基因工程重組抗cea抗cd3抗cd28單鏈三特異抗體的製作方法

2023-04-29 02:20:01

專利名稱：基因工程重組抗cea抗cd3抗cd28單鏈三特異抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程抗體領域，更具體地，涉及一種基因工程重組抗CEA抗CD3抗CD28單鏈三特異抗體；這種抗體的構建、表達和純化方法；含有該抗體的載體和大腸桿菌宿主菌。
背景技術：
在人體內，T細胞的活化需要雙信號傳遞途徑的作用抗原呈遞細胞(APCAntigen Presenting Cells)表面的MHC/抗原肽複合物與T細胞表達的TCR/CD3複合物相互作用，產生第一信號傳遞途徑；而APC細胞表面的輔刺激信號分子受體(如B7)與T細胞表面的輔刺激信號分子(如CD28)相互作用，產生第二信號，即輔刺激信號傳遞途徑。一般認為，僅存在第一信號，不能充分活化T細胞(Baxter Hodgkin，2002；Bernard etal.，2002)。
T細胞主要包括兩類殺傷性T淋巴細胞(CTLCytotoxic TLymphocytes)和輔助性T細胞(THT help cells)。其中CTL細胞是細胞免疫的主要效應細胞，而TH細胞通過分泌細胞因子(如IL-2等)和細胞之間的直接相互作用，調節CTL細胞的活性，間接參與細胞免疫。由於腫瘤免疫主要以細胞免疫為主，因此以特異活化CTL細胞為目的設計抗腫瘤藥物是進行腫瘤免疫治療的重要途徑。(Foss，2002)目前人們針對T細胞活化的第一信號途徑，設計並構建了一系列基因工程抗腫瘤抗CD3雙特異抗體，其中相當一部分已經進入臨床實驗(Daniel et al.，1998；Holliger et al.，1999；Loffler etal.，2000；Manzke et al.，2001；Manzke et al.，2001；Dreier etal.，2002；Dreier et al.，2003；Loffler et al.，2003；MinFang，2003；Fang et al.，2004)。已有的實驗數據已經表明，該類雙特異抗體能夠通過特異活化識別腫瘤細胞的T淋巴細胞，間接特異殺傷腫瘤細胞。然而由於僅有第一信號傳遞途徑，還不足以完全活化T淋巴細胞，甚至可能誘導T淋巴細胞產生激活誘導的細胞死亡(AICDactivationinduced cell death)現象，從而降低殺傷腫瘤細胞的作用效果(Daniel etal.，1998)。
為了克服該種雙特異抗體的缺點，人們設計構建了另外一種雙特異抗體抗腫瘤抗CD28雙特異抗體。將其與抗腫瘤抗CD3雙特異抗體兩種雙特異抗體聯合使用，就可以為T細胞活化提供完整的雙信號途徑(Junget al.，2001；Kodama et al.，2002)。實驗證明，這樣做能大幅度提高殺傷腫瘤細胞的效率。然而兩種雙特異抗體聯合使用的方式，在具體應用上會帶來一系列不便，如增加了表達和純化的操作工序和生產成本，臨床應用時必須考慮兩種抗體的相對比例等。因此，如果構建一種同時針對三種抗原(腫瘤抗原、CD3或TCR、CD28)的三特異抗體(TsAbtri-specificantibody)分子，那麼該三特異抗體分子將具有上述兩種雙特異抗體分子的特性，並且在表達、純化和臨床應用中將具有更大的優越性。
三特異抗體有以下三種類型，化學偶聯型(Jung et al.，1991；Tuttet al.，1991；French，1998；Wong et al.，2000)、基因工程多聚體型(Atwell et al.，1999；Dolezal et al.，2000；Schoonjans etal.，2000；Schoonjans et al.，2000；Kortt et al.，2001；Schoonjans etal.，2001；Willems et al.，2003)和基因工程單鏈融合分子型(Song etal.，2003；Zhang et al.，2003)。其中第三種類型的三特異抗體的構建方式簡單，表達產物單一，易於純化，因此具有更好的應用前景。採用該種方式，本發明人已經成功構建了一種基因工程抗卵巢癌抗CD3抗CD28單鏈三特異抗體(Song et al.，2003；Zhang et al.，2003)，並且已經證明能夠在體外介導產生卵巢癌細胞特異的殺傷作用。由於癌胚抗原-CEA(carcinoma embryonic antigen)是廣譜的腫瘤相關抗原(Shi etal.，1983；Ganjei et al.，1988；Horie et al.，1996；Kuo et al.，1996；Feilet al.，1999；Tomita et al.，2000；Kammerer et al.，2003)，用其抗體構建單鏈三特異抗體將可應用於多種腫瘤的預防和治療。

發明內容
發明概述本發明將廣譜的腫瘤相關抗原CEA引入三特異抗體的構建，構建抗CEA抗CD3抗CD28基因工程單鏈三特異抗體CEA-TsAb，從而明確了三特異抗體識別腫瘤細胞的特異標記，一方面使三特異抗體能夠區分腫瘤細胞和機體正常細胞，儘量避免非特異殺傷反應，另一方面，由於CEA是一種廣譜腫瘤相關抗原，該三特異抗體在多種腫瘤的免疫治療領域，具有了廣闊的應用前景。
因此在本發明的一個方面，提供了一種用於治療多種腫瘤的抗CEA抗CD3抗CD28基因工程單鏈三特異抗體。
在本發明的另一個方面，提供了一種構建該種三特異抗體的方法。
本發明所述的CEA-TsAb包含的抗CEA鼠源單鏈抗體的胺基酸序列(SEQ ID NO1)如下QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSDYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGRTDYNERFKGKATFTGDVSSNTAYMKLSSLTSEDSAVYYCATGTTPFGYWGQGTLVTVSATSTPSHNSHQVPSAGGPTANSGSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYTYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTAYYYCQHSWEIPRTFGGGTKLEIK本發明所述的CEA-TsAb包含的抗CD3鼠源單鏈抗體的胺基酸序(SEQID NO2)如下EVKLVESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLELKRA本發明所述的CEA-TsAb的核苷酸序列(SEQ ID NO3)如下1 ATGGGTCTCGAGCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCGGAACTGATGAA51 ACCGGGCGCGAGCGTGAAAATCAGCTGCAAAGCGACCGGCTATACCTTCA101 GCGATTATTGGATCGAATGGGTGAAACAGCGTCCGGGTCACGGCCTGGAA151 TGGATCGGTGAAATCCTGCCGGGCAGCGGCCGTACCGACTACAACGAACG201 TTTCAAAGGCAAAGCGACCTTCACCGGCGACGTTTCTAGCAACACCGCGT251 ATATGAAACTGTCTAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTACTGC
301 GCGACCGGCACCACCCCGTTCGGTTACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTAC351 CGTTTCCGCGACTAGTACCCCGAGCCATAACAGCCATCAGGTGCCGAGCG401 CGGGCGGCCCGACCGCGAACAGCGGCTCTAGAGACATCGTGCTGACCCAG451 AGCCCGGCGAGCCTGGCGGTGTCTCTGGGTCAGCGTGCGACCATCTCCTG501 CCGTGCTTCCCAGTCCGTTTCCACCTCCTCCTACACCTACATGCACTGGT551 ATCAGCAGAAACCGGGTCAGCCGCCGAAACTGCTGATCAAATATGCGAGC601 AACCTGGAATCTGGTGTGCCGGCGCGTTTCAGCGGTTCTGGCAGCGGCAC651 CGACTTCACCCTGAACATCCACCCGGTGGAAGAAGAAGATACCGCGTATT701 ACTATTGCCAGCACTCTTGGGAAATCCCGCGTACCTTCGGTGGCGGCACC751 AAACTGGAAATCAAAGAATTCAACAGCACGTACCGGGTTGTAAGCGTCCT801 CACCGTACTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAATACAAATGCAAGA851 GTACTGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGA901 GCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTA951 CACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGG1001 GACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAG1051 GACAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGA1101 ACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAT1151 CGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGA1201 ACCTCAGTCACTGTCTCCTCAACTAGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGG1251 TGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTCTAGAGACATCCAGATGACCCAGACCA1301 CATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGG1351 GCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGA1401 TGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAG1451 TCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACC1501 ATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGG1551 TAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAACTGGAACTGAAGC1601 GCGCTGTCGACTTCCAGAATGCGCTGCTGGTTCGTTACACCAAGAAAGTA1651 CCCCAAGTGTCAACTCCAACTCCTGTAGAGGTCTCACATATGCAGGTACA1701 GCTACAGGAATCTGGTCCGGGTCTGGTAAAACCGTCTCAGACCCTGTCTC1751 TGACCTGTACCGTATCTGGTTTCTCTCTGTCTGACTATGGTGTTCATTGG
1801 GTACGTCAGCCGCCAGGTAAAGGTCTGGAATGTCTGGGTGTAATATGGGG1851 TGGAGGCACGAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACGTGTAACCTCTT1901 CCGACGATACCTCTAAAAATCAGTTCTCTCTGAAACTGTCTTCCGTAGAC1951 ACCGCTGTATACTATTGTGCTCGTTCCTATTACTATTCTATGGACTACTG2001 GGGTCAGGGCACCCTGGTAACCGTATCTTCCGGTACCGAACAAAAACTCA2051 TCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCACATCATCATCACCATCACGAG2101 CAA本發明所述的CEA-TsAb的胺基酸序列(SEQ ID NO4)如下MGLEQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSDYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGRTDYNERFKGKATFTGDVSSNTAYMKLSSLTSEDSAVYYCATGTTPFGYWGQGTLVTVSATSTPSHNSHQVPSAGGPTANSGSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYTYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTAYYYCQHSWEIPRTFGGGTKLEIKEFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKSTEVKLVESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLELKRAVDFQNALLVRYTKKVPQVSTPTPVEVSHMQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSDYGVHWVRQPPGKGLECLGVIWGGGTNYNSALMSRRVTSSDDTSKNQFSLKLSSVDTAVYYCARSYYYSMDYWGQGTLVTVSSGTEQKLISEEDLNGAAHHHHHHEQ在本發明的另一個方面，提供了一種用於表達該抗體的載體CEA-TsAb/pTRI。
在本發明的另一個方面，提供了一種含有上述載體的大腸桿菌宿主細胞。
在本發明的另一個方面，提供了一種低溫誘導促進三特異抗體胞內可溶表達的方法。
在本發明的另一個方面，提供了一種採用DEAE陰離子交換樹脂純化該三特異抗體的方法。
但是，在本說明書的上下文，尤其是「實施例」部分的公開內容的基礎上，本發明的其它方面和優點對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。


圖1.採用重疊PCR拼接用於構建CEA-TsAb的載體多克隆位點DNA的過程簡圖，其中符號2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分別代表用於構建的合成寡聚核苷酸片段，字母A、B、C、D、E，羅馬數字I、II、III、IV和符號UP、DOWN分別代表構建過程中的中間產物，符號WHOLE代表終產物。
圖2.重疊PCR拼接用於構建CEA-TsAb的載體多克隆位點DNA片段的瓊脂糖電泳鑑定，第一泳道重疊PCR拼接產物；第二泳道DL2000 DNA分子量標準(大連寶生物公司)圖3.多克隆位點DNA片段核苷酸序列、酶切位點及組成。
圖4.構建CEA-TsAb的操作過程簡圖。
圖5.用於構建CEA-TsAb的各中間載體和構建成功的含有CEA-TsAb的載體簡圖。
圖6.構建CEA-TsAb過程中各中間產物和終產物的瓊脂糖電泳鑑定，第1泳道以質粒pTRI為模板的PCR產物；第2泳道以質粒CD28 VH/pTRI為模板的PCR產物；第3泳道以質粒CD3 scFv/CD28 VH/pTRI為模板的PCR產物；第4泳道以質粒CEA-TsAb/pTRI為模板的PCR產物；第5泳道DL2000 DNA分子量標準(大連寶生物公司)圖7.採用重疊PCR拼接用於構建CEA-TsAb的載體多克隆位點DNA的過程簡圖，其中數字1-22分別代表用於構建的合成寡聚核苷酸片段，字母A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、a、b、c、d、e、f、g，羅馬數字I、II、III、IV和符號UP、DOWN分別代表構建過程中的中間產物，符號WHOLE代表終產物。
圖8.重疊PCR拼接用於構建抗CEA單鏈抗體DNA片段的瓊脂糖電泳鑑定，泳道1和9為DNA分子量標準(大連寶生物公司)DL2000；泳道2-5依次為構建過程的中間產物I、II、III和IV；泳道6和7分別為構建過程的中間產物UP和DOWN；泳道8為全長單鏈抗體片段WHOLE。
圖9.低溫誘導CEA-TsAb胞內可溶表達的SDS-PAGE鑑定結果，泳道1超聲沉澱；泳道2超聲上清；泳道3低分子量蛋白標準(上海生物化學研究所)；泳道4pTRI空載體表達超聲沉澱；泳道5pTRI空載體表達超聲上清，其中箭頭所指為CEA-TsAb特異條帶。
圖10.低溫誘導表達CEA-TsAb的Western blot鑑定，泳道1預染蛋白分子量標準(NEB公司)；泳道2CEA-TsAb/pTRI表達產物超聲沉澱；泳道3pTRI空載體表達產物超聲沉澱；泳道4CEA-TsAb/pTRI表達產物超聲上清；泳道5pTRI空載體表達產物超聲上清。
圖11.DEAE陰離子交換純化結果的SDS-PAGE鑑定，泳道1pTRI空載體表達產物超聲上清；泳道2CEA-TsAb表達產物超聲上清；泳道3DEAE陰離子交換純化過柱流穿組分；泳道4DEAE陰離子交換純化NaCl洗脫組分；泳道5DEAE陰離子交換純化NaOH洗脫組分；泳道6低分子量蛋白標準(購自上海生物化學研究所)。箭頭所指為CEA-TsAb特異條帶。
圖12.CEA-TsAb的ELISA鑑定結果，圖中的曲線由上而下分別代表四種測定結果。第一條曲線10μg/ml Jurkat細胞膜抗原；第二條曲線1μg/ml CEA抗原；第三條曲線1μg/mlCD28抗原；第四條曲線不包被任何抗原的測定結果。
圖13.CEA-TsAb對各種腫瘤細胞結合特異性的FACS鑑定結果，圖中帶陰影的峰是不加抗體CEA-TsAb的對照樣品測定結果，不帶陰影的峰是添加抗體CEA-TsAb的樣品測定結果。
圖14.CEA-TsAb對Jurkat細胞和PBMC細胞結合特異性的FACS鑑定，圖中帶陰影的峰是不加抗體CEA-TsAb的對照樣品測定結果，不帶陰影的峰是添加抗體CEA-TsAb的樣品測定結果。
圖15.MTT法檢測不同效靶比對CEA-TsAb介導的T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞效率的影響，三條曲線分別代表三個不同效靶比(E/T＝10、5、1)時，殺傷腫瘤細胞的效率與抗體濃度的相關性，圖中的曲線由上而下分別代表三種不同的效靶比的特異殺傷率測定結果，第一條曲線效靶比為10；第二條曲線效靶比為5；第三條曲線效靶比為1。
