用於抗血管生成治療的雙特異性結合分子的製作方法

2023-05-18 19:00:26

專利名稱：用於抗血管生成治療的雙特異性結合分子的製作方法
技術領域：
本發明涉及人類治療的領域，尤其是癌症治療的領域，以及適於該治療中的藥物和組合物。
現有技術如US 2008/0014196中所概述 ，血管生成涉及於大量疾病(包括實體瘤及轉移)的發病機制中。在腫瘤生長的情況下，血管生成對於自增生轉變為瘤形成以及對於為腫瘤生長及轉移提供營養似乎是至關重要的(Folkman等人，Nature 339-58 (1989)),這使腫瘤細胞相比於正常細胞獲得生長優勢。因此，抗血管生成治療已成為若干類型腫瘤的重要治療選擇。最重要的促血管生成因子之一為血管內皮生長因子(VEGF-A，以下稱為「VEGF」)，其屬於包括胎盤生長因子(PlGF)、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D及VEGF-E的基因家族，並且以由替代性拼接單一基因的mRNA產生的若干同工型形式存在，VEGF165為生物學上最相關的同工型。因此，大多數依賴抗血管生成的抗癌治療已集中於阻斷VEGF路徑(Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov.2004 年 5 月；3(5):391-400)。近來，D114(或Delta樣4或delta樣配體4)已鑑定為癌症治療的有希望的靶點。D114為Notch配體的Delta家族成員。Notch信號傳導在許多癌症中，例如在T細胞急性淋巴母細胞白血病中及在實體腫瘤中調控異常(Sharma等人，2007，Cell Cycle6 (8) : 927-30 ；Shih 等人，Cancer Res. 2007 年 3 月 I 日；67 (5) : 1879-82)。D114的細胞外域由N-末端域、Delta/Serrate/Lag-2 (DSL)域、及一串八個表皮生長因子(EGF)樣重複構成。一般而言，認為EGF域包含胺基酸殘基218-251 (EGF-1 ;域I)、252-282 (EGF-2 ;域 2)、284-322 (EGF-3 ;域 3)、324-360 (EGF-4 ;域 4)及 362-400 (EGF-5 ;域5)，同時DSL域在hDl 14的約胺基酸殘基173-217處，並且N-末端域在約胺基酸殘基27-172處(W0 2008/076379)。已報導D114由血管內皮高度選擇性表達，特別是在動脈內皮中高度選擇性表達(Shutter 等人，(2000)Genes Develop. 14:1313-1318)。近來在小鼠中的研究已顯示，D114由VEGF誘導且為限制血管萌芽及分枝的負反饋調節子。與此作用一致，缺失或抑制D114會導致血管生成過度(Scehnet等人，Blood. 2007年6月I日;109 (11) :4753-60)。這種不受限制的血管生成由於非生產性(non-productive)血管的形成而反常地減緩腫瘤生長，即使在對抗VEGF治療具有抗性的腫瘤中也是如此(Thurston等人，Nat Rev Cancer. 2007年5 月；7(5) :327-31 ；W0 2007/070671 ；Noguera-Troise 等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444(7122))。除對腫瘤血管生成的作用外，抑制D114還顯示降低臨床前腫瘤模型中癌幹細胞的頻率(Hoey 等人，Cell Stem Cell. 2009 年 8 月 7 日；5 (2) : 168-77)。已公開的處於臨床(前)研發中的若干靶向D114的生物化合物有REGN-421 ( = SAR153192 ;Regeneron，Sanofi-Aventis ;W0 2008076379)及0PM-21M18 (OncoMed) (Hoey 等人，Cell Stem Cell. 2009 年 8 月 7 日；5 (2) : 168-77)，兩者均為完全人 D114 抗體；YW152F (Genentech),—種人化 D114 抗體(Ridgway 等人，Nature. 2006年 12 月 21 日；444 (7122) :1083-7) ;D114_Fc (Regeneron，Sanofi-Aventis)，一種由 D114 細胞外區域及人IgGl的Fe區域構成的重組融合蛋白(Noguera-Troise等人，Nature. 2006年 12 月 21 日；444(7122))ο已顯示在多個腫瘤類型的異種移植模型中及在抗VEGF抗性腫瘤模型中，相比於單獨的抗VEGF,VEGF與D114的組合抑制會提供優越的抗腫瘤活性(Noguera-Troise等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122) : 1032-7 ；Ridgway 等人，Nature. 2006 年 12 月 21H ；444(7122):1083-7 ；US2008175847)。單克隆抗體(MAb)及融合蛋白鑑於其治療應用具有若干缺點為了防止其降解，其必須儲存在接近冰點的溫度。此外，因為其在消化道中快速消化，所以其不適於口服給藥。MAb用於癌症治療的另一主要限制為轉運不良，這導致濃度較低以及不能靶向於腫瘤中的所有細胞。此外，基於靶向VEGF及D114兩者的現有技術的治療代表了涉及兩種單獨的抑制劑(即VEGF結合分子和獨立的D114結合分子)的組合治療。然而，這些治療具有以下缺點兩種獨立藥物的研發及生產涉及高成本和大量資源，兩種藥物可能具有不同藥代動力學性質，以及給予兩種藥物對患者造成不便。鑑於以上所述，本發明的一個目標在於提供用於人類抗腫瘤治療的改良分子。本發明基於將一個或多個VEGF結合分子與一個或多個D114結合分子合併在單一治療劑中的概念。因此，本發明涉及包含一個或多個D114結合分子與一個或多個VEGF結合分子的雙特異性結合分子。在下文中，除非另有說明，則術語「結合分子」(或「抗原結合分子」)是指D114結合分子(特別是免疫球蛋白單一可變域)或VEGF結合分子(特別是免疫球蛋白單一可變域)或兩者。術語「雙特異性結合分子」是指包含至少一個D114結合分子(或「結合組分」)和至少一個VEGF結合分子(或結合組分)的分子。雙特異性結合分子在結合Dl 14或VEGF的分子部分中，即分別在其「D114結合組分」(或抗D114組分)或「VEGF結合組分」(或抗VEGF組分)中，可含有一個以上Dl 14結合分子和/或一個以上VEGF結合分子，即在雙特異性結合分子含有雙互補位(biparatopic,如下文所定義)D114結合分子和/或雙互補位VEGF結合分子的情況下。本發明的雙特異性結合分子適於用作預防、治療、減輕和/或診斷可通過抑制D114而調節的疾病或病症(例如癌症)的組合物中的藥理學活性劑。本發明的另一目標在於提供預防、治療、減輕和/或診斷這些疾病、病症或症狀的方法，其涉及使用和/或給予這些藥物及組合物。特別地，本發明的一個目標在於提供所述藥理學活性劑、組合物和/或方法，其相比於當前使用的和/或本領域中已知的藥物、組合物和/或方法可提供某些優勢。尤其相比於如上所述的常規抗體或其片段，這些優勢包括治療性質和/或藥理學性質得到改良和/或其他(例如)對於製造目的而言有利的性質。 更具體地，本發明的一個目標在於提供新分子，且具體為結合哺乳動物且尤其人D114及人VEGF的分子，其中所述分子適用於如本文所述的治療及診斷目的。

發明內容
根據第一方面，提供雙特異性結合分子，其於單一分子中包含D114結合組分及VEGF結合組分。更具體地，本發明的雙特異性結合分子基本上包含(i)特異性結合D114的至少一個表位的D114結合組分和(ii)特異性結合VEGF的至少一個表位的VEGF結合組分，其中所述組分以同時結合Dl 14及VEGF的方式或一次僅結合Dl 14或VEGF的方式彼此連接。根據本發明的優選方面，所述兩種組分包含一個或多個可彼此獨立地為VHH或域抗體的免疫球蛋白單一可變域、和/或如本文所定義的任一其他種類的免疫球蛋白單一可變域，例如VL域，條件是這些免疫球蛋白單一可變域各自與抗原(D114或VEGF)結合。
根據優選的實施方案，免疫球蛋白單一可變域具有相同類型，特別地，所有免疫球蛋白單一可變域均為VHH或域抗體。根據特別優選的實施方案，所有免疫球蛋白單一可變域均為VHH，優選為人化(或如本文定義的「序列最優化」)VHH。因此，本發明涉及包含(任選地人化或序列最優化的)抗Dl 14 VHH和(任選地人化或序列最優化的)抗VEGF VHH的雙特異性結合分子。然而，本領域技術人員會了解，本文的教導可以類似方式應用於包括其他抗D114或抗VEGF免疫球蛋白單一可變域(例如域抗體)的雙特異性結合分子。在另一方面中，本發明涉及編碼本發明的雙特異性結合分子的核酸以及含有所述核酸的宿主細胞。本發明還涉及一種產品或組合物，其含有或包含至少一種本發明的雙特異性結合分子和任選的這些組合物的一種或多種其他組分。本發明還涉及製備或產生本文所述的雙特異性結合分子、核酸、宿主細胞、產品及組合物的方法。本發明還涉及本文所述雙特異性結合分子、核酸、宿主細胞、產品及組合物的應用及用途，以及預防和/或治療可通過抑制D114而調節的疾病及病症的方法。本發明的這些及其他方面、實施方案、優勢及應用將由下文進一步描述而變得明確。定義除非另有指示或定義，否則所有所用術語均具有本領域中的通常含義，該含義將為本領域技術人員所了解。參考例如標準手冊，如Sambrook等人，「MolecularCloning:A Laboratory Manual，，(第 2 版)，第 1-3 卷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989) ；Lewin, 「Genes IV」，Oxford University Press, New York, (1990);及 Roitt等人，「 Immunology」(第 2 版)，Gower Medical Publishing, London, New York (1989),以及本文中引用的一般現有技術；此外，除非另有說明，否則未具體詳述的所有方法、步驟、技術及操作均可以且已經以本身已知的方式進行，該方式將為本領域技術人員所了解。亦參考例如標準手冊、上述一般現有技術及其中引用的其他參考文獻。除非另有說明，否則術語「免疫球蛋白」及「免疫球蛋白序列」在本文中無論是指重鏈抗體還是指常規4鏈抗體，均用作一般術語以包括全長抗體、其單個的鏈以及其所有部分、域或片段(包括但不限於抗原結合域或片段，分別例如VHH域或VH/VL域)。此外，本文所用的術語「序列」(例如在「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「(單一)可變域序列」、「VHH序列」或「蛋白序列」等的術語中)一般應理解為既包括相關胺基酸序列，又包括編碼所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解釋。如本文所用的術語(多肽或蛋白的)「域」是指摺疊蛋白結構，其能夠獨立於蛋白的其餘部分維持其三級結構。一般而言，域負責蛋白的單個的功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其他蛋白而不損失蛋白的其餘部分和/或域的功能。如本文所用的術語「免疫球蛋白域」是指抗體鏈(例如常規4鏈抗體的鏈或重鏈抗體的鏈)的球形區域，或是指基本上由這類球形區域組成的多肽。免疫球蛋白域 的特徵在於其維持抗體分子的免疫球蛋白摺疊特徵，其由排列在兩個β摺疊中任選由保守二硫鍵穩定的約7個反平行β摺疊股的2層夾層(sandwich)組成。如本文所用的術語「免疫球蛋白可變域」是指基本上由本領域及下文中分別稱為「框架區I 」或「 FR I 」、「框架區2 」或「 FR2 」、「框架區3 」或「 FR3 」、及「框架區4 」或「 FR4 」的四個「框架區」組成的免疫球蛋白域；所述框架區由本領域及下文中分別稱為「互補決定區I」或「⑶R1」、「互補決定區2」或「⑶R2」、及「互補決定區3」或「CDR3，，的三個「互補決定區」或「CDR」中斷。因此，免疫球蛋白可變域的一般結構或序列可如下表示為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變域正是因具有抗原結合位點而賦予抗體對抗原的特異性。如本文所用的術語「免疫球蛋白單一可變域」是指能夠在不與其他免疫球蛋白可變域配對的情況下特異性結合抗原的表位的免疫球蛋白可變域。本發明含義中的免疫球蛋白單一可變域的一個實例為「域抗體」，例如免疫球蛋白單一可變域VH及VL (VH域及VL域)。免疫球蛋白單一可變域的另一實例為如下文定義的駱駝科的「VHH域」(或簡稱為
