Mthfr基因snp指導葉酸及相關營養元素攝入的用途、檢測方法和試劑盒的製作方法

2023-05-18 23:09:16 1

專利名稱：：Mthfr基因snp指導葉酸及相關營養元素攝入的用途、檢測方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及MTHFR(亞甲基四氫葉酸還原酶)基因的SNP(多態性位點)基因型用於指導葉酸及相關營養元素攝入的用途，一種MTHFR基因的SNP基因型的檢測方法和試劑盒，屬於醫藥
技術領域：
。
背景技術：
：人類的遺傳基因與營養代謝的關係是息息相關的，遺傳基因在人的一生中幾乎不會改變，這就意味著我們的生理過程特性大部分都是從受精卵形成之初就決定的，例如我們的長相，身高和性格等。相對基因，健康狀況卻是不斷在變化的，通過對遺傳基因的分析可以幫助我們來預計健康發展的方向，提供個性化的健康諮詢，提高生活質量。人類從外界攝取各種食物，經過消化、吸收和新陳代謝以維持機體的生長、發育和各種生理功能，這一連續過程就叫營養。一個人生命的整個過程都離不開營養。營養成分在體內的代謝過程離不開基因和基因的產物，每個人的基因都不完全相同，對營養代謝的方式也各有不同，如果能知道自己的遺傳基因狀況就能更好的吸收營養，更好的健康生活。最近，美國醫學專家指出，人類基因組圖譜成功繪製之後，一項以基因組為基礎的營養學研究將給疾病治療帶來一場變革。將來，食療師和醫生也許就會根據個人基因圖譜，來給患者制定食譜，以此有針對性的防病。隨著人類基因組序列的繪製完成，生命科學領域的研究熱點正迅速轉向如何解讀如此大量的基因組序列；如何從已知的序列中了解各個基因的功能、表達調控、多個基因及其產物之間的相互作用以及基因組和環境的相互作用等。其中對基因組序列的單個核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)形成的多態性研究是該階段的重要研究內容。單核苷酸多態性(SNP)全稱SingleNucleotidePolymorphisms，是指在基因組上單個核苷酸的變異，包括置換、顛換、缺失和插入。從理論上來看每一個SNP位點都可以有4種不同的變異形式，但實際上發生的只有兩種，即轉換和顛換，二者之比為21。SNP在CG序列上出現最為頻繁，而且多是C轉換為T，原因是CG中的C常為甲基化的，自發地脫氨後即成為胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指變異頻率大於的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每1000個鹼基就有一個SNP，人類基因組上的SNP總量大概是3X106個。因此，SNP成為第三代遺傳標誌，人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關。1998年，美國能源部和NIH人類基因組計劃工作組共同決定將鑑定SNP和繪製SNP圖譜作為人類基因組計劃最後五年計劃的一部分即人類基因組計劃中SNP計劃。具體目標是發展可快速、大規模鑑定和評價SNP及其它DNA序列變異的技術；對大部分已知基因編碼區SNP進行鑑定；產生至少包括100000個標記物的SNP圖譜；發展用於序列變異研究的學術基金；建立公共DNA樣本和細胞株資源。正如我們現在所知的人類所有疾病或病理狀態都直接或間接與基因的結構和功能相關，而疾病過程正是這些致病或相關基因與人體內外環境各因素相互作用的結果。SNP作為人類可遺傳變異中最常見的一種，佔所有已知多態性的90%以上，不僅可以作為遺傳標記，通過連鎖分析定位疾病基因，而且有些SNP本身就可直接導致疾病的發生，因此，SNP在疾病的早期風險性評估，早期診斷，預防和治療等各方面具有重要功能和應用價值，在最近幾年裡受到異乎尋常的關注。MTHFR為亞甲基四氫葉酸還原酶，是葉酸代謝中最重要的酶，它以NAD⑵H為還原劑催化5，10一亞甲基四氫葉酸(5，10-methylenetetrahydrofolate,5,10-CH2THF)還原為5-甲基四氫葉酸(5-methyl-tetrahydrofo]ate，5-CH3THF)，而5-CH3THF是進一步提供甲基給甲硫氨酸，最後轉移到SAM上，SAM是DNA等生物大分子甲基化的直接供體。MTHFR催化的還原反應不可逆，是甲基化的限速步驟，同時MTHFR受產物SAM的反饋調節。同時MTHFR的活性強弱直接影響底物5，10CH2THF的量，而這個正是用來進行胸腺嘧啶和嘌呤合成的原料。所以MTHFR處於連接DNA甲基化和DNA池的戰略地位，它的缺陷可直接導致血漿中HcyQiomosysteine)的水平升高。由於MTHFR在葉酸代謝過程的獨特地位，關於該酶的生化特點，蛋白質結構，基因的遺傳多態性，分子流行病學以及與疾病的易感性和預後的關係等問題都有大量的研究報導。葉酸(Folicacid)是維生素B複合體之一，相當於蝶醯穀氨酸(pteroylglutamicacid,PGA)，有促進骨髓中幼細胞成熟的作用，如果缺少葉酸可招致紅血球的異常未成熟細胞的增加和貧血以及白血球減少。葉酸的生物利用需要經過很多物理和化學的步驟，包括小腸吸收，血液中轉運，細胞膜受體結合以及酶的作用轉化為活性可利用的形式等。