一種高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的方法
2023-05-18 19:31:31
一種高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的方法。採用方法的要點是將綠色木黴接種於察氏培養基上活化，挑取單菌落接種於液體活化培養基中擴大培養得到種子液，按照體積比1:10～20的接種量接種於液體產酶培養基中，40至60目毛竹粉5～20g/L作為發酵底物，液體發酵72～120h製備纖維素酶。該方法穩定、高效，特別適用於綠色木黴發酵產纖維素酶。本發明針對綠色木黴生理特性優化得到一套高效液體發酵工藝，可以獲得高酶活力的纖維素酶；同時提出資源化利用毛竹原料作為纖維素酶誘導底物，製備高附加值生物酶製劑，是高值化利用毛竹資源的一條創新思路，可切實提高我國竹區農民的經濟收入，具有重要的現實意義。
【專利說明】一種高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種製備纖維素酶的方法，特別涉及一種高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的方法，屬於生物化學中微生物培養【技術領域】。
【背景技術】
[0002]纖維素酶是一組能夠水解纖維素分子鏈的葡萄糖苷鍵使其轉化成葡萄糖的多組分酶的總稱，是幾種具有不同酶活力的酶複合物，主要包括外切纖維素酶、內切纖維素酶、
葡萄糖苷酶等。纖維素需要這些酶的共同出現並協同作用、共同催化才能被完全降解。 利用纖維素酶將纖維素轉化為食品、能源、化工材料，對解決人類面臨的諸多資源、環境問題具有極大的現實意義。
[0003]當前阻礙人類廣泛高效利用纖維素酶的瓶頸，一是缺少纖維素酶高產菌，二是發酵產酶工藝仍待進一步優化。目前用於生產纖維素酶的微生物菌種較多的是絲狀真菌， 其中，酶活力較強的菌種為木黴屬、麴黴屬和青黴屬，特別是綠色木黴及其近緣菌株較為典型，是公認較好的纖維素酶生產菌。此外，反芻動物依靠瘤胃微生物可消化纖維素，如瘤胃細菌和熱纖梭菌等，但產量和活性較低。國內外纖維素酶的製備方法主要有固體發酵法和液體發酵法兩種。固體發酵設備投資少，但佔地面積大、易染雜菌、生產穩定性較差，而且技術不易掌握，難以進行擴大化生產，目前我國多數企業仍採用固體發酵工藝製備纖維素酶；液體發酵具有生產穩定性高、技術易掌握、便於工業化生產等優勢，但因纖維素酶為誘導酶，採用玉米秸、麥秸、稻草等作為誘導物，效果並不十分理想，因此企業紛紛採用價格昂貴的木材作為原料，大大增加了企業生產成本，制約了纖維素酶生產技術的推廣和應用。
[0004]在發酵微生物製備纖維素酶領域，中國專利(ZL200810023480.8) 「一種提高纖維素酶產量的裡氏木黴培養方法」在裡氏木黴產酶過程中調節通風量，使產酶主要階段溶解氧濃度在20~30%，以利於菌體生長，產出的纖維素酶較固定通風量產酶的濾紙酶活提高30%，產酶時間縮短14% ;中國專利(ZL200510009000.9) 「高活性纖維素酶及其製造方法」以擔子菌CGMCCN0.1294作為生產菌種，滅菌接入三角瓶液體菌種，進行液體深層發酵， 經過濾、濃縮和噴霧乾燥製成纖維素酶粉，測定產酶活力為40000u/g，且過程穩定性好、不易染菌、便於大規模工業化生產；中國專利(ZL200610002014.2) 「微生物發酵生產低溫纖維素酶的方法」將產生纖維素酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環境中生長良好，經過擴大培養、發酵產酶，根據不同需要和使用對象，將粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備不同活性、純度和劑型的纖維素酶製劑；美國專利(US61110732) 「Hosts an`d fermentation processes for cellulase production」將經過基因改性的絲狀真菌作為培養菌種，以 25~100wt%的半纖維素來源醇糖和0~75wt%的葡萄糖、丙三醇或者二者的混合物作為碳源，發酵製備同時含有纖維素酶和半纖維素酶活力的複合酶。美國專利(US60920942) 「Process for producing cellulase」將長枝木黴、木素木黴、黑麴黴、木麴黴通過不同培養和發酵工藝，同時製備纖維素酶和槐糖脂兩種產品。截至目前，還未見到利用毛竹原料作為誘導底物，高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的相關工藝技術出現。
【發明內容】