「麗」)。鑑於以上定義，常規4鏈抗體(例如本領域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常規4鏈抗體的Fab片段、F(ab』)2片段、Fv片段(例如二硫鍵連接的Fv或scFv片段)、或雙特異抗體(均為本領域中已知)的抗原結合域，通常不視為免疫球蛋白單一可變域，這是因為在該情況下，與抗原的各別表位發生結合通常並非通過一個(單一)免疫球蛋白域，而是通過共同結合各別抗原的表位的一對(締合)免疫球蛋白域(例如輕鏈及重鏈可變域)，即通過免疫球蛋白域的VHVL對。「VHH域」，亦稱為VHH、VhH域、VHH抗體片段和VHH抗體，已最初描述為「重鏈抗體」(即「缺乏輕鏈的抗體」)的抗原結合免疫球蛋白(可變)域(Hamers-CastermanC，Atarhouch Tj Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，HamersR. : 「Naturally occurring antibodies devoid of light chains，，；Nature363，446-448 (1993))。已經選擇術語「VHH域」以將這些可變域與存在於常規4鏈抗體中的重鏈可變域(其在本文中稱為「νΗ域」或「VH域」)以及存在於常規4鏈抗體中的輕鏈可變域(其在本文中稱為「'域」或「VL域」)進行區分。VHH域特異性結合表位而沒有無其他抗原結合域(此與常規4鏈抗體中的VH或VL域相反，在該情況下表位由VL域與VH域一起識別)。VHH域為由單一免疫球蛋白域形成的小型穩定及高效的抗原識別單元。在本發明的上下文中，術語VHH域、VHH、VhH域、VHH抗體片段、VHH抗體以及「Nanobody ⑧」及 「Nanobody ⑧域」 (「Nanobody」 為 Ablynx N. V.公司，Ghent, Belgium 的商標)可互換使用且表示免疫球蛋白單一可變域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4結構且無需第二免疫球蛋白可變域的存在即可特異性結合表位)，且其由例如WO2009/109635圖I中定義的所謂「印記殘基(hallmark residue) 」與VH域區分。如例如Riechmann 及 Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999)的圖2中所示，對於駱駝科的VHH域所應用的免疫球蛋白單一可變域(例如VHH)的胺基酸殘基，根據Kabat等人給出的VH域的一般編號法來編號(「Sequence of proteins ofimmunological interest」，US Public Health Services, NIH Bethesda, MD,公開案第 91號)。根據該編號法，-FRl包含在位置1-30處的胺基酸殘基，-⑶Rl包含在位置31-35處的胺基酸殘基，-FR2包含在位置36-49處的胺基酸，-⑶R2包含在位置50-65處的胺基酸殘基，-FR3包含在位置66-94處的胺基酸殘基，-⑶R3包含在位置95-102處的胺基酸殘基，且-FR4包含在位置103-113處的胺基酸殘基。然而應注意，如本領域中對於Vh域及VHH域所公知的，各CDR中的胺基酸殘基的總數可能不同，且可能不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數(即根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中未被佔據，或實際序列可能含有多於Kabat編號所允許數目的胺基酸殘基)。這意味著一般而言，根據Kabat的編號可能對應或可能不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。對Vh域的胺基酸殘基進行編號且還可以類似方式應用於VHH域的替代方法在本領域中是已知的。然而，除非另有說明，否則在本說明書、權利要求書及附圖中，將遵循如上所述根據Kabat且應用於VHH域的編號。VHH域中的胺基酸殘基的總數將通常在110至120範圍內，常常介於112與115之間。然而應注意較小及較長序列也可適於本文所述的目的。免疫球蛋白單一可變域(例如VHH及域抗體)具有大量使其極有利於在治療中用作功能性抗原結合分子的獨特結構特徵及功能性質。特別地，且不對其進行限制，VHH域(其已本質上經「設計」為在不與輕鏈可變域配對情況下功能性地結合抗原)可充當單一、相對較小、功能性的抗原結合結構單元。由於其獨特性質，如本文定義的免疫球蛋白單一可變域，例如VHHs或VHs (或VLs)，無論是單獨存在還是作為較大多肽(例如雙互補位分子或雙特異性結合分子)的一部分，均提供許多顯著優點·僅需要單一域以高親和性及高選擇性地結合抗原，因而無需存在兩個各別的域，也無需確保這兩個域以正確的空間構象及構型存在(即通過使用特別設計的連接子，如scFv的連接子);·免疫球蛋白單一可變域可從單一核酸分子表達且不需要任何翻譯後修飾(如糖基化)；
·免疫球蛋白單一可變域可輕易經工程改造為多價及多特異性形式(如本文進一步論述)；
·免疫球蛋白單一可變域對其靶點具有高特異性及親和性，具有低遺傳毒性，可通過輸注或注射以外的替代途徑給予；·免疫球蛋白單一可變域對熱、pH、蛋白酶及其他變性劑或變性條件高度穩定，因此可在不使用冷凍設備情況下製備、儲存或運輸；·免疫球蛋白單一可變域無論是以小規模還是以生產規模製備均較為容易且相對廉價。例如，免疫球蛋白單一可變域及含有免疫球蛋白單一可變域的多肽可使用微生物發酵(例如下文進一步公開)產生，不需要像常規抗體那樣使用哺乳動物表達系統； 相比於常規4鏈抗體及其抗 原結合片段，免疫球蛋白單一可變域是相當小的(約15kDa，或為常規IgG的1/10)，因此顯示穿透入組織(包括但不限於實體瘤及其他緻密組織)的穿透性(更)高，且可以以高於這些常規4鏈抗體及其抗原結合片段的劑量給予；· VHH具有特定的所謂「空腔結合性質」(尤其是由於相比於4鏈抗體的VH域，其CDR3環更為延伸)，因此其也能夠進入常規4鏈抗體及其抗原結合片段不能進入的靶點及表位；· VHH具有高度可溶及極其穩定且不具有凝集趨勢的特別優勢(正如由Ward等人，Nature 341:544-546(1989)所述的小鼠源性抗原結合域的情況一樣)。本發明的雙特異性結合分子的組分中含有的免疫球蛋白單一可變域，在獲得所述免疫球蛋白單一可變域的具體生物來源或具體製備方法的方面不受限制。例如，獲得VHH可包括以下步驟(I)分離天然存在的重鏈抗體的VHH域；或篩選包含重鏈抗體或VHH的文庫且從中分離VHH ；(2)表達編碼具有天然存在序列的VHH的核酸分子；(3)任選在親和力成熟之後使具有天然存在序列的VHH 「人化，，(或序列最優化)，或表達編碼所述人化VHH的核酸；(4)使動物物種(特別是哺乳動物物種，例如人)的天然存在抗體的免疫球蛋白單一可變重域「駱駝化」(如下所述)，或表達編碼所述駱駝化域的核酸分子；(5)使VH 「駱駝化」，或表達編碼這類駱駝化VH的核酸分子；(6)使用以合成方式或半合成方式製備蛋白、多肽或其他胺基酸序列的技術；(7)使用核酸合成技術製備編碼VHH域的核酸分子，隨後表達由此獲得的核酸；(8)使重鏈抗體或VHH經受親和力成熟、誘變(例如隨機誘變或定點誘變)和/或任何其他技術以增加VHH的親和性和/或特異性；和/或(9)組合或選擇上述步驟。適於進行上述步驟的方法及技術在本領域中是已知的且將為本領域技術人員所了解。根據一個具體實施方案，存在於本發明的雙特異性結合分子中的免疫球蛋白單一可變域為胺基酸序列基本上對應於天然存在VHH域的胺基酸序列的VHH，但其已經人化(序列最優化，任選在親和力成熟之後)，即通過以人的常規4鏈抗體可變重域中相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基置換該天然存在VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基。這可使用本領域中已知的方法進行，所述方法可由本領域技術人員以常規方式使用。
序列最優化的VHH可含有一個或多個完全人框架區序列，且在一個甚至更具體的實施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分，或之此高度同源的人框架區序列。因此，人化方案可包含單獨或組合使用生殖系VH基因(例如DP 47、DP29及DP 51)的相應框架1、2和3(FR1、FR2和FR3)殘基來置換任何VHH殘基。本發明的免疫球蛋白單一可變域的適合的框架區(FR)可選自那些例如WO 2006/004678中公開的FR，且具體地包括所謂「KERE」及「GLEW」類型。在約位置44至47處具有胺基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白單一可變域及其分別的人化對應物是特別優選的。例如，屬於103P，R，S組和/或GLEW組(如下文所定義)的VHH的人化取代為108Q至108L。使免疫球蛋白單一可變域人化的方法在本領域中是已知的。