食物葉酸經小腸黏膜細胞內特異葉醯多穀氨酸水解酶(GCPIT)的作用，水解為喋醯單穀氨酸(或稱單穀氨酸葉酸)後，依賴小腸細胞表面的特異性葉酸結合蛋白(即葉酸受體)主動攝取進入肝門靜脈循環，隨後單谷氮酸葉酸被還原並甲基化為5-甲基四氫葉酸(5-CH3THF)進入血液循環，5-CH3THF是血液和細胞中存在的主要葉酸形式[ChevrierC，PerretC，BahuauM,etal.FetalandmaternalMTHFRC677Tgenotype,maternalfolateintakeandtheriskofnonsyndromicoralclefts.AmericanJournalofMedicalGeneticsPartA2007；143A=248-57.]0細胞也可通過胞飲的形式吸收後單穀氨酸葉酸並通過FPGS轉變為多穀氨酸葉酸，在肝臟、紅細胞及其他組織細胞內貯存，其餘部分則以單穀氨酸葉酸的形式分布於血漿、組織液、膽汁及尿液中。肝臟的葉酸濃度是血漿的幾百倍，但其單穀氨酸葉酸濃度與血漿相近。在葉酸代謝的龐大網絡中涉及多種合成酶，轉移酶以及氧化和還原酶，已經證明這些酶的遺傳多態性會導致的整個代謝網絡的失衡。遺傳流行病學已經驗證出MTHFR，MS，TS，SHMT等與各種癌症相關。這些酶相互作用，同時與葉酸，B族維生素的相互作用影響葉酸代謝的方向和速度。葉酸代謝是近年來醫學、遺傳學和營養學研究的熱點之一，主要是因為人們發現葉酸與神經管畸形、腫瘤和心血管疾病有關。已知MTHFR是同型半胱氨酸代謝中的關鍵酶之一，這種酶的活性和熱穩定性都較低。現已證實，這種熱不穩定性是由MTHFR基因等677位的鹼基由C—TU298A—C型等的突變所造成的。MTHFR基因的遺傳變異體在葉酸水平較低時易造成中度的高半胱氨酸血症，這種遺傳與營養的交互作用，增加了心血管疾病的神經管缺陷的危險性。而實驗和臨床資料表明，大劑量葉酸補充可以增加體內5-甲基四氫葉酸生成，從而降低血漿同型半胱氨酸水平，減少心血管疾病的發病和神經管畸形兒童的出生率。由此推斷，就MTHFR基因突變的個體而言，他們對葉酸的需求要高於普通人群。很多研究關注基於人群的MTHFRC677T和A1298c突變型與腫瘤的關係，但是結果有不一致的現象。大多數學者認為MTHFR突變型引起的酶活性降低可以引起葉酸代謝紊亂，表現葉酸紊亂後產生的一系列結果，當葉酸攝入較高時，這種缺陷就被緩解，所看到的不一致結果可能與研究者研究的角度和時間點不一樣有關。流行病學研究揭示出MTHFRC677T遺傳多態位點與結直腸癌，急性淋巴癌，子宮內膜癌以及食管癌的發生風險有關，提示是一個易感性因素[MooreLE,HungR,KaramiS,etal.Folatemetabolismgenes,vegetableintakeandrenalcancerriskincentralEurope.InternationalJournalofCancer2008；122:1710-5.]。神經管畸形(neuraltubedefects，NTDs)是指在胚胎發育早期，由於遺傳傾向與一些致畸因素的影響，導致神經管閉合不全而產生的一組出生缺陷，主要包括無腦兒、脊柱裂、腦或腦脊膜膨出等。NTDs可引起孕婦流產、嬰兒死亡和終生殘疾，嚴重威脅著婦女兒童的身心健康和人口素質的提高，給社會的發展帶來沉重負擔。葉酸缺乏與NTDs的關係是近年來研究最多的。多數研究顯示，婦女在妊娠前後服用葉酸可降低胎兒發生NTDs的危險性，使其發生率降低50%—70%。這一發現使得NTDs的研究取得了突破性進展，各國的NTDs發生率也隨著葉酸的強化明顯下降。21世紀初，NTDs在英國的發生率為3.3%;美國的發生率為0.5%。因此，婦女妊娠期定量補充葉酸已經成為預防NTDs發生非常有效的措施之一。但是，葉酸影響NTDs的發生可能是通過遺傳代謝途徑而不僅僅是攝入不足，所以仍有30%-45%的病例不能通過實施該措施阻止發生。
發明內容為解決上述技術問題，本發明提供一種MTHFR基因SNP指導葉酸及相關營養元素攝入的用途，一種指導葉酸及相關營養元素攝入的MTHFR基因的SNP的檢測方法和試劑盒，利用PCR方法提取DNA，分析MTHFR的C677T和A1289C多態位點，闡明葉酸代謝相關遺傳背景，從而指導其攝入葉酸及相關營養的多少。本發明是通過以下的技術方案實現的一種MTHFR基因SNP指導葉酸及相關營養元素攝入的用途。所述用途的MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型包含C677T和A1289C的多態位點的基因型，還可以進一步包含與上述基因多態性位點存在連鎖不平衡的多態性位點，包括無意義突變位點、錯義突變位點以及位於基因內含子部位、基因調節部位的多態性位點。所述葉酸攝入指導是根據SNP多態性位點基因型的不同，葉酸的日攝入量，相關營養元素攝入指導是維生素B12、B6、膽鹼以及甜菜鹼的攝入指導。