圖16.MTT檢測抗體濃度對CEA-TsAb介導的T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的效率的影響，圖中顯示特異殺傷率的變化分為四個階段階段1在6g/ml-12g/ml之間，特異殺傷率與抗體濃度負相關，在12g/ml時，特異殺傷率達到最高；階段2特異殺傷率與抗體濃度正相關，至750ng/ml時特異殺傷率最低；階段3在24ng/ml-750ng/ml之間，特異殺傷率與抗體濃度負相關，在24ng/ml特異殺傷率最高；階段4特異殺傷率與抗體濃度又出現正相關。
圖17.CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞過程中，抗體濃度對T淋巴細胞增殖的影響。圖中顯示SI的變化分為三個階段階段1抗體濃度在1.5g/ml-12g/ml之間，SI與抗體濃度呈正相關變化，在1.5g/ml達到最低；階段2SI與抗體濃度呈負相關變化，在47ng/ml左右達到最高；階段3在小於47ng/ml時，SI與抗體濃度呈正相關變化，在0.7ng/ml時SI最低。
圖18.CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞過程中細胞形態觀察記錄(二)，A單獨培養SW1116細胞20小時後細胞形態；B-I按照效靶比為5共孵育SW1116細胞和PBMC細胞，並添加CEA-TsAb(終濃度為1g/ml)共孵育20小時後處於不同殺傷階段的各種細胞形態，其中B靶細胞由貼壁開始脫離；C效應細胞開始聚集在靶細胞的表面；D靶細胞表面局部出現突起；E靶細胞局部破碎；F靶細胞整體破碎；G-I靶細胞逐漸完全破碎。
圖19.CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的作用機制簡圖，上圖CEA-TsAb的結構簡圖；下圖CEA-TsAb殺傷腫瘤細胞的作用機制CEA-TsAb與腫瘤細胞和CTL細胞特異結合，並通過活化CTL細胞而殺傷腫瘤細胞。
圖20.PI和FITC-Annexin V雙標記被殺傷的腫瘤細胞(SW1116)的螢光顯微鏡觀察記錄，A、B和C行分別代表三種不同狀態的被殺傷腫瘤細胞(依次為壞死細胞、晚期凋亡細胞和早期凋亡細胞)；第2列為綠色螢光單色觀察結果，第3列為紅色螢光單色觀察結果，第1列是採用LeicaQFISH軟體將前兩種單色螢光觀察結果進行疊加的結果。
圖21.PI和FITC-Annexin V雙標記被殺傷的腫瘤細胞(SW1116)的FACS檢測結果，代表不同細胞殺傷狀態的明顯各個分區左下區(Low Left，LL)為活細胞(viable cells)、右下區(Low Right，LR為早期凋亡細胞(early apoptosis cells)、左上區(Up Left，UL)為壞死細胞(necrosiscells)、右上區(Up Right，UR)為晚期凋亡細胞(late apoptosis cells)。不添加抗體組(SW1116+PBMC)左下區90.17％，右下區1.66％，左上區5.94％，右上區2.23％；添加50ng/ml CEA-TsAb(SW1116+PBMC+CEA-TsAb)左下區52.83％，右下區16.12％，左上區9.80％，右上區21.25％。
發明詳述在本發明的上下文中，所使用的術語除非另外說明，一般具有本領域的普通技術人員通常理解的含義。特別地，下列術語具有如下的含義本發明所構建的基因工程單鏈三特異抗體是採用基因工程重組的方法構建的，同時具有三種抗原結合特異性的單一抗體分子。具體地，本文所述的抗CEA抗CD3抗CD28單鏈三特異抗體是指將三種抗體片段通過兩種連接肽(FC連接肽和HSA連接肽)(Min Fang，2003)串聯在一起構建而成的單一分子的三特異抗體。可以在該抗體的C端添加c-myc標籤和組氨酸標籤((His)6-tag)(Hengen，1995；Fan et al.，1998)，用於活性檢測和純化，也可以不加。這三種抗體片段可以是單鏈抗體片段(scFvsinglechain fragment of variable region)，抗體Fab片段或單域抗體片段(VH或VL)。更具體地，CEA-TsAb是將抗CEA scFv、抗CD3scFv和抗CD28 VH依次通過FC連接肽和HSA連接肽串聯在一起，再在C端添加c-myc標籤和組氨酸標籤((His)6-tag)構建而成。該抗體具有以下優點1.是基於T細胞活化需要雙信號傳遞途徑的理論基礎之上構建的，具有完全活化T細胞的能力。
2.能夠識別廣譜腫瘤相關抗原CEA，能夠介導CTL細胞特異殺傷多種腫瘤細胞，具有治療多種腫瘤的應用前景。
本文所述的低溫誘導，促進三特異抗體胞內可溶表達的方法是指採用0.4mM的IPTG((異丙基-β-D-半乳糖苷))在30℃誘導大腸桿菌表達三特異抗體。這種方法能夠保證大幅度減少包涵體形成，胞內可溶表達的三特異抗體的比例(佔所有三特異抗體的比例)達到50％以上。使用該方法得到的表達產物不必進行的變性和復性，直接進行純化，有利於提高產率和節約成本。
本文所述的採用DEAE陰離子交換樹脂，一步流穿純化三特異抗體的方法是指在合適的pH值(pH8.0)，將上述胞內可溶表達產物，經過一次DEAE陰離子交換層析，使幾乎所有雜蛋白被吸附在DEAE柱上，而大部分三特異抗體隨流穿液流出，三特異抗體的純度達到75％以上。
本發明的技術方案如下首先構建含有特定多克隆位點的中間載體pTRI。然後從已有的表達載體上採用PCR的方法，擴增出抗CD28單域抗體的編碼DNA片段CD28 VH，同時將其兩端的酶切位點更換為NdeI/KpnI；再從已有的載體上擴增出抗CD3單鏈抗體的編碼DNA片段，同時將其兩端的酶切位點更換為ScaI/SalI；再從已有的載體上切下CEA scFv(XhoI/EcoRI)。最後按照一定的先後順序進行酶切連接和轉化反應即可以構建完成抗CEA抗CD3抗CD28單鏈三特異抗體CEA-TsAb。
將CEA-TsAb/pTRI轉入大腸桿菌BL21(DE3)後，進行IPTG低溫誘導表達，表達產物超聲上清經過一步DEAE陰離子交換後，即可以得到初步純化。採用酶聯免疫吸附反應(ELISA)檢測CEA-TsAb純化產物的抗原結合活性；CEA-TsAb純化產物標記FITC後採用單色流式細胞術(FACS)檢測的腫瘤細胞結合特異性；採用MTT方法檢測CEA-TsAb純化產物介導T淋巴細胞殺傷表達CEA的腫瘤細胞的效果；以及採用倒置顯微鏡記錄上述殺傷過程中腫瘤細胞形態變化；採用MTT方法檢測CEA-TsAb純化產物介導T淋巴細胞殺傷表達CEA的腫瘤細胞的過程中，T細胞的增殖情況；採用PI/annexin-V雙色FACS檢測CEA-TsAb純化產物介導T淋巴細胞殺傷表達CEA的腫瘤細胞，誘導其凋亡的效果，同時使用螢光顯微鏡記錄上述殺傷過程中壞死或凋亡腫瘤細胞的形態。
具體實施例方式
下面結合具體的實施例，並參照附圖進一步詳細地描述本發明。應理解，本說明書中的實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。
實施例1.重疊PCR拼接用於構建三特異抗體表達載體pTRI的多克隆位點DNA片段重疊PCR拼接的流程圖見圖1。用於拼接反應的寡聚核苷酸片段如下1.5』-TAT ACC ATG GGT CTC GAG-3』(SEQ ID NO5)2.5』-TAT ACC ATG GGT CTC GAG ATG TAC CCG CGC GGT AAC ACT AGT GAATTC AAC AGC ACG TA-3』(SEQ ID NO6)3.5』-AGC CAG TCC TGG TGC AGT ACG GTG AGG ACG CTT ACA ACC CGG TACGTG CTG TTG AAT TC-3』(SEQ ID NO7)4.5』-CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAA TAC AAA TGC AAG AGTACT TCT AGA ATG TA-3』(SEQ ID NO8)5.5』-CGA ACC AGC AGC GCA TTC TGG AAG TCG ACG TTA CCG CGC GGG TACATT CTA GAA GTA CT-3』(SEQ ID NO9)6.5』-AAT GCG CTG CTG GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA CCC CAA GTG TCAACT CCA ACT CCT GT-3』(SEQ ID NO10)7.5』-GCG GTA CCG TTA CCG CGC GGG TAC ATC ATA TGT GAG ACC TCT ACAGGA GTT GGA GTT GA-3』(SEQ ID NO11)8.5』-CGC GGT AAC GGT ACC GCG CTG GAA GTT GAC GAA ACC TAC GTT CCGAAA GAA TTT AAC GC-3』(SEQ ID NO12)9.5』-TCG CTA GCC CCA TCC GCG GGA TGT CAG CGT GGA AGG TGA AGG TTTCCG CGT TAA ATT CTT TCG G-3』(SEQ ID NO13)10.5』-ATC GAG CTC ATG TAC CCG CGC GGT AAC GCT AGC GAA CAA AAACTC ATC TCA GAA GAG GA-3』(SEQ ID NO14)11.5』-TA TTG CTC GTG ATG GTG ATG ATG ATG TGC GGC CCC ATT CAGATC CTC TTC TGA GAT GAG-3』(SEQ ID NO15)12.5』-CTC GAC GGA TCC TTA TTG CTC GTG ATG GTG-3』(SEQ ID NO16)操作步驟如下步驟1將片段2-11按照圖1所示及如下的反應條件各自配對重疊延伸，不加引物。得到的反應產物不需要回收，可直接進行下一步反應。