在治療應用方面具有改良的性質(例如增強的親和性或減少的免疫原性)的結合免疫球蛋白單一可變域，可通過本領域中已知的技術而從單個的結合分子獲得，所述技術例如親和力成熟(例如從合成、隨機或天然存在免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人化、合併源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引物的PCR組裝、及本領域技術人員公知的用於工程改造免疫球蛋白序列的類似技術；或任何上述者的任何適合組合，也稱為如本文所述的「序列最優化」。例如參考標準手冊以及其他公開及實例。適當時，可通過使另一結合分子親和力成熟來獲得親和性增加的結合分子，所述另一結合分子表示就親和力成熟分子而言的「親本」結合分子。獲得結合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公開於例如WO 2006/040153及WO2006/122786中。亦如其中所詳述，源自駱駝科的VHH域可通過以人常規4鏈抗體VH域中相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基而經「人化」(本文中亦稱為「序列最優化」，除人化外，「序列最優化」也可涵蓋通過提供VHH改良性質的一個或多個突變對序列進行的其他修飾，例如移除潛在的翻譯後修飾位點)。人化VHH域可含有一個或多個完全人框架區序列，且在一甚至更具體實施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分，任選與JH序列(例如JH5)合併的人框架區序列。域抗體，亦稱為「Dab」 及 「dAb」(術語「域抗體(Domain Antibodies) 」 及 「dAb」被GlaxoSmithKline公司集團用作商標)，已公開於例如以下文獻中Ward, E. S.，等人:「Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variabledomains secreted from Escherichia coli，，；Nature 341: 544-546 (1989) ；Holt, L.J·等人「Domain antibodies:proteins for therapy，，；TRENDS in Biotechnology21(11) :484-490(2003);及冊 2003/002609。域抗體基本上對應於非駱駝科哺乳動物的抗體(特別是人4鏈抗體)的VH或VL域。為了以單一抗原結合域的形式(即在不與VL域或VH域分別配對的情況下)結合表位，需要例如通過使用人單一 VH或VL域序列的文庫對這些抗原結合性質進行具體選擇。如同VHH的域抗體的分子量為約13kDa至約16kDa，且若源自完全人序列，則不需要進行人化以供例如人治療使用。在VHH域的情況下，域抗體在原核表達系統中也很好地得以表達，從而顯著降低總製造成本。此外，本領域技術人員還將了解，有可能將一個或多個上述⑶R 「移植」於其他「支架」(包括但不限於人支架或非免疫球蛋白支架)上。適於所述CDR移植的支架及技術在本領域中是已知的。可互換使用的術語「表位」及「抗原決定簇」是指大分子(例如多肽)的一部分，其由抗原結合分子(例如常規抗體或本發明的多肽)識別，且更具體地由所述分子的抗原結合位點識別。表位定義免疫球蛋白的最小結合位點，因此表示免疫球蛋白的特異性的靶點。可「結合」或「特異性結合」某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、對其「具有親和性」和/或「具有特異性」的多肽(例如免疫球蛋白、抗體、本發明的免疫球蛋白單一可變域、或一般而言結合分子或其片段)是指「對抗」或「針對」該表位、抗原或蛋白，或為關於該表位、抗原或蛋白的 「結合」分子。在上下文中，VEGF或D114結合分子也可分別稱為「VEGF中和」分子或「D114中和」分子。—般而言，術語「特異性」是指特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(例如免疫球蛋白單一可變域)分子可結合的不同類型抗原或表位的數目。可基於抗原結合分子的親和性和/或親抗原性(avidity)確定其特異性。由抗原與抗原結合蛋白的解離平衡常數(Kd)所表示的親和性，是表位與抗原結合蛋白上抗原結合位點之間結合強度的量度KD值越小，表位與抗原結合分子之間的結合強度越強(或者，親和性也可表示為親和性常數(Ka)，其為1/KD)。如本領域技術人員將了解(例如基於本文其他公開的內容)，取決於具體感興趣的抗原，可以以以本身已知方式測定親和性。親抗原性為抗原結合分子(例如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽)與相關抗原之間結合強度的量度。親抗原性與以下兩者有關與其抗原結合分子上的抗原結合位點之間的親和性，以及存在於抗原結合分子上的相關結合位點的數目。抗原結合分子識別表位的部分稱為互補位。除非另有說明，否則術語「D114結合分子」或「VEGF結合分子」包括如本文定義的抗Dl 14或抗VEGF抗體、抗Dl 14抗體或抗VEGF抗體片段、「抗Dl 14抗體樣分子」或「抗VEGF抗體樣分子」、及與上述任一者的綴合物。抗體包括但不限於單克隆抗體及嵌合單克隆抗體。術語「抗體」涵蓋通過於宿主細胞中重組表達產生的完全免疫球蛋白(如單克隆抗體)、以及抗體片段或「抗體樣分子」，包括單鏈抗體及線型抗體，例如描述於WO 02/056910中的所謂的「SMIP」 ( 「小模塊免疫藥物」)；抗體樣分子包括如本文定義的免疫球蛋白單一可變域。抗體樣分子的其他實例為免疫球蛋白超家族抗體(IgSF)或CDR移植分子。「VEGF結合分子」或「D114結合分子」分別是指以下兩者單價靶結合分子(即與各別靶點的一個表位結合的分子)，以及二價或多價結合分子(即結合一個以上表位的結合分子，例如如下文定義的「雙互補位」分子)。含有一個以上VEGF (或Dl 14)結合免疫球蛋白單一可變域的VEGF (或Dl 14)結合分子亦稱為「形式化(formatted) 」結合分子,其在靶結合組分內除免疫球蛋白單一可變域外也可包含連接子和/或具有效應器功能的部分，例如半衰期延長部分(如白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域)、和/或融合配偶體(如血清白蛋白)和/或連接聚合物(如PEG)。如本文所用的術語「雙互補位VEGF (或D114)結合分子」或「雙互補位免疫球蛋白單一可變域」將是指包含如本文定義的第一免疫球蛋白單一可變域及第二免疫球蛋白單一可變域的結合分子，其中兩個分子結合各別抗原的兩個非重疊表位。雙互補位結合分子由對於表位具有不同特異性的免疫球蛋白單一可變域構成。識別表位的抗原結合分子(例如抗體或本發明的免疫球蛋白單一可變域)的部分稱為互補位。即使是次優選的形式化結合分子，也可包含識別相同或重疊表位或其各別抗原的兩個相同免疫球蛋白單一可變域或兩個不同免疫球蛋白單一可變域。在此情況下，就VEGF而言，所述兩個免疫球蛋白單一可變域可與形成VEGF 二聚體的兩個單體中的相同或重疊表位結合。
通常，本發明的結合分子將以如例如於Biacore或Kinexa分析中測量的10E-5至10E-14摩爾/升(M)或10E-14摩爾/升以下、且優選10E-7至10E-14摩爾/升(M)或10E-14摩爾/升以下、更優選10E-8至10E-14摩爾/升、且甚至更優選10E-11至10E-13的解離常數(Kd)，和/或以至少10E7ME-1、優選至少10E8ME-1、更優選至少10E9ME-1，例如至少10E11ME-1的締合常數(Ka)結合。任何大於10E-4M的Kd值一般都視為指示非特異性結合。優選地，本發明的多肽將以小於500nM、優選小於200nM、更優選小於ΙΟηΜ，例如小於500pM的Kd結合所要結合的抗原(即分別為VEGF或D114)。抗原結合蛋白對抗原或表位的特異性結合可以以本身已知的任何適合方式來測定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或競爭性結合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夾心式競爭性分析(sandwich competition assay))及本領域中本身已知的其不同變化形式。胺基酸殘基將根據如本領域中公知且達成一致的標準三字母或一字母胺基酸碼加以指示。在比較兩個胺基酸序列時，術語「胺基酸差異」是指相比於第二序列，在參考序列某一位置處指定數目胺基酸殘基的插入、缺失或取代。在取代的情況下，所述取代將優選為保守胺基酸取代，所述保守胺基酸是指胺基酸殘基被化學結構類似的另一胺基酸殘基置換，且其對多肽的功能、活性或其他生物性質影響較小或基本上無影響。這些保守胺基酸取代在本領域中是公知的，例如根據WO 98/49185，其中保守胺基酸取代優選是以下群組(i)-(v)內的一個胺基酸被同一群組內的另一胺基酸殘基所取代(i)較小脂族非極性或弱極性殘基Ala、Ser> Thr> Pro及Gly ； (ii)極性帶負電殘基及其(不帶電)醯胺Asp、Asn、Glu及Gln ； (iii)極性帶正電殘基His、Arg及Lys ； (iv)較大脂族非極性殘基Met、Leu、Ile、Val及Cys ;及(V)芳族殘基Phe、Tyr及Trp。特別優選的保守胺基酸取代如下Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile 被 Leu 或 Val 取代；Leu 被 Ile 或 Val 取代；Lys 被 Arg、Gln 或 Glu 取代；Met 被 Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。例如相比於其天然生物來源和/或獲得該多肽或核酸分子的反應介質或培養基，在其已與至少一種在該來源或介質(培養基)中其通常與之相關的其他組分分離時，多肽或核酸分子視為「(呈)基本上分離(的形式)」(所述其他組分例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物組分或大分子或至少一種汙染物、雜質或微量組分)。特別地，多肽或核酸分子在其已純化至少2倍、特別是至少10倍、更特別是至少100倍且多達1000倍或1000倍以上時被視為「基本上被分離」。經適合的技術(例如適合色譜技術，如聚丙烯醯胺凝膠電泳)確定，「呈基本上被分離的形式」的多肽或核酸分子優選基本上為均質的。兩個VEGF結合分子序列之間的「序列一致度」指示序列之間相同胺基酸的百分t匕。其可如WO 08/020079第49及50頁段落f)中所述加以計算或測定。「序列相似度」指示相同或表達保守胺基酸取代的胺基酸的百分比。
對Vh域的胺基酸殘基進行編號並且也可以類似方式應用於VHH域的替代方法在本領域中是已知的。然而，除非另有說明，否則在本說明書、權利要求書及附圖中，將遵循如上所述根據Kabat且應用於VHH域的編號。「親和力成熟」的結合分子，特別是VHH或域抗體，在一個或多個CDR中具有一個或多個變化，所述變化導致對其靶點的親和性相比於其各自的親本結合分子有所增加。親和力成熟的結合分子可通過例如由以下所述的本領域中已知的方法來製備Marks 等人，1992，Biotechnology 10:779-783 或 Barbas,等 人，1994，Proc.Nat.Acad. Sci1USA 91:3809-3813. ；Shier 等人，1995，Gene 169:147-155 ;Yelton 等人，1995，Immunol. 155:1994-2004 Jackson 等人，1995，J. Immunol. 154(7):3310-9 ；及Hawkins 等人，1992，J. MoI. Biol. 226(3) :889 896 ；KS Johnson 及 RE Hawkins, 「Affinitymaturation of antibodies using phage display，，，Oxford University Press 1996。對於本發明，除非另有說明，則「SEQ ID Ν0:χ的胺基酸序列」包括a)與各別SEQ ID Ν0:χ中所顯示的序列100%—致的胺基酸序列；b)與各別SEQ ID Ν0:χ中所示序列具有至少80%胺基酸一致度的胺基酸序列；c)與各別SEQ ID NO:X中所示序列具有3個、2個或I個胺基酸差異的胺基酸序列。術語「癌症」及「癌性」是指或描述哺乳動物中通常以不受調控的細胞生長/增殖為特徵的生理症狀。可用本發明的雙特異性結合分子治療的癌症的實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。如US 2008/0014196中表明用D114拮抗劑治療的這些癌症的更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各種類型的頭頸癌。血管生成的調控異常可導致許多可由本發明組合物及方法治療的病症。這些病症包括非腫瘤性症狀及腫瘤性症狀兩者。腫瘤性病症包括但不限於上述病症。