所述用途其中(1)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298AA時，葉酸的攝入量為0.40.6mg/day,維生素B12攝入量為23μg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(2)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298AC時，葉酸的攝入量為0.40.6mg/day,維生素B12攝入量為23μg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(3)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298CC時，葉酸的攝入量為0.61.5mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(4)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298AA時，葉酸的攝入量為0.61.5mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(5)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298AC時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(6)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298CC時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(7)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298AA時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(8)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298AC時，葉酸的攝入量為2.54mg/day，維生素B12攝入量為510yg/day,維生素B6的攝入量為4lOmg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為10001500mg/day。(9)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298CC時，葉酸的攝入量為2.54mg/day，維生素B12攝入量為510yg/day,維生素B6的攝入量為4lOmg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為10001500mg/day。一種指導葉酸及相關營養元素攝入的MTHFR基因的SNP基因型的檢測方法和試劑盒，所述檢測方法包括基因組DNA樣品的提取，PCR擴增反應，純化反應，限制性內切酶酶切和DNA凝膠電泳分析。所述基因組DNA樣品的提取選自血液、體液、組織樣品和培養細胞中的一種，優選的選自血液。所述檢測方法和試劑盒的MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型包含C677T和A1289C多態位點，還可以進一步包含與上述基因多態性位點存在連鎖不平衡的多態性位點，包括無意義突變位點、錯義突變位點以及位於基因內含子部位、基因調節部位的多態性位點。所述葉酸攝入指導是根據SNP多態性位點基因型的不同，葉酸的日攝入量，相關營養元素攝入指導是維生素B12、B6、膽鹼以及甜菜鹼的攝入指導。所述檢測方法和試劑盒其中(1)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298AA時，葉酸的攝入量為0.40.6mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(2)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298AC時，葉酸的攝入量為0.40.6mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(3)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298CC時，葉酸8的攝入量為0.61.5mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(4)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298AA時，葉酸的攝入量為0.61.5mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(5)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298AC時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(6)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298CC時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(7)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298AA時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(8)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298AC時，葉酸的攝入量為2.54mg/day，維生素B12攝入量為510yg/day,維生素B6的攝入量為4lOmg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為10001500mg/day。