[0005]為了解決目前微生物發酵製備纖維素酶工藝過程的菌種產酶效率低、固體發酵穩定性差、誘導底物效果不理想等實際問題，同時資源化利用我國豐富、價格低廉的毛竹資源，製備高附加值生物酶製劑，本發明目的是提供一種高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的方法。
[0006]為實現上述目的，本發明的技術方案是採用以下步驟:
[0007]I)將未經活化的綠色木黴在無菌環境中以無菌水溶解，採用平板劃線法將菌種接種於察氏培養基上，在24~32°C的恆溫培養箱中培養72~168h，至生長出單菌落，得到經過活化的綠色木黴；
[0008]2)將步驟I)得到的經過活化的綠色木黴在無菌環境中挑取單菌落，接種於液體活化培養基中，在24~32°C、180~260r/min的恆溫振蕩器中培養48~72h，得到擴大培養的種子液；
[0009]3)將步驟2)得到的擴大培養的種子液按照體積比1:10~20的接種量接種於液體產酶培養基中，按照60%的裝入量裝入發酵罐中，產酶培養製備纖維素酶，控制發酵液pH 值3~7、發酵溫度24~32°C、通氣量1:0.4~1.2、發酵時間72~120h，得到的發酵液在 4000r/min的冷凍離心機中離心IOmin,採用截留分子量100~500k的聚醚碸膜濃縮使其濃度提升20倍，得到纖維素酶。
[0010]所述的液體活化培養基配方為:葡萄糖10~20g/L、蛋白腖I~2g/L、 Tween800.2~0.4g/L、硫酸銨I~2g/L、磷酸二氫鉀I~3g/L、硫酸鎂0.1~0.3g/L、氯化鈣0.1~0.3g/L、尿素0.4~0.8g/L、佔液體活化培養基總體積10~20%的Mandels營養鹽、溶劑為PH=3~7的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0011]所述的液體產酶培養基配方為:葡萄糖4~6g/L、40至60目毛竹粉5~20g/L、 Tween800.2~0.6g/L、硫酸銨I~3g/L、磷酸二氫鉀3~5g/L、硫酸鎂0.3~0.5g/L、氯化鈣0.3~0.5g/L、尿素0.8~1.2g/L，佔液體產酶培養基總體積0.1~0.3%的Mandels微量元素、溶劑為pH=3~7的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0012]與【背景技術】相比，本發明具有的有益效果是:
[0013]本發明在發酵製備纖維素酶的微生物菌種中引入綠色木黴，針對綠色木黴的生理特性優化得到一套高效液體發酵工藝，在此工藝下可以獲得高酶活力的纖維素酶；`同時提出資源化利用毛竹原料作為纖維素酶的誘導底物，製備高附加值生物酶製劑，是高值化利用毛竹資源的一條創新思路，符合國家發展循環經濟政策，並可切實提高我國竹區農民的經濟收入。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1是實施例3經過察氏培養基活化生長出單菌落的綠色木黴照片；
[0015]圖2是依據實施例3的工藝條件，在不同發酵時間段製備的纖維素酶的CMC酶活。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。[0017]實施例1:
[0018]I)將未經活化的綠色木黴在無菌環境中以無菌水溶解，採用平板劃線法將菌種接種於察氏培養基上，在24°C的恆溫培養箱中培養72h，至生長出單菌落，得到經過活化的綠色木黴；
[0019]2)將步驟I)得到的經過活化的綠色木黴在無菌環境中挑取單菌落，接種於液體活化培養基中，在24°C、180r/min的恆溫振蕩器中培養48h,得到擴大培養的種子液；(液體活化培養基配方:葡萄糖10g/L、蛋白腖lg/L、Tween800.2g/L、硫酸銨lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、 硫酸鎂0.lg/L、氯化鈣0.lg/L、尿素0.4g/L、佔液體活化培養基總體積10%的Mandels營養鹽、溶劑為PH=3的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0020]3)將步驟2)得到的擴大培養的種子液按照體積比1:10的接種量接種於液體產酶培養基中，按照60%的裝入量裝入發酵罐中，產酶培養製備纖維素酶，控制發酵液PH值3、發酵溫度24°C、通氣量1:0.4、發酵時間72h，得到的發酵液在4000r/min的冷凍離心機中離心 lOmin，採用截留分子量IOOk的聚醚碸膜濃縮使其濃度提升20倍，得到纖維素酶(a)。(液體產酶培養基配方:葡萄糖4g/L、40至60目毛竹粉5g/L、Tween800.2g/L、硫酸銨lg/L、磷酸二氫鉀3g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.3g/L、尿素0.8g/L，佔液體產酶培養基總體積0.1% 的Mandels微量元素、溶劑為pH=3的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0021]實施例2:
[0022]I)將未經活化的綠色木黴在無菌環境中以無菌水溶解，採用平板劃線法將菌種接種於察氏培養基上，在28°C的恆溫培養箱中培養108h，至生長出單菌落，得到經過活化的綠色木黴；
[0023]2)將步驟I)得到的經過活化的綠色木黴在無菌環境中挑取單菌落，接種於液體活化培養基中，在28°C、220r/min的恆溫振蕩器中培養60h，得到擴大培養的種子液；(液體活化培養基配方:葡萄糖15g/L、蛋白腖1.5g/L、Tween800.3g/L、硫酸銨1.5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.2g/L、氯化鈣0.2g/L、尿素0.6g/L、佔液體活化培養基總體積15%的 Mandels營養鹽、溶劑為pH=5的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0024]3)將步驟2)得到的擴大培養的種子液按照體積比1:15的接種量接種於液體產酶培養基中，按照60%的裝入量裝入發酵罐中，產酶培養製備纖維素酶，控制發酵液pH值5、 發酵溫度28°C、通氣量1:0.8、發酵時間96h，得到的發酵液在4000r/min的冷凍離心機中離心lOmin，採用截留分子量300k的聚醚碸膜濃縮使其濃度提升20倍，得到纖維素酶(b)。 (液體產酶培養基配方:葡萄糖5g/L、40至60目毛竹粉10g/L、Tween800.4g/L、硫酸銨2`g/ L、磷酸二氫鉀4g/L、硫酸鎂0.4g/L、氯化鈣0.4g/L、尿素1.0g/L,佔液體產酶培養基總體積
0.2%的Mandels微量元素、溶劑為pH=5的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0025]實施例3:
[0026]I)將未經活化的綠色木黴在無菌環境中以無菌水溶解，採用平板劃線法將菌種接種於察氏培養基上，在30°C的恆溫培養箱中培養144h，至生長出單菌落，得到經過活化的綠色木黴；
[0027]2)將步驟I)得到的經過活化的綠色木黴在無菌環境中挑取單菌落，接種於液體活化培養基中，在30°C、240r/min的恆溫振蕩器中培養72h，得到擴大培養的種子液；(液體活化培養基配方:葡萄糖20g/L、蛋白腖2g/L、Tween800.3g/L、硫酸銨1.5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.2g/L、尿素0.8g/L、佔液體活化培養基總體積15%的Mandels營養鹽、溶劑為pH=5的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0028]3)將步驟2)得到的擴大培養的種子液按照體積比1:15的接種量接種於液體產酶培養基中，按照60%的裝入量裝入發酵罐中，產酶培養製備纖維素酶，控制發酵液PH值5、發酵溫度30°C、通氣量1: 1、發酵時間108h，得到的發酵液在4000r/min的冷凍離心機中離心 lOmin，採用截留分子量300k的聚醚碸膜濃縮使其濃度提升20倍，得到纖維素酶(C)。(液體產酶培養基配方:葡萄糖6g/L、40至60目毛竹粉15g/L、Tween800.4g/L、硫酸銨1.5g/ L、磷酸二氫鉀4g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣0.4g/L、尿素1.2g/L，佔液體產酶培養基總體積 0.15%的Mandels微量元素、溶劑為pH=5的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0029]實施例4:
[0030]I)將未經活化的綠色木黴在無菌環境中以無菌水溶解，採用平板劃線法將菌種接種於察氏培養基上，在32°C的恆溫培養箱中培養168h，至生長出單菌落，得到經過活化的綠色木黴；