非腫瘤性病症包括但不限於如US 2008/0014196中所述用D114拮抗劑治療的不欲或異常的肥大、關節炎、類風溼性關節炎(RA)、牛皮癬、牛皮癬斑塊、類肉瘤病(sarcoidosis)、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性及其他增生性視網膜病(包括早產兒視網膜病、晶狀體後纖維組織增生(retiOlental fibroplasia),新生血管性青光眼、年齡相關的黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成(cornealneovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜紅變(rubeosis))、眼新血管病(ocular neovascular disease))、血管再狹窄(vascular restenosis)、動靜脈畸形(arteriovenous malformations,AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纖維瘤(angiofibroma)、甲狀腺增生(包括格雷夫氏病(Grave’s disease))、角膜及其他組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺動脈高壓(primary pulmonary hypertension)、惡性肺積液(malignant pulmonary effusion)、腦水腫(例如與急性中風/閉鎖性頭部損傷(closedhead injury) /外傷相關)、滑液炎症、RA中的血管醫形成(pannus formation)、骨化性肌炎(myositis ossificans)、肥大性骨形成(hypertropic bone formation)、骨關節炎(OA)、難治癒的腹水症、多囊性卵巢疾病(polycystic ovarian disease)、子宮內膜異位症(endometriosis)、第 3 間隔體液疾病(3rd spacing of fluid disease)(胰腺炎、間隔症候群(compartment syndrome)、灼傷、腸病)、子宮纖維瘤、早產、例如IBD(克羅恩氏病(Crohn’s disease)及潰瘍性結腸炎)的慢性炎症、腎同種異體移植排斥、發炎性腸病、腎病症候群、不欲或異常的組織大量生長(非癌)、血友病性關節(hemophilic joint)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scar)、頭發生長抑制、奧斯勒-韋伯症候群(Osier-Webersyndrome)、化膿性肉芽腫晶狀體後纖維組織增生(pyogenic granuloma retrolentalfibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascular adhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子癇前症(preeclampsia)、腹水症、心包積液(pericardial effusion)(例如與心包炎(pericarditis)相關的心包積液)、及胸膜積液(pleural effusion)。實施方案在第一方面中，本發明涉及包含D114結合組分及VEGF結合組分的雙特異性結合分子。根據優選的實施方案，該D114結合組分及該VEGF結合組分分別包含至少一個D114結合免疫球蛋白單一可變域及至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變域。在優選方面中，該Dl 14結合組分及該VEGF結合組分各自分別包含至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變域及至少一個D114結合免疫球蛋白單一可變域，其中所述各個免疫球蛋白單一可變域具有四個框架區及三個分別為CDRl、CDR2及CDR3的互補決定區，其中a)所述至少一個D114結合免疫球蛋白單一可變域的CDR3具有選自以下的胺基酸序列i)如 SEQ ID NO: I 中所不的 Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro Tyr XaaTyr Asp Xaa,其中位置8 處的 Xaa 為 Arg、Ala 或 Glu ；位置11處的Xaa為Leu或Glu ;及位置14處的Xaa為Tyr或His ;及ii)如 SEQ ID N0:2 中所不的Asp Arg Tyr He TrpAlaArg Gln Gly Glu Tyr TrpGly Ala Tyr Xaa Asp Tyr,其中 Xaa 為 Gin、Ala 或 Tyr ;且其中b)所述至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變域的⑶R3具有如SEQID NO: 3中 所不的胺基酸序列 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr XaaTyr,其中 Xaa 為 Asp 或 Glu,其中該VEGF結合免疫球蛋白單一可變域能夠以彡60%的抑制率阻斷人重組VEGF165與人重組VEGFR-2的相互作用。根據優選的實施方案，所述免疫球蛋白單一可變域為VHH。在優選的實施方案中，本發明的雙特異性結合分子含有已通過任選在親本免疫球蛋白單一可變域的親和力成熟之後進行序列最優化獲得的免疫球蛋白單一可變域，特別是VHH。例如，所述雙特異性結合分子中含有的D114結合分子已從具有表5及SEQ IDNO:4-20中所示胺基酸序列的親本D114結合分子(其為VHH)獲得。
D114結合組分中含有的優選免疫球蛋白單一可變域源自具有顯示於SEQ IDNO: 10中的胺基酸序列的VHH。在某些實施方案中，所述優選的Dl 14結合免疫球蛋白單一可變域通過對源自序列顯示於SEQ ID NO: 10中的VHH的親和力成熟的VHH進行序列最優化而獲得，其中所述親和力成熟VHH具有顯示於SEQ ID NO: 21-27及表16中的胺基酸序列。在一個優選的實施方案中，該親和力成熟的VHH具有選自顯示於SEQ ID N0:22中的序列的胺基酸序列。在優選的實施方案中，VHH已通過對胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 22中的VHH進行序列最優化而獲得。優選的序列最優化的VHH具有選自顯示於SEQ ID NO: 34及35及表23中的序列的胺基酸序列。D114結合組分中含有的另一組優選的免疫球蛋白單一可變域源自具有顯示於SEQID NO: 12中的胺基酸序列的VHH。在某些實施方案中，所述優選Dl 14結合免疫球蛋白單一可變域已通過對源自序列顯示於SEQ ID NO: 12中的VHH的親和力成熟的VHH進行序列最優化而獲得，其中所述親和力成熟的VHH具有顯示於SEQ ID NO:28-33及表17中的胺基酸序列。在一個優選的實施方案中，該親和力成熟的VHH具有選自顯示於SEQ ID N0:30、32及33中的序列的胺基酸序列。在一個甚至更優選的實施方案中，所述VHH已通過對胺基酸序列顯示於SEQ IDNO: 32中的VHH進行序列最優化而獲得。序列最優化的VHH的實例為具有顯示於SEQ IDNO:36-39及表24中的序列的VHH，且特別優選為具有顯示於表25中的SEQ ID NO: 40及41的序列的VHH。能夠以彡60%的抑制率阻斷人重組VEGF165與人重組VEGFR-2的相互作用的VEGF結合免疫球蛋白單一可變域的實例為顯示於SEQ ID NO:42-44及表32中的VHH。優選地，VEGF結合組分中含有的VEGF結合免疫球蛋白單一可變域已通過對胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:43中的VHH進行序列最優化而獲得。優選的VHH具有如SEQ IDNO: 54-62中所示的序列，特別優選的受體阻斷VHH具有顯示於SEQ ID N0:63及64及表59中的序列。在另一實施方案中，本發明涉及雙特異性結合分子，其中D114結合組分和/或VEGF結合組分包含兩個或多個呈免疫球蛋白單一可變域形式的結合分子，其在各別抗原上的不同非重疊表位處分別結合抗原D114或VEGF。本發明的雙特異性結合分子中含有的這些結合分子包含針對分別存在於D114或VEGF中的至少兩個非重疊表位的免疫球蛋白單一可變域，其中所述單個的免疫球蛋白單一可變域以能夠同時結合其各別表位的方式彼此連接。因此，本發明的雙特異性結合分子中含有的抗D114和/或抗VEGF組分可分別包括兩個(或多個)抗D114(或抗VEGF)免疫球蛋白單一可變域，其中所述免疫球蛋白單一可變域為針對D114(或VEGF)靶點內的不同表位。因此，所述雙特異性結合分子中的兩個免疫球蛋白單一可變域將具有不同抗原特異性且因此具有不同的CDR序列。
因為兩個免疫球蛋白單一可變域將包括兩個不同的互補位，所以這些二價結合分子也分別稱為「雙互補位單域抗體構建體(construct) 」 (若免疫球蛋白單一可變域由或基本上由單域抗體組成)或「雙互補位VHH構建體」(若免疫球蛋白單一可變域由或基本上由VHH組成)。在本發明的雙特異性結合分子中，結合分子之一或兩者可為二價；例如所述VEGF結合組分可為雙互補位且Dl 14結合組分可為一個免疫球蛋白單一可變域，或所述VEGF結合組分可為一個免疫球蛋白單一可變域且Dl 14結合組分可為雙互補位。在本發明的雙特異性結合分子中，VEGF結合組分優選含有二價VEGF結合免疫球蛋白單一可變域，例如雙互補位VHH。所述VEGF結合免疫球蛋白單一可變域可為兩個或多個VEGF結合VHH，其為a.能夠以彡60%的抑制率阻斷重組人VEGF與重組人VEGFR-2之間相互作用的相同VHH或 b.結合VEGF的非重疊表位的不同VHH，其中至少一個VHH能夠以彡60%的抑制率阻斷重組人VEGF與重組人VEGFR-2之間的相互作用，且其中至少一個VHH能夠以彡60%的抑制率阻斷該相互作用。能夠以< 60%的抑制率阻斷該相互作用的VHH( 「非受體阻斷」VHH)的實例列於SEQ ID NO: 45-47及表33中；這類優選的VHH具有顯示於SEQ ID NO:45中的序列。適合作為用於人治療的雙特異性結合分子中的組分的這類VHH為具有SEQ ID N0:45中所示序列的、特別是具有SEQ ID NO:65及66及表61中所示序列的VHH的序列最優化變異體，二價VEGF結合VHH中的特別優選的結合配偶體具有顯示於SEQ ID NO: 67 (表63)中的序列。二價抗VEGF VHH構建體例示於SEQ ID NO:48-53及表45中；用於人治療的雙特異性結合分子含有這些VHH的各別序列最優化的變異體。雙特異性結合分子例示於SEQ IDNO:68-73(亦參見表66及圖39)及SEQ ID NO: 74-80 (亦參見表68及圖40)中；所示實例含有作為構建塊(blocks)的親本VHH及親和力成熟VHH;用於人治療的雙特異性結合分子含有這些VHH的各別序列最優化變異體(如SEQ ID NO:81-89及圖48中所例示)。優選的本發明的雙特異性結合分子包含a)序列選自SEQ ID N0:35或41中的序列的VHH作為D114結合組分，及b)以下作為VEGF結合組分i)具有顯示於SEQ ID N0:64中的序列的VHH或ii)包含序列顯示於SEQ ID NO:64中的VHH及序列顯示於SEQ ID N0:67中的VHH的雙互補位VHH。根據優選的實施方案，VEGF結合組分位於N-末端。在以EVQ起始的本發明的雙特異性結合分子中，VHH的N-末端E可被D置換(這經常是序列最優化的結果)或可缺失(就大腸桿菌(E. coli)中的表達而言)。這通常僅適用於位於N-末端的VHH。N-末端E缺失的雙特異性結合分子的實例為圖48中給出化合物A1、A2 及 A3(SEQ ID NO:81-83) 根據優選的實施方案，存在於所述雙特異性結合分子中的結合分子(D114結合組分內的Dl 14結合分子，或VEGF結合組分內的VEGF結合分子，或兩種相鄰的Dl 14及VEGF結合組分)可彼此直接連接(即不使用連接子)或通過連接子連接。連接子優選為連接肽，且將經過選擇以使所述兩個不同結合分子與靶點的各非重疊表位結合，所述靶點可在同一個靶分子內或在兩個不同的分子內。
