日本血吸蟲表皮蛋白基因、蛋白及其應用的製作方法

2023-05-18 19:01:16 2

專利名稱：日本血吸蟲表皮蛋白基因、蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物基因領域，尤其涉及日本血吸蟲表皮蛋白的胺基酸序列及其基因核酸序列；此外，本發明還涉及日本血吸蟲表皮基因、蛋白的應用。
背景技術：
血吸蟲病由血吸蟲的感染引起，在世界上有76個國家，受感染者約1.5億。致病的血吸蟲有3種，既日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸蟲(S.mansoni)和埃及血吸蟲(S.haematobium)。在我國流行的是日本血吸蟲。血吸蟲病的流行給人民身體健康和經濟發展都造成巨大的損失，因此，防治血吸蟲病、開發研製治療血吸蟲病和抗血吸蟲的藥物具有巨大的社會和經濟效益。
研製新的治療血吸蟲病和抗血吸蟲的藥物，首先必須找到合適的藥物作用靶點。血吸蟲的表皮是宿主和血吸蟲相互作用的界面。而組成血吸蟲表皮的蛋白質暴露在這個界面上，對小分子的化學藥物和大分子的抗體藥物而言都是最理想的藥物作用靶點。已經有研究表明治療血吸蟲的化學藥物——吡喹酮的作用靶點就是存在於血吸蟲的表皮。另外一些已知的血吸蟲表皮蛋白，例如GST28，paramyosin，已經用於疫苗研究和應用。通過大規模的蛋白質組學研究，發現了日本血吸蟲表皮蛋白質，這些蛋白質，都是可能的藥物作用靶點和候選疫苗。
在本發明之前，還沒有出現涉及本發明的日本血吸蟲表皮蛋白的公開報導。

發明內容
本發明要解決的技術問題之一是提供一類日本血吸蟲表皮蛋白，及其基因的核酸序列。
本發明要解決的技術問題之二是提供一類日本血吸蟲病防治疫苗，該疫苗以日本血吸蟲表皮蛋白為免疫原。
本發明要解決的技術問題之三是提供一類與日本血吸蟲表皮蛋白結合的抗體。
本發明要解決的技術問題之四是提供日本血吸蟲表皮蛋白在製備預防和治療日本血吸蟲病的藥物中的應用。
為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一類日本血吸蟲表皮蛋白，包括
(a)具有SEQ ID No.24～SEQ ID No.46所示胺基酸序列的蛋白；(b)由(a)的蛋白發生一個或幾個胺基酸置換、缺失或插入而形成的具有(a)蛋白相同活性的蛋白。
較佳地，所述蛋白是具有SEQ ID No.24～SEQ ID No.46胺基酸序列的蛋白。
在本發明的另一方面，提供了一類編碼日本血吸蟲表皮蛋白的基因，包括(a)SEQ ID No.1～SEQ ID No.23所示的核苷酸序列；(b)SEQ ID No.1～SEQ ID No.23所示的核苷酸序列中每條序列的互補序列；(c)與SEQ ID No.1～SEQ ID No.23所示的核苷酸序列中每條序列有至少70％同源性、且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。
較佳地，所述基因具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.23所示的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，還提供了一類日本血吸蟲病防治疫苗，該疫苗以日本血吸蟲表皮蛋白為免疫原。
在本發明的另一方面，還提供了一類與日本血吸蟲表皮蛋白結合的抗體。
此外，本發明還提供了日本血吸蟲表皮蛋白在製備預防和治療日本血吸蟲病的藥物中的應用。
在本發明中，術語「日本血吸蟲表皮蛋白」指具有日本血吸蟲表皮蛋白活性的SEQ ID No.24～SEQ ID No.46所示胺基酸序列的蛋白質。該術語還包括具有與日本血吸蟲表皮蛋白質相同功能的、SEQ ID No.24～SEQ ID No.46序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括日本血吸蟲表皮蛋白的活性片段和活性衍生物。
在本發明中，術語「編碼日本血吸蟲表皮蛋白的基因序列」指編碼具有日本血吸蟲表皮蛋白活性的核苷酸序列，如SEQ ID No.1～SEQ ID No.23所示的核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID No.1～SEQ ID No.23序列中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID No.1～SEQ ID No.23所示核苷酸序列的同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID No.24～SEQ ID No.46所示的胺基酸序列。
在本發明中，可以使用一系列本領域已知的方法來製備針對日本血吸蟲表皮蛋白的抗體。例如，將提純的日本血吸蟲表皮蛋白產物或它的抗原片段注射入動物體內以產生多克隆抗體。同樣，表達日本血吸蟲表皮蛋白或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。本發明製備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術製備。
應用本發明的日本血吸蟲表皮蛋白，可研究血吸蟲治療藥物的作用靶點，從而在開發研製預防或治療血吸蟲病的藥物的過程中發揮重要作用。


圖1是用免疫螢光抗體原位雜交實驗驗證本發明的日本血吸蟲表皮蛋白的圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。
以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1日本血吸蟲表皮蛋白的分離和鑑定實驗。
1.日本血吸蟲表皮的分離純化血吸蟲表皮的純化按照文獻報導的Triton-x-100提取方法進行。表皮蛋白從血吸蟲雄蟲、雌蟲、雌雄混合成蟲和童蟲分離。蟲體用Krebs』-Ringer’s，Tris-馬來酸鹽-緩衝鹽液(KRTM)洗3次，再用KRTM/0.2％Triton X-100溶液懸浮。這個液體和蟲體的混和物置於冰水浴中，在搖床上搖動10分鐘。然後，裝有液體和蟲體的混和物的試管在渦旋混合器上混旋幾次，然後再放回冰水浴中，靜置使蟲體下沉。用吸管吸出上部液體，放置到另一個新管中。這個試管在離心機上用2500g的離心力，離心15分鐘。得到的沉澱就是血吸蟲的表皮。Krebs』-Ringer’s溶液的配方是0.15M NaCl，6.2mM KCl，1.2mM Na2HPO4，1.2mM MgSO4，10mM Glucose and 20mM Tris-Hepes，pH 7.4。Tris maleate緩衝溶液的配方是0.2M Tris and 0.2M Maleicanhyclride，pH 7.4。
2.日本血吸蟲表皮蛋白的電泳分離日本血吸蟲表皮用裂解劑裂解，蛋白溶液用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，條帶切割後再做第二維的在線毛細液相色譜分離以及質譜鑑定。軟體分析得到鑑定蛋白。分離好的血吸蟲表皮，用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)緩衝液懸浮，用超聲波促進組織細胞裂解和蛋白溶解，超聲波裂解方法為超聲1秒，暫停3秒，總時間2分鐘。並用100℃加熱5分鐘以使蛋白質變性。然後這些表皮蛋白混合物用SDS-PAGE分離，分離方法按照普通的SDS凝膠電泳方法進行。膠上電泳泳道用刀切割下來，再用刀均等分割成8-12份。接下來做蛋白的膠內酶解。
3.日本血吸蟲表皮蛋白的膠內酶解過程膠內酶解參照文獻的方法進行。蛋白膠塊用刀切碎，每個小塊大小約為1立方毫米。加入100mM NH4HCO3，洗2次；轉入到試管中；加入10mM二硫蘇糖醇(dithio-threitol，DTT)/100mM NH4HCO3，56度放置反應1小時；冷卻到室溫，離心吸去DTT；加入等體積的55mM碘乙醯胺iodoacetamide/100mM NH4HCO3，室溫/黑暗反應45分鐘；吸去iodoacetamide，加入100mM NH4HCO3，洗2次；去掉NH4HCO3，加入乙腈縮膠；去掉乙腈，真空抽乾；加入100mM NH4HCO3，膠膨脹，去掉NH4HCO3，加入乙腈縮膠；去掉乙腈，抽乾；加入含Trypsin的消化緩衝液(50mM NH4HCO3/12.5ng/ul trypsin)冰上放置45min；去掉多餘酶液，加入50mM NH4HCO3，以剛覆蓋膠為準；37度，過夜酶切；酶切結束後，從試管中吸出上清液到新管子中，膠中加入60％ACN/0.5％HAC，在水浴中超聲處理15min，再重複一次；吸出上清液到新管子中，在原管子中再加入60％ACN/0.5％HAC，37度40min，吸出上清液，與前面的上清液合併，真空抽氣去ACN。
4.日本血吸蟲表皮蛋白酶解肽段的在線色譜分離和質譜鑑定酶解產生的肽混合物，用真空將溶液體積抽減到30μl。之後，每個組分的肽混合物上樣到一個反相捕獲柱(C18，5μm，300，300μm i.d×5mm，LC Packings)，在20μl/min的流速下脫鹽。然後這個捕獲柱和一個分析用的75μm×150mm C18柱(LCPackings)相連接，肽混合物就在200nl/min的流速下，從這個柱子上洗脫進入裝有Protana NanoES的電噴霧離子源的QSTAR pulseri中。Agilent 1100毛細液相系統(Agilent Technologies)用來提供流動相A(0.5％乙酸/水)和流動相B(0.5％乙酸/乙腈)，線性梯度是60分鐘內5％B到50％B，30分鐘內50％B到90％B，然後是在90％B停留15分鐘。在分析柱後通過一個不鏽鋼的兩通(Valco Instrument)連接一個10μm直徑的PicoTip納噴霧頭(New Objective)，加上2500-3000伏的噴霧電壓，以獲得穩定的噴霧。MS/MS串聯質譜譜圖通過信息依賴的採集(IDA)和任務-循環增強來記錄。在每個測定掃描中，選取3-6個信號最強、帶2到3個電荷的離子，用滾動碰撞能量打碎，以獲得串聯質譜的信息。