反應條件每個片段各1μl；2μl 10×PCR緩衝液；2μl dNTPs(每種2mmol/ml)(大連寶生物技術公司)；0.3μl Taq(1U)(大連寶生物技術公司)；水14μl。
94℃預變性1分鐘；94℃變性30秒；45℃退火30秒；72℃延伸30秒；進行10個循環。
得到反應產物A(片段2和3配對)、B(片段4和5配對)、C(片段6和7配對)、D(片段8和9配對)和E(片段10和11配對)。
步驟2將反應產物A和B，B和C，C和D，D和E按照圖1所示及如下的反應條件各自配對重疊延伸，不加引物。1％瓊脂糖凝膠電泳回收反應產物。反應產物I(反應產物A和B配對)約180bp，II(反應產物B和C配對)約180bp，III(反應產物C和D配對)約180bp，IV(反應產物D和E配對)約100bp。
反應條件反應產物各10μl，不需要補充其它反應成分，按照下述條件進行反應。
94℃預變性1分鐘；94℃變性30秒；45℃退火30秒；72℃延伸30秒；進行10個循環。
步驟3將反應產物I和II，III和IV按照圖1所示及如下的反應條件分別配對，重疊延伸。1％瓊脂糖凝膠電泳回收反應產物。UP(反應產物I和II配對)約340bp，DOWN(反應產物III和IV)約260bp)反應條件反應產物I和II，III和IV各1μl；2μl 10×PCR緩衝液；2μl dNTPs(每種2mmol/ml)；0.3μl Taq(1U)；13μl水。
94℃預變性1分鐘；94℃變性30秒；72℃延伸50秒；進行25個循環。
步驟4反應產物UP和DOWN配對，重疊延伸，以片段1和12作為引物。
反應條件反應產物UP和DOWN各1μl；引物各1μl；2μl 10×PCR緩衝液；2μl dNTPs(每種2mmol/ml)；0.3μl Taq(1U)；水12μl。
94℃預變性1分鐘；94℃變性30秒；72℃延伸50秒；進行25個循環。得到重疊PCR產物。
最後，重疊PCR產物經1％瓊脂糖電泳鑑定，片段大小為439bp，(見圖2)，表明採用上述方法成功完成了多克隆位點DNA片段的拼接。重疊PCR產物即多克隆位點DNA片段的核苷酸序列、酶切位點及組成見圖3。
實施例2CEA-TsAb的構建具體構建過程參考圖4。在構建過程中使用的各種載體的簡圖見圖5。構建過程具體操作步驟如下(1)載體pTRI的構建將多克隆位點DNA片段和pTMF空載體(Zhang et al.，2002)同時進行NcoI/BamHI雙酶切反應，回收多克隆位點DNA片段的酶切產物和pTMF酶切的大片段產物，連接並轉化TOP10菌株，提取陽性轉化克隆的質粒後經PCR鑑定得到正確的連接產物。將正確連接產物的質粒命名為pTRI，用於下一步操作。
其中所進行的酶切反應、連接反應、細菌感受態製備和轉化反應的具體操作如下酶切反應使用20μl體系，對約1μg pTMF空載體或多克隆位點DNA片段分別進行NcoI/BamHI(Promega公司)雙酶切反應。酶的用量、緩衝溶液以及反應條件參見所用限制性內切酶的說明書。酶切產物經過1％瓊脂糖電泳後，採用膠回收試劑盒(上海華舜公司)回收特異大小的片段，pTMF空載體酶切產物大小約5000bp，多克隆位點DNA片段酶切產物大小約為430bp。
連接反應酶切後的pTMF載體片段50-100ng；酶切後的多克隆位點DNA片段載體的3-10倍(摩爾比)；10×T4 DNA連接酶緩衝溶液2μl；T4 DNA連接酶(大連寶生物公司)1U；補加ddH2O至總體積為20μl。16℃過夜連接。
製備大腸桿菌感受態細胞將TOP10菌株(Invitrogen公司)轉接在2ml LB培養基((10g/l tryptone(GIBCO公司)，5g/l yeast extract(GIBCO公司)，5g/l NaCl，pH7.5))中37℃振蕩培養過夜。按1∶100的比例轉接至20-40ml無抗生素LB培養基中，快速振蕩培養至A600為0.3-0.4時(約2.5小時)停止，冰浴15分鐘，4℃ 4,000rpm離心10分鐘收集菌體，棄上清，加入10ml預冷的0.1mol/ml CaCl2(Sigma公司)，重懸混勻，冰浴20分鐘，4℃4,000rpm離心10分鐘，棄上清後加入預冷的含12％甘油的0.1mol/mlCaCl21~2ml，輕輕懸起菌體，每管200μl，-80℃凍存備用。
連接產物的轉化在200μl感受態細胞中加入1μl上述連接混合物，混勻後冰浴30分鐘，42℃熱激100秒，然後迅速冰浴2分鐘。向冰浴後的混合物中加入0.8ml LB培養基，37℃輕搖(＜150rpm)或靜置45分鐘復甦；10,000rpm離心1分鐘，棄上清，加50～100μl LB培養基重懸沉澱，塗布於LB-K平板(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/l NaCl，15g/l瓊脂(SIGMA公司)，50μg/ml卡那黴素(SIGMA公司)，pH7.5)，37℃培養過夜。
陽性重組克隆的篩選與鑑定挑取卡那黴素篩選陽性的連接產物單克隆，接入2ml LB-K培養基(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/lNaCl，50μg/ml卡那黴素(SIGMA公司)，pH7.5)，37℃振蕩過夜培養，然後按照質粒提取試劑盒(上海華舜公司)的說明書提取質粒DNA，命名為pTRI。按照下述方法進行PCR鑑定。
PCR鑑定在20μl的擴增體系中加入0.1~1μl質粒DNA(約20~200ng)，上遊引物(T7-up5』-TAATACGACTCACTATAGGGG A-3』)(SEQID N017)和下遊引物(T7-down5』-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3』)(SEQID NO18)各10pmol，2μl 10×Taq酶緩衝液和2μl 2mmol/ml的dNTPs，Taq酶1U，補水至總體積20μl。具體反應程序94℃預變性5分鐘後，94℃變性40秒，53℃退火40秒，72℃延伸40秒，擴增25個循環，取5μlPCR產物，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果見圖6，PCR產物大小約為500bp。
(2)CD28 VH/pTRI的構建採用PCR方法從質粒CD28 VH/pTMF(Cheng et al.，2002)上擴增抗CD28 VH的DNA片段，由於所使用的上遊引物(P15』-TCACATATGCA GGTACAGC TACAG-3』)(SEQ ID NO19)和下遊引物(P25』-TTCGCTAGCGGAAGATACGGTA CCA-3』)(SEQ ID NO20)的5』端分別帶有酶切位點NdeI和NheI，因此PCR產物的兩端也會帶上這兩個新的酶切位點。
PCR反應混合物組成引物各1μl，dNTPs 2μl(每種2mmol/ml)，10×pfu緩衝液2μl，質粒CD28 VH/pTMF 1μl(約100ng)，Pfu酶(Promega公司)0.3μl，補ddH2O至20μl。PCR反應條件94℃預變性3分鐘，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸50秒，一共反應25個循環。經1％瓊脂糖凝膠電泳後用膠回收試劑盒(上海華舜公司)回收約350bp的PCR產物。
將該PCR產物與載體pTRI進行NdeI/NheI(Promega公司)雙酶切反應，具體酶切反應條件參照酶供應商的說明書，用膠回收試劑盒回收PCR產物的酶切產物(約350bp)和pTRI酶切大片段產物(約5300bp)，經連接和轉化，具體反應過程參照上述步驟(1)，然後提取卡那黴素抗性陽性克隆進行PCR鑑定，鑑定方法參考上述步驟(1)。結果見圖6，PCR產物大小為750bp左右的克隆為正確連接的質粒，命名為CD28 VH/pTRI，用於下一步操作。
(3)CD3 scFv/CD28 VH/pTRI的構建採用PCR方法從質粒CD3 scFv/pTMF(劉喜富等，1996)上擴增抗CD3 scFv的DNA片段，由於所使用的上遊引物(P15』-AAGAGTACTGAGGTGAAGCTGGTGG-3』)(SEQ ID NO21)和下遊引物(P25』-GAAGTCGACAGCGCGCTTCAGTTCCAG-3』)(SEQ ID NO22)的5『端分別帶有酶切位點ScaI和SalI，因此PCR產物的兩端也會帶上這兩個新的酶切位點。
PCR反應混合物組成引物各1μl，dNTPs 2μl(每種2mmol/ml)，10×pfu緩衝液2μl，質粒CD3 scFv/pTMF 1μl(約100ng)，Pfu酶(Promega公司)0.3μl，補ddH2O至20μl。PCR反應條件94℃預變性3分鐘，94℃變性30秒，55℃復性30秒，72℃延伸50秒，一共反應25個循環。採用1％瓊脂糖凝膠電泳和膠回收試劑盒(上海華舜公司)回收750bp左右的PCR產物。
將該PCR產物與載體CD28 VH/pTRI同時ScaI/SalI(Promega公司)雙酶切反應，具體酶切反應條件參照酶供應商的說明書，用膠回收試劑盒回收PCR產物的酶切產物(750bp左右)和CD28 VH/pTRI酶切大片段產物(5700bp左右)，進一步進行連接和轉化TOP10菌株。具體連接和轉化反應過程參照上述步驟(1)，然後提取卡那黴素抗性陽性克隆進行PCR鑑定。PCR鑑定方法參考上述步驟(1)。鑑定結果見圖6，PCR產物大小為1400bp左右的克隆為正確連接的質粒，保留鑑定陽性的克隆，提取質粒命名為CD3 scFv/CD28 VH/pTRI，用於下一步操作。