在雙互補位結合分子的情況下，D114或VEGF結合組分內的連接子的選擇將尤其取決於表位，且特別是取決於免疫球蛋白單一可變域所結合靶點上的表位之間的距離，並且本領域技術人員基於本文公開的內容，任選在一些有限程度的常規實驗之後將了解此選擇。兩個結合分子(兩個VHH或域抗體，或VHH和一個域抗體)或兩個結合組分可分別通過另一 VHH或域抗體而彼此連接(在這些結合分子中，兩個或兩個以上免疫球蛋白單一可變域可直接或通過適合連接子連接至所述另一免疫球蛋白單一可變域)。所述另一 VHH或域抗體可例如為提供增加的半衰期的VHH或域抗體。例如，後一 VHH或域抗體可為能夠結合(人)血清蛋白(例如(人)血清白 蛋白)或(人)轉鐵蛋白(transferrin)的VHH或域抗體。或者，結合各別靶點的兩個或兩個以上免疫球蛋白單一可變域可(直接或通過適合連接子)串聯連接，且所述另一 VHH或域抗體(其可提供增加的半衰期)可直接或通過連接子連接至這些兩個或兩個以上上述免疫球蛋白序列之本文中也公開了與本發明的具體多肽相關、並且例如但不限於包含一定胺基酸序列的合適的連接子，所述胺基酸序列長度優選為9個或9個以上胺基酸、更優選為至少17個胺基酸，例如約20至40個胺基酸。然而，上限並不關鍵，該上限是由於與例如這些多肽的生物醫藥生產的便利性的相關的原因而選擇的。連接序列可為天然存在序列或非天然存在序列。若用於治療目的，則在給予本發明的雙特異性結合分子的受試者中所述連接子優選為非免疫原性的。一組適用連接序列為如WO 96/34103及WO 94/04678中所述源自重鏈抗體鉸鏈區的連接子。其他實例為聚丙氨酸連接序列，例如Ala-Ala-Ala。連接序列的其他優選實例為不同長度的 Gly/Ser 連接子,例如(glyx sery)z 連接子,包括(gly4 ser)3、(gly4 ser)4> (gly4ser)、(gly3 ser)、gly3 和(gly3 ser2)3。連接子的一些非限制性實例顯示於圖40及48中，例如以下連接子GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS;SEQ ID NO:90);GGGGSGGGS(9GS;SEQ ID N0:91);GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(40GS;SEQ ID NO :92).若雙特異性結合分子通過聚合物例如聚乙二醇PEG (聚乙二醇)部分的連接進行修飾，則連接序列優選包括允許連接區域中的此修飾(例如聚乙二醇化)的胺基酸殘基，例如半胱氨酸或賴氨酸。適用於聚乙二醇化的連接子的實例為GGGGCGGGS ( 「GS9, C5」，SEQ ID NO: 93);GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS( 「GS25, C5, SEQ ID NO:94)GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG ("GS27, C14", SEQ ID NO:95)，GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS("GS35, C 15'SEQ ID NO:96)，和GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS( 「GS35, C5」，SEQ ID NO:97)。此外，連接子也可為例如於WO 04/081026中所示的聚(乙二醇)部分。在另一實施方案中，免疫球蛋白單一可變域通過另一部分(任選通過一個或兩個連接子)，例如另一多肽來彼此連接，該另一多肽在一個優選但非限制性實施方案中可為如上所述的另一免疫球蛋白單一可變域。該部分可為基本上非活性的或可具有例如改良多肽的所需性質的生物效應或可賦予多肽一種或多種其他所需性質。例如但不限於，該部分可改良蛋白或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性質。根據一個優選的實施方案，尤其在欲使用或用作治療劑時，本發明的雙特異性結合分子包括延長本發明的多肽在患者血清或其他體液中的半衰期的部分。術語「半衰期」定義為(經修飾)多肽的血清濃度例如由於天然機制所致的多肽降解和/或清除和/或螯合而在體內降低50%所花費的時間。更具體地，該半衰期延長部分可共價連接至或融合至免疫球蛋白單一可變域且可為(但不限於)Fe部分、白蛋白部分、白蛋白片段部分、白蛋白結合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白單一可變域)、轉鐵蛋白結合部分(例如抗轉鐵蛋白免疫球蛋白單一可變域)、聚氧化烯(polyoxyalkylene)分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白結合肽或輕乙基澱粉(HES)衍生物。在另一實施方案中，本發明的雙特異性結合分子包含與存在於血液中的抗原結合的部分，例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、纖維蛋白原(brinogen)或轉鐵蛋白，因而使所得本發明的多肽的體內半衰期增加。根據一個特別優選的實施方案，該部分為白蛋白結合免疫球蛋白且尤其優選為白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域，例如白蛋白結合VHH域。若欲在人中使用，則該白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域優選結合人血清白蛋白且優選為人化白蛋白結合VHH域。結合人血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變域在本領域中是已知的，且進一步詳述於例如WO 2006/122786中。特別地，適用的白蛋白結合VHH為ALB I及其人化對應物ALB8 (W0 2009/095489)。然而，也可使用在以上專利公開案中提及的其他白蛋白結合VHH域。具體適用的白蛋白結合VHH域為由顯示於SEQ ID NO:98中的胺基酸序列組成或含有該胺基酸序列的ALB8。根據本發明的另一實施方案，優選呈VHH形式的兩個免疫球蛋白單一可變域可融合至例如公開於WO 01/79271及WO 03/59934中的血清白蛋白分子。如例如於W001/79271中所述，融合蛋白可通過以下常規重組技術獲得將編碼血清白蛋白或其片段的DNA分子接合至編碼VEGF結合分子的DNA，將所得構建體插入適於在所選宿主細胞(例如酵母細胞(如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))或細菌細胞)中表達的質粒中，接著用融合的核苷酸序列轉染該宿主細胞，並使之在合適條件下生長。適用於HSA的序列顯示於SEQ IDNO:99 中。根據另一實施方案，本發明的多肽的半衰期延長修飾(此修飾亦降低多肽的免疫原性)包含連接藥理學上可接受的合適的聚合物，例如直鏈或支鏈聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可使用任何適合形式的聚乙二 醇化，例如本領域中用於抗體及抗體片段(包括但不限於域抗體及scFv片段)的聚乙二醇化；參考例如Chapman, Nat. Biotechnol. , 54, 531-545 (2002) ；Veronese 及 Harris, Adv.Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003) ;Harris 及 Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003);及WO 04/060965o
用於使多肽聚乙二醇化的各種試劑也是市售的，例如可從NektarTherapeutics, USA 或 NOF Corporation, Japan 購得，所述試劑例如 Sunbright EA 系列、SH 系列、MA 系列、CA 系列及 ME 系列，例如 Sunbright ME-1OOMA、Sunbright ME-200MA及 Sunbright ME-400MA。優選使用(特別是通過半胱氨酸殘基的)定點聚乙二醇化(參見例如Yang等人，Protein Engineering 16, 761-770 (2003)) 例如，出於此目的，PEG可連接至天然存在於本發明的多肽中的半胱氨酸殘基，本發明的多肽可經修飾以便適當引入一個或多個用於連接PEG的半胱氨酸殘基，或包含一個或多個用於連接PEG的半胱氨酸殘基的胺基酸序列可融合至本發明的多肽的N-末端和/或C-末端，以上均使用對本領域技術人員而言本身已知的蛋白工程的技術。
優選地,對於本發明的多肽,使用PEG的分子量大於5kDa(例如大於IOkDa)且小於200kDa (例如小於IOOkDa)，例如在20kDa至80kDa範圍內。關於聚乙二醇化應注意，一般而言，本發明也優選涵蓋已在一個或多個胺基酸位置處經聚乙二醇化的任何雙特異性結合分子，該聚乙二醇化(I)增加體內半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供對於聚乙二醇化本身已知的一種或多種其他有益性質；(4)基本上不影響多肽對其靶點的親和性(例如通過本領域中所述的適合分析所測定，不使該親和性降低50%以上、且更優選不使之降低10%以上)；和/或(5)不影響本發明的雙特異性結合分子的任何其他所需性質。適合的PEG群組及用於特異性或非特異性與之連接的方法將為本領域技術人員所了解。用於使多肽聚乙二醇化的各種試劑也是市售，例如可從NektarTherapeutics, USA 或 NOF Corporation, Japan 購得，所述試劑例如 Sunbright EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如Sunbright⑩ME-100ΜΑ、Sunbright ME-200MA 及 Sunbright ⑩ ME-400MA。根據本發明的一個尤其優選的實施方案，本發明的聚乙二醇化多肽包括一個具有40kDa或60kDa分子量的線性PEG的PEG部分，其中該PEG部分在連接區域中連接至所述多肽，且特別是在如SEQ ID NO: 93中所示的GS9連接肽的位置5處、在如SEQ ID NO: 95中所示的GS27連接肽的位置14處、或在如SEQ ID NO:96中所示的GS35連接肽的位置15處、或在如SEQ ID NO:97中所示的35GS連接肽的位置5處的Cys殘基處連接至所述多肽。如以下化學式中所示，本發明的雙特異性結合分子可經如上提及的PEG試劑之一(例如「Sunbright⑩ME-400MA」)來聚乙二醇化
O%
IlJrfc5Ss.