(9)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298CC時，葉酸的攝入量為2.54mg/day，維生素B12攝入量為510yg/day,維生素B6的攝入量為4lOmg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為10001500mg/day。所述的試劑盒，其特徵在於包括引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'；引物2，MTHFR-677-3，5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3『；引物3，MTHFR-1298-5，5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3『；引物4，MTHFR-1298-3，5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3『；10XBuffer；dNTP；ddH20；TaqPlusDNAPolymerase；10XHinfl酶切緩衝液；Hinfl內切酶；10XMB0I酶切緩衝液和MB0I內切酶。所述試劑盒還可以表現為微晶片、微檢測系統或者依賴於各種載體的檢測系統，以及包括前述檢測系統的統一包裝形式，如微孔板系統紙質載體、玻璃載體、尼龍膜載體、塑料載體、矽膠載體、凝膠載體和膜質載體中的一種。本發明的有益效果為通過上述的檢測方法，可以根據分子生物學技術簡單準確的檢測MTHFR的C677T和A1298C的SNP多態位點基因型，從而應用於葉酸及相關營養元素攝入的指導，為葉酸代謝能力低者提供及時準確的營養攝入指導，防止因葉酸代謝能力低而產生的身體缺陷，為生活中個人尤其是孕前或孕期婦女服用葉酸及相關營養元素提供指導。本發明還提供了上述檢測方法的試劑盒，從而降低了醫療成本。圖1是葉酸及相關營養元素攝入的MTHFR基因的SNP基因型的檢測方法的流程圖。具體實施例方式下面對指導葉酸及相關營養元素攝入的MTHFR基因的SNP基因型的檢測方法做進一步的說明。1試劑、材料及儀器1.1主要試劑和酶類ACD抗凝劑，蛋白酶K，TaqDNA聚合酶，分裝dNTPs，PCRMarker,引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3『引物2，MTHFR-677-3，5『-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3『引物3，MTHFR-1298-5，5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3『引物4，MTHFR-1298-3，5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3『凝膠純化試劑盒，其它試劑瓊脂糖、EB、澳酚蘭、二甲苯氰、平衡酚、氯仿、異戊醇、冰醋酸、無水乙醇、Tris、EDTANa2、SDS等1.2主要儀器設備GeneAmp9600PCR儀EPPEND0RF5415C臺式高速離心機HITACHIHimacCR21型高速冷凍離心機GeneQuantll型紫外分光光度計微量進樣器(多頭)，0.5-10u1,10-100U1,200-1000ii1，300型電子天平Milli-QAcademic超純水儀SH-650型微波爐DY-501型電泳儀FR-180A型電泳槽FR-200型紫外與可見分析裝置PRUV-100B手提式紫外燈2實驗步驟與結果分析2.1外周血DNA的抽提A.材料的預處理1)lml新鮮血液加入180u1A⑶抗凝劑抗凝，混勻後-70°C長期保存。2)0.5ml凍藏血加0.5mlPBS,用槍打勻，5000rpm5min,棄上清3)反覆用PBS(0.5-0.8ml)吹打洗滌、離心棄上清，至上清無明顯紅色為止，棄上清。B.DNA的抽提和純化4)消化沉澱中加入500iilTE，25iil20%SDS,4u110mg/ml蛋白酶K，混勻；55°C水浴2-3小時，至溶液透明為止。5)抽提冷卻至室溫，加700u1平衡酚，緩慢來回顛倒印pendorf管至混勻(約10分鐘)；12k離心lOmin，上清轉移至1.5ml印pendorf管，加700yl酚-氯仿-異戊醇(25241)，混勻(約來回顛倒lOmin)，12kl0min,上清轉移至1.5mlepp管，加700u1氯仿-異戊醇(241)，混勻，12kl0min，上清轉移至1.5ml印pendorf管。C.乙醇沉澱DNA6)上清中加入1/10體積3MNaAc和2-2.5體積_20°C預冷的無水乙醇，立即搖勻，-20°C1小時。7)取出後12000rpml5min，倒去乙醇，吸乾，-20V預冷，70%乙醇洗滌(約500ill)；12000rpml5min，棄上清，吸乾，空氣中乾燥。8)加50u1TE溶解，_20°C保存。D.DNA的電泳檢測2u1樣品加2iil6x上樣液加8iUTAEbuffer室溫，0.8%瓊脂糖凝膠，恆壓80V,電泳30min。