[0031]2)將步驟I)得到的經過活化的綠色木黴在無菌環境中挑取單菌落，接種於液體活化培養基中，在32°C、260r/min的恆溫振蕩器中培養72h，得到擴大培養的種子液；(液體活化培養基配方:葡萄糖20g/L、蛋白腖2g/L、Tween800.4g/L、硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀3g/L、 硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.3g/L、尿素0.8g/L、佔液體活化培養基總體積20%的Mandels營養鹽、溶劑為PH=7的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0032]3)將步驟2)得到的擴大培養的種子液按照體積比1:20的接種量接種於液體產酶培養基中，按照60%的裝入量裝入發酵罐中，產酶培養製備纖維素酶，控制發酵液pH值7、 發酵溫度32°C、通氣量1: 1.2、發酵時間120h，得到的發酵液在4000r/min的冷凍離心機中離心lOmin，採用截留分子量500k的聚醚碸膜濃縮使其濃度提升20倍，得到纖維素酶(d)。 (液體產酶培養基配方:葡萄糖6g/L、40至60目毛竹粉20g/L、Tween800.6g/L、硫酸銨3g/ L、磷酸二氫鉀5g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣0.5g/L、尿素1.2g/L，佔液體產酶培養基總體積
0.3%的Mandels微量元素、溶劑為pH=7的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0033]測定實施例1、2、3、4製備得到的四種纖維素酶的CMC酶活。表1為由實施例1、2、
3、4製備的四種纖維素酶CM`C酶活的測定結果。由表1中數據可知，採用本發明所述的製備方法獲得的纖維素酶(a)、(b)、(c)、(d)的CMC酶活分布在2110~2640IU/mL，均具有較高的纖維素酶活力，說明本發明涉及方法符合高效發酵製備纖維素酶的技術範疇。
[0034]如圖1，從實施例3經過察氏培養基活化生長出單菌落的綠色木黴照片可看出，其為氣生綠色菌絲，菌絲較長而直，側枝較少，在生長的中後期收縮而產生孢子絲，孢子小，呈卵圓形。如圖2，依據實施例3的工藝條件，在72~120h的發酵過程中，得到的纖維素酶 CMC酶活先升後降，在108h達到最高酶活2640IU/mL，因此實施例3的最佳產酶發酵時間定為 108h。
[0035]表1
[0036]
【權利要求】
1.一種高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的方法，其特徵在於，包括以下步驟:1)將未經活化的綠色木黴(Trichodermaviviride)在無菌環境中以無菌水溶解,採用平板劃線法將菌種接種於察氏培養基(czapck)上，在24~32°C的恆溫培養箱中培養72~ 168h，至生長出單菌落，得到經過活化的綠色木黴；2)將步驟I)得到的經過活化的綠色木黴在無菌環境中挑取單菌落，接種於液體活化培養基中，在24~32°C、180~260r/min的恆溫振蕩器中培養48~72h，得到擴大培養的種子液；3)將步驟2)得到的擴大培養的種子液按照體積比1:10~20的接種量接種於液體產酶培養基中，按照60%的裝入量裝入發酵罐中，產酶培養製備纖維素酶，控制發酵液pH值3~7、發酵溫度24~32°C、通氣量1:0.4~1.2、發酵時間72~120h，得到的發酵液在4000r/ min的冷凍離心機中離心IOmin,採用截留分子量100~500k的聚醚碸膜濃縮使其濃度提升20倍，得到纖維素酶。
2.根據權利要求1所述的一種高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的方法，其特徵在於: 所述的液體活化培養基配方為:葡萄糖10~20g/L、蛋白腖I~2g/L、Tween800.2~0.4g/ L、硫酸銨I~2g/L、磷酸二氫鉀I~3g/L、硫酸鎂0.1~0.3g/L、氯化鈣0.1~0.3g/L、尿素0.4~0.8g/L、佔液體活化培養基總體積10~20%的Mandels營養鹽、溶劑為pH=3~7 的磷酸緩衝液(PBS)，120°C高壓蒸汽滅菌20min。
3.根據權利要求1所述的一種高效發酵綠色木黴製備纖維素酶的方法，其特徵在於:所述的液體產酶培養基配方為:葡萄糖4~6g/L、40至60目毛竹粉5~20g/L、 Tween800.2~0.6g/L、硫酸銨I~3g/L、磷酸二氫3~5g/L、硫酸鎂0.3~0.5g/L、氯化鈣0.3~0.5g/L、尿素0.8~1.2g/L，佔液體產酶培養基總體積0.1~0.3%的Mandels微量元素、溶劑為pH=3~7的PBS，120°C高壓蒸汽滅菌20min。
【文檔編號】C12R1/885GK103497941SQ201310393491
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月1日 優先權日:2013年9月1日
【發明者】姚菊明, 莊源, 張勇, 崔建梅 申請人:浙江理工大學