CH3O-Ip H2CHoQn-CH2CH2CH2NHC(CH2)2-N |
Vj
O含有連接子和/或半衰期延長官能團的雙特異性結合分子顯示於SEQ ID N0:81及圖48中。根據另一實施方案，所述免疫球蛋白單一可變域為如本文所定義的域抗體。存在於本發明的雙特異性結合分子中的免疫球蛋白單一可變域的序列也可具有對應於天然存在VH域已經「駱駝化」的胺基酸序列，即通過以一個或多個存在於重鏈抗體VHH域中相應位置處的胺基酸殘基置換常規4鏈抗體的天然存在可變重鏈胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基。這可以本領域技術人員所了解的本身已知的方式進行，且另外參考WO 94/04678。所述駱駝化可優先發生在存在於VH-VL界面的胺基酸位置處及所謂駱駝科印記殘基處(也例如參見W094/04678)。這些「人化」及「駱駝化」技術及與此相符的優選框架區序列的詳述也可參見WO 2006/040153的第46頁及第98頁及WO 2006/122786的第107頁。所述結合分子分別對D114或VEGF具有特異性，因為其包含分別與D114分子內或VEGF分子內的一個或多個表位特異性結合的一個或多個免疫球蛋白單一可變域。
結合分子對其抗原D114或VEGF的特異性結合可以以本身已知的任何適合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或競爭性結合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夾心式競爭分析)及本領域中本身已知的其不同變化形式來測定。關於分別抗原Dl 14或VEGF，免疫球蛋白單一可變域在物種方面分別不受限制。因此，若欲用於人中的治療目的，則免疫球蛋白單一可變域優選分別結合人D114或人VEGF。然而，分別結合另一哺乳動物物種的D114或VEGF的免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽也在本發明的範圍內。與一個物種形式的D114或VEGF結合的免疫球蛋白單一可變域，可與一個或多個其他物種的各別抗原發生交叉反應。例如，結合人抗原的免疫球蛋白單一可變域可表現出與一個或多個其他靈長類物種的各別抗原和/或與用於疾病動物模型(且特別是用於可通過抑制D114而調節的疾病及病症的動物模型)中的一個或多個動物物種(例如猴(特別是短尾猴或恆河猴)、小鼠、大鼠、兔、豬、犬)(例如本文提及的物種及動物模型)的抗原的交叉反應性。表現所述交叉反應性的本發明的免疫球蛋白單一可變域，在研究和/或藥物研發中是有利的，因為其允許在公認的疾病模型(例如猴(特別是短尾猴或恆河猴)、或小鼠及大鼠)中對本發明的免疫球蛋白單一可變域進行測試。此外，所述結合分子不限於其所針對的抗原的特定域或抗原決定子或不由其所針對的抗原的特定域或抗原決定子限定。優選地，鑑於與除人以外的物種(其欲在治療性D114/VEGF拮抗劑的研發期間將其用作動物模型)的一種或多種抗原分子的交叉反應性，結合分子識別與人抗原具有高一致度的各別抗原的區域中的表位。例如，鑑於使用小鼠模型，本發明的雙特異性結合分子中含有的抗D114免疫球蛋白單一可變域識別完全或部分位於D114的EGF-2域內的表位，該EGF-2域在人與小鼠之間顯示較高的一致度。因此，根據一個優選的實施方案，本發明的雙特異性結合分子包含D114結合分子，其為選自與完全或部分地包含於EGF-2域內的表位結合的免疫球蛋白單一可變域，該EGF-2域對應於SEQ ID NO: 101的胺基酸殘基252-282。若本發明的雙特異性結合分子含有包含多於一個免疫球蛋白單一可變域的雙互補位D114結合分子，則至少一個免疫球蛋白單一可變域組分與上文所定義的EGF-2域內的表位結合。VEGF結合組分優選結合VEGF同工型VEGF165和/或VEGF121。優選地，作為本發明的雙特異性結合分子的組分的免疫球蛋白單一可變域以小於500nM、優選小於200nM、更優選小於ΙΟηΜ，例如小於500pM(如如實例5. 7中所述地通過表面等離子共振分析所測定)的親和性分別結合D114或VEGF。優選地，如競爭ELISA分析(如實例5. I.中所述)中所測得，本發明的雙特異性結合分子中含有的免疫球蛋白單一可變域具有的IC5tl值在10_6至10,摩爾/升或10,摩爾/升以下的範圍內，更優選在10_8至10_1CI摩爾/升或10,摩爾/升以下的範圍內、且甚至更優選在10_9至10,摩爾/升或10,摩爾/升以下的範圍內。根據本發明的一非限制性但優選的實施方案，本發明的雙特異性結合分子中含有的Dl 14或VEGF結合免疫球蛋白單一可變域分別以10_5至10_12摩爾/升(M)或10_12摩爾/升以下、且優選10_7至10_12摩爾/升(M)或10_12摩爾/升以下、且更優選10_8至10_12摩爾/升(M)或10_12摩爾/升以下的解離常數(Kd)，和/或以至少IO7M'優選至少IO8M'更優選至少IO9M-1,例如至少IO12M-1的締合常數(Ka);且特別是以小於500nM、優選小於200nM、更優選小於ΙΟηΜ，例如小於500pM的Kd分別結合D114或VEGF。可測定本發明的免疫球蛋白單一可變域針對Dl 14的Kd及Ka值。 在另一方面中，本發明涉及編碼本發明的雙特異性結合分子的核酸分子。這些核酸分子在本文中也稱為「本發明的核酸」且也可呈如本文定義的遺傳構建體形式。本發明的核酸可為基因組DNA、cDNA或合成DNA (例如具有已特定適於在預定宿主細胞或宿主有機體中表達的密碼子用途(codon usage)的DNA)。根據本發明的一個實施方案，本發明的核酸呈如上定義的基本上分離的形式。本發明的核酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、粘端質粒或YAC。載體可尤其為表達載體，即可提供D114結合分子體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本發明的核酸，其可操作地連接至一個或多個適合調控組件(例如啟動子、增強子、終止子等)。這些組件及其鑑於特測序列在特定宿主中的表達的選擇為本領域技術人員的常識。對本發明D114結合分子的表達有用或必需的調控組件及其他組件的具體實例，例如啟動子、增強子、終止子、整合因子(integration factor)、選擇標記物、前導序列、報告基因(reporter gene)等公開於例如WO 2006/040153的第131至133頁。本發明的核酸可基於關於本文給出的本發明的多肽的胺基酸序列的信息以本身已知的方式(例如通過自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。在另一方面中，本發明涉及表達或能夠表達一種或多種本發明的雙特異性結合分子和/或含有本發明的核酸的宿主細胞。根據一個特別優選的實施方案，所述宿主細胞為細菌細胞；其他適用細胞為酵母細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。適合的細菌細胞包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。適合真菌細胞包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及曲菌屬(Aspergillus)的物種的細胞。適合酵母細胞包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)) >畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。適合的哺乳動物細胞包括例如CHO細胞、BHK細胞、海拉細胞(HeLa cell)、C0S細胞等。然而，也可使用兩棲類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。本發明還提供製造本發明的雙特異性結合分子的方法，這些方法通常包含以下步驟-在允許表達本發明的雙特異性結合分子的條件下培養包含能夠編碼雙特異性結合分子的核酸的宿主細胞；及-從培養物回收或分離由宿主細胞表達的多肽；及-任選進一步純化和/或修飾和/或調配本發明的雙特異性結合分子。對於工業規模生產而言，優選的宿主有機體包括適於大規模表達、生產及發酵，且 特別是適於大規模醫藥表達、生產及發酵的大腸桿菌菌株、巴斯德畢赤酵母菌株及釀酒酵母菌株。具體表達系統的選擇部分取決於某些翻譯後修飾的要求，更特別是糖基化的要求。需要或要求糖基化的本發明的雙特異性結合分子的產生，必需使用能夠使所表達蛋白糖基化的哺乳動物表達宿主。就此而言，本領域技術人員將了解所獲得的糖基化樣式(即所連接殘基的種類、數目及位置)將取決於用於表達的細胞或細胞株。本發明的雙特異性結合分子可在如上所述細胞中以細胞內方式(例如在細胞溶質中、在胞間質(periplasma)中或在包涵體(inclusion body)中)產生,接著從宿主細胞分離且任選進一步純化；或其可以細胞外方式(例如在培養宿主細胞的培養基中)產生，接著自培養基分離且任選進一步純化。用於重組產生多肽的方法及試劑，例如特定適合表達載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造本發明的多肽的方法中的蛋白分離及純化技術為本領域技術人員所公知。在另一方面中，本發明涉及胺基酸序列選自分別顯示於SEQ ID NO: I至166、SEQID NO:333至353、或SEQ ID N0:375至395中的胺基酸序列的肽，及編碼該肽的核酸分子。這些肽對應於源自本發明的VHH的⑶R3。這些肽，特別是編碼這些肽的核酸分子，適用於⑶R移植以置換免疫球蛋白鏈中的⑶R3，或適用於插入非免疫球蛋白支架，例如蛋白酶抑制劑、DNA結合蛋白、細胞色素b562、螺旋束(helix-bundle)蛋白、雙硫橋式肽(disulfde-bridged peptide)、脂質運載蛋白(Iipocalin)或抗運載蛋白(anticalin)中，從而賦予此支架靶結合性質。CDR移植方法在本領域中是公知的且已廣泛使用，例如用於使抗體人化(此通常包含將齧齒動物抗體的CDR移植在人抗體的Fv框架上)。為了獲得含有本發明CDR3的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，可根據如例如由Daugherty 等人，1991，Nucleic Acids Research,第 19卷，9，2471-2476所述的分子生物學標準方法，例如通過基因合成、通過寡核苷酸退火或藉助於重疊PCR片段來獲得編碼此分子的DNA。將VHH CDR3插入非免疫球蛋白支架中的方法已由Nicaise等人，2004，ProteinScience, 13，1882-1891 公開。本發明還涉及一種產物或組合物，其含有或包含至少一種本發明的雙特異性結合分子及任選的這些組合物的本身已知的一種或多種其他組分，即視組合物的預定用途而定。對於醫藥用途而言，本發明的雙特異性結合分子或含有本發明的雙特異性結合分子的多肽可調配成醫藥製劑或組合物，其包含至少一種本發明的雙特異性結合分子及至少一種醫藥學上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑及任選的一種或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。藉助於非限制性實例，這類調配物可呈適於口服給藥、腸胃外給藥(例如通過靜脈內、肌內或皮下注射或靜脈內輸注)、局部給藥或通過吸入、皮膚貼片、植入物、栓劑等給藥的形式。根據給藥方式，合適的給藥形式可為固體、半固體或液體，且其製備方法及載劑將為本領域技術人員所了解且進一步在本文中公開。因此，在另一方面中，本發明涉及一種藥物組合物，其含有至少一種雙特異性結合分子，特別是一種本發明的免疫球蛋白單一可變域或含有該免疫球蛋白單一可變域的多肽，及至少一種適合的載劑、稀釋劑或賦形劑(即適於醫藥用途)及任選一種或多種其他活性物質。
本發明的雙特異性結合分子可以以本身已知的任何適合方式調配及給予特別是對於免疫球蛋白單一可變域，例如參考WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、W004/041867 及 TO 08/020079,以及標準手冊，例如 Remington’s PharmaceuticalSciences,第 18 版，Mack Publishing Company, USA(1990) ；Remington, the Science andPractice of Pharmacy,第 21 版,Lippincott Williams and Wilkins (2005)；或 theHandbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel 編)，Wiley, Weinheim, 2007 (參見例如第252-255 頁)。例如，本發明的免疫球蛋白單一可變域可以以用於常規抗體及抗體片段(包括ScFv片段及雙特異抗體)及其他醫藥活性蛋白的本身已知的任何方式調配及給予。這些調配物及製備這些調配物的方法將為本領域技術人員所了解，且例如包括適於腸胃外給藥(例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、腔內、動脈內或鞘內給藥)或局部(即經皮或皮內)給藥的製劑。用於腸胃外給藥的製劑可例如為適於輸注或注射的滅菌溶液、混懸液、分散液或乳液。適用於這些製劑的載劑或稀釋劑，例如包括(但不限於)滅菌水及醫藥學上可接受的水性緩衝液及溶液，例如生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、葡萄糖溶液及漢克氏溶液(Hank’s solution);含水油(water oil);甘油；乙醇；二醇(例如丙二醇)或以及礦物油、動物油及植物油(例如花生油、大豆油)，以及其適合的混合物。通常將優選水性溶液或混懸液。因此，本發明的雙特異性結合分子可組合醫藥學上可接受的載體(例如惰性稀釋劑或可吸收食用載劑)而全身給予(例如口服給予)。對於口服治療性給藥而言，可將本發明的雙特異性結合分子與一種或多種賦形劑組合且以可攝取片劑、口腔錠、錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸液、糖漿、糯米紙囊劑(wafer)等形式使用。這些組合物及製劑應含有至少0. 1%的本發明的雙特異性結合分子。其在組合物及製劑中的百分比當然可變化且宜介於既定單位劑型重量的約2%與約60%之間。本發明的雙特異性結合分子在用於這些治療的組合物中的量為獲得有效劑量濃度的量。所述片劑、丸劑、膠囊劑等也可含有粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑及甜味劑或矯味劑，例如在W008/020079的第143-144頁上所提及的。當單位劑型為膠囊劑時，其除以上類型的物質外也可含有液體載劑，例如植物油或聚乙二醇。可存在各種其他物質作為包衣或者用以修飾固體單位劑型的外形。例如，片劑、丸劑或膠囊劑可由明膠、蠟、蟲膠(shellac)或糖等包衣。糖漿或酏劑可含有本發明的雙特異性結合分子、蔗糖或果糖(作為甜味劑)、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯(作為防腐劑)、色素及矯味劑(例如櫻桃或橙香料)。當然，在製備任何單位劑型中使用的任何物質均應為醫藥學上可接受且在所用量下基本上無毒。此外，本發明的雙特異性結合分子可併入持續釋放製劑及裝置中。用於口服給藥的製劑及調配物也可具有將使本發明構建體抵抗胃環境且進入腸中的腸溶包衣。更一般地，用於口服給藥的製劑及調配物可經適當調配以遞送進入胃腸道的任何所需部分中。此外，可使用適合的栓劑以遞送進入胃腸道中。