電泳結束後，EB染色約15分鐘，紫外觀察。E.DNA的濃度測定及純度判定取DNA溶液用TE液做適量稀釋，以TE液作空白對照，在紫外分光光度計上讀取A260和A280的光密度值。按下面公式計算濃度DNA濃度(ug/ul)=A260*50*稀釋倍數/1000。DNA純度的判定A260/A280比值應介於1.7-2.0之間。2.2SNP位點分型A.MTHFR的667C->T多態位點分型1)以人血中提取的基因組DNA為模板，根據已知的MTHFR基因的序列設計引物，引物序列如下引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3『引物2，MTHFR-677-3，5『-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3『反應總體系50iiL。模板4iiL，引物1(引物3)和引物2(引物4)各liiL，10XBuffer5uL,dNTPluL,ddH2037.5uL,TaqPlusDNAPolymeraseO.5iiPCR條件為94°C預變性5min；循環條件為94°C變性30sec，68°C退火30sec，72°C延伸0.5min，共32個循環；最後72°C延伸5min。擴增到MTHFR基因含667C->T多態位點o2)瓊脂糖凝膠電泳鑑別PCR擴增產物取5ulPCR擴增產物與lul6X上樣緩衝液(0.25%濱酚藍，40%(W/V)蔗糖水溶液)混勻，在含0.5%濱化乙錠(EB)的2.0%瓊脂糖凝膠中上樣、電泳，電壓為50V，時間為30min,以marker為參照，在紫外燈下觀察，判斷擴增產物是否為所需片段。3)限制性內切酶反應取PCR擴增產物10ul，用0.8ulHinfl內切酶於37攝氏度酶解消化。酶解體系包括10X酶切緩衝液2.OulHinfl內切酶0.8ulPCR擴增產物10.Oul無菌去離子水7.2ul總體積20ul酶切反應體系在37°C恆溫箱中放置3h.4)瓊脂糖凝膠電泳鑑別基因型型別11配製2.0%瓊脂糖凝膠，內含0.5%EB。取8ulPCR酶切產物與1.7ul6X上樣緩衝液混勻後，上樣，電泳，電壓為50V，以marker為參照，在紫外燈下觀察，判斷酶切產物的MTHFR基因667C->T多態位點型別。若片段為僅246bp，判定為野生型；有246bpl74bp和72bp三個片段，判定為雜合突變型，有174bp和72bp兩個片段，判定為純合突變型。B.MTHFR的1298A->C多態位點分型1)以人血中提取的基因組DNA為模板，根據已知的MTHFR基因的序列設計引物，引物序列如下引物3，MTHFR-1298-5，5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3『引物4，MTHFR-1298-3，5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3『PCR反應總體系50iiL。模板4iiL，引物1(引物3)和引物2(引物4)各liiL，10XBuffer5uL,dNTPluL,ddH2037.5uL,TaqPlusDNAPolymeraseO.5iiPCR條件為94°C預變性5min；循環條件為94°C變性30sec，68°C退火30sec，72°C延伸0.5min，共32個循環；最後72°C延伸5min。擴增到MTHFR基因含1298A->C多態位點o2)瓊脂糖凝膠電泳鑑別PCR擴增產物取5ulPCR擴增產物與lul6X上樣緩衝液(0.25%濱酚藍，40%(W/V)蔗糖水溶液)混勻，在含0.5%濱化乙錠(EB)的2.0%瓊脂糖凝膠中上樣、電泳，電壓為50V，時間為30min,以markr為參照，在紫外燈下觀察，判斷擴增產物是否為所需片段。3)限制性內切酶反應取PCR擴增產物10ul，用0.8ulMB0I內切酶於37攝氏度酶解消化。酶解體系包括10X酶切緩衝液2.OulMB0I內切酶0.8ulPCR擴增產物10.Oul無菌去離子水7.2ul總體積20ul酶切反應體系在37°C恆溫箱中放置3h。4)瓊脂糖凝膠電泳鑑別基因型型別配製2.0%瓊脂糖凝膠，內含0.5%EB。取8ulPCR酶切產物與1.7ul6X上樣緩衝液混勻後，上樣，電泳，電壓為50V，以marker為參照，在紫外燈下觀察，判斷酶切產物的MTHFR基因1298A->(多態位點型別。若片段為僅大片段，判定為野生型；有大中小三個片段，判定為雜合突變型，有中和小兩個片段，判定為純合突變型。2.3基於SNP位點分型的葉酸及相關營養元素攝入指導根據基因分型結果，葉酸等營養攝入指導請參考下表667C->T1298A->C葉酸攝入維生素維生素膽鹼/甜菜位點基位點基因指導B12攝B6攝入鹼攝入指因型型(mg/day)入指導指導導(μg/(mg/day)(mg/day)_day)_CCAA0.4-0.62-31.5-2500-800CCAC0.4-0.62-31.5-2500-800CCCC0.6-1.52-31.5-2500-800CTAA0.6-1.52-31.5-2500-800CTAC1.5-2.53-52-4800-1000CTCC1.5-2.53-52-4800-1000TTAA1.5-2.53-52-4800-1000TTAC2.5-45-104-101000-1500_TT_CC2.5-45-104-101000-15003試劑盒所含內容A.PCR反應體系10XBuffer,dNTP,ddH20,TaqPlusDNAPolymerase,引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，引物2，MTHFR-677-3，5『-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3『引物3，MTHFR-1298-5，5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3『，引物4，MTHFR-1298-3，5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3『。B.酶切反應體系IOXHinfI酶切緩衝液，HinfI內切酶，IOXMBOI酶切緩衝液，MBOI內切酶。權利要求一種MTHFR基因SNP指導葉酸及相關營養元素攝入的用途。2.如權利要求1所述的用途，其特徵在於所述用途的MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型包含C677T和A1289C的多態位點的基因型，還可以進一步包含與上述基因多態性位點存在連鎖不平衡的多態性位點，包括無意義突變位點、錯義突變位點以及位於基因內含子部位、基因調節部位的多態性位點。3.如權利要求1所述的用途，其特徵在於所述葉酸攝入指導是根據SNP多態性位點基因型的不同，葉酸的日攝入量，相關營養元素攝入指導是維生素B12、B6、膽鹼以及甜菜鹼的攝入指導。4.如權利要求1所述的用途，其特徵在於所述用途其中(1)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298AA時，葉酸的攝入量為0.40.6mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(2)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298AC時，葉酸的攝入量為0.40.6mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(3)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298CC時，葉酸的攝入量為0.61.5mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(4)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298AA時，葉酸的攝入量為0.61.5mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(5)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298AC時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(6)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298CC時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(7)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298AA時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(8)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298AC時，葉酸的攝入量為2.54mg/day，維生素B12攝入量為510yg/day,維生素B6的攝入量為410mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為10001500mg/day。(9)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298CC時，葉酸的攝入量為2.54mg/day，維生素B12攝入量為510yg/day,維生素B6的攝入量為410mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為10001500mg/day。5.一種指導葉酸及相關營養元素攝入的MTHFR基因的SNP基因型的檢測方法和試劑盒，其特徵在於檢測方法包括基因組DNA樣品的提取，PCR擴增反應，純化反應，限制性內切酶酶切和DNA凝膠電泳分析。6.如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於所述基因組DNA樣品的提取選自血液、體液、組織樣品和培養細胞中的一種，優選的選自血液。7.如權利要求5所述的檢測方法和試劑盒，其特徵在於所述檢測方法和試劑盒的MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型包含C677T和A1289C多態位點，還可以進一步包含與上述基因多態性位點存在連鎖不平衡的多態性位點，包括無意義突變位點、錯義突變位點以及位於基因內含子部位、基因調節部位的多態性位點。