(4)CEA-TsAb/pTRI的構建重疊PCR構建抗CEA單鏈抗體將抗CEA單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列(Koga etal.，1990)以一段多肽序列(GGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO23)連接起來，設計成抗CEA單鏈抗體。然後按照大腸桿菌喜好的密碼子表(Nakamuraet al.，2000)將其反向翻譯成一段DNA序列，並進一步拆分成互補的寡聚核苷酸片段(下述序列1-22)，以便於使用重疊PCR技術拼接成全長的抗CEA單鏈抗體DNA片段。以下為用於拼接抗CEA單鏈抗體全基因片段的寡聚核苷酸片段。
1.5』-TTCCTCGAGCAGGTTCAGCT-3』(SEQ ID NO24)2.5』-TCGCGCCCGGTTTCATCAGTTCCGCACCGCTCTGCTGCAGCTGAACCTGCTCGAGGAA-3』(SEQ ID NO25)3.5』-ACTGATGAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAATCAGCTGCAAAGCGACCGGCTATACCTTC-3』(SEQ ID NO26)4.5』-CACCCATTCGATCCAATAATCGCTGAAGGTATAGCCGGTCGCTT-3』(SEQID NO27)5.5』-ATTATTGGATCGAATGGGTGAAACAGCGTCCGGGTCACGGCCTGGAATGGATCGGTGAA-3』(SEQ ID NO28)6.5』-ACGTTCGTTGTAGTCGGTACGGCCGCTGCCCGGCAGGATTTCACCGATCCATTCCAGG-3』(SEQ ID NO29)7.5』-CGTACCGACTACAACGAACGTTTCAAAGGCAAAGCGACCTTCACCGGCGACGTTTCTAGC-3』(SEQ ID NO30)8.5』-TTCGCTGGTCAGGCTAGACAGTTTCATATACGCGGTGTTGCTAGAAACGTCGCCGGTGAA-3』(SEQ ID NO31)9.5』-TGTCTAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTACTGCGCGACCGGCACCACCCCG-3』(SEQ ID NO32)10.5』-GCTCACGGTCACCAGGGTGCCCTGACCCCAGTAACCGAACGGGGTGGTGCCGGTCGCGCA-3』(SEQ ID NO33)11.5』-GCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGACTAGTACCCCGAGCCATAACAGCCATCAGGTGCCG-3』(SEQ ID NO34)12.5』-GTCTCTAGAGCCGCTGTTCGCGGTCGGGCCGCCCGCGCTCGGCACCTGATGGCTGTTAT-3』(SEQ ID NO35)13.5』-CGAACAGCGGCTCTAGAGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGAGCCTGGCGG
TGTC-3』(SEQ ID NO36)14.5』-CTGGGAAGCACGGCAGGAGATGGTCGCACGCTGACCCAGAGACACCGCCAGGCTCGCCGG-3』(SEQ ID NO37)15.5』-TCTCCTGCCGTGCTTCCCAGTCCGTTTCCACCTCCTCCTACACCTACATGCACTGGTAT-3』(SEQ ID NO38)16.5』-GATCAGCAGTTTCGGCGGCTGACCCGGTTTCTGCTGATACCAGTGCATGTAGGTGT-3』(SEQ ID NO39)17.5』-AGCCGCCGAAACTGCTGATCAAATATGCGAGCAACCTGGAATCTGGTGTGCCGGCGCGT-3』(SEQ ID NO40)18.5』-GTTCAGGGTGAAGTCGGTGCCGCTGCCAGAACCGCTGAAACGCGCCGGCACACCAGATT-3』(SEQ ID NO41)19.5』-GCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCGGTGGAAGAAGAAGATACCGCGTATTACTAT-3』(SEQ ID NO42)20.5』-GCCACCGAAGGTACGCGGGATTTCCCAAGAGTGCTGGCAATAGTAATACGCGGTATCTT-3』(SEQ ID NO43)21.5』-TCCCGCGTACCTTCGGTGGCGGCACCAAACTGGAAATCAAAGAATTCGCC-3』(SEQ ID NO44)22.5』-GGCGAATTCTTTGATTTCCAG-3』(SEQ ID NO45)S1)5』-GGCGAATTCTTTGATTTCCAG-3』(SEQ ID NO46)S17)5』-AGCCGCCGAAACTGCTGATC-3』(SEQ ID NO47)S16)5』-GATCAGCAGTTTCGGCGGCT-3』(SEQ ID NO48)S13)5』-CGAACAGCGGCTCTAGAGAC-3』(SEQ ID NO49)S12)5』-GTCTCTAGAGCCGCTGTTCG-3』(SEQ ID NO50)S7)5』-GTACCGACTACAACGAACGT-3』(SEQ ID NO51)S6)5』-ACGTTCGTTGTAGTCGGTAC-3』(SEQ ID NO52)步驟1將片段1-22各自配對重疊延伸，不加引物，反應產物不需要回收，直接進行下一步反應。用於反應的每個片段各1μl(10pmol)；2μl10×PCR緩衝液(500mM KCl，50mM Tris pH8.5，25mM Mg(Cl)2下同)；2μl dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，每種2mM)(購自大連寶生物技術公司，下同)；0.3μl Taq(1U)(購自大連寶生物技術公司，下同)；水14μl。反應條件94℃預變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；10個循環。
得到反應產物A(片段1和2配對)、B(片段3和4配對)、C(片段5和6配對)、D(片段7和8配對)、E(片段9和10配對)，F(片段11和12配對)、G(片段13和14配對)、H(片段15和16配對)、I(片段17和18配對)、J(片段19和20配對)、K(片段21和22配對)。
步驟2將反應產物A和B，D和E，G和H，J和K各自配對重疊延伸，不加引物。用於反應的每種物質各10μl(10pmol)。反應條件94℃預變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；10個循環。經1％瓊脂糖凝膠電泳，採用膠回收試劑盒進行回收反應產物a(A和B配對)、b(C)、c(D和E配對)、d(F)、e(G和H配對)，f(I)和g(J和K配對)。a和g的大小為120bp，c和e的大小約為170bp，b、d和f的大小約為100bp。
步驟3將a與b、c與d、f與g分別配對，單獨使用反應產物e，添加各自引物(s1和s6對應a和b的配對，s7和s12對應c和d的配對，s13和s16對應e，s17和22對應f和g的配對)，進行PCR擴增。用於反應的每種物質各1μl(約100ng)；2μl 10×PCR緩衝液；2μl dNTPs(每種2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq(1U)；補加水至終體積為20μl。反應條件94℃預變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；25個循環。經1％瓊脂糖凝膠電泳，採用膠回收試劑盒進行回收反應產物I(a和b配對)、II(c和d配對)、III(對應於反應產物e)和IV(f和g配對)。反應產物I大小約為200bp，II大小約為250bp，III的大小約為140bp，IV的大小約為230bp。
步驟4將反應產物I與II、III與IV分別配對，添加各自引物(s1和s12對應I和II的配對，s13和22對應III和IV的配對)，進行PCR擴增。用於反應的每種物質各1μl(約100ng)；2μl 10×PCR緩衝液；2μldNTP(2mM each)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq(1U)；水12μl。反應條件94℃預變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；25個循環。得到反應產物UP(I和II配對)和DOWN(III和IV配對)，經1％瓊脂糖凝膠電泳，採用膠回收試劑盒進行回收。UP的大小約為430bp，DOWN的大小約為340bp。