如WO 08/020079第144及145頁上所進一步公開，本發明的雙特異性結合分子也可通過輸注或注射而經靜脈內或腹膜內給予。對於本發明的雙特異性結合分子的局部給藥而言，如W008/020079第145頁上所進一步公開，一般需要將其與皮膚可接受的載劑(其可為固體或液體)組合而以組合物或調配物形式給予皮膚。一般而言，本發明的雙特異性結合分子在液體組合物(例如洗劑)中的濃度將為約O. 1-25重量％、優選約O. 5-10重量％。在半固體或固體組合物(例如凝膠或粉末)中的濃度將為約O. 1-5重量％、優選約O. 5-2. 5重量％。本發明的雙特異性結合分子的治療中需要的量不僅依所選特定雙特異性結合分子，而且也依給藥途徑、所治療症狀特性及患者年齡及症狀而變化且將最終由當值醫師或臨床醫師酌情決定。此外，本發明的雙特異性結合分子的劑量視靶細胞、腫瘤、組織、移植物或器官而變化。所需劑量宜呈現為單次劑量或以適當間隔給予的分次劑量，例如呈每天兩次、三次、四次或四次以上的亞劑量形式。所述亞劑量自身可經進一步劃分，例如分成大量單個的鬆散間隔的給藥；例如來自吹入器(insufflator)的多次吸入或通過對眼中多次滴眼。給藥方案可包括長期每天治療。「長期」是指持續時間至少兩周且優選數周、數月或數年。該劑量範圍的必要修改可由一般技術人員僅使用本文教導的常規實驗來確定。參見 Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E. ff.第 4 版)，Mack PublishingCo.，Easton, PA。若發生任何併發症，則該劑量也可由單個的醫師來調整。根據另一實施方案，本發明涉及雙特異性結合分子(例如免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽)的用途，其用於治療目的，例如-尤其在人中用於預防、治療和/或減輕與D114對血管生成的介導效應相關或可通過用D114結合分子調節Notch信號傳導路徑來預防、治療或減輕的病症、疾病或症狀，-在一治療需要此治療的患者的方法中，該方法包含給予有需要的個體醫藥活性量的至少一種本發明的雙特異性結合分子(例如免疫球蛋白單一可變域)或含有所述的本發明的雙特異性結合分子的藥物組合物；-用於製備預防、治療或減輕與D114對血管生成的介導效應相關的病症、疾病或症狀的藥物；-作為用於以上目的藥物組合物或藥物中的活性成分。根據一個具體的方面，該病症、疾病或症狀為如本文定義的癌症或癌性疾病。根據另一方面，疾病為與D114對血管生成的介導效應相關或可通過用D114結合分子調節Notch信號傳導路徑來治療或減輕的眼病。
視欲治療的癌性疾病而定，本發明的雙特異性結合分子可單獨或組合一種或多種特別是選自以下的其他治療劑加以使用化學治療劑(如DNA損傷劑)，或抑制癌細胞中血管生成、信號轉導路徑或有絲分裂檢查點(mitotic checkpoint)的治療活性化合物。其他治療劑可任選作為同一醫藥製劑的組分與雙特異性結合分子的給藥同時給予、或在該雙特異性結合分子的給藥之前或之後給予。在某些實施方案中，所述其他治療劑可為(不限於，且在包括各別配位體的受體的情況下)一種或多種選自以下物質的抑制劑EGFR、VEGFR、HER2_neu、Her3、AuroraA,AuroraB, PLK 及 PI3 激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP、PDK 1、PTK2、IGF-R 或 IR。其他治療劑的其他實例為CDK、Akt, src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c_Myc、Flt3、HSP90 的抑制劑；刺蝟拮抗劑(hedgehog antagonist) ;JAK/STAT、Mek、mTor、NF κ B、蛋白酶體、Rho的抑制劑；wnt信號傳導的抑制劑或遍在蛋白化(ubiquitination)路徑的抑制劑或Notch信號傳導路徑的另一抑制劑。Aurora 抑制劑的實例為(但不限於)PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。PLK抑制劑的一個實例為GSK-461364。raf 抑制劑的實例為 BAY-73-4506 (也為 VEGFR 抑制劑)、PLX 4032、RAF-265 (此外也為VEGFR抑制劑)、索拉非尼(sorafenib)(此外也為VEGFR抑制劑)及XL 281。KSP 抑制劑的實例為伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731及 SB-743921。src和/或bcr-abl抑制劑的實例為達沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL 228 (也為 IGF-IR 抑制劑)、尼洛替尼(nilotinib)(也為 PDGFR 及 cKit抑制劑)、伊馬替尼(imatinib)(也為cKit抑制劑)及NS-187。PDKl抑制劑的一個實例為BX-517。Rho抑制劑的一個實例為BA-210。PI3激酶抑制劑的實例為PX-866、BEZ-235 (也為mTor抑制劑)、XL 418 (也為Akt抑制劑)、XL-147及XL 765 (也為mTor抑制劑)。cMet或HGF的抑制劑的實例為XL-184 (也為VEGFR、cKit、Flt3的抑制劑)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(也為 VEGFR 的抑制劑)、MGCD_265(也為 VEGFR、Ron、Tie2 的抑制劑)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102 及 AV-299。c-Myc抑制劑的一個實例為CX-3543。Flt3抑制劑的實例為AC-220 (也為cKit及TOGFR的抑制劑)、KW 2449、來他替尼(Iestaurtinib)(也為 VEGFR、PDGFR、PKC 的抑制劑)、TG_101348(也為 JAK2 的抑制劑)、XL-999 (也為 cKit、FGFR、PDGFR 及 VEGFR 的抑制劑)、舒尼替尼(sunitinib)(也為 PDGFR、VEGFR及cKit的抑制劑)及坦度替尼(tandutinib)(也為TOGFR及cKit的抑制劑)。HSP90抑制劑的實例為坦螺旋黴素(tanespimycin)、阿螺旋黴素(alvespimycin)、IPI-504 及 CNF 2024。JAK/STAT抑制劑的實例為CYT-997 (其也與微管蛋白相互作用)、TG 101348 (也為Flt3的抑制劑)及XL-019。
Mek 抑制劑的實例為 ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330 及 XL 518。mTor抑制劑的實例為西羅莫司脂化物(temsirolimus)、AP_23573 (其也作為VEGF抑制劑)、依維莫司(everolimus)(此外也為VEGF抑制劑)、XL_765 (也為PI3激酶抑制劑)及BEZ-235 (也為PI3激酶抑制劑)。Akt抑制劑的實例為哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立濱(triciribine)。cKit抑制劑的實例為AB-1010、0SI_930(也作為VEGFR抑制劑)、AC_220(也為Flt3及TOGFR的抑制劑)、坦度替尼(也為Flt3及TOGFR的抑制劑)、阿西替尼(也為VEGFR及TOGFR的抑制劑)、XL-999 (也為Fl t3、PDGFR, VEGFR、FGFR的抑制劑)、舒尼替尼(也為Flt3、H)GFR、VEGFR的抑制劑)、及XL-820 (也作為VEGFR及TOGFR抑制劑)、伊馬替尼(也 為bcr-abl抑制劑)、尼洛替尼(也為bcr-abl及TOGFR的抑制劑)。刺蝟拮抗劑的實例為IPI-609及CUR-61414。CDK 抑制劑的實例為塞來昔布(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK_CDK(亦抑制VEGFR2 及 PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509 及 AG 024322。蛋白酶體抑制劑的實例為硼替佐米(bortezomib)、卡菲佐米(carfiIzomib)及NPI-0052 (也為NF κ B的抑制劑)。NFkB路徑抑制劑的一個實例為NPI-0052。遍在蛋白化路徑抑制劑的一個實例為HBX-41108。在優選的實施方案中，所述其他治療劑為抗血管生成劑。抗血管生成劑的實例為FGFRJDGFR及VEGFR或各別配位體的抑制劑(例如VEGF抑制劑，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗體貝伐單抗(bevacizumab))及沙立度胺(thalidomide),這些藥物選自(但不限於)貝伐單抗、莫替沙尼(motesanib)、Q)P_791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK (也為 CDK 的抑制劑)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KdR, IMC-18FK IMiD (免疫調節藥物)、沙立度胺衍生物CC-4047、來那度胺(Ienalidomide)、ENMD 0995、MC_Dll、Ki23057、布裡瓦尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999 (也為 cKit 及 Flt3 的抑制劑)、1B3、CP 868596、IMC3G3,R-1530(也為Flt3的抑制劑)、舒尼替尼(也為cKit及Flt3的抑制劑)、阿西替尼(也為cKit的抑制劑)、來他替尼(也為Flt3及PKC的抑制劑)、瓦拉他尼(vatalanib)、坦度替尼(也為 Flt3 及 cKit 的抑制劑)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW786034、PF-337210、MC_1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR 258、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)(也為Raf的抑制劑)、RAF-265(也為Raf的抑制劑)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、0SI-930、AEE-788 (也為 EGFR 及 Her2 的抑制劑)、BAY-57-9352 (也為 Raf 的抑制劑)、BAY-73-4506 (也為Raf的抑制劑)、XL 880 (也為cMet的抑制劑)、XL-647 (也為EGFR及EphB4的抑制劑)、XL 820 (也為cKit的抑制劑)及尼洛替尼(也為cKit及brc-abl的抑制劑)。其他治療劑也可選自EGFR抑制劑，其可為小分子EGFR抑制劑或抗EGFR抗體。抗EGFR抗體的實例(但不限於)為西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab);小分子EGFR抑制劑的一個實例為吉非替尼(gefitinib)。EGFR調節劑的另一實例為EGF融合毒素。
尤其適用於與本發明的雙特異性結合分子組合的EGFR及Her2抑制劑為拉帕替尼(Iapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)、凡德他尼(也為 VEGFR 的抑制劑)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788 (也為 VEGFR 的抑制劑)、ARRY-333786、MC-11F8、Zemab。