8.如權利要求5所述的檢測方法和試劑盒，其特徵在於所述葉酸攝入指導是根據SNP多態性位點基因型的不同，葉酸的日攝入量，相關營養元素攝入指導是維生素B12、B6、膽鹼以及甜菜鹼的攝入指導。9.如權利要求5所述的檢測方法和試劑盒，其特徵在於所述檢測方法和試劑盒其中(1)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298AA時，葉酸的攝入量為0.40.6mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(2)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298AC時，葉酸的攝入量為0.40.6mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(3)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CC和1298CC時，葉酸的攝入量為0.61.5mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(4)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298AA時，葉酸的攝入量為0.61.5mg/day,維生素B12攝入量為23yg/day,維生素B6的攝入量為1.52mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為500800mg/day。(5)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298AC時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(6)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677CT和1298CC時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(7)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298AA時，葉酸的攝入量為1.52.5mg/day,維生素B12攝入量為35yg/day,維生素B6的攝入量為24mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為800lOOOmg/day。(8)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298AC時，葉酸的攝入量為2.54mg/day，維生素B12攝入量為510yg/day,維生素B6的攝入量為410mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為10001500mg/day。(9)當所述MTHFR基因的SNP多態性位點的基因型為677TT和1298CC時，葉酸的攝入量為2.54mg/day，維生素B12攝入量為510yg/day,維生素B6的攝入量為410mg/day，膽鹼以及甜菜鹼的攝入量為10001500mg/day。10.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於包括引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3『；引物2，MTHFR-677-3』5『-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3『；引物3，MTHFR-1298-5』5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3『；引物4，MTHFR-1298-3』5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3『；.10XBuffer；dNTP；ddH20；TaqPlusDNAPolymerase；10XHinfI酶切緩衝液；Hinfl內切酶；10XMB0I酶切緩衝液和MB0I內切酶。11.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還可以表現為微晶片、微檢測系統或者依賴於各種載體的檢測系統，以及包括前述檢測系統的統一包裝形式，如微孔板系統紙質載體、玻璃載體、尼龍膜載體、塑料載體、矽膠載體、凝膠載體和膜質載體中的一種。全文摘要本發明公開了一種MTHFR基因SNP指導葉酸及相關營養元素攝入的用途，一種指導葉酸及相關營養元素攝入的MTHFR基因的SNP的檢測方法和試劑盒，由於提供與葉酸代謝能力及相關營養攝入的SNP基因型的陽性位點不同，從而發現可能由此產生身體缺陷的原因，為生活中個人尤其是孕前或孕期婦女服用葉酸及相關營養的攝入提供指導。文檔編號C12Q1/68GK101864479SQ200910049499公開日2010年10月20日申請日期2009年4月17日優先權日2009年4月17日發明者吳奇涵,竇同海,鐘鳴申請人:吳奇涵;鐘鳴;竇同海