琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHi’s)的製作方法
2023-04-29 14:14:16
本發明涉及琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽，其通過抑制琥珀酸的累積而用於治療或預防再灌注損傷，其中所述抑制劑或其前藥和/或藥用鹽是琥珀酸脫氫酶的可透過細胞的可逆抑制劑。
發明背景
已知琥珀酸在厭氧條件下累積。例如，可以觀察到潛水動物，腫瘤中心的缺氧區，和某些寄生蟲顯示在缺氧條件下的升高的琥珀酸。然而，這些研究的背景典型地是在嘗試殺死細胞或從研究的系統中阻止或去除細胞。然而，這些系統並非始終與缺氧下哺乳動物細胞經歷的情況類似。例如，在細菌中，參與琥珀酸代謝的兩種酶活性存在於兩種分開的酶中[而非在哺乳動物細胞中相同的單個酶琥珀酸脫氫酶(SDH)中]。
已經在某些體外系統中研究琥珀酸。可能的是，在某些體外系統中已經觀察到通過琥珀酸的活性氧類別(ROS)生成。然而，這些觀察大多數被認為是體外奇異現象而不是體內可能狀況的真實反映。
對於氧傳感應用已經研究了琥珀酸。在現有技術中已經嘗試阻斷琥珀酸以便努力獲得抗炎效果。
在現有技術中沒有已知的實驗關聯將體內琥珀酸累積和在再灌注後琥珀酸氧化導致的線粒體複合物I造成的ROS生產聯繫起來。
Hu等，Journal of Huazhong University of Science and Technology(華中科技大學期刊)，Medical Sciences(醫學)，第25卷，2005，第439-441頁和Hirata等，Transplantation(移植)，第71卷，2001，第352-359頁兩者都顯示了：使用3-硝基丙酸化學預處理(preconditioning)減少了大鼠中的缺血-再灌注損傷。化合物3-硝基丙酸是線粒體複合物II的抑制劑。Woitovich等，Basic Research in Cardiology(心臟基礎研究)，第104卷，2009，第121-129頁已經報導了複合物II抑制劑atpennin A5通過mKATP通道依賴性機制保護心臟免受模擬的缺血-再灌注損傷。然而，諸如3-硝基丙酸和atpennin A5的抑制劑具有的缺點是它們是不可逆的。因此，結合這些不可逆抑制劑的任何複合物II被永久阻止實施其正常功能。
Drose等，Molecular Pharmacology(分子藥理學)，第79卷，2011，第814-822頁研究了幾種保護心臟的複合物II抑制劑，包括2-噻吩甲醯三氟丙酮(TTFA)，3-硝基丙酸，atpennin A5和丙二酸。在測試的抑制劑中，丙二酸要求最高的濃度(毫摩爾水平)，以實現半最大抑制，相比之下atepennin A5要求納摩爾水平。另外，丙二酸具有不能透過細胞的缺點。其他抑制劑TTFA、3-硝基丙酸和atpennin A5具有的缺點是它們是不可逆的。
丙二酸二甲酯是已知的化合物。丙二酸及其衍生物是用作聚合物形成的原料的工業化合物。關於使用丙二酸衍生物(如丙二酸二甲酯)作為SDH抑制劑的前藥，現有技術中沒有已知的教導。前藥丙二酸二甲酯將在體內水解為丙二酸，其為SDH的抑制劑。
本發明尋求克服與現有技術相關的問題。
發明概述
本發明人進行了廣泛的代謝組學研究以鑑定在缺血過程中累積的代謝物。作為仔細對照研究的一部分，該代謝組學分析在廣泛範圍的組織類型中平行進行。觀察到許多代謝物在缺血條件下在不同組織中變化。然而，儘管這一發現，但是發明人堅持他們的分析並且僅選擇在所有研究範圍的組織中被相似影響的那些代謝物。由此，發明人能夠巧妙地選擇更可能對於缺血效應而言共同的代謝物。
另外，發明人進一步分析再灌注對於分析物的影響。這允許發明人僅選擇在缺血期間在各種組織類型中表現類似累積的三種代謝物(次黃嘌呤，黃嘌呤和琥珀酸)。最令人意外的是，發明人發現在這三者中，僅琥珀酸可以貌似在再灌注後的活性氧類別的生成中發揮作用。本發明正是基於這些引人注目的見解，其將琥珀酸挑選出來，因為在缺血過程中累積，被快速代謝並參與再灌注後活性氧類別的生成。
對於發明人意外的是，琥珀酸在再灌注之後消失的如此快。還出人意料的是發現琥珀酸是在常氧條件下代謝功能恢復後活性氧類別的來源。另一個意外是多個器官共享相同的代謝特徵，證明琥珀酸代謝是哺乳動物細胞對缺血情形的應答中廣泛適用的現象。
因此，在一方面，本發明提供琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽，其通過抑制琥珀酸的累積而用於治療或預防再灌注損傷，其中所述抑制劑或其前藥和/或藥用鹽是琥珀酸脫氫酶的可透過細胞的可逆抑制劑。
在另一方面，本發明提供一種治療或預防受試者中的再灌注損傷的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽，其中所述抑制劑或其前藥和/或藥用鹽是琥珀酸脫氫酶的可透過細胞的可逆抑制劑。
在另一方面，本發明提供琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽，其用於治療或預防再灌注損傷，其中所述抑制劑或其前藥和/或藥用鹽是琥珀酸脫氫酶的可透過細胞的可逆抑制劑。
在另一方面，本發明提供琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽，其通過抑制琥珀酸的累積而用於治療或預防再灌注損傷，其中所述抑制劑或其前藥和/或藥用鹽是琥珀酸脫氫酶的可透過細胞的可逆抑制劑。
定義
C1-12烷基：是指直鏈和支鏈飽和烴基，通常具有1-12個碳原子。烷基的實例包括甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基，戊-1-基，戊-2-基，戊-3-基，3-甲基丁-1-基，3-甲基丁-2-基，2-甲基丁-2-基，2，2，2-三甲基乙-1-基，正己基，正辛基，正壬基，正癸基，正十一烷基，正十二烷基等。
「藥物」，「藥物物質」，「活性藥物成分」等是指可以用於治療需要治療的受試者的化合物(例如式(I)的化合物和以下具體命名的化合物)。
「賦形劑」是指可以影響藥物的生物利用度、但是另一方面沒有藥理學活性的任何物質。
「藥用的」物質是指落入合理醫學判斷範圍內的那些物質，其適合用於與受試者組織接觸而沒有過度毒性、刺激性、變態反應等，與合理的收益/風險比相稱，並且有效用於它們的意欲用途。
「藥物組合物」是指一種或多種藥物物質和一種或多種賦形劑的組合。
本文所用的術語「受試者」是指人或非人哺乳動物。非人哺乳動物的實例包括家畜，如綿羊、馬、牛、豬、山羊、兔和鹿；和陪伴動物，如貓、狗、嚙齒類和馬。
藥物的「治療有效量」是指有效治療受試者和由此提供所需治療、緩解、抑制或預防效果的藥物或組合物的量。治療有效量可取決於受試者的重量和年齡以及給藥途徑等等。
「治療」是指逆轉、緩解、抑制該術語應用的病症、疾病或病況的進展或者預防該病症、疾病或病況，或者逆轉、緩解、抑制該病症、疾病或病況的一種或多種症狀的進展或者預防該病症、疾病或病況的一種或多種症狀。
「治療(Treatment)」是指「治療(treating)」的行為，如以上剛剛定義的。
「預防」是指降低患上給定疾病或病症的風險，即導致臨床症狀不發展。因此，「預防」是指預防性治療需要其的受試者。預防性治療可以通過向受試者施用適當劑量的治療劑來實現，所述受試者具有對病症的易感性或者處在發展病症的風險中，儘管該病症的症狀還不存在或是最小的，由此實質性地避免該病症的發作。
術語「前藥」是指在施用於受試者之後在體內(優選在血液中)進行結構改變(如水解)以產生SDHi或其鹽的化合物。例如，已知各種從具有羧酸、氨基、羥基等的藥物化合物生產前藥的方法，並且本領域技術人員能夠選擇適當的方式。不特別限制SDHi或其鹽的前藥的類型。例如，當SDHi具有一個或多個羧酸時，實例包括其中一個或多個所述羧酸被轉化為酯的前藥。優選的實例包括酯化合物，如甲酯或二甲酯(diemethyl ester)。
「琥珀酸脫氫酶抑制劑」或「SDHi」是指抑制琥珀酸脫氫酶的作用的化合物。
如本文所用，術語「包含(comprising)」是指「至少部分由...組成」。當在本說明書中解釋包括術語「包含」的每個陳述時，也可以存在除了由該術語作為開始的那個或那些以外的特徵。相關術語如「包含(comprise)」和「包含(comprises)」意欲以相同方式解釋。
琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHi’s)或其前藥
SDHi或其前藥和/或藥用鹽通過抑制琥珀酸的累積用於治療或預防再灌注損傷。因此，與不施用SDHi或其前藥和/或藥用鹽的情況下在再灌注處觀察到的琥珀酸的量相比，通過降低組織中再灌注處觀察到的琥珀酸的量，施用SDHi或其前藥和/或藥用鹽治療或預防受試者組織中的再灌注損傷，如心肌缺血。
SDHi是SDH的可逆抑制劑。SDHi的可逆性是重要的，因為這允許該抑制劑隨時間過去通過競爭性結合從線粒體複合物上去除，由此其作用將是暫時的。結果，複合物將恢復行使其正常功能。
對於通過琥珀酸位點作用的SDHi，可以通過測量和比較以下的梗死大小來確定SDHi的可逆性：(1)用SDHi處理的心臟；(2)未處理的心臟；和(3)用SDHi+琥珀酸二甲酯處理的心臟。如果與未處理的心臟相比，在用SDHi處理的心臟中梗死大小減小，則顯示心臟保護。如果通過加回琥珀酸二甲酯而抑制用SDHi處理的心臟顯示的心臟保護，則證明SDHi的可逆性。該方法在實施例中討論，實施例使用氯化三苯基四唑鎓染色來確定心臟的梗死大小(還參見附圖4b&c)。
SDHi的功效可以通過確定SDHi防止缺血期間琥珀酸累積的能力來評估。SDHi防止缺血期間琥珀酸累積的能力可以如下確定：通過液相色譜法/質譜法(LC/MS)測量組織中琥珀酸水平，如實施例中代謝組學分析中詳述的。通過比較用SDHi處理後的琥珀酸水平和用SDHi+琥珀酸二甲酯處理後的琥珀酸水平，可以顯示SDHi的可逆性。
SDHi或其前藥和/或藥用鹽是膜可滲透的。該膜可透性使得化合物能夠進入細胞並累積。
在細胞實驗中可以通過測量氧消耗率(OCR)和通過用琥珀酸二甲酯驅動其和然後加入SDHi或其前藥和/或藥用鹽(如丙二酸二甲酯)抑制其來測定膜可透性，由此可以評估SDHi或其前藥和/或藥用鹽的功效以及攝取和水解的時間表。另外，如圖5a中所示，通過比較未處理細胞中化合物的水平和處理的細胞中化合物的水平，可以確定化合物的細胞可透性。典型地，使用LC/MS可以確定化合物的水平，如實施例中代謝組學分析中詳述的。
更適當地，SDHi或其前藥和/或藥用鹽是SDHi的前藥或其藥用鹽。
更適當地，SDHi或其前藥和/或藥用鹽是前藥。
適當地，SDHi結合SDH。
適當地，SDHi或其前藥和/或藥用鹽具有通式(I)：
其中：
n是0或1；
R1選自C1-12烷基；
R2選自H和OH；
R3選自CO2R4，和C(O)-CO2R4；並且
R4選自C1-12烷基。
適當地琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽選自R1O2C-CH2-CO2R4，R1O2C-CH(OH)-CH2-CO2R4，R1O2C-CH2-C(O)-CO2R4。
更適當地琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽選自R1O2C-CH2-CO2R4，其中R1和R4獨立地選自甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，仲丁基，叔丁基。
最適當地SDHi或其前藥和/或藥用鹽是丙二酸類(malonate)化合物。
適當地SDHi或其前藥和/或藥用鹽可以包含可透過細胞的丙二酸類。
適當地本發明的丙二酸類SDHi或其前藥和/或藥用鹽是丙二酸乙酯。
最適當地琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽是丙二酸二甲酯。
丙二酸二甲酯是有利的，因為其具有極低的毒性。例如，當口服施用時，丙二酸二甲酯的LD50大約是5gms/kg。
適當地，SDHi與SDH的結合是在琥珀酸結合位點。適當地，這是與琥珀酸的競爭性結合。
適當地，在琥珀酸結合位點結合SDH的SDHi或其前藥和/或藥用鹽選自R1O2C-CH2-CO2R4，R1O2C-CH(OH)-CH2-CO2R4和R1O2C-CH2-C(O)-CO2R4。
適當地，SDHi在泛醌結合位點結合SDH。適當地，該結合是與醌的競爭性結合。
更適當地，用於本發明的SDHis抑制常氧條件下的琥珀酸的再氧化。
適當地，本發明的SDHi是「複合物II」抑制劑。
本發明的SDHi是可逆抑制劑。
適當地，本發明的SDHi是可逆SDHi。
R1
適當地R1選自甲基，乙基，丙基，丁基，戊基和己基。
更適當地R1選自甲基和乙基。
R2
適當地R2是H。
R3
適當地R3是CO2R4。
R4
適當地R4選自甲基，乙基，丙基，丁基，戊基和己基。
更適當地R4選自甲基和乙基。
給藥和時間安排
適當地將SDHi或其前藥和/或藥用鹽口服、局部、皮下、腸胃外、肌內、動脈內和/或靜脈內給藥。
更適當地，將SDHi或其前藥和/或藥用鹽靜脈內施用。
可以通過直接注射到冠狀動脈來施用SDHi或其前藥和/或藥用鹽。
適當地，在缺血前施用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。在這些情況中，將SDHi或其前藥和/或藥用鹽施用於處於缺血風險中的受試者。
適當地，在缺血後施用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。
適當地，在再灌注之前施用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。
適當地，在再灌注開始後儘可能快地施用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。
適當地，在再灌注開始五分鐘內施用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。適當地，在再灌注開始四分鐘內；在再灌注開始三分鐘內；在再灌注開始兩分鐘內；或在再灌注開始一分鐘內，施用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。
適當地，在外科手術之前施用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。
適當地，在外科手術期間施用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。
適當地，在缺血前將本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽施用於意欲保存的器官。
適當地，在缺血後儘可能快地將本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽施用於待保存的器官。
適當地，在再灌注後儘可能快地將本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽施用於待保存的器官。
適當地，在再灌注五分鐘內將本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽施用於待保存的器官。適當地，在再灌注開始四分鐘內；在再灌注開始三分鐘內；在再灌注開始兩分鐘內；或在再灌注開始一分鐘內，施用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。
適當地，在器官移植中應用本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽。
本發明的一個優勢是提供保護性治療。目前市場上沒有批准的保護性化合物。
適當地，本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽在哺乳動物中快速代謝。
丙二酸SDHi’s或其前藥和/或藥用鹽的一個優勢是它們在哺乳動物細胞中被代謝。可透過細胞的丙二酸衍生物被適當地代謝以便一旦在細胞內就釋放丙二酸。丙二酸本身通過細胞內的天然代謝途徑被有利地代謝。更具體地，丙二酸被代謝成哺乳動物細胞中天然存在的脂肪降解途徑的一部分。這提供了以下優勢，即當SDHi或其前藥和/或藥用鹽是丙二酸類化合物時，本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽的代謝沒有副作用或副產物。
適當地琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽可以以0.1-50mg/kg受試者/min的劑量施用1-30分鐘。更適當地，琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽可以以0.5-20mg/kg受試者/min的劑量施用1-30分鐘。更適當地，琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽可以以1-10mg/kg受試者/min的劑量施用1-30分鐘。
發明詳述
從分析的候選代謝物，發明人排除了在不同組織中變化不同的那些。例如，在缺血病症後一些代謝物在一種組織中升高，但在另一種組織中下降。一些代謝物受影響的水平不同。其他代謝物似乎根本不受影響。另外的代謝物似乎不在所有研究的組織類型中受影響。發明人系統地研究數據並去除具有這些不同標準的每一種代謝物以便僅選擇在研究的各種各樣的不同組織的缺血中顯示共同性質的那些代謝物。
本發明基於的一個關鍵發現是在再灌注後琥珀酸快速恢復到正常水平。這例如在附圖1E中闡述，其中可以看到琥珀酸水平在再灌注僅五分鐘內急劇下降至正常。該反應的快速性是引人注目的。這有助於發明人積累的證據，即琥珀酸形成電子貯庫，其在缺血病症期間產生。此外，時機也是特別的，因為其與再灌注施加給組織的損傷的時程精確重疊。正是在發明人觀察到的該同一個五分鐘窗口期間導致大多數損傷，其也完全符合在再灌注後琥珀酸代謝的時程。
應用
適當地，本發明涉及琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽，其通過抑制琥珀酸的累積而用於治療或預防再灌注損傷。
適當地，本發明涉及琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽，其通過抑制琥珀酸轉運而用於治療或預防再灌注損傷。
適當地，本發明涉及琥珀酸脫氫酶抑制劑或其前藥和/或藥用鹽，其通過抑制琥珀酸氧化而用於治療或預防再灌注損傷。
本發明應用於外科手術。
本發明應用於器官保存。
本發明應用於減少或抑制ROS產生。
本發明應用於抑制或防止琥珀酸累積。
本發明應用於延緩再灌注之後ROS的釋放。
本發明應用於所有形式的選擇性外科手術。在本發明的這些應用中，治療可以是預防性的，即防止在再灌注之後產生ROS。
再灌注損傷
適當地，所述再灌注損傷是缺血-再灌注損傷。
適當地，所述再灌注損傷是選自以下的病症的結果：腹主動脈瘤，動脈粥樣硬化，動脈疾病，燒傷，癌症，心臟停搏，腦血管疾病，卒中繼發腦水腫，腦損傷，慢性阻塞性肺病，充血性心臟病，經皮腔內冠狀動脈血管成形術後狹窄，冠心病，糖尿病，高血壓，分娩期間/之後的缺氧，由擠壓傷或外科手術導致的機械性創傷，偏頭痛，心肌梗死，(非致命)溺水，外周血管病，肺血管疾病，再生醫學，心臟手術後再灌注，卒中後再灌注，視網膜血管病，卒中和外科手術組織再灌注損傷。
適當地，所述外科手術組織再灌注損傷可以是肝臟，腎臟或腸外科手術的結果。
外科手術組織再灌注損傷可以是選擇性外科手術操作的結果，其中將器官暴露於缺血時期，包括肝外科手術(當對肝的血液供應被暫時夾緊以允許解剖/部分切除)和腎外科手術(例如，部分切除腫瘤)。
腦損傷的一個常見原因是在外科手術期間的系統性高血壓，導致腦的暫時灌注不足。
更適當地，再灌注損傷是選自以下的病症的結果：腹主動脈瘤，動脈粥樣硬化，動脈疾病，心臟停搏，腦血管疾病，卒中繼發腦水腫，充血性心臟病，經皮腔內冠狀動脈血管成形術後狹窄，冠心病，由擠壓傷或外科手術導致的機械性創傷，心肌梗死，外周血管病，肺血管疾病，心臟手術後再灌注，卒中後再灌注，視網膜血管病，卒中和外科手術組織再灌注損傷。
適當地，外科手術是血管外科手術，心臟搭橋手術(heart bypass surgery)或移植外科手術。
更適當地，再灌注損傷是選自以下的病症的結果：卒中後再灌注，卒中和心肌梗死。
適當地，所述再灌注損傷是在待保存的器官中的再灌注損傷。適當地，待保存的器官可以選自心臟，腸，腎，肝臟，肺，胰腺和皮膚。
可以保存器官用於移植，或者作為細胞和組織來源用於再生醫學(例如，分離幹細胞)。
更適當地，再灌注損傷是再生醫學中的再灌注損傷。再生醫學的未來是基於以下原理：在可能缺氧條件下(冷凍-)保存幹細胞和幹細胞來源的細胞和組織，隨後過繼轉移和/或移植到氧合接受者。
組合
本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽可以與下述治療聯合施用，所述治療用於或意欲去除血流中的阻塞。
本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽可以與以下中的一種或多種組合施用：支架，MitoSNO，血液稀釋劑，溶解劑(lysis agents)，血液保存液，器官保存液或用於或意欲去除血流中的阻塞的任何其他治療。