宜在治療中與本發明的雙特異性結合分子組合的其他藥物為替坦託西莫單抗(tositumumab tiuxetan)及替坦伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(兩种放射性標記的抗CD20抗體)、阿侖單抗(alemtuzumab)( 一種抗⑶52抗體)、地諾單抗(denosumab)( 一種破骨細胞分化因子配位體抑制劑)、加利昔單抗(galiximab)( 一種CD80拮抗劑)、奧法木單抗(ofatumumab)( 一種CD20抑制劑)、扎木單抗(zanoIimumab)( 一種CD4拮抗劑)、SGN40 ( 一種CD40配位體受體調節劑)、利妥昔單抗(rituximab)( 一種CD20抑制劑)或馬帕木單抗(mapatumumab)( 一種TRAIL-1受體激動劑)。可與本發明的雙特異性結合分子組合使用的其他化學治療藥物選自但不限於激素、激素類似物及抗激素藥(例如他莫昔芬(tamoxifen)、託瑞米芬(toremifene)、雷諾昔芬(raloxifene)、氟維司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(f Iutamide)、尼魯米特(niIutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、乙酸環丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelinacetate)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟甲睪酮(fIuoxymesterone)、甲輕孕酮(medroxyprogesterone)、奧曲妝(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕西瑞妝(pasireotide)、伐普肽(vapreotide));芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(Ietrozole)、利阿唑(Iiarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane)) ;LHRH激動劑及拮抗劑(例如乙酸性瑞林(goserelinacetate)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、組氨瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin));抗代謝物(例如抗葉酸物(如甲胺噪呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed))、啼P定類似物(如5-氟尿啼卩定、卡培他濱(capecitabine)、地西他濱(decitabine)、奈拉濱(nelarabine)、及吉西他濱(gemcitabine)) ^票呤及腺苷類似物(例如巰基11 票呤、硫鳥口票呤、克拉屈濱(cladribine)及噴司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)));抗腫瘤抗生素(例如蒽環黴素(anthracycline)(如多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊達比星(idarubicin))、絲裂黴素_C (mitomycin-C)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素 D(dactinomycin)、普卡黴素(plicamycin)、米託蒽酉昆(mitoxantrone)、匹杉瓊(pixantrone)、鏈佐星(streptozocin));鉬衍生物(例如順鉬(cisplatin)、奧沙利 白(oxaliplatin)、卡 f白(carboplatin)、洛f白(Iobaplatin)、沙 f白(satraplatin)) ； ^化劑(例如雌莫司汀(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環憐酉先胺(cyclophosphamide)、異環憐酸胺(ifosfamide)、輕基服(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亞硝基脲(nitrosourea)(例如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(Iomustine))、塞替派(thiotepa));抗有絲分裂劑(例如長春花生物鹼類(vincaalkaloids),如長春喊(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞賓(vinorelbine)、長春氟寧(vinflunine)及長春新鹼(vincristine);及紫杉燒類(taxanes),如紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)及其調配物、拉諾他賽(Iarotaxel)、司莫紫杉醇(simotaxel);及埃博黴素(epothilone),如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹隆(patupilone)、ZK-EP0);拓撲異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素(epipodophyIIotoxin)(如依託泊苷(etoposide)及凡畢復(etopophos)、替尼泊苷(teniposide))、安B丫 P定(amsacrine)、拓樸替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及雜項化學治療藥物,例如氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、幹擾素P、丙卡巴肼(procarbazine)、米託坦(mitotane)、及卩卜菲爾鈉(porfi mer)、貝沙羅汀(bexarotene)、塞來考昔(celecoxib)。可根據感興趣的具體疾病或病症而使用本身已知的任何適合的體外分析、基於細胞的分析、體內分析和/或動物模型或其任何組合來測試本發明的雙特異性結合分子或含有所述分子的多肽以及包含本發明的雙特異性結合分子的組合物的效能。適合的分析及動物模型將為本領域技術人員所了解且例如包括本文所述且用於以下實例中的分析，例如增殖分析。


圖I :人、恆河猴及短尾猴DLL4的胺基酸序列比對。圖2 :人及小鼠DLL4缺失突變體(上標中為胺基酸域邊界)。圖3 :純化的 VHH 阻斷 hDLL4/hNotchl_Fc 相互作用(ELISA)。圖4 :純化的 VHH 阻斷 hDLL4/hNotchl_Fc 相互作用(AlphaScreen)。圖 5 :純化的 VHH 阻斷 CH0-hDLL4/hNotchl-Fc 及 CH0-mDLL4/hNotchl_Fc 相互作用(FMAT)。圖6 :純化的VHH阻斷DLL4介導的Notchl裂解(報告基因)。圖7 :純化的VHH對重組人及小鼠DLL4的結合(ELISA)。圖8 :純化的VHH對重組人DLLl及人Jagged-Ι的結合(ELISA)。圖9 :純化的VHH對人/小鼠/短尾猴DLL4的結合(FACS)。圖10 :親和力成熟的VHH阻斷hDLL4/hNotchl_Fc相互作用(ELISA)。圖11 :親和力成熟的 VHH 阻斷 CH0-hDLL4/hNotchl_Fc 及 CH0_mDLL4/hNotch
I-Fc相互作用(FMAT)。圖12 :純化的VHH對人/小鼠DLL4的結合(ELISA)。圖13 :純化的親和力成熟的VHH對重組人DLLl及人Jagged-I的結合(ELISA)。圖14 :純化的VHH對人/小鼠/短尾猴DLL4的結合(FACS)。圖15 =VHH對Dl 14介導的HUVEC增殖抑制效應的評估。圖16 DLL4介導的報導基因分析中的親和力成熟的VHH。圖17 :A)VHH DLLBII129B05與人VH3/JH生殖系序列的序列比對。B) VHH DLLBII136C07與人VH3/JH5生殖系序列的序列比對。圖18
A)阻斷 CH0-hDLL4/hNotchl-Fc 及 CH0mDLL4/hNotchl_Fc 相互作用的DLLBII129B05的純化的序列最優化的VHH變異體(FMAT)。B)阻斷 CH0-hDLL4/hNotchl-Fc 及 CH0-mDLL4/hNotchl_Fc 相互作用的DLLBII136C07的純化的序列最優化的VHH變異體(FMAT)。圖19 :阻斷DLL4介導的Notchl裂解的純化的序列最優化的VHH(報告分析)。圖20 :純化的單價 VHH 阻斷 hVEGF165/hVEGFR2_Fc 相互作用(ELISA)。圖21 :純化的單價 VHH 阻斷 hVEGF165/hVEGFRl_Fc 相互作用(ELISA)。圖22 :純化的單價 VHH 阻斷 hVEGF165/hVEGFR2_Fc 相互作用(AlphaScreen)。 圖23 :純化的單價 VHH 阻斷 hVEGF165/hVEGFRl_Fc 相互作用(AlphaScreen)。圖24 :單價VHH對重組人及小鼠VEGF (ELISA)的結合。圖25 :單價VHH對人VEGF121的結合。圖 26 :純化的 VHH 不結合 VEGFB、VEGFC, VEGFD 及 P1GF。圖27 :格式化的 VHH 阻斷 hVEGF165/hVEGFR2_Fc 相互作用(ELISA)。圖28 :格式化的 VHH 阻斷 hVEGF165/hVEGFRl_Fc 相互作用(ELISA)。圖29 :格式化的 VHH 阻斷 hVEGF165/hVEGFR2_Fc 相互作用(AlphaScreen)。圖30 :格式化的 VHH 阻斷 hVEGF165/hVEGFRl-Fc 相互作用(AlphaScreen)。圖31 :格式化的 VHH 阻斷 mVEGF164/mVEGFR2-Fc 相互作用(AlphaScreen)。圖32 :格式化的VHH對小鼠及人VEGF的結合。圖 33 :格式化的 VHH 不結合 VEGFB、VEGFC, VEGFD 及 P1GF。圖34 :格式化的VHH對VEGFl21的結合。圖35 VHH VEGFBII23B04與人VH3/JH生殖系共同序列的序列比對。圖36 =VEGFBII23B4 的 VHH 變異體阻斷 hVEGF165/hVEGFR2_Fc 相互作用(AlphaScreen)。圖37 =VEGFBII23B4的序列最優化的克隆阻斷hVEGF165/hVEGFR2_Fc相互作用(AlphaScreen)。圖38 VHH VEGFBI15B5與人VH3/JH生殖系共同序列的序列比對。圖39 :循環I雙特異性VEGF-DLL4VHH的形式。圖40 :循環2雙特異性VEGF-DLL4VHH的形式。圖41 VEGF/VEGFR2 AlphaScreen分析(在5 μ M HSA存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環I)。圖42 VEGF/VEGFR1 AlphaScreen分析(在5 μ M HSA存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環I)。圖43 CH0-hDLL4/hNotchl-Fc FMAT 分析(在 25 μ M HSA 存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環I)。圖44 VEGF/VEGFR2 AlphaScreen分析(在5 μ M HSA存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環2)。圖45 VEGF/VEGFR1 AlphaScreen分析(在5 μ M HSA存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環2)。圖 46 CH0-hDLL4/hNotchl-Fc 及 CH0-mDLL4/hNotchl_Fc FMAT 分析(在 25 μ MHSA存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環2)。圖47 :DLL4介導的報告分析(在175 μ M HSA存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環 2)。圖48 :序列最優化的雙特異性VEGF-DLL4 VHH的形式。圖49 VEGF/VEGFR2 AlphaScreen分析(在5 μ M HSA存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環3)。圖50 VEGF/VEGFR1 AlphaScreen分析(在5 μ M HSA存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環3)。圖 51 CH0-hDLL4/hNotchl-Fc 及 CH0-mDLL4/hNotchl_Fc FMAT 分析(在 25 μ MHSA存在或不存在下)中的雙特異性VHH (循環3)。圖52 :所選VHH在人結腸癌的小鼠模型(SW620模型)中的效能A SW620腫瘤生長動力學；B :第21天研究結束時的絕對腫瘤體積；C :體重隨時間的變化。材料及方法a)過度表達人、小鼠及短尾猴Dl 14的CHO及HEK293細胞株的產生使用按照相應序列的5』及3』UTR設計的寡核苷酸分別從人成人正常組織心臟cDNA文庫(BioChain, Hayward, CA, USA)和小鼠心臟組織cDNA文庫(分離自C57/B16株)擴增編碼人(SEQ ID Ν0:101 ;ΝΜ_019074· 2)和小鼠 D114(NM_019454. 3)的 cDNA。將擴增子克隆至哺乳動物表達載體 pQ)NA3. I (+) -neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。使用根據親緣關係接近的物種恆河猴的D114編碼序列(稱猴(Macaca mulatta)D114，SEQ ID NO: 102 ；ΧΜ_001099250. I)的5』及3』UTR設計的引物，從短尾猴正常組織心臟cDNA文庫(BioChain, Hayward, CA, USA)擴增短尾猴D114cDNA(參見圖I)。將最終擴增子克隆於哺乳動物表達載體pQ)NA3. I (+) -neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。顯示短尾猴Dl 14的胺基酸序列與恆河猴100% —致且與人99% —致(參見圖I ;與人序列的差異用粗體加下劃線標示)。為了產生過度表達人D114、小鼠D114或短尾猴D114的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，分別用 pCