間與那些市售的甲酯標準樣品(Nu-ChekPrep，Inc)的寸呆留時間進4亍比專支。表達pY175、pY176、pY177和pY178的解脂耶氏酵母的脂肪酸概況在圖6中示出。通過如下方式計算C20去飽和百分比("C20A-8去々包和百分比")將DGLA的重量百分比(wt%)除以EDA和DGLA的總wt%再乘以100以表示為百分比形式，或者將ETA的wt%除以ERA和DTA的總wt%再乘以100以表示為百分比形式，這取決於是供給哪種底物(即EDA或ERA)。用適當的標題信息之後的平均數表示平均值。EDA與ERA的去々包和比通過將EDA的C20A-8去々包和百分比的平均值除以ERA的C20A-8去飽和百分比的平均值來計算。所有EuglenaanabaenaA8去飽和酶均在耶氏酵母中起到了相似的好的作用，將大約50%的供給的EDA轉化成了DGLA。似乎EDA比ERA稍;微偏好些，EDA/ERA比率為1.1至1.2。實施例6用於解脂耶氏酵母的經密碼子最優化的△8去飽和酶基因(EaD8S)的合成以與PCT公布WO2004/101753和美國專利7,125,672中所描述的類似方式，將Euglenaanabaena的△8去飽和酶基因(EaD8Des3;SEQIDNO:19)的密碼子使用最優化以便在解脂耶氏酵母屬中表達。具體地講，基於EaD8Des3(SEQIDNO:19和23)的編碼序列，根據耶氏酵母密碼子4吏用才莫式(PCT7^布WO2004/101753)、'ATG，翻"i奪起始密碼子周圍的共有序列以及RNA穩定性的一般規則(Guhaniyogi,G.和J.Brewer,Gene,265(1-2):11-23(2001)),來設計經密碼子最優4匕的A8去飽和酶基因(稱為"EaD8S",SEQIDNO:39)。除了修飾翻譯起始位點之外，還對1260bp編碼區中的231bp進行了修飾(18.3%)並最優化了208個密碼子(49.5%)。GC含量從野生型基因(即EaD8Des3)中的56.8%減少到合成基因(即EaD8S)中的54.8%。分別將NcoI位點和Notl位點整合到EaD8S(SEQIDNO:39)的翻i奪起始密碼子的周圍和終止密碼子之後。圖7A和7B示出了EaD8Des3(SEQIDNO:19)和EaD8S(SEQIDNO:39)的核苦酸序列的比4交。由經密碼子最優化^的基因編碼的蛋白質序列(即SEQIDNO:40)與野生型EaD8Des3蛋白質序列(即SEQIDNO:23)相同。設計的EaD8S基因由GenScriptCorporation(Piscataway,NJ)合成並將其克隆到pUC57(基因庫編號Y14837)中，以產生pEaD8S(SEQIDNO:41;圖8A)。實施例7包含經密碼子最優化以在解脂耶氏酵母屬中表達的合成的A8去飽和酶基因(來源於Euglenaanabaena)(EaD8S)的解脂耶氏酵母表達載體。ZUFmEaD8S的構建和功能分析本實施例描述了包含FBAINm::EaD8S::Pex20嵌合基因的解脂耶氏酵母載體pZUFmEaD8S的功能性表達，其中EaD8S是來源於Euglenaanabaena的經密碼子最優化以便在耶氏酵母屬中表達的合成的△8去飽和酶(實施例6)。質粒pZUFmEaD8S(圖8B)含有如下組分62表10tableseeoriginaldocumentpage63包含pZUFmEaD8S的解脂耶氏酵母轉化抹的功能分析如在"一般方法，，中所述，將質粒pZUFmEaD8S(SEQIDNO:51;圖8B)轉化進菌4朱Y4001U中。在MMLeu平^反上選才奪轉化抹。在30t:下生長2天後，挑取轉化抹並將其再次劃線至新鮮的MMLeu平板上。生長之後，將這些菌抹單個地接種在30°C下的3mL液體MMLeu中，以250rpm/mm搖動2天。離心收集細胞，提取脂質，通過酯交換反應來製備脂肪酸曱酯，隨後用Hewlett-Packard6890GC進行分析。GC分析顯示，在所有7個轉化抹中產生了佔總脂質約6.5%的DGLA和9.4%的EDA,其中測得這7個轉化4朱中EDA轉化成DGLA的轉化效率為約41%。權利要求1.包含分離的多核苷酸的微生物宿主細胞，所述分離的多核苷酸包含(a)編碼具有Δ8去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於ClustalV比對方法在與選自下列的胺基酸序列進行比較時，所述多肽具有至少80％的胺基酸同一性SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23和SEQIDNO24；(b)編碼具有Δ8去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於BLASTN比對方法在與選自下列的核苷酸序列進行比較時，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO20和SEQIDNO39；(c)編碼具有Δ8去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在嚴格條件下與選自下列的核苷酸序列雜交SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO20和SEQIDNO39；或(d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數目的核苷酸組成並且100％互補。2.權利要求1的微生物宿主細胞，其中所述分離的多核苷酸編碼選自下列的胺基酸序列SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23和SEQIDNO:24。3.權利要求l的微生物宿主細胞，其中所述微生物宿主細胞選自酵母、藻類、細菌、類眼蟲、原生藻菌和真菌。4.權利要求3的微生物宿主細胞，其中所述細胞是被孢黴屬物種的真菌。5.權利要求3的微生物宿主細胞，其中所述細胞是選自下列的原生藻菌破嚢壺菌屬物種和裂殖壺菌屬物種。6.權利要求3的微生物宿主細胞，其中所述酵母是含油酵母。7.權利要求6的微生物宿主細胞，其中所述含油酵母選自耶氏酵母屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。8.用於產生二高-Y-亞油酸的方法，所述方法包括a)提供微生物宿主細胞，所述微生物宿主細胞包含(i)編碼A8去飽和酶多肽的重組核苷酸分子，基於ClustalV比對方法在與具有選自下列的胺基酸序列的多肽進行比較時，所述去飽和酶多肽具有至少80%的胺基酸同一性SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23和SEQIDNO:24;和(ii)二十碳二烯酸源；b)使步驟(a)的微生物宿主細胞在使編碼A8去飽和酶多肽的核酸片段表達並使所述二十碳二烯酸轉化成二高-Y-亞油酸的條件下生長；以及c)任選回收步驟(b)的二高-Y-亞油酸。9.用於產生二十碳四烯酸的方法，所述方法包括a)提供微生物宿主細胞，所述微生物宿主細胞包含(i)編碼A5去飽和酶多肽的重組核普酸分子，基於ClustalV比對方法在與具有選自下列的胺基酸序列的多肽進行比較時，所述去飽和酶多肽具有至少80%的胺基酸同一性SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23和SEQIDNO:24;和(11)二十/友三烯酸源；b)使步驟(a)的微生物宿主細胞在使編碼A8去飽和酶多肽的核酸片段表達並使所述二十碳三烯酸轉化成二十碳四烯酸的條件下生長；以及，c)任選回收步驟(b)的二十-友四烯酸。10.權利要求8或9的方法，其中所述微生物宿主細胞是包含如SEQIDNO:39中示出的編碼△8去飽和酶多肽的重組核苷酸分子的耶氏酵母屬物種，其中所述重組核苷酸分子包含至少208個經最優化以便在耶氏酵母屬中表達的密碼子。11.權利要求8或9的方法，其中a.)所述重組核酸分子具有選自下列的核酸序列SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20和SEQIDNO:39;並且b.)所述宿主細胞是解脂耶氏酵母。12.如SEQIDNO:39中示出的編碼△8去飽和酶的分離的核酸分子，其中至少208個密碼子經密碼子最優化以便在耶氏酵母屬物種中表達。全文摘要本發明涉及Δ8去飽和酶基因，所述去飽和酶基因具有將二十碳二烯酸(EDA；20:2ω-6)轉化成二高-γ-亞麻酸(DGLA；20:3ω-6)和/或將二十碳三烯酸(ETrA；20:3ω-3)轉化成二十碳四烯酸(ETA；20:3ω-3)的能力。公開了分離的核酸片段和包含這種編碼Δ8去飽和酶的片段的重組DNA構建體，以及用這些Δ8去飽和酶在含油酵母中製備長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)的方法。文檔編號C12N15/63GK101679990SQ200880018763公開日2010年3月24日申請日期2008年4月10日優先權日2007年4月10日發明者H·G·達穆德,Q·Q·朱申請人:納幕爾杜邦公司