適當地，血液或器官保存液可以包括結晶狀的和非結晶狀的溶液，包括但不限於鹽水，人白蛋白溶液，Hartmann’s溶液和gelofusin。
MitoSNO可以如WO2008039085中所述製備。
適當地，血液稀釋劑可以選自CoumadinTM(華法林)；PradaxaTM(達比加群)；XareltoTM(利伐沙班)和EliquisTM(阿哌沙班)，磺達肝癸鈉(Fondaparinux)，未分級肝素，低分子量肝素，包括但不限於依諾肝素(enoxaparin)和deltaparin，溶栓劑，包括但不限於鏈激酶(SK)，尿激酶，拉諾替普酶(Lanoteplase)，瑞替普酶(Reteplase)，葡激酶(Staphylokinase)和替奈普酶(Tenecteplase)。
本發明的SDHi或其前藥和/或藥用鹽可以作為藥物組合物施用，所述藥物組合物包含SDHi和藥用賦形劑、載體或稀釋劑。
適當的賦形劑、載體和稀釋劑可以在標準藥學課本中找到。參見例如，Handbook for Pharmaceutical Additives，第3版(編輯M.Ash和I.Ash)，2007(Synapse Information Resources，Inc.，Endicott，New York，USA)和Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版(編輯D.B.Troy)2006(Lippincott，Williams和Wilkins，Philadelphia，USA)，其通過參考結合於此。
用於本發明的組合物中的賦形劑包括但不限於微晶纖維素，檸檬酸鈉，碳酸鈣，磷酸氫鈣和甘氨酸，可以與各種崩解劑以及制粒粘合劑一起使用，所述崩解劑諸如澱粉(並且優選玉米、馬鈴薯或木薯澱粉)，藻酸和某些複合矽酸鹽，所述制粒粘合劑如聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖，明膠和阿拉伯膠。另外，潤滑劑如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和滑石對於壓片目的經常是非常有用的。也可以使用類似類型的固體組合物作為明膠膠囊中的填料；這方面優選的材料還包括乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇。當意欲將水性混懸液和/或酏劑用於口服給藥時，活性成分可以與各種甜味劑或調味劑、著色劑或染料和(如果需要)還有乳化劑和/或懸浮劑以及諸如水、乙醇、丙二醇、甘油的稀釋劑及其各種類似組合進行組合。
藥物載體包括固體稀釋劑或填料，無菌水性介質和各種非毒性有機溶劑等。
藥用載體包括樹膠，澱粉，糖，纖維素材料及其混合物。通過例如皮下移植小丸，可以將化合物施用於受試者。通過靜脈內、動脈內或肌肉內注射液體製劑、口服施用液體或固體製劑或通過局部應用，也可以施用製劑。也可以通過使用直腸栓劑或尿道栓劑完成給藥。
另外，如本文所用的「藥用載體」是本領域技術人員公知的，並且包括但不限於0.01-0.1M和優選0.05M磷酸緩衝液或0.9％鹽水。另外，這些藥用載體可以是水性或非水性溶液，懸浮液，和乳液。非水性溶劑的實例有丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水，醇/水溶液，乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。
藥用腸胃外載體包括氯化鈉溶液，Ringer′s葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸Ringer′s和固定油。靜脈內載體包括流體和營養補充劑，電解質補充劑如基於Ringer′s葡萄糖的那些，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，如例如，抗微生物劑，抗氧化劑，整理劑(collating agents)，惰性氣體等等。
用於根據本發明可施用的控釋或緩釋組合物的藥用載體包括在親脂性貯庫(例如，脂肪酸，蠟，油)中的製劑。本發明還包括用聚合物(例如，泊洛沙姆或poloxamines)和與針對組織特異性受體的抗體、配體或抗原偶聯或與組織特異性受體的配體偶聯的化合物包被的顆粒組合物。
藥用載體包括通過共價連接以下各項而修飾的化合物：水溶性聚合物如聚乙二醇，聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡萄糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸，其已知在靜脈注射後在血液中顯示與相應的未修飾化合物相比顯著更長的半衰期(Abuchowski和Davis，Soluble Polymer-Enzyme Adducts，Enzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts，編輯，Wiley-Interscience，New York，N.Y.，(1981)，pp 367-383；和[65])。這樣的修飾也可以增加化合物在水溶液中的溶解度，消除聚集，增強化合物的物理和化學穩定性，和極大地降低化合物的免疫原性和反應性。結果，通過與未修飾化合物相比以更低頻率或更低劑量施用該聚合物-化合物加合物(abducts)，可以獲得所需的體內生物學活性。
更多具體和優選方面在後附獨立和從屬權利要求中闡述。從屬權利要求的特徵可以與獨立權利要求的特徵適當組合，並且該組合不同於權利要求中明確列出的那些。
異構體，鹽和溶劑化物
某些化合物可以以一種或多種特別的幾何、光學、對映體、非對映體、差向異構體、位阻異構體(atropic)、立體異構體、互變異構體、構象或異頭物(anomeric)形式，包括但不限於順式和反式；E-和Z-型；c-，t-，和r-型；內向型(endo-)和外向(exo)-型；R-，S-，和內消旋型；D-和L-型；d-和1-型；(+)和(-)型；酮式-，烯醇-，和烯醇化物(enolate)-型；順式-和反式；向斜式(synclinal)-和背斜式(anticlinal)-；α-和β-型；軸向(axial)和赤道(equatorial)型；船-，椅-，卷-，包封-，和半椅-型；和它們的組合存在，以下總稱為「異構體」(或「異構型」)。
應當注意，除了以下關於互變異構型討論的，特別從本文所用的術語「異構體」中排除的有結構(或構造)異構體(即，原子之間的連接而不僅僅是原子空間位置不同的異構體)。例如，提到甲氧基，-OCH3，不應解釋為提到其結構異構體，羥甲基，-CH2OH。
對一類結構的提及可以完全包括落入該類別的結構異構形式(例如，C1-67烷基包括正丙基和異丙基；丁基包括正丁基，異丁基，仲丁基，和叔丁基；甲氧基苯基包括鄰-、間-和對-甲氧基苯基)。
上述排除不適用於互變異構形式，例如，酮式，烯醇式和烯醇化物式，如例如在下列互變異構對中：酮/烯醇，亞胺/烯胺，醯胺/亞胺醇，脒/脒，亞硝基/肟，硫酮/烯硫醇(enethiol)，N-亞硝基/羥基偶氮(hyroxyazo)，和硝基/異硝基(aci-nitro)。
注意，術語「異構體」中特別包括具有一個或多個同位素取代的化合物。例如，H可以是任何同位素形式，包括1H，2H(D)，和3H(T)；C可以是任何同位素形式，包括12C，13C，和14C；O可以是任何同位素形式，包括16O和18O；等等。
除非另外指出，對具體化合物的提及包括所有這些異構體形式，包括(完全或部分)外消旋物和它們的其他混合物。
用於製備(例如，不對稱合成)和分離(例如，分級結晶和色譜方法)這些異構體形式的方法或者是本領域已知的，或者是通過以已知的方式改編本文教導的方法或已知方法而容易獲得。
除非另外指出，對具體化合物的提及還包括離子的、互變異構的、鹽的、溶劑化物的、被保護的形式，和它們的組合，例如，如下討論的。
它們的組合的一個實例是對SDHi的提及包括互變異構體的鹽。例如，對化合物蘋果酸二乙酯的提及包括如下所示的烯醇化物形式的鈉鹽：
SDHi’s，其包括以上特別命名的化合物，可以形成藥用複合物，鹽，溶劑化物和水合物。這些鹽包括非毒性酸加成鹽(包括二酸類)和鹼鹽。
如果化合物是陽離子型或者具有可以是陽離子型的官能團(例如-NH2可以是-NH3+)，那麼可以與適當的陰離子形成酸加成鹽。適當的無機陰離子的實例包括但不限於，衍生於以下無機酸的那些：鹽酸，硝酸，亞硝酸，磷酸，硫酸，亞硫酸，氫溴酸，氫碘酸，氫氟酸，磷酸和亞磷酸。適當的有機陰離子的實例包括但不限於，衍生於以下有機酸的那些：2-乙醯氧基苯甲酸，乙酸，抗壞血酸，天冬氨酸，苯甲酸，樟腦磺酸，肉桂酸，檸檬酸，乙二胺四乙酸，乙二磺酸，乙磺酸，富馬酸，葡庚糖酸，葡糖酸，穀氨酸，乙醇酸，羥基馬來酸，羥基萘羧酸，羥基乙磺酸，乳酸，乳糖酸，月桂酸，馬來酸，蘋果酸，甲磺酸，粘酸，油酸，草酸，棕櫚酸，雙羥萘酸，泛酸，苯乙酸，苯磺酸，丙酸，丙酮酸，水楊酸，硬脂酸，琥珀酸，對氨基苯磺酸，酒石酸，甲苯磺酸，和戊酸。適當的聚合物有機陰離子的實例包括但不限於，衍生於以下聚合酸的那些：鞣酸，羧甲基纖維素。這些鹽包括乙酸鹽，己二酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，碳酸氫鹽，碳酸鹽，硫酸氫鹽，硫酸鹽，硼酸鹽，樟腦磺酸鹽，檸檬酸鹽，環己氨基磺酸鹽(cyclamate)，乙二磺酸鹽，乙磺酸鹽，甲酸鹽，富馬酸鹽，葡庚糖酸鹽，葡糖酸鹽，葡糖醛酸鹽，六氟磷酸鹽，海苯酸鹽(hibenzate)，鹽酸鹽/氯化物，氫溴酸鹽/溴化物，氫碘酸鹽/碘化物，羥乙磺酸鹽，乳酸鹽，蘋果酸鹽，馬來酸鹽，丙二酸鹽，甲磺酸鹽，甲基磺酸鹽，萘酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，硝酸鹽，乳清酸鹽，草酸鹽，棕櫚酸鹽，雙羥萘酸鹽，磷酸鹽，磷酸氫鹽，磷酸二氫鹽，焦穀氨酸鹽，糖酸鹽(saccharate)，硬脂酸鹽，琥珀酸鹽，鞣酸鹽，酒石酸鹽，甲苯磺酸鹽，三氟乙酸鹽和昔萘酸鹽(xinofoate)。
例如，如果化合物是陰離子型的，或者具有可以是陰離子型的官能團(例如，-COOH可以是-COO-)，那麼可以與適當的陽離子形成鹼鹽。適當的無機陽離子的實例包括但不限於，金屬陽離子，如鹼金屬或鹼土金屬陽離子，銨和取代的銨陽離子，以及胺。適當的金屬陽離子的實例包括鈉(Na+)鉀(K+)，鎂(Mg2+)，鈣(Ca2+)，鋅(Zn2+)，和鋁(Al3+)。適當的有機陽離子的實例包括但不限於，銨離子(即NH4+)和取代的銨離子(例如NH3R+，NH2R2+，NHR3+，NR4+)。一些適當的取代的銨離子的實例是衍生於以下的那些：乙胺，二乙胺，二環己基胺，三乙胺，丁胺，乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，哌嗪，苯甲胺，苯基苯甲胺，膽鹼，甲葡胺，和緩血酸胺(tromethamine)，以及胺基酸，如賴氨酸和精氨酸。常見季銨離子的實例是N(CH3)4+。適當胺的實例包括精氨酸，N，N′-二苄基乙二胺，氯普魯卡因，膽鹼，二乙胺，二乙醇胺，二環己基胺，乙二胺，甘氨酸，賴氨酸，N-甲基葡糖胺，膽胺，2-氨基-2-羥甲基-丙-1，3-二醇，和普魯卡因。關於有用酸加成鹽和鹼鹽的討論，參見S.M.Berge等.，J.Pharm.Sci.(1977)66：1-19；還參見Stahl和Wermuth，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use(2011)。
可以使用各種方法製備藥用鹽。例如，可以將SDHi與適當的酸或鹼反應以獲得所需鹽。還可以使SDHi化合物的前體與酸或鹼反應來去除酸-或鹼-不穩定的保護基或打開前體的內酯或內醯胺基團。另外，可以通過用適當的酸或鹼處理或者通過與離子交換樹脂接觸，將SDHi化合物的鹽轉化為另一種鹽。在反應後，然後可以通過過濾分離鹽(如果其從溶液中沉澱)或者通過蒸發分離鹽，以回收鹽。鹽的離子化程度可以從完全離子化到幾乎非離子化變化。
可能便利的或理想的是製備、純化和/或處理活性化合物的相應的溶劑化物。術語「溶劑化物」描述了包含化合物和一個或多個藥用溶劑分子(例如，EtOH)的分子複合物。術語「水合物」是其中溶劑為水的溶劑化物。藥用溶劑化物包括其中溶劑可以是同位素取代的那些(例如D2O，丙酮-d6，DMSO-d6)。
當前接受的有機化合物的溶劑化物和水合物的分類系統是在隔離位點(isolated site)、通道和金屬-離子配位溶劑化物和水合物之間進行區分的系統。參見例如K.R.Morris(H.G.Brittain ed.)Polymorphism in Pharmaceutical Solids(1995)。隔離位點溶劑化物和水合物是其中通過插入有機化合物分子而將溶劑(例如，水)分子隔離而不彼此直接接觸。在通道溶劑化物中，溶劑分子位于格子通道中，其中它們緊接其他溶劑分子。在金屬-離子配位溶劑化物中，溶劑分子與金屬離子鍵合。
當溶劑或水被緊密結合時，複合物將具有獨立於溼度的定義明確的化學計量。然而，當溶劑或水被弱結合時，如在通道溶劑化物和在吸溼性化合物中，水或溶劑含量將依賴於溼度和乾燥條件。在這些情形中，將典型地觀察到非化學計量。
更多具體和優選方面在後附獨立和從屬權利要求中闡述。從屬權利要求的特徵可以與獨立權利要求的特徵適當組合，並且該組合不同於權利要求中明確列出的那些。
各種各樣的SDHi’s化合物是可商購的。這些可商購化合物的衍生物可以通過進行官能團相互轉化或進行取代和進行常規反應來製備，如本領域已知的。常見的技術和反應，包括氧化，還原等等，分離技術(萃取，蒸發，沉澱，色譜，過濾，研磨，結晶等)和分析方法是有機化學領域的普通技術人員已知的。這些反應和技術的細節可以在許多專著中找到，包括Richard Larock，Comprehensive Organic Transformations，A Guide to Functional Group Preparations，第2版(2010)，和Michael B.Smith和他人，Compendium of Organic Synthetic Methods(1974參照以下)編輯的多卷系列。原材料和試劑可以獲自商購來源或者可以使用文獻方法製備。另外，在一些情形中，在不分離或純化情況下(即，原位)可以在隨後步驟中使用反應中間體。
使用保護基可以製備某些化合物，保護基防止在其他反應性位點的不需要的化學反應。保護基也可以用於增強化合物的溶解性或另外改變物理性質。關於保護基策略的討論，用於安裝和去除保護基的材料和方法的描述，和用於常見官能團(包括胺，羧酸，醇，酮，醛等)的有用保護基的彙編，參見T.W.Greene和P.G.Wuts，Protecting Groups in Organic Chemistry，第4版，(2006)和P.Kocienski，Protective Groups，第3版(2005)。
通常，可以使用基本上化學計量的量的反應試劑進行化學轉化，但是某些反應可以受益於使用過量的一種或多種反應試劑。此外，可以在大約室溫(RT)和環境壓力下進行許多適當反應，但是取決於反應動力學，產率等，一些反應可以在升高的壓力下進行或者採用較高溫度(例如，回流條件)或較低溫度(例如，-78℃.至0℃.)。在本公開中對於化學計量範圍、溫度範圍、pH範圍等的任何提及，無論是否明確使用措詞「範圍」，也包括所示端點。
附圖簡述
參考附圖，現在將進一步描述本發明的實施方案，其中：
圖1：比較代謝組學鑑定琥珀酸為潛在的驅動再灌注ROS產生的線粒體代謝物。(a)用於鑑定在缺血條件下在體內累積的代謝物的比較代謝組學策略的概述。
圖1：(b)在所有缺血組織中在體內顯著累積的代謝物的HIVE圖表比較分析。突出在所有組織中普遍累積的代謝物。
圖1：(c)在缺血期間在鼠組織中代謝物累積的普遍性。
圖1：(d)在五種缺血組織情況下在缺血後線粒體檸檬酸循環(CAC)代謝物水平的曲線。每種組織，每組n＝3-4隻小鼠。
圖1：(e)在心肌缺血和再灌注5分鐘期間在離體心臟中CAC代謝物水平的時程。每組n＝4個小鼠心臟。
圖1：(f)在缺血後和在5分鐘再灌注後，在處於風險中的和外周心臟組織中體內心肌IR期間的CAC代謝物水平。每組n＝3-5隻小鼠。
圖1：(g)緊接著在缺血後和在5min再灌注後，在體內腦IR期間的CAC代謝物水平。每組n＝3隻大鼠。
圖1：(h)緊接著在缺血後和在5min再灌注後，在體內腎IR期間的CAC代謝物水平。每組n＝3隻小鼠。
圖1：(i)在成年原代心肌細胞中通過二氫乙錠(DHE)氧化評估在IR期間琥珀酸對於ROS生產的影響。每組n＝3種獨立的心肌細胞製備物。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。數據顯示為至少三個重複的平均值±s.e.m。
圖2：通過還原富馬酸，反向SDH活性驅動缺血性琥珀酸累積，所述富馬酸是通過蘋果酸-天冬氨酸穿梭作用和嘌呤核苷酸循環產生的。(a)對於琥珀酸-定向的缺血通量的潛在輸入。
圖2：(b)13C-葡萄糖代謝標記策略。
圖2：(c)在常氧和缺血心肌中琥珀酸的13C同位素標記曲線。每組n＝4個心臟。
圖2：(d)在缺血心肌中氨己烯酸分流的γ-氨基丁酸(GABA)的抑制對於GABA和琥珀酸水平的影響。每組n＝3個心臟。
圖2：(e)通過反向SDH操作驅動的缺血性琥珀酸累積的潛在驅動者的計算機(in silico)代謝建模總結；和13C-天冬氨酸代謝物標記策略，以確定蘋果酸-和腺苷醯(adenylo)-琥珀酸關聯途徑對於缺血性琥珀酸累積的貢獻。
圖2：(f)在體內缺血心肌中通過丙二酸二甲酯抑制SDH對於琥珀酸累積和CAC代謝物豐度的影響。每組n＝3隻小鼠。
圖2：(g)在常氧和缺血心肌中13C-天冬氨酸與所示CAC代謝物的相對缺血通量。每組n＝4個心臟。
圖2：(h)通過氨基氧乙酸(AOA)-介導的天冬氨酸氨基轉移酶的抑制，阻斷NADH-依賴性的天冬氨酸進入CAC，或通過用AICAR抑制腺苷醯琥珀酸裂解酶來阻斷PNC，對於體內缺血心肌中CAC代謝物豐度的影響。每組n＝3隻小鼠。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。數據顯示為至少三個重複的平均值±s.e.m。
圖3：在成年原代心肌細胞中，在再灌注時缺血性琥珀酸水平控制ROS生產，線粒體膜極化，和NAD(P)H還原態。(a)缺血性琥珀酸水平的操控對於ROS生產的影響，其作為晚期缺血和早期再灌注期間的DHE氧化來測量。每組n＝3個獨立的心肌細胞製備物。
圖3：(b)通過用MitoSNO選擇性抑制，確定在再灌注時線粒體複合體I RET對琥珀酸-驅動的ROS生產的貢獻。每組n＝3個獨立的心肌細胞製備物。
圖3：(c)晚期缺血和早期再灌注期間，缺血性琥珀酸水平的操控對於NAD(P)H氧化的影響。每組n＝3個獨立的心肌細胞製備物。
圖3：(d)使用TMRM螢光，以去猝滅模式(高螢光＝低膜電位)，在晚期缺血(左圖)和早期再灌注(右圖)後，缺血性琥珀酸水平的操控對於線粒體膜電位的影響。
圖3：(e)如通過在再灌注時TMRM猝滅的速率測定，缺血性琥珀酸水平的操控對於在40min缺血後內膜再極化的初始速率的影響。每組n＝3個獨立的心肌細胞製備物。
圖3：(f)在有氧C2C12成肌細胞中，琥珀酸二甲酯和寡黴素(oligomycin)對於線粒體ROS的影響。用寡黴素和琥珀酸二甲酯將在常氧溫育下的成肌細胞內的線粒體超極化，並評估MitoSOX氧化的速率以測量線粒體ROS生產。每次試驗10-12個成肌細胞的n＝4次獨立實驗。*p＜0.05，**p＜0.01。數據顯示為至少三個重複的平均值±s.e.m。
圖4：NADH和AMP傳感途徑驅動缺血性琥珀酸累積，以通過線粒體ROS生產控制體內再灌注病理。(a)在缺血期間琥珀酸累積和在再灌注期間通過反向電子傳遞(RET)形成超氧化物的模型。
圖4：(b)在心肌梗死±通過i.v.注射丙二酸二甲酯抑制缺血性琥珀酸累積，或通過i.v.注射丙二酸二甲酯和琥珀酸二甲酯再引入缺血性琥珀酸後，來自小鼠心臟的橫截面的代表性圖像。梗死組織是白色的，有風險的其餘面積是紅色的，並且無風險組織是深藍色的。
圖4：(c)如b所述進行心肌梗死大小的定量。每個空心圓表示來自單只小鼠的數據，並且填充圓表示對於特定情形的所有小鼠的平均值。每組n＝6隻小鼠。
圖4：(d)丙二酸二甲酯針對體內腦IR損傷的保護。在使用或未使用丙二酸二甲酯處理的情況下在進行體內tMCAO後，來自大鼠腦的橫截面的代表性圖像。用蘇木精和曙紅處理腦，以勾畫出梗死組織。定量腦梗死體積。
圖4：(e)和喙尾(rostro-caudal)梗死分布。
圖4：(f)在通過tMCAO體內腦IR損傷後±丙二酸二甲酯。每組n＝3-6隻大鼠。
圖4：(g)在tMCAO±丙二酸二甲酯後大鼠的神經學評分。每組n＝3-6隻小鼠。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。數據顯示為平均值±s.e.m，除了數據是中值±C.I的(g)以外。
圖5：丙二酸二甲酯和琥珀酸二甲酯處理體內細胞，導致丙二酸和琥珀酸的胞內累積。a，體內靜脈內輸注丙二酸二甲酯導致丙二酸在缺血性心肌內的累積。b，C2C12細胞與以下各項溫育：無添加，葡萄糖，5mM琥珀酸二甲酯，5mM丙二酸二甲酯，或5mM丙二酸二甲酯和5mM琥珀酸二甲酯。由於ATP合成導致的細胞氧消耗率和c，最大速率，使用Seahorse XF96分析儀測定。n＝3-4，*，p＜0.05；***，p＜0.001。
圖6：對於琥珀酸-定向缺血性通量的三種潛在代謝輸入的總結。為了理解可以有助於在缺血下琥珀酸生產的代謝途徑，使用通量平衡分析，採用更新版本的心臟代謝iAS253模型來模擬缺血。該模型顯示了生產琥珀酸的三種可能機理：來自由CAC生產的α-酮戊二酸，來源於糖酵解和穀氨醯胺裂解(灰色框)，來自從GABA支路(藍色框)生產的琥珀酸半醛，和來自富馬酸，所述富馬酸是通過逆轉SDH從蘋果酸-天冬氨酸穿梭作用和嘌呤核苷酸循環(紅色框)生產的。
圖7：在缺血和常氧心肌中通過13C葡萄糖的CAC和鄰近(proximal)代謝物的代謝標記。在常氧和缺血性心肌呼吸期間，CAC和鄰近代謝物的比例同位素標記曲線。將小鼠心臟用11mM 13C葡萄糖灌注10min，接著30min無流動缺血或30min常氧呼吸，接著快速冷凍和LC-MS代謝分析。n＝4，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
圖8：在缺血和常氧心肌中，通過13C穀氨醯胺對CAC和鄰近代謝物的代謝標記。在常氧和缺血性心肌呼吸期間，從穀氨醯胺至CAC和鄰近代謝物的同位素通量。將小鼠用4mM 13C穀氨醯胺(+5標記的)灌注達10min，接著30min無流動缺血或30min常氧呼吸，接著快速冷凍和代謝組學分析。(a)每種代謝物的同位素曲線表示為總池(pool)的比例。
圖8：(b，)另外，相對於心臟中+5穀氨醯胺池的比例，確定至αKG的通量。n＝4，*p＜0.05。
圖9：在缺血性心肌中，氨己烯酸抑制GABA轉氨酶對於GABA支路和CAC代謝物的影響。將灌注的小鼠心臟進行30min無流動缺血±在缺血之前連續輸注氨己烯酸(Vig；100，300，和700μM)10min。將心臟組織快速冷凍，和通過LC-MS，相對於常氧水平定量a，GABA和b，琥珀酸豐度。n＝3，*p＜0.05。
圖10：完整的代謝模型，鑑定通過組織缺血可以激活的途徑以驅動琥珀酸累積。為了鑑定在缺血下可以促進琥珀酸生產的代謝途徑，我們使用通量平衡分析，結合擴展版本的中央心臟代謝的iAS253線粒體模型，模擬這些情況。促進琥珀酸累積的主要途徑(粗紅線)是通過富馬酸進料到SDH反向活性。這是通過嘌呤核苷酸循環(PNC)和蘋果酸-天冬氨酸穿梭作用(MAS)(其消耗葡萄糖和天冬氨酸)產生的，並且還導致乳酸和丙氨酸的顯著生產。較少來源的琥珀酸(細紅線)包括糖酵解和穀氨醯胺裂解，但是這是相對較少的，因為該途徑被NADH的過量生成所約束。另外，丙酮酸羧化酶活性產生少量富馬酸。GABA支路並沒有貢獻(黑色虛線)。
圖11：相對於同位素池，比較朝向琥珀酸的13C缺血性代謝物通量。將小鼠心臟用13C-葡萄糖(+6標記的)，13C-穀氨醯胺(+5標記的)，或13C-天冬氨酸(+1標記的)灌注10min，接著30min無流動缺血或30min常氧呼吸，和快速冷凍和代謝組學分析。為了比較來自每個碳源的代謝物通量的相對規模，相對於常氧確定與未標記的琥珀酸池相比摻入琥珀酸的缺血性13C，並且相對於13C-輸注前體的全部標記池表示。數據以線性(左)和對數(右)刻度作圖。
圖12：在缺血期間和在再灌注後，在琥珀酸和OXPHOS代謝途徑中的預測變化。為了確定缺血、再灌注和常氧期間琥珀酸代謝的可能變化，使用通量平衡分析，使用擴展版的iAS253模型，模擬在這些情況中的心臟代謝。模擬預測：(a)在缺血下，複合物II相反運行，通過使用複合物I生產的泛醇將富馬酸還原為琥珀酸，由此用作末端電子受體而不是氧。從嘌呤核苷酸循環(PNC)和反向檸檬酸循環(CAC)生成富馬酸。通過呼吸鏈的其餘部分的通量減少並且由於不充分的ATP生產，從ADP生成AMP。
圖12：(b)隨著氧恢復，複合物II代謝過多的琥珀酸。AMP至ADP再生的延遲，如在再灌注第一分鐘內典型的，限制了通過ATP-合酶的通量。這又防止了複合物III消耗所有由複合物II產生的泛醇，因為膜變得超極化。過量的泛醇和質子通量迫使複合物I反向運行，其將產生ROS。
圖12：(c)一旦琥珀酸通量降低至正常水平，如在從後期再灌注至常氧的過渡中，通過呼吸鏈和檸檬酸循環的通量恢復正常。
圖13：追蹤在原位IR期間在原代心肌細胞中的心肌細胞ROS水平。將原代大鼠心肌細胞進行40min缺血和再氧合，並且通過比例測量二氫乙錠(DHE)氧化，在整個實驗中追蹤ROS水平。缺血緩衝液含有：無添加，4mM丙二酸二甲酯，或4mM琥珀酸二甲酯。顯示每種情形的代表性蹤跡。加亮窗顯示了在圖3.a中詳細放大的實驗期。
圖14：追蹤在原位IR期間原代心肌細胞中NADH還原狀態。將原代大鼠心肌細胞進行40min缺血和再氧合，並且通過測量NAD(P)H自發螢光，在整個實驗中跟蹤NADH還原狀態。缺血緩衝液含有：無添加，4mM丙二酸二甲酯，或4mM琥珀酸二甲酯。顯示每種情形的代表性蹤跡。加亮窗顯示了在圖3c中詳細放大的實驗期。
圖15：追蹤在原位IR期間原代心肌細胞中線粒體膜電位。將原代大鼠心肌細胞進行40min缺血和再氧合，並且通過測量四甲基羅丹明(TMRM)螢光，在整個實驗中跟蹤線粒體膜電位。缺血緩衝液含有：無添加或4mM丙二酸二甲酯。顯示來自至少三個重複實驗的平均蹤跡。(a)在整個實驗中的TMRM信號。
圖15：(b)在從缺血至再氧合的過渡期間的TMRM信號。每組來自獨立地分離的原代大鼠心肌細胞n＝3-4個實驗。
具體實施方式
線粒體ROS生產是缺血-再灌注(IR)損傷的關鍵早期驅動物，並且已經被認為是在再灌注期間功能失調的呼吸鏈與氧相互作用的非特異性後果1-4。發明人研究了替代性的假說：在IR期間的線粒體ROS是通過一種特異代謝過程產生的。為此發明人開發了一種比較代謝組學方法來鑑定在IR期間保守的代謝特徵，其可能指示線粒體ROS的來源(圖1a)。對於進行體內缺血的鼠腦、腎、肝和心臟的基於液相色譜-質譜(LC-MS)的代謝組學分析揭示幾種代謝物的變化。然而，僅三種在所有組織中升高(圖1b，c和表1)。
將暴露於足夠缺血時期以引發再灌注ROS生產的各種鼠組織進行代謝組分析和比較
表1在缺血性促-ROS情況中顯著累積的代謝物的完全比較分析。B＝腦，H＝離體全心臟缺血，HL＝體內LAD缺血，K＝腎，L＝肝
兩種代謝物是缺血性嘌呤核苷酸降解的良好表徵的副產物，黃嘌呤和次黃嘌呤6，支持了我們的方法的有效性。黃嘌呤和次黃嘌呤是通過胞質黃嘌呤氧化還原酶代謝並且不促進線粒體代謝7。第三種代謝物，線粒體檸檬酸循環(CAC)中間體琥珀酸，在測試的組織中(圖1d)增加3-至19-倍，並且是在各種各樣的代謝各異的組織中普遍出現的缺血的唯一線粒體代謝特徵。因此，本發明聚焦於琥珀酸在IR期間在線粒體ROS生產中的潛在作用。
由於在再灌注早期發生線粒體ROS生成1-4，8，9，所以給ROS提供燃料的代謝物應當被快速氧化。引人注目的，在心臟中通過離體5分鐘再灌注，在缺血期間累計的琥珀酸恢復至常氧水平(圖1e)，並且這也在體內心臟、腦和腎中觀察到(圖1f-h)。此外，這些琥珀酸變化局限於體內發生IR損傷的組織區域，並且在缺乏其他CAC代謝物累積的情況下發生(圖1d，f)。為了進一步評估琥珀酸在驅動ROS生產中的作用，發明人將琥珀酸的一種可透過細胞的衍生物，琥珀酸二甲酯(圖5)，施用於缺血性原代心肌細胞8並且發現在再灌注期間這顯著增加線粒體ROS生產(圖1i)。這些數據提示，在缺血期間的琥珀酸累積於是為再灌注後的ROS生產提供燃料。
為了確定負責在缺血期間琥珀酸累積的機制和研究其在IR損傷中的作用，發明人聚焦於心臟，因為可以獲得許多實驗和理論資源。在哺乳動物組織中，琥珀酸可以通過α-酮戊二酸-依賴性CAC通量從丙酮酸或穀氨酸或γ-氨基丁酸(GABA)支路產生，(圖2a和6)10，11。通過測量在用13C-標記的葡萄糖或穀氨醯胺輸注後其同位素體(isotopologue)分布，研究經由α-酮戊二酸的至琥珀酸的缺血性CAC通量，所述13C-標記的葡萄糖或穀氨醯胺分別從丙酮酸和穀氨酸進入CAC。用U-13C-葡萄糖灌注後琥珀酸的13C-同位素體分布在缺血性心臟中顯著降低，指示丙酮酸和α-酮戊二酸-連接的CAC向琥珀酸的通量在缺血期間降低(圖2b，c，和7)。穀氨醯胺並非常氧或缺血中CAC代謝物的主要碳源(圖8a)。此外，在缺血中，觀察到的最少的13C-穀氨醯胺摻入α-酮戊二酸下降，並且用氨己烯酸10抑制GABA支路並不減少缺血性琥珀酸累積(圖2d和9)。因此，在缺血期間琥珀酸的累積並非通過心臟代謝的常規操作導致。
為了研究可以導致缺血期間琥珀酸累積的其他機制，發明人考慮在無氧代謝期間SDH是否可能反向作用來將富馬酸還原為琥珀酸12-14。儘管沒有在缺血性組織中顯示SDH逆轉，但是計算機通量分析確定在缺血期間通過SDH逆轉生產琥珀酸是一個最優方案(圖2e和10)。該方法還提示對SDH的富馬酸供應可以來自兩個收斂途徑：蘋果酸/天冬氨酸穿梭(MAS)，其中高NADH/NAD比率驅動蘋果酸形成，其轉化為富馬酸14-16；和AMP-依賴性的嘌呤核苷酸循環(PNC)的激活，其驅動富馬酸生產17，18(圖2e和10)。為了實驗檢驗該預測，發明人用丙二酸二甲酯(SDH競爭抑制劑丙二酸的一種可透過膜的前體)輸注小鼠(圖5)19，20。出人意料的，丙二酸二甲酯輸注顯著地降低缺血性心肌中的琥珀酸累積(圖2f)。該結果表明，SDH在缺血性心臟中反向運轉，因為以其常規方向運轉的SDH的抑制將具有進一步增加的琥珀酸(圖2a和10)。因此，缺血期間的琥珀酸累積通過逆轉SDH而來自富馬酸還原。
由於天冬氨酸是PNC和MAS途徑兩者的富馬酸的共同來源(圖2e)，所以發明人使用13C-標記的天冬氨酸來評估這些途徑對缺血期間琥珀酸生產的貢獻(圖6和10)。13C-天冬氨酸輸注顯著增加與常氧相比缺血性心肌的13C-琥珀酸含量(圖2g)。事實上，13C-天冬氨酸是在缺血期間顯著摻入琥珀酸中的唯一的13C-供體(圖11)。為了表徵MAS和PNC對缺血性琥珀酸累積的相對貢獻，發明人使用氨基氧乙酸(AOA)(其抑制MAS中的天冬氨酸氨基轉移酶21)(圖2e)和5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-甲醯胺(AICAR)(其抑制PNC中的腺苷醯琥珀酸裂解酶18，22)(圖2e)。兩種抑制劑都降低缺血性琥珀酸水平(圖2h)。因此，這些結果表明，在缺血期間，MAS和PNC途徑兩者都增加富馬酸生產，其然後通過SDH逆轉轉化為琥珀酸。
為了研究構成琥珀酸-驅動線粒體ROS生產的基礎的潛在機理，發明人對於在再灌注後缺血性心臟代謝如何改變進行建模(圖12)。該分析提示，SDH將氧化累積的琥珀酸並且由此通過線粒體複合物I驅動反向電子傳遞(RET)23-26。有趣的是，琥珀酸驅動通過體外RET從複合物I形成廣泛的超氧化物，使得其成為IR期間線粒體ROS的引人注目的潛在來源26。然而，複合物I RET在IR損傷中的作用還未研究過。為了檢驗缺血期間累積的琥珀酸在再灌注後是否可以驅動複合物I RET，發明人在IR損傷的心肌細胞模型中27，用螢光探針二氫乙錠(DHE)追蹤線粒體ROS和從四甲基羅丹明(TMRM)的電位-敏感的螢光追蹤線粒體膜電位。DHE的氧化速率在缺血期間保持穩定，但是在再灌注後快速增加，與增加的超氧化物生產一致(圖3a和13)27。用丙二酸二甲酯抑制SDH-介導的缺血性琥珀酸累積將再灌注後的DHE氧化減少(圖3a)，而在缺血期間用琥珀酸二甲酯進一步增加琥珀酸放大了再灌注DHE氧化，表明琥珀酸水平控制再灌注ROS的程度(圖3b)。重要的是，用MitoSNO選擇性阻斷複合物I RET8消除了在再灌注後琥珀酸二甲酯-驅動的DHE氧化(圖3b)，指示缺血性琥珀酸水平通過複合物I RET驅動過氧化物生產。以下觀察進一步支持琥珀酸-依賴性RET：通過用琥珀酸二甲酯增加琥珀酸水平抑制了在再灌注時的NAD(P)H氧化(圖3c和14)。追蹤線粒體膜電位揭示：抑制缺血性琥珀酸累積減小了再灌注後線粒體極化的速率(圖3d，e和15)，與琥珀酸-依賴性增強的複合物I RET一致。最後，在C2C12小鼠成肌細胞中用琥珀酸二甲酯升高琥珀酸，同時用寡黴素將線粒體超極化，增加了MitoSOX氧化，其與IR無關(圖3f)，提示將高琥珀酸水平與大的質子驅動力組合足以驅動通過RET的複合物I ROS生產。
發明人的發現可以通過以下模型來解釋(圖4a)：在缺血期間，通過活化MAS和PNC，富馬酸生產增加，然後通過SDH逆轉還原為琥珀酸。在再灌注後，累積的琥珀酸被快速氧化，由此維持大的質子驅動力和驅動複合物I處的RET，以產生線粒體ROS，其引發IR損傷26。該模型為IR損傷的迄今許多未聯繫的方面提供了統一的框架，如在缺血期間需要引發以在再灌注後誘導ROS，通過抑制複合物I8和II28和通過輕度解偶聯29保護免受IR損傷。
有趣的，發明人的模型還產生了出人意料的但是可測試的預測。操控缺血期間增加琥珀酸的途徑和在再灌注後將其氧化應當確定IR損傷的程度。由於SDH的可逆抑制阻斷缺血期間的琥珀酸累積(圖2b)及其在再灌注後的氧化兩者，所以它應當保護免受體內IR損傷。在心臟IR損傷的體內模型中，靜脈內(i.v.)輸注丙二酸二甲酯-SDH抑制劑丙二酸的前體-是保護性的(圖4b，c)。重要的是，通過加回琥珀酸二甲酯抑制了該心臟保護(圖4b，c)，指示保護僅僅是通過鈍化琥珀酸累積產生的。最後，在大鼠腦的大腦中動脈短暫性閉塞(tMCAO)-卒中期間腦IR損傷的體內模型-過程中，靜脈內輸注丙二酸二甲酯是保護性的，減少了固縮核的形態和神經氈的空泡化(圖4d)，降低了由IR損傷導致的梗死腦組織的體積(圖4e，f)和防止與卒中相關的神經功能的下降(圖4g和表2)。
表2：進行體內tMCAO IR±丙二酸二甲酯輸注的大鼠的神經學評分的擴展總結。在圖4g中描述的tMCAO IR±丙二酸二甲酯之後三天，中值神經學得分的擴展數據總結。
這些發現證實了發明人的琥珀酸-驅動的IR損傷模型，證明了琥珀酸累積構成了心臟和腦中IR損傷的基礎，並且證實了降低琥珀酸累積和氧化以治療IR損傷的治療方法。
發明人已經證明了經由富馬酸生產和逆轉SDH的琥珀酸的累積是體內缺血的普遍代謝特徵。相應地，琥珀酸是再灌注後線粒體ROS生產的主要驅動物，線粒體ROS生產是各種組織中IR損傷的基礎。琥珀酸的缺血性累積通過其在炎症和缺氧信號轉導10中的作用可能進一步相關。因此，琥珀酸可以通過線粒體ROS促進IR損傷的急性發病和然後在分泌後還引發炎症和新血管生成30。除了闡明了構成IR損傷基礎的代謝反應以外，發明人已經證明了防止缺血期間的琥珀酸累積對於體內IR損傷具有保護作用，因此，提供了病理學(如心臟病發作和卒中)中IR損傷的新的治療靶標。
方法總結
使用熱缺血和/或IR損傷的以下鼠模型：活體外(ex vivo)灌注小鼠心臟的整體(global)缺血；體內小鼠左降冠狀動脈(LAD)結紮術；體內大鼠腦的大腦中動脈短暫性閉塞(tMCAO)；通過單側閉塞腎門的體內小鼠腎缺血；在頸脫位後肝臟的體內整體缺血。如之前所述11，進行缺血性心肌中的代謝途徑的建模。使用的IR損傷的細胞模型是成年分離的原代大鼠心肌細胞和小鼠C2C12成肌細胞細胞系。通過雷射掃描共聚焦顯微鏡評估心肌細胞內的螢光。將DHE螢光用於測量ROS生產，將去猝滅模式的TMRM螢光用於線粒體膜電位，和將NAD(P)H自發螢光用於評估NAD(P)H池的還原電位8。為了評估活體外灌注小鼠心臟中的代謝途徑，將13C-標記的葡萄糖，穀氨醯胺或天冬氨酸輸注到分離的心臟中，然後通過LC-MS定量CAC代謝物的13C同位素體。通過靜脈內輸注代謝抑制劑，接著LC-MS分析組織代謝物，評估代謝抑制劑對於缺血性代謝物累積和13C-標記物的分布的影響。通過LC評估心臟CoQ池的氧化還原態。通過靜脈內施用抑制劑、接著通過氯化三苯基四唑鎓染色測量心臟中的梗死大小和通過測定神經學功能和通過組織學測定梗死大小，評估代謝抑制劑對體內IR損傷的緩解。
實施例
方法
體內小鼠心肌實驗。使用的小鼠是C57BL/6J。
體內小鼠心肌實驗。對於體內心臟IR模型，使用開胸的原位心臟模型31，32。將雄性小鼠(8-10周齡；Charles River Laboratories，UK)用戊巴比妥鈉(70mg/kg，腹膜內(i.p.))麻醉，氣管內插管並以3em H2O呼氣末正壓通氣。使用角膜和屈肌反射來監視麻醉的充分性。將通氣頻率保持在每分鐘110次呼吸，潮汐量為125-150μL。進行胸廓切開術並且通過剝去心包膜而暴露心臟。將左前降支冠狀動脈(LAD)的突出分支用7-0Prolene縫合線圍繞，所述縫合線然後通過小的塑料管。通過將管對著心臟表面收緊，誘導缺血。為了評估體內IR期間的代謝物，將小鼠分成三組：30min缺血，30min缺血+5min再灌注和30min假手術，其中放置縫合線但是沒有封閉LAD。在每個方案結束時，通過比較白色和紅色組織從心臟有風險的和外周區域中摘除組織，並且速凍在液氮中。從假定風險區摘除假手術組織。
在30min的缺血接著120min再灌注後，使用2％氯化三苯基四唑鎓染色評估梗死大小，並表示為風險區域的百分比33。以下列劑量，在缺血之前10min和貫穿缺血過程將無菌鹽水中的代謝抑制劑(全部來自Sigma)通過尾靜脈靜脈內輸註：丙二酸二甲酯(4mg/kg/min)，AOA(50μg/kg/min；Fluorochem)和AICAR 10mg/kg/min)。將琥珀酸二甲酯(8mg/kg/min)與丙二酸二甲酯聯合輸注。用無菌鹽水輸注對照小鼠。總施用體積不超過200μL/小鼠。
用於代謝組分析的活體外Langendorff心臟實驗。將小鼠用肝素處理(200U i.p.)和用戊巴比妥鈉(100mg/kg i.p.)麻醉。然後將胸腔打開並快速摘除心臟和放入pH 7.4的冷Krebs-Henseleit(KH)緩衝液(0.5mM EDTA，118mM NaCl，4.7mM KCl，25mM NaHCO3，11mM葡萄糖，1.2mM MgSO4，1.2mM KH2PO4和2mM CaCl2)。然後用22G鈍針將主動脈插套管，並轉到灌注裝置中。將心臟用37℃ KH緩衝液(95％O2/5％CO2)以80mm Hg的恆壓灌注。在20min平衡後，將心臟分成四組：60min常氧灌注；30min整體缺血；30min整體缺血+5min再灌注；和30min整體缺血+30mins再灌注。在缺血之前通過主動脈插管之上的側面埠以1％的冠脈血流量輸注代謝抑制劑。在實驗結束時，將心臟速凍在液氮中並貯存在-80℃。
在活體外Langendorff心臟實驗中13C代謝物標記。將小鼠用戊巴比妥鈉(～140mg/kg)麻醉。將心臟快速摘除，插套管和在80mm Hg灌注壓力下在37℃用KH緩衝液以等體積Langendorff模式灌注，所述緩衝液連續用95％O2/5％CO2供氣(pH 7.4)34。使用填充流體的球囊評估心臟功能，所述球囊插入左心室(LV)並且連接到壓力傳感器和PowerLabTM系統(ADInstruments，UK)。將球囊體積調整為4-9mm Hg的初始LV舒張壓34並且所有心臟步調為550bpm。從收縮壓(SP)和舒張壓(DP)之間的差異計算左心室形成壓(Left ventricular developed pressure，LVDP)。使用LabChartTM軟體v.7(ADInstruments，UK)連續記錄功能參數(SP，舒張期末壓，心率，LVDP，冠脈血流量，灌注壓)。
在用標準KH緩衝液平衡20min後，將心臟分成以下各組：用含有11mM U-13C葡萄糖的KH緩衝液灌注，接著30min常氧呼吸(n＝4/組)；用含有11mM U-13C葡萄糖的KH緩衝液灌注10min，然後進行30min整體溫度正常的缺血(n＝4/組)；用含有1mM 5-13CL-穀氨醯胺的KH緩衝液灌注10min，接著使用未標記的KH緩衝液進行標準常氧灌注30min(n＝4)；用1mM 13C5L-穀氨醯胺灌注10min，接著30min整體缺血(n＝4)；灌注1mM 1-13C L-天冬氨酸1Omin，接著用未標記KH緩衝液常氧灌注30min；用1mM 1-13C L-天冬氨酸灌注10min，接著30min整體缺血。在結束時，將心臟快速冷凍在液氮中並保存在-80℃。
體內大鼠腦缺血和再灌注。將來自供養在格拉斯哥大學的群落的雄性有自發性高血壓性卒中傾向的(SHRSP)大鼠(270-310g)用氧中的5％異氟烷麻醉，並通過外科手術插氣管並在整個手術中通氣(～2.5％異氟烷/氧)。將體溫保持在37±0.5℃。將動物進行卒中前鑽孔外科手術35，之後短暫性大腦中動脈閉塞(tMCAO，45min)。簡而言之，將矽酮塗層的單絲(Doccol Corporation，USA)推進通過頸總動脈，以阻斷MCA的來源36。在缺血期間，將動物保持在麻醉下。在取出單絲之後立即，或者在5mins的再灌注後，在頸脫位法後摘除腦並從同側的周圍組織上分離梗死組織，並快速冷凍在液氮中用於代謝組學分析。相應的區域獲自對側。在tMCAO之前和期間用丙二酸二甲酯(6mg/kg/min)通過靜脈內輸注10min或載體將另一組輸注，允許恢復3天，期間對它們進行神經學功能評分37，如改進的38。然後通過跨心臟(transcardiac)灌注固定將這些大鼠殺死，並且在蘇木精和曙紅染色後將梗死面積在7個冠向水平上評估39。
體內小鼠腎缺血和再灌注。在異氟烷全身麻醉下，將小鼠進行剖腹手術並暴露雙側腎門。將血管夾(8mm，InterFocus Fine Science Tools，Cambridge，UK)放置在一個腎門上以誘導單側腎缺血。在45min缺血結束時，去除夾子並注意到腎再灌注是腮紅的顏色的恢復和觀察到從腎靜脈流過。在缺血結束時或者在5min再灌注之後取出腎臟，並且快速冷凍在液氮中用於代謝組學分析。
體內小鼠肝臟熱缺血。通過頸脫位法以確保血流中止而殺死小鼠。通過使用恆溫加熱墊，將肝臟組織在37℃原位保持在體腔內達45min，接著摘除和快速冷凍在液氮上用於隨後的代謝組學分析。
代謝組學分析。按照製造商的使用說明，將等量溼重的鼠組織在Precellysis 24小管中在每10mg組織中250μL提取溶液(ES；30％乙腈，50％甲醇和20％水)中裂解。將懸浮液立即離心(16,000g，15min，0℃)並將上清液用於LC-MS分析。對於LC分離，柱A是Sequant Zic-Hilic(150mm×4.6mm，內徑3.5μm)，具有保護柱(20mm×2.1mm 3.5μm)，來自HiChrom，Reading，UK。流動相。A：水中0.1％甲酸(v/v)。B：乙腈中0.1％甲酸(v/v)。流速300μL/min。梯度：0-3min 80％B，25min 20％B，26min 80％B，36min 80％B。柱B是sequant Zic-pHilic(150mm×2.1mm內徑3.5μm)，具有保護柱(20mm×2.1mm內徑3.5μm)，來自HiChrom，Reading，UK。流動相。C：20mM碳酸銨+0.1％氫氧化銨，在水中。D：乙腈。流速100μL/min。梯度：0min 80％D，28min 20％D，29min 80％D，45min 80％D。以完整MS和極性轉換模式操作質譜儀(Thermo QExactive Orbitrap)。將樣品隨機化，以便避免機器漂移(drifts)。使用靶向和非靶向的方法分析光譜。對於靶向方法，通過參照內部化合物文庫，使用XCalibur Qual Browser和XCalibur Quan Browser軟體(Thermo Scientific)分析光譜。對於非靶向方法，使用SieveTM2.0軟體(Thermo Scientific)處理光譜，並且提取光譜峰。光譜陣列然後使用R包裝muma的函數explore.data和univariate進行統計學分析40。
成年大鼠原代心肌細胞的原位缺血和再灌注。將雄性Sprague-Dawley大鼠(300-370g)通過IP注射200mg/kg戊巴比妥鈉和330U/kg肝素，末端麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠(300-370g)。摘除心臟並在Langendorff-灌注系統上用13mL/min氧合的KH緩衝液在37℃逆向灌注。使用標準方法，通過膠原酶消化分離細胞41。簡而言之，將心臟用KH緩衝液灌注5min，然後用含有100μM EGTA的無Ca2+KH緩衝液灌注5min，接著用含有100μM CaCl2和0.5mg/ml膠原酶II(Worthington)的KH緩衝液灌注8min。從套管中摘除心臟並且快速切碎心室並浸浴在20mL的相同膠原酶緩衝液中達15min。將消化的組織通過100μm細胞濾器，並且將細胞通過重力收集。去除上清液，並且將細胞首先用含有0.5mM CaCl2的KH緩衝液洗滌，然後用含有1mM CaCl2的KH緩衝液洗滌。典型的收率是2x 106個細胞/心臟，具有90％活的杆狀細胞。將細胞重懸於培養基199(補充有5mM肌酐，2mM肉鹼，5mM牛磺酸，和100μg/mL青黴素/鏈黴素)中，並鋪平板於包被了層粘連蛋白(Sigma)的蓋玻片。在37℃/5％CO2溫育1h後，洗去未貼壁的細胞，並且將新鮮培養基199加入每個孔中，在37℃/5％CO2至少4小時。
在鋪平板36小時內將細胞成像。成像使用具有Fluar 20x/0.75NA UV物鏡的ZeissTM LSM 510META共聚焦顯微鏡，或裝配有OrcaIM ER冷卻CCD照相機(Hamamatsu)，單色儀(Cairn Research)和發射濾光片輪(Prior)、具有Fluar 20x/0.75NA物鏡的顯微鏡。將貼壁到載玻片(其形成定製的成像室的基底)的細胞與常氧記錄緩衝液(156mM NaCl，3mM KCl，2mM MgSO4，1.25mM K2HPO4，2mM CaCl2，10mM Hepes，10mM D-葡萄糖；pH 7.4)一起放置在顯微鏡上37℃熱臺上。通過用模擬缺血的預先充氣的缺氧記錄緩衝液(如上所述，但是缺少葡萄糖並含有10mM乳酸鈉，14.8mM KCl；pH 6.4)替換所述緩衝液和用透明的氣密蓋子覆蓋所述熱臺，形成其中強加入氬氣以保持缺氧的小室，從而實現模擬缺血。在模擬缺血期間將pO2常規測量為＜2.0mm Hg。為了模擬再灌注，從小室中去除蓋子，並且用常氧記錄緩衝液替換所述緩衝液。
使用四甲基羅丹明，甲酯(TMRM，Life Technologies)以去猝滅(dequench)模式測量線粒體膜電位。以該模式，線粒體去極化導致高濃度的猝滅的TMRM從線粒體再分布至細胞溶質中，其中低濃度導致去猝滅和螢光的增加27。將細胞在室溫裝載含有3μM TMRM的常氧記錄緩衝液達30min。在成像前，去除裝載緩衝液並替之以常氧記錄緩衝液。在543nm激發TMRM螢光，並且使用LP 560濾光片收集發射。
通過DHE的氧化評估ROS生產。對此，將細胞用5μM二氫乙錠(DHE，Invitrogen)裝載，其貫穿整個常氧和缺血性條件保持存在。在351nm激發DHE，並且用BP 435-485 IR濾光片獲得發射的信號。在543nm激發氧化的DHE，並且用LP 560濾光片收集發射。在351nm激發NADH自發螢光，並使用BP 435-485IR濾器收集發射的信號。所有測量的細胞參數使用Fiji圖像處理軟體分析。
在成肌細胞中評估琥珀酸依賴性的線粒體超氧化物生產。將C2C12成肌細胞接種在35mm玻璃底培養皿(MatTek)中並在低葡萄糖(1g/L)DMEM中溫育24h。在成像前2h，去除DMEM，並替之以成像緩衝液(132mM NaCl；10mM HEPES；4.2mM KCl；1mM MgCl21mM CaCl2，用Tris鹼調節至pH 7.4並補充有2-脫氧葡萄糖(25μM)，和丙酮酸鈉(10mg/L或4μM寡黴素，如所示的)。將成肌細胞與2μM MitoSOX預溫育15min，之後成像。使用Nikon Eclipse Ti共聚焦顯微鏡，在37℃在溫度控制臺上監視MitoSOX螢光達30min。將MitoSOX在510nm激發，並且在所示添加後用LP 560濾光片收集激發的信號。
在缺血和再灌注期間代謝通量的計算機分析。
使用擴展版本的心肌線粒體代謝模型iAS25311，進行模擬。通過使用最新版本的MitoMiner(一種線粒體蛋白質組資料庫42)，將該模型擴展以包括另外的線粒體反應。使用MitoMiner，通過將這些數據與來自BRENDA43，HumanCyc44和相關文獻的信息互相參照以證實新反應在人中存在、在人心臟組織中表達和局限於線粒體基質，鑑定包括的新線粒體反應。另外，包括可促進能量生產的細胞溶質反應，如胺基酸降解和轉化反應以及嘌呤核苷酸循環。通過使用Marvin套件的計算化學軟體(ChemAxon Ltd，Budapest，Hungary)，計算模型中的代謝物的質子化狀態。然後根據在pH 8.05對於線粒體基質45和在pH 7.30對於細胞溶質發現的主要細微物質的質子化狀態，將反應進行電荷平衡。另外，基於來自公共資源如BRENDA和HumanCyc的不可逆性、熱動力學和信息的一般規則，施加方向性約束，並且從文獻11中獲得容量限制。最終的模型含有227個線粒體基質反應，76個細胞溶膠反應，在兩個區室之間的91個運輸步驟和代表輸入和輸出系統的84個邊界條件。擴展的模型是線粒體的手工處理的(curated)和高度精煉的模型，並且如同iAS253，不存在代謝物死路並且所有反應能夠具有通量。
為了表示缺血，將最大氧攝取降低至其正常條件下水平的5％(0.99向對19.8μmol/min/g乾重)。為了表示再灌注，將氧水平恢復至其正常水平，並且將琥珀酸、乳酸、丙酮酸和NADH的可利用性增加至各種水平，以反映這些代謝物的缺血性累積。ATP合酶的通量容量被降低至可達50％以表示從AMP產生ADP(ATP合酶行使功能必需)的延遲，以及對線粒體膜的超極化進行建模，實際上是通過限制電子傳遞鏈的其他質子泵複合物的效率。
使用通量平衡分析-一種已經在別處詳細描述的技術46-模擬線粒體網絡的代謝。用於最優化反應通量的目標函數是最大ATP生產。使用帶有COBRA Toolbox47的MATLABTMR2012b(Math Works，Inc，Natick，MA)和線性編程解決者GLPK(http：//www.gnu.org/software/glpk)，進行所有的FBA模擬。
參考文獻
1.Murphy，E.& Steenbergen，C.Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion iniury(構成心臟缺血-再灌注損傷的急性保護的基礎的機理).Physiol.Rev.88，581-609，(2007).
2.Yellon，D.M.& Hausenloy，D.J.Myocardial reperfusion injury(心肌再灌注損傷).N.Engl.J.Med.357，1121-1135，(2007).
3.Burwell，L.S.，Nadtochiy，S.M.& Brookes，P.S.Cardioprotection by metabolic shut-down and gradual wake-up(通過代謝切斷和逐漸喚醒來保護心臟).J.Mol.Cell.Cardiol.46，804-810，(2009).
4.Eltzschig，H.K.& Eckle，T.Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation(缺血和再灌注-從機理到轉化).Nat.Med.17，1391-1401，(2011).
5.Timmers，L.等The innate immune response in reperfused myocardium (在再灌注心肌中的先天免疫應答).Cardiovasc.Res.94，276-283，(2012).
6.Harmsen，E.，de Jong，J.W.& Serruys，P.W.Hypoxanthine production by ischemic heart demonstrated by high pressure liquid chromatography of blood purine nucleosides and oxypurines(通過高壓液相色譜證明的血液嘌呤核苷酸和羥嘌呤的通過缺血心臟的次黃嘌呤生產).Clin.Chim.Acta 115，73-84(1981).