步驟5將反應產物UP和DOWN配對，添加引物(片段s1和片段22)進行PCR擴增。反應產物UP和DOWN各1μl(約100ng)；2μl 10×PCR緩衝液；2μl dNTP(每種2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq(1U)；水12μl。反應條件94℃預變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸1min；25個循環。得到的反應產物WHOLE(約750bp)經1％瓊脂糖凝膠電泳，採用膠回收試劑盒進行回收。
上述操作步驟流程參見圖7，各個步驟的反應產物的PCR鑑定見圖8。
將上述750bp的DNA片段和載體pTMF同時進行XhoI和EcoRI(Promega)雙酶切反應。具體酶切反應條件參照酶供應商的說明書。採用膠回收試劑盒回收PCR產物的酶切產物(750bp左右)和pTMF酶切大片段產物(5200bp左右)，進行連接和轉化TOP10菌株，具體連接和轉化反應過程參照的步驟(1)。然後提取卡那黴素抗性陽性克隆，命名為CEAscFv/pTMF。
將CEA scFv/pTMF與CD3 scFv/CD28 VH/pTRI同時進行XhoI和EcoRI(Promega)雙酶切反應。具體酶切反應條件參照酶供應商的說明書。將750bp左右的CEA scFv/pTMF酶切小片段產物(抗CEA scFv)和CD3scFv/CD28 VH/pTRI的酶切大片段(6000bp左右)產物進行連接和轉化TOP10菌株，具體連接和轉化反應過程參照的步驟(1)。然後提取卡那黴素抗性陽性克隆進行PCR鑑定。PCR鑑定方法參考步驟(1)。鑑定結果見圖6，PCR產物大小為2100bp左右的克隆為正確連接的質粒，命名為CEA-TsAb/pTRI。
實施例3CEA-TsAb的低溫誘導胞內可溶表達(1)將CEA-TsAb/pTRI轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen公司)按照實施例2中所述製備感受態細胞的方法，製備大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞。按照質粒提取試劑盒(上海華舜公司)的說明書提取質粒CEA-TsAb/pTRI，按照實施例2步驟(1)進行轉化實驗，並如實施例2所述進行鑑定。
(2)低溫誘導表達將含有CEA-TsAb/pTRI的BL21(DE3)塗LB-K平板，37℃過夜培養，然後挑取單克隆，接種於5ml LB-K液體培養基中，在大試管內，37℃搖床培養過夜(200轉/分鐘)。次日取過夜培養物按1/100的比例轉接到250ml LB-K液體培養基中，繼續37℃搖床培養(200轉/分鐘)至A600＝0.6，補加IPTG(大連寶生物公司)至終濃度為0.4mmol/ml，繼續在30℃培養4小時，進行低溫誘導表達。室溫12,000rpm離心10分鐘，收集菌體，懸於1/5培養體積的PBS緩衝液中，進行菌體超聲破碎。經過進一步室溫12,000m離心10分鐘後，離心上清組分含有胞內可溶表達的CEA-TsAb；離心沉澱含有以包涵體形式表達的CEA-TsAb，將離心沉澱懸浮在1/5培養體積的PBS中。按照《分子克隆實驗指南》(金冬雁，黎孟楓譯，1996，科學出版社)，採用還原SDS-PAGE電泳和Western blot檢測上述超聲上清和超聲沉澱中CEA-TsAb的表達情況，並使用數字圖象分析儀(美國Alpha Innotech公司，AlphaImage 2200 Documentation analysissystem)確定胞內可溶表達和包涵體表達的相對比例。SDS-PAGE電泳(見圖9)和Western blot(見圖10)的結果表明，採用上述胞內可溶表達的方法，胞內可溶表達的比例達到70％左右。因為超聲上清可以直接用於純化和後續的體外活性實驗，省去了變性和復性的步驟，大大節約生產成本和時間。
實施例4採用DEAE陰離子交換樹脂純化CEA-TsAb將上述250ml的低溫誘導胞內可溶表達產物室溫12,000rpm離心10分鐘，收集菌體並懸於1/5體積(50ml)的DEAE陰離子交換樹脂(發瑪西亞公司)的平衡緩衝液(20mmol/ml NaCl，50mmol/ml Tris-HCl，pH8.0)中，進行超聲破碎。然後室溫12,000rpm離心10分鐘，離心上清直接用於純化。
將20ml DEAE陰離子交換樹脂懸浮在100ml平衡緩衝液中，進行裝柱(上海華美公司)，柱的規格為16mm×20cm；然後使用5個柱體積的平衡緩衝液進行平衡，流速為1ml/分鐘；將上述超聲產物的離心上清直接上柱，上樣流速為0.25ml/分鐘，收集流穿組分，即為純化的CEA-TsAb；收集結束後，使用2個柱體積(約40ml)的洗脫緩衝液(500mmol/ml NaCl，50mmol/ml Tris-HCl，pH8.0)進行洗脫，流速為0.25ml/分鐘；使用2個柱體積(約40ml)0.5mol/L NaOH清洗柱料，2個柱體積(40ml)1mol/LNaCl進行柱的再生，流速為0.5ml/分鐘；最後再使用2個柱體積(40ml)平衡緩衝液平衡柱料，流速為1ml/分鐘用於下一次純化。如果較長時間不使用，必須使用4個柱體積以上的20％乙醇水溶液過柱後，保存在4℃，以免柱料滋生細菌。
上述流穿組分，直接進行還原SDS-PAGE，鑑定純化效果。SDS-PAGE的結果(見圖11)顯示經過一步DEAE陰離子交換純化，可以去除超聲上清中的大部分雜蛋白，使用數字圖象分析儀(美國Alpha Innotech公司，AlphaImage 2200 Documentationanalysis system)確定CEA-TsAb的純度達到70％左右。
上述純化樣品需要對PBS(8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4，用HCl調pH至7.4，定容至1升)透析過夜(4℃)。透析體積為500ml，每隔6個小時換一次透析液。採用Bradford法對透析後的樣品進行蛋白定量，具體操作按照《精編分子生物學實驗指南》(顏子穎，王海林譯，金冬雁校，1999，科學出版社，)進行。定量後的樣品補加NaN3(Sigma公司)至終濃度0.05％(W/V)，作為防腐劑；補加海藻糖(購自中國科學院微生物研究所)至終濃度0.15mol/L，作為穩定劑。然後分裝為1ml/份凍存於-80℃，待用。
實施例5ELISA方法檢測CEA-TsAb的抗原結合活性Jurkat細胞膜抗原的製備收集Jurkat細胞(人急性白血病淋巴瘤細胞)(購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，序號TIB-152)約5×106，1,000g離心10分鐘後，將細胞沉澱懸浮在0.5ml PBS中，進行超聲破碎。將超聲破碎液12,000rpm室溫離心10分鐘後，保留超聲上清，使用Bradford法進行蛋白濃度定量。然後補加NaN3至終濃度0.05％(W/V)，作為防腐劑；補加海藻糖(購自中國科學院微生物研究所)至終濃度0.15mol/L，作為穩定劑。然後分裝為100μl/份凍存於-80℃，待用。
ELISA操作步驟
(1)包被抗原濃度分別為1μg/ml CEA(Fitzerald公司，德國)；1μg/mlCD28-FC chimera(RD公司)；10μg/ml Jurkat細胞膜抗原。包被體積為100μl/孔包被。包被緩衝液配方1.36g Na2CO3，7.35g NaHCO3，950ml水，使用1mol/L HCl或1mol/L的NaOH調pH9.2，補水至1L。PBS 37℃包被2小時或4℃包被過夜。
(2)封閉PBS洗板1-2次後，加入封閉液PBSA(PBS-1％BSA(W/V))，200μl/孔，37℃封閉1-2小時。
(3)加樣PBS洗板三次後，加入純化樣品，100μl/孔，37℃孵育1-2小時。樣品使用方法以10μg/ml的純化CEA-TsAb作為起始濃度，進行倍比稀釋6個梯度，每個梯度三復孔。
(4)加入第一抗體PBST(PBS-0.05％Twen-20(V/V))洗板三次後，以封閉液1/1000稀釋抗cmyc-tag單抗(9E10，購自SANTA CRUTZ公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小時。
(5)加入第二抗體PBST洗板三次後，以封閉液1/1000稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG(購自華美公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小時。
(6)顯色PBST洗板5次後，添加顯色液(48.6ml 0.1M檸檬酸，51.4ml 0.2MNa2HPO4加水至1L，pH5.0，配成底物緩衝液；10ml底物緩衝液中加入4mgOPD即鄰苯二胺(Sigma公司)，15μl 30％H2O2配成顯色液)，100μl/孔，室溫避光顯色15-30分鐘。
(7)終止反應添加終止液(1mol/L HCl)，50μl/孔。
(8)測定結果在490nm讀取吸光值。
ELISA結果(見圖12)顯示，CEA-TsAb與兩種純抗原(CEA和CD28)特異結合。由於Jurkat豐富表達CD3，因此CEA-TsAb與CD3也特異結合。
實施例6FACS(流式細胞術)方法檢測CEA-TsAb與腫瘤細胞的結合活性首先採用間接FACS方法檢測CEA-TsAb對各種腫瘤細胞的結合特異性。所使用的各種腫瘤細胞的腫瘤相關性和組織來源見下表。