5.日本血吸蟲表皮蛋白的軟體搜索鑑定用牛胰酶的自裂解片段如([M+H]+)1153.5741，2163.0569和2274.1600作為內標，或者以預先資料庫搜索得到的得分高的肽段的分子量，來校正所有的質譜譜圖。質譜搜索用的資料庫，包括從8420個從EST cluster預測得到的血吸蟲蛋白質序列，以及可能的汙染蛋白質序列如牛胰酶的序列、宿主蛋白汙染如人蛋白質序列、小鼠蛋白質序列、大鼠蛋白質序列、兔子蛋白質序列和角蛋白序列等。搜索軟體是MASCOT(http://www.matrixscience.com/，Matrix Science)。搜索參數為最大漏切點，3個；monoisotopic；肽電荷數，+1/+2/+3；修飾，半胱氨酸carbamoylmethylation和methionine氧化。搜索結果合併後，用下列標準進行過濾篩選(1)對每一個串聯質譜譜圖的搜索結果列表，只提取排位在第一個的結果，其他的則丟棄；(2)搜索得到的肽段中如果有KR，KK，RK，RR等序列，則這個肽段丟棄；(3)搜索得到的肽段，長度在8個胺基酸以上的保留，小於8個胺基酸的丟棄；(4)重複打到的肽段，只計算其中分值最高的，把這些肽段分值加起來，做為蛋白的得分；(5)蛋白的得分超過60，就認為是可信的結果。低分的蛋白，手工檢查後保留或者丟棄。匹配到宿主或者牛胰酶、角蛋白的肽段，則丟棄。
實施例2日本血吸蟲表皮蛋白的生物信息學分析和功能注釋。
1.同源性和相似性分析。日本血吸蟲表皮蛋白序列對GenBank的非冗餘資料庫(Non-redundant，NR)做BLASTP比對；日本血吸蟲表皮蛋白序列對Swissprot資料庫做BLASTP同源性比對。根據比對結果得到的與已知其他物種或已知的血吸蟲蛋白的序列相似性，做出日本血吸蟲表皮蛋白的功能注釋。
2.文獻查檢。根據已經發表的文獻報導，發現鑑定得到的50個表皮蛋白在蟲體上的位置，有一些的確在血吸蟲表皮上。而其他則是新發現的表皮蛋白。以下表皮分離和質譜鑑定得到的蛋白，根據文獻報導，就是已知的表皮蛋白，且有些蛋白已經進行了疫苗和抗原研究，如paramyosin，tropomyosin，myosin，dynein light chain1，22.6 kDa tegument membrane-associated antigen，tegumental antigen Sm20，nitric oxide synthase 1(NOS1)，leucine aminopeptidase，14-3-3 proteins，SnaK，cathepsin B-like cysteine protease precursor，21.7 kDa antigen，FK506-bindingprotein50(immunophilin)。
實施例3日本血吸蟲表皮蛋白的實驗驗證。
為了進一步驗證用蛋白質組學手段鑑定得到的血吸蟲表皮蛋白，選取了一個Immunophilin(SjFKBP50，GenBank登錄號為AY815389)做免疫螢光抗體原位雜交實驗，對Immunophilin蛋白作定位分析。
實驗方法血吸蟲成蟲用冷凍包埋劑(OCT)完全包埋，切成5μm厚的切片。用抗Immunophilin的抗體覆蓋切片，在37℃反應60分鐘。該抗體是用重組表達的Immunophilin免疫小鼠製備的單克隆抗體。隨後切片用PBS洗滌，再加入FITC-偶聯的兔抗鼠免疫球蛋白的抗體(1∶40稀釋，用含有0.5mg/ml的Evans藍的PBS稀釋)，置溼盒中37℃反應60分鐘。染色結果用Leica DM-RB型螢光顯微鏡觀察並拍照，得圖1。從圖1可以看出，Immunophilin確實分布在血吸蟲成蟲的表皮上，T指tegument(表皮)，G指gut(腸道)，ST指subtegument(下表皮)，綠色螢光部分是Immunophilin的信號。免疫螢光抗體原位雜交實驗結果表明，前面表皮分離和質譜鑑定的結果是可信的。
序列表110上海人類基因組研究中心120日本血吸蟲表皮蛋白基因、蛋白及其應用130NP-1025816046170PatentIn version 3.321012111465212DNA213日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)4001acaactgagg aagccattgc attttccttt cgagtaagta catagagaat gcaaatcttt 60gtgaagacgt tgacggggaa gacgatcaca ttggaggttg agcctagtga cacgattgag120aatgtgaaag cgaaaatcca agataaagaa ggtattcctc ctgaccaaca acgtttgata180ttcgctggta aacagttgga agatggtcgt acgttatctg actacaacat tcagaaggag240tctactttac accttgttct ccgtctacgt ggtggtatgc agatctttgt gaagacattg300acggggaaga cgatcacatt ggaggttgag cctagtgaca cgattgagaa tgtgaaagcg360aaaatccaag ataaagaagg tattcctcct gaccaacaac gtttgatatt cgctggtaaa420cagttggaag atggtcgtac gttatctgac tacaacattc agaaggagtc aactttacac480cttgttctcc gtctacgtgg tggtatgcag atctttgtga agacgttgac ggggaagacg540atcacattgg aggttgagcc tagtgacacg attgagaatg tgaaggcgaa aatccaagat600aaagaaggta ttcctcctga ccaacaacgt ttgatattcg ctggtaaaca gttggaagat660ggtcgtacgt tatctgacta caacattcag aaggagtcta ctttacacct tgttctccgt720ctacgtggtg gtatgcagat tttcgttaag actttgacag gaaagacgat tacgctggag780gttgagccta gtgacacgat tgagaatgtg aaggcgaaaa ttcaagataa agaaggtatt840cctcctgacc aacaacgttt gatattcgct ggtaaacagt tggaagatgg tcgtacgtta900tctgactaca acattcagaa ggagtctact ttacaccttg ttctccgtct acgtggtggt960atgcagatct ttgtgaagac attgacgggg aagacgatca cattggaggt tgagcctagt 1020gacacgattg agaatgtgaa agcgaaaatc caagataaag aaggtattcc tcctgaccaa 1080caacgtttga tattcgctgg taaacagttg gaagatggtc gtacgttatc tgactacaac 1140attcagaagg agtctacttt acaccttgtt ctccgtctac gtggtggtat gcagatcttt 1200gtgaagacat tgacggggaa gacgatcaca ttggaggtag agcctagtga cacgattgag 1260aatgtgaaag cgaaaatcca agataaagaa ggtattcctc ctgaccaaca acgtttgata 1320ttcgctggta aacagttgga agatggtcgt acgttatctg actacaacat tcagaaggag 1380tcaactttac accttgttct tcgtcttcgt ggtggactgt aatatttcgg atttgagtta 1440ttaaataaat tttagtttca ttctt 1465
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權利要求
1.一類日本血吸蟲表皮蛋白，其特徵在於，選自下組(a)具有SEQ ID No.24～SEQ ID No.46所示胺基酸序列的蛋白；(b)由(a)的蛋白發生一個或幾個胺基酸置換、缺失或插入而形成的具有(a)蛋白相同活性的蛋白。
2.如權利要求1所述的蛋白，其特徵在於，它具有SEQ ID No.24～SEQ ID No.46所示的胺基酸序列。
3.一類日本血吸蟲表皮蛋白基因，其特徵在於，它編碼權利要求1所述的蛋白。
4.如權利要求3所述的基因，其特徵在於，選自下組(a)SEQ ID No.1～SEQID No.23所示的核苷酸序列；(b)SEQ ID No.1～SEQ ID No.23所示的核苷酸序列中每條序列的互補序列；(c)與SEQ ID No.1～SEQ ID No.23所示的核苷酸序列中每條序列有至少70％同源性、且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。
5.如權利要求3或4所述的基因，其特徵在於，它具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.23所示的核苷酸序列。
6.一類日本血吸蟲病防治疫苗，其特徵在於，所述疫苗以權利要求1所述的蛋白為免疫原。
7.一類能與權利要求1所述的蛋白特異性結合的抗體。
8.權利要求1所述的蛋白在製備預防和治療日本血吸蟲病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)表皮蛋白及其基因序列，還公開了與該蛋白特異結合的抗體，以及把表皮蛋白作為免疫原製備所得的日本血吸蟲病防治疫苗，此外，本發明還公開了日本血吸蟲表皮蛋白在製備預防和治療日本血吸蟲病的藥物中的應用。運用本發明的日本血吸蟲表皮蛋白，可研究血吸蟲治療藥物的作用靶點，從而在開發研製預防或治療血吸蟲病的藥物過程中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/12GK1986563SQ20051011171
公開日2007年6月27日 申請日期2005年12月20日 優先權日2005年12月20日
發明者韓澤廣, 劉鋒, 王志勤, 胡薇, 馮正 申請人:上海人類基因組研究中心, 中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所