7.Pacher，P.，Nivorozhkin，A.& Szabo，C.Therapeutic effects of xanthine oxidase inhibitors：renaissance half a century after the discovery of allopurinol(黃嘌呤氧化酶抑制劑的治療效果：在發現別嘌呤醇後半個世紀復興).Pharmacol.Revs.58，87-114，(2006).
8.Chouchani，E.T.等Cardioprotection by S-nitrosation of a cysteine switch on mitochondrial complex I(線粒體複合物I上半胱氨酸轉換S-硝基化的心臟保護作用).Nat.Med.19，753-759，(2013).
9.Zweier，J.L.，Flaherty，J.T.& Weisfeldt，M.L.Direct measurement of free radical generation following reperfusion of ischemic myocardium(直接測量在再灌注缺血性心肌後的自由基產生).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，1404-1407(1987).
10.Tannahill，G.M.等Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1beta through HIF-1alpha(琥珀酸是通過HIF-1α誘導IL-1β的炎症信號).Nature 496，238-242，(2013).
11.Smith，A.C.& Robinson，A.J.A metabolic model of the mitochondrion and its use in modelling diseases of the tricarboxylic acid cycle(線粒體的代謝模型及其在三羧酸循環疾病建模中的應用).BMC Syst.Biol.5，102，(2011).
12.Pisarenko，O.I.等On the mechanism of enhanced ATP formation in hypoxic myocardium caused by glutamic acid(關於由穀氨酸導致的缺血心肌中增強的ATP形成的機理).Basic Res.Cardiol.80，126-134(1985).
13.Taegtmeyer，H.Metabolic responses to cardiac hypoxia.Increased production of succinate by rabbit papillary muscles(對於心臟缺血的代謝反應。通過兔乳頭肌增加琥珀酸生產).Circ.Res.43，808-815(1978).
14.Hochachka，P.W.& Storey，K.B.Metabolic consequences of diving in animals and man(潛水在動物和人中的代謝後果).Science 187，613-621(1975).
15.Easlon，E.，Tsang，F.，Skinner，C.，Wang，C.& Lin，S.J.The malate-aspartate NADH shuttle components are novel metabolic longevity regulators required for calorie restriction-mediated life span extension in yeast(蘋果酸-天冬氨酸NADH穿梭組分是酵母中限制熱量介導的壽命延長的新的代謝壽命調節物).Genes Dev.22，931-944，(2008).
16.Barron，J.T.，Gu，L.& Parrillo，J.E.Malate-aspartate shuttle，cytoplasmic NADH redox potential，and energetics in vascular smooth muscle(血管平滑肌中的蘋果酸-天冬氨酸穿梭，細胞質NADH氧化還原電位，和能量).J.Mol.Cell.Cardiol.30，1571-1579，(1998).
17.Van den Berghe，G.，Vincent，M.F.& Jaeken，J.Inborn errors of the purine nucleotide cycle：adenylosuccinase deficiency(嘌呤核苷酸循環的先天性缺陷：腺苷醯琥珀酸酶缺陷).J.Inherit.Metab.Dis.20，193-202(1997).
18.Sridharan，V.等O2-sensing signal cascade：clamping of O2respiration，reduced ATP utilization，and inducible fumarate respiration(O2-傳感信號級聯：O2呼吸的鉗制減少了ATP利用和可誘導的富馬酸呼吸).Amer.J.Physiol.295，C29-37，(2008).
19.Dervartanian，D.V.& Veeger，C.Studies on succinate dehydrogenase.I.spectral properties of the purified enzyme and formation of enzyme-competitive inhibitor complexes(對琥珀酸脫氫酶的研究。I.純化酶的光譜性質和形成酶-競爭性抑制劑複合物).Biochim.Biophys.Acta 92，233-247(1964).
20.Gutman，M.Modulation of mitochondrial succinate dehydrogenase activity，mechanism and function(線粒體琥珀酸脫氫酶活性、機理和功能的調節).Mol.Cell.Biochem.20，41-60(1978).
21.Bunger，R.，Glanert，S.，Sommer，O.& Gerlach，E.Inhibition by(aminooxy)acetate of the malate-aspartate cycle in the isolated working guinea pig heart(在分離的工作豚鼠心臟中通過(氨基氧)乙酸抑制蘋果酸-天冬氨酸循環).Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.361，907-914(1980).
22.Swain，J.L.，Hines，J.J.，Sabina，R.L.，Harbury，O.L.& Holmes，E.W.Disruption of the purine nucleotide cycle by inhibition of adenylosuccinate lyase produces skeletal muscle dysfunction(通過抑制腺苷琥珀酸裂解酶破壞嘌呤核苷酸循環導致骨骼肌功能失調).J.Clin.Invest.74，1422-1427，(1984).
23.Hirst，J.，King，M.S.& Pryde，K.R.The production of reactive oxygen species by complex I(複合物I生產活性氧類別).Biochem.Soc.Trans.36，976-980(2008).
24.Kussmaul，L.& Hirst，J.The mechanism of superoxide production by NADH：ubiquinone oxidoreductase(complex I)from bovine heart mitochondria(NADH產生超氧化物的機理：來自牛心臟線粒體的泛醌氧化還原酶(複合物I)).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103，7607-7612(2006).
25.Pryde，K.R.& Hirst，J.Superoxide is produced by the reduced flavin in mitochondrial complex I：a single，unified mechanism that applies during both forward and reverse electron transfer(在線粒體複合物I中通過還原黃素生產超氧化物).J.Biol.Chem.286，18056-18065，(2011).
26.Murphy，M.P.How mitochondria produce reactive oxygen species(線粒體如何產生活性氧類別).Biochem.J.417，1-13，(2009).
27.Davidson，S.M.，Yellon，D.& Duchen，M.R.Assessing mitochondrial potential，calcium，and redox state in isolated mammalian cells using confocal microscopy(在分離的哺乳動物細胞中使用共聚焦顯微鏡評估線粒體電位、鈣和氧化還原狀態).Methods Mol.Biol.372，421-430，(2007).
28.Wojtovich，A.P.，Smith，C.O.，Haynes，C.M.，Nehrke，K.W.& Brookes，P.S.Physiological consequences of complex II inhibition for aging，disease，and the mKATP channel(複合物II抑制對於衰老、疾病和mKATP通道的生理後果).Biochim.Biophys.Acta 1827，598-611，(2013).
29.Brennan，J.P.等Mitochondrial uncoupling，with low concentration FCCP，induces ROS-dependent cardioprotection independent of KATP channel activation(用低濃度FCCP將線粒體解偶聯誘導獨立於KATP通道活化的ROS-依賴性心臟保護).Cardiovas.Res.72，313-321，(2006).
30.Hamel，D.等G-Protein-coupled receptor 91 and succinate are key contributors in neonatal postcerebral hypoxia-ischemia recovery(G-蛋白偶聯受體91和琥珀酸是新生兒腦缺氧缺血恢復的關鍵貢獻者).Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.34，285-293，(2014).
31.Schmidt，K.等Cardioprotective effects of mineralocorticoid receptor antagonists at reperfusion(鹽皮質激素受體拮抗劑在再灌注中的心臟保護作用).Eur.Heart J.31，1655-1662，(2010).
32.Methner，C.等Protection through postconditioning or a mitochondria-targeted S-nitrosothiol is unaffected by cardiomyocyte-selective ablation of protein kinase G(通過後調解或線粒體靶向的S-亞硝基硫醇的保護不受蛋白激酶G的心肌選擇性消除的影響).Basic Res.Cardiol.108，337，(2013).
33.Nadtochiy，S.M.，Redman，E.，Rahman，I.& Brookes，P.S.Lysine deacetylation in ischaemic preconditioning：the role of SIRT1(缺血預調節中的賴氨酸脫乙醯化：SIRT1的作用).Cardiovasc.Res.89，643-649，(2011).
34.Ashrafian，H.等Fumarate is cardioprotective via activation of the Nrf2 antioxidant pathway(富馬酸是通過活化Nrf2抗氧化途徑來保護心臟的).Cell Metab.15，361-371，(2012).
35.Ord，E.N.J.，Shirley，R.，van Kralingen，J.C.，Graves，A.，McClure，J.D.，Wilkinson，M.，McCabe，C.，Macrae，I.M.& Work，L.M.Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats(卒中前外科手術對於高血壓大鼠中暫時性局灶性缺血後的存活的正面影響).J.Neurosci.Methods 211，305-308，(2012).
36.Koizumi，J.，Yoshida，Y.，Nakazawa，T.& Ooneda，G..Experimental studies of ischemic brain edema：a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area(缺血性腦水腫的實驗研究：大鼠中腦水腫的新實驗模型，其中可以在缺血區域中引入再循環).Jpn.J.Stroke 8，1-8(1986).
37.Hunter，A.J.，等，Functional assessments in mice and rats after focal stroke(在局灶性卒中後小鼠和大鼠中的功能評估).Neuropharmacology.39，806-816，(2000).
38.Ord，E.N.J.等，Combined antiapoptotic and antioxidant approach to acute neuroprotection for stroke in hypertensive rats(抗凋亡和抗氧化聯合方法對於高血壓大鼠中的卒中的急性保護).J.Cereb.Blood Flow Metab.33，1215-1224，(2013).
39.Osborne，K.A.等Quantitative assessment of early brain damage in a rat model of focal cerebral ischaemia(局灶性腦缺血的大鼠模型中早期腦損傷的定量評估).J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 50，402-410(1987).
40.Gaude，E.等muma，An R Package for metabolomics univariate and multivariate statistical analysis(用於代謝組學單變量和多變量統計學分析的R套裝).Current Metabol.1，180-189(2013).
41.Davidson，S.M.& Duchen，M.R.Effects of NO on mitochondrial function in cardiomyocytes：Pathophysiological relevance(NO對於心肌中線粒體功能的影響：病理生理學相關性).Cardiovasc.Res.71，10-21，(2006).
42.Smith，A.C.，Blackshaw，J.A.& Robinson，A.J.MitoMiner：a data warehouse for mitochondrial proteomics data(MitoMiner：用於線粒體蛋白質組學數據的數據倉庫).Nucleic Acids Res.40，(2012).
43.Chang，A.，Scheer，M.，Grote，A.，Schomburg，I.& Schomburg，D.BRENDA，AMENDA and FRENDA the enzyme information system：new content and tools in 2009(D.BRENDA，AMENDA和FRENDA酶信息系統：2009年的新內容和工具).Nucleic Acids Res.37，D588-592，(2009).
44.Romero，P.等Computational prediction of human metabolic pathways from the complete human genome(從完整人基因組的人代謝途徑的計算機預測).Genome Biol.6，R2，(2005).
45.Abad，M.F.，Di Benedetto，G.，Magalhaes，P.J.，Filippin，L.& Pozzan，T.Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant(通過新改造的綠色螢光蛋白突變體監視線粒體pH).J.Biol.Chem.279，11521-11529，(2004).
46.Orth，J.D.，Thiele，I.& Palsson，B.O.What is flux balance analysis？(通量平衡分析是什麼？)Nat.Biotechnol.28，245-248，(2010).
47.Becker，S.A.等Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models：the COBRA Toolbox(用基於約束的模型定量預測細胞代謝).Nat.Prot.2，727-738，(2007).
上述說明書中提到的所有出版物通過參考結合於此。儘管在本文中已經參考附圖詳細公開了本發明的例舉性實施方案，但是應當理解，本發明不限於精確的實施方案，並且本領域技術人員在不背離如後附權利要求和它們的等同物限定的本發明的範圍的情況下可以在其中進行各種改變和改進。