名稱腫瘤相關性來源A549肺腺癌ATCCCCL-185MCF-7 乳腺癌ATCCHTB-22SKOV3 卵巢癌ATCCHTB 77SW1116 結腸癌ATCCCCL-233具體操作如下(1)培養、收集上述4種細胞除SW1116細胞外，其餘3種細胞的培養條件均為RPMI-1640液體培養基(GIBCO公司)，10％胎牛血清(黑龍江江海生物工程技術公司)，5％CO2，37℃孵箱培養；SW1116細胞的培養條件L15液體培養基(GIBCO公司)，10％新生牛血清(黑龍江江海生物工程技術公司)，5％CO2，37℃孵箱培養。在細胞生長至對數期後，每種細胞收集5×105個。
(2)將上述各種細胞1,000g離心10分鐘後，使用PBS懸浮細胞，再次1,000g離心10分鐘後，將細胞沉澱懸浮在100μl含有10μg/ml CEA-TsAb的PBS中，4℃放置30分鐘。每種細胞均設立不加抗體的同型對照，該對照以下各步均與待測樣品同樣操作。
(3)1,000g離心10分鐘後，將細胞沉澱懸浮在100μl含有1/1000稀釋抗cmyc-tag抗體(9E10，SANTA CRUTZ公司)的PBS中，繼續4℃放置30分鐘。
(4)1,000g離心10分鐘後，將細胞沉澱懸浮在100μl含有1/1000稀釋FITC偶聯羊抗鼠IgG(BD公司)的PBS中，繼續4℃放置30分鐘。
(5)流式細胞儀(BD公司，FACS Calibur)檢測，激發光為488nm，每次收10,000個細胞。
上述實驗結果(見圖13)顯示，CEA-TsAb與各種腫瘤細胞的結合能力不同與SKOV3、SW1116有較強結合；與A549發生較弱結合；與MCF-7不發生結合。
實施例7FACS(流式細胞術)方法檢測CEA-TsAb與外周血淋巴細胞(PBMC)和Jurkat細胞的結合活性我們還採用直接FACS的方法檢測CEA-TsAb對外周血淋巴細胞(PBMC)(購自北京市輸血中心)和Jurkat細胞的結合活性。具體實驗操作如下(1)將CEA-TsAb標記螢光素FITC(Sigma公司)。螢光標記方法按照《現代免疫學實驗技術》(沈關心周汝麟主編，湖北科學技術出版社出版)所述操作。
(2)採用Ficol方法提取PBMC(外周血淋巴細胞)，並在含有10％新生牛血清的RPMI 1640培養基中，在玻璃細胞培養瓶中，37℃放置過夜，吸附並去除巨噬細胞等粘附細胞。將未吸附的細胞(主要是T淋巴細胞)計數後，收集5×105個細胞，用於FACS檢測。Ficol方法方法《現代免疫學實驗技術》(沈關心 周汝麟 主編，湖北科學技術出版社出版)所述操作。
(3)採用含有10％新生牛血清的RPMI1640培養基，在37℃CO2(5％)培養箱中培養兩種細胞。待細胞生長至對數期後，收集5×105個細胞，用於FACS檢測。
(4)將上述兩種細胞1,000g離心10分鐘後，使用PBS懸浮細胞，再次1,000g離心10分鐘後，將細胞沉澱懸浮在100μl含有10μg/ml FITC標記CEA-TsAb的PBS中，4℃放置30分鐘。每種細胞均設立不加抗體的同型對照，該對照以下各步均與待測樣品同樣操作。
(5)流式細胞儀(BD公司，FACS Calibur)檢測，激發光為488nm，每次收10,000個細胞。
上述實驗結果(見圖14)顯示CEA-TsAb與兩種細胞均能發生特異結合。
綜合CEA-TsAb與腫瘤細胞的結合特異性實驗，CEA-TsAb與PBMC及Jurkat細胞的結合特異性實驗，可以得出結論CEA-TsAb與T淋巴細胞和表達CEA的腫瘤細胞均能發生特異結合作用。
實施例8MTT方法檢測CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷結腸癌細胞SW1116的活性我們以與CEA-TsAb發生特異結合的結腸癌細胞SW1116為靶細胞(Target cells)，以PBMC為效應細胞(Effect cells)，在體外按照一定的效靶比(靶細胞/效應細胞，E/T)混合，同時添加一定濃度的CEA-TsAb，然後在37℃培養48小時，再採用MTT方法測定腫瘤細胞的存活情況。以此檢測CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷結腸癌細胞SW1116的活性。具體操作如下(1)提取收集PBMC，具體操作與實施例7相同。
(2)培養收集SW1116細胞，具體操作與實施例6相同。
(3)使用L15培養基(購自GIBCO公司)調整效應細胞(PBMC)和靶細胞(SW1116)的濃度固定SW1116細胞的密度為1×105個/ml，100l/孔加入到96孔細胞培養板(Nunc公司)中。同時添加不同濃度的PBMC，100l/孔加入到上述細胞培養板中，以分別對應不同的效靶比(分別為1、5、10)。同時使用L15培養基調整CEA-TsAb的濃度5倍濃縮於使用抗體濃度(例如CEA-TsAb使用濃度為1g/ml，那麼濃縮液的濃度應為5g/ml)。將抗體濃縮液以50l/孔加入已經加有效應細胞和靶細胞的96孔細胞培養板中，然後在37℃的CO2(5％)培養箱中，培養48小時。每種樣品均為4復孔。同時每種效靶比均設立不加抗體的陰性對照，單獨效應細胞或靶細胞的陰性對照以及不加任何細胞的培養基陰性對照。
(4)將細胞培養基棄掉後，使用PBS(300l/孔)洗板一次，再加入MTT(Sigma公司)溶液(濃度200l/孔)，37℃孵育4小時後，使用PBS(300l/孔)洗板一次，加入DMSO(二甲基亞碸，200l/孔)(Sigma公司)37℃孵育30分鐘後，測定A600。
(5)特異殺傷率(specific cytolysis)的計算公式為特異殺傷率(％)＝[A600(E/T)-A600(E/T/A)]/[A600(E/T)-A600(M)]×100％A600(E/T)每種效靶比不加抗體的陰性對照孔的A600測定值；A600(E/T/A)每種樣品的A600測定值；A600(M)不加任何細胞的培養基陰性對照的A600測定值。
採用上述方法我們首先比較了不同效靶比(1、5、10)對CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的效率的影響，結果(圖15)顯示，殺傷效率並未隨著效靶比的提高而提高。效靶比為1時，特異殺傷效率最低；效靶比為10時居次；效靶比為5時特異殺傷率最高。最高特異殺傷率達到85％左右。這說明特異殺傷率不僅與效靶比有關，可能還受其他因素的影響。為了進一步研究抗體濃度對特異殺傷率的影響，我們固定效靶比為5，測定特異殺傷率的抗體濃度(0.4ng/ml-12g/ml)依賴曲線。結果(見圖16)發現特異殺傷率的變化分為四個階段階段1在6g/ml-12g/ml之間，特異殺傷率與抗體濃度負相關，在12g/ml時，特異殺傷率達到最高；階段2特異殺傷率與抗體濃度正相關，至750ng/ml時特異殺傷率最低；階段3在24ng/ml-750ng/ml之間，特異殺傷率與抗體濃度負相關，在24ng/ml特異殺傷率最高；階段4特異殺傷率與抗體濃度又出現正相關。從整個過程看，特異殺傷率出現兩個最大值12g/ml時約為85％；24ng/ml時約為70％。該結果表明，在較低的效靶比和極低的抗體濃度下，CEA-TsAb仍然保持高效介導T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的能力。
實施例9CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷SW1116細胞過程的細胞形態觀察我們以與CEA-TsAb發生特異結合的結腸癌細胞SW1116為靶細胞(Target cells)，以PBMC為效應細胞(Effect cells)，在體外按照效靶比(E/T)為5混合，同時添加一定濃度(750ng/ml)的CEA-TsAb，在37℃培養20-40小時，再採用OLYMPUS IMT-2倒置顯微鏡觀察效應細胞殺傷腫瘤細胞的情況並進行顯微照相。使用40×物鏡在第20小時觀察並記錄，結果(圖18)發現CEA-TsAb介導效應細胞殺傷腫瘤細胞的過程可以分為以下四個步驟首先靶細胞逐漸由貼璧變為脫落(圖18B)；然後效應細胞聚集在腫瘤細胞的表面(圖18C)；隨著聚集的效應細胞數目的增加，腫瘤細胞表面開始出現突起(圖18D)；最後，細胞的邊緣越來越模糊，直至細胞完全破碎死亡(圖18E、F、G)。
實施例10CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷SW1116細胞過程中，T淋巴細胞增殖的MTT檢測我們採用MTT方法檢測T細胞的增殖，以此評估在CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷SW1116細胞過程中，T細胞的活化情況，具體操作如下(1)提取收集PBMC，具體操作與實施例7相同。
(2)培養收集SW1116細胞，具體操作與實施例6相同。
(3)使用L15培養基調整SW1116細胞的濃度為106/ml，然後添加絲裂黴素C(終濃度為25g/ml，SIGMA公司)，37℃CO2(5％)孵箱孵育20分鐘後，使用PBS洗3次，除去殘餘的絲裂黴素C備用。
(4)使用L15培養基調整效應細胞和靶細胞的濃度PBMC為5×105個/ml；SW1116為1×105個/ml。混勻後，100l/孔加入到96孔細胞培養板(Nunc公司)中。同時使用L15培養基調整CEA-TsAb的濃度(抗體使用濃度是終濃度的5倍，例如終濃度是1μg/ml，則此步抗體濃度為5μg/ml)，以50l/孔加入到已經加有效應細胞和靶細胞的96孔細胞培養板中，然後在37℃的CO2(5％)培養箱中，培養4天。設立不加抗體的對照，單獨效應細胞或靶細胞的對照以及不加任何細胞的培養基對照。上述檢測樣品均為4復孔。
(5)1,000g離心10分鐘，將細胞培養基上清棄掉，使用PBS(300l/孔)懸浮細胞沉澱，再次1,000g離心10分鐘，棄離心上清，再加入MTT溶液(濃度25g/ml，200l/孔)，37℃孵育4小時後，使用PBS(300l/孔)洗板一次，加入DMSO(二甲基亞碸，200l/孔)並37℃孵育30分鐘後，測定A600。
(6)特異刺激指數(SIspecific index)的計算公式為SI＝[A600(E/T/A)/A600(E/T)]A600(E/T)不加抗體的對照孔的A600測定值；A600(E/T/A)加抗體的樣品孔的A600測定值；如圖17所示，隨著CEA-TsAb的濃度變化，SI的變化分為三個階段階段1抗體濃度在1.5g/ml-12g/ml之間，SI與抗體濃度呈正相關變化，在1.5g/ml達到最低；階段2SI與抗體濃度呈負相關變化，在47ng/ml左右達到最高；階段3在小於47ng/ml時，SI與抗體濃度呈正相關變化，在0.7ng/ml時SI最低。該結果表明在較低的抗體濃度時，CEA-TsAb仍然具有活化T淋巴細胞的能力。將SI的變化規律與腫瘤細胞特異殺傷率的變化規律相比較，我們還發現CEA-TsAb介導T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的效率與T細胞的活化程度直接相關，T細胞活化程度越高，殺傷腫瘤細胞的效率越高。
綜合實施例4、5、6、7、8、9的實驗結果，我們認為在上述殺傷過程中，CEA-TsAb的作用主要體現在兩個方面在腫瘤細胞和效應細胞(T淋巴細胞)之間建立直接聯繫，即發揮導向作用；通過活化聚集在腫瘤細胞周圍的效應細胞，發揮殺傷腫瘤細胞的功能。該作用總結為如圖19所示的機制模型。即當CEA-TsAb應用於人體後，與T淋巴細胞和表達CEA的腫瘤細胞均能發生特異結合作用，結果起到將T淋巴細胞導向至腫瘤細胞的附近的作用。同時CEA-TsAb通過與CD3和CD28發生特異結合活化T細胞。活化的CTL細胞將直接殺傷腫瘤細胞，而活化的TH細胞通過分泌細胞因子(如IL-2、IFN-γ等)，輔助活化CTL、NK細胞等細胞免疫的效應細胞，間接殺傷腫瘤細胞。
實施例11CEA-TsAb介導的T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的殺傷機制的檢測活化的CTL細胞可以通過三種途徑殺傷腫瘤細胞一種途徑是通過分泌穿孔素在腫瘤細胞表面製造微孔，導致細胞破碎而壞死；另外活化的CTL細胞分泌的顆粒酶由上述微孔進入腫瘤細胞內，誘導腫瘤細胞凋亡；還可以通過活化CTL細胞表面誘導表達的FASL與腫瘤細胞表面的FAS相互作用，誘導腫瘤細胞凋亡。為了具體分析CEA-TsAb介導的T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的殺傷機制，我們採用PI(碘化丙錠)和FITC偶聯的Annexin-V(均購自BD公司)標記被殺傷的腫瘤細胞，然後採用螢光顯微鏡和FACS來觀察和檢測腫瘤細胞壞死和凋亡的產生情況和相互比例。具體操作如下(1)提取收集PBMC，具體操作與實施例7相同。
(2)培養收集SW1116細胞，具體操作與實施例6相同。
(3)使用L15培養基調整效應細胞和靶細胞的的濃度PBMC和SW1116均為1×105個/ml。混勻後，1.0ml/孔加入到48孔細胞培養板(Nunc公司)中。同時使用L15培養基調整CEA-TsAb的濃度為5g/ml，250l/孔加入到細胞培養孔內，使CEA-TsAb的使用濃度為1g/ml。在37℃的CO2(5％)培養箱中培養20小時。設立不加抗體的對照，單獨效應細胞以及單獨靶細胞的對照。
(4)將48孔細胞培養板1,000g離心10分鐘後，棄培養基上清，使用0.3％胰酶(Sigma公司)(w/v)消化貼壁細胞1分鐘(50l/孔)，補加10％新生牛血清的RPMI1640(1ml/孔)，將細胞輕輕吹打成細胞懸浮液，轉移到1.5ml離心管中，1,000g離心10分鐘。
(5)使用PBS(500l/管)洗細胞一次，再加入結合緩衝液(購自BD公司)(100l/管)懸浮細胞沉澱，每管補加5l PI溶液(50g/ml)和3lFITC-Annexin-V溶液，4℃避光15分鐘。
(6)每管補加300l結合緩衝液，取少量細胞制細胞壓片，採用Leica DMRA2螢光顯微鏡觀察殺傷的腫瘤細胞的形態和螢光標記狀況。使用QFISH軟體(Leica公司)進行分析。結果如圖20所示。
(7)使用BD FACS Calibur進行雙色螢光檢測(FL1和FL2)。條件共收集20,000個細胞，激發光波長為488nmol/L，。結果如圖21所示圖21顯示了早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞的差別。早期凋亡細胞表面僅有綠色螢光(FITC)，晚期凋亡細胞表面同時存在綠色和紅色(PI)兩種螢光，壞死細胞表面主要是紅色螢光，同時伴有少量綠色螢光。
在圖21的上圖中，四個分區分別代表四種不同狀態的細胞左下區為存活的腫瘤細胞為；右下區為早期凋亡細胞；右上區為晚期凋亡細胞；左上區為壞死細胞。不添加抗體的對照樣品中四種狀態的細胞比例依次為90.17％、1.66％、2.23％、5.94％；添加抗體後，四種狀態的細胞比例依次為52.83％、16.12％、21.25％、9.86％。該結果顯示，在添加CEA-TsAb後，活化的T淋巴細胞通過誘導腫瘤細胞壞死和凋亡發揮殺傷效應；與不加抗體的對照相比，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例均提高了近9倍，壞死細胞的比例提高了一倍。
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SEQUENCE LISTING110北京安波特基因工程技術有限公司120基因工程重組抗CEA抗CD3抗CD28單鏈三特異抗體130I04017916052170PatentIn version 3.12101211251212PRT213人工合成4001Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30
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權利要求
1.一種單鏈三特異抗體，其特徵在於由抗腫瘤相關抗原的抗體、FC連接肽、抗人CD3抗體、HSA連接肽、抗人CD28抗體依次連接而成。
2.權利要求1所述的單鏈三特異抗體，其中所述抗腫瘤相關抗原的抗體、抗人CD3抗體、抗人CD28抗體可以為單鏈抗體片段、抗體Fab片段或單域抗體片段。
3.權利要求1所述的單鏈三特異抗體，其特徵在於所述單鏈三特異抗體的C末端具有c-myc標籤和/或組氨酸標籤。
4.權利要求1所述的單鏈三特異抗體，其中所述腫瘤相關抗原是癌胚抗原。
5.權利要求1所述的單鏈三特異抗體，其是由抗癌胚抗原單鏈抗體、FC連接肽、抗人CD3單鏈抗體、HSA連接肽和抗CD28抗體重鏈片段依次連接構成的CEA-TsAb，具有SEQ ID NO4所示的胺基酸序列。
6.一段DNA序列，其特徵在於編碼權利要求1-5任一項的單鏈三特異抗體。
7.權利要求6的DNA序列，其是編碼權利要求5的單鏈三特異抗體的DNA序列，具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
8.權利要求5的單鏈三特異抗體，其特徵在於所述抗癌胚抗原單鏈抗體具有SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。
9.權利要求5的單鏈三特異抗體，其特徵在於所述抗人CD3單鏈抗體具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列。
10.一種表達載體，其特徵在於含有權利要求6或7的DNA序列。
11.權利要求10的表達載體，其是CEA-TsAb/pTRI。
12.一種宿主細胞，其特徵在於含有權利要求10的表達載體。
13.權利要求12的宿主細胞，其是大腸桿菌。
14.一種促進單鏈三特異抗體胞內可溶表達的方法，其特徵在於將處於對數生長期的含編碼所述單鏈三特異抗體的DNA序列的宿主細胞用IPTG於30℃誘導表達，所述IPTG的終濃度為0.4mmol/ml。
15.權利要求14的方法，其中所述宿主細胞是含權利要求11的CEA-TsAb/pTRI的大腸桿菌BL21。
16.一種純化單鏈三特異抗體的方法，其特徵在於用DEAE陰離子交換樹脂純化用權利要求14的方法獲得的單鏈三特異抗體。
17.一種用於治療或預防腫瘤的藥物組合物，其特徵在於包含權利要求1-5任一項的單鏈三特異抗體和藥用載體。
18.權利要求17的藥物組合物，其中所述腫瘤為表達癌胚抗原的腫瘤。
19.權利要求1-5任一項的單鏈三特異抗體在製備用於治療或預防腫瘤的藥物中的應用。
20.權利要求19的應用，其中所述腫瘤為表達癌胚抗原的腫瘤。
全文摘要
本發明涉及一種重組單鏈三特異抗體，其特徵在於由抗腫瘤相關抗原的抗體、FC連接肽、抗人CD3抗體、HSA連接肽、抗人CD28抗體依次連接而成。更具體地，本發明涉及抗CEA、抗CD3、抗CD28的重組單鏈三特異抗體CEA－TsAb，該抗體是將三種抗體片段(抗CEA單鏈抗體、抗CD3單鏈抗體和抗CD28單域抗體)通過兩種連接肽(FC連接肽和HSA連接肽)串聯在一起構建而成，並可在其C端添加c－myc標籤和組氨酸標籤((His)
文檔編號A61P35/00GK1563092SQ200410032158
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月1日 優先權日2004年4月1日
發明者王祥斌, 黃華樑, 趙寶峰, 趙琦, 樸錦華, 林晴 申請人:北京安波特基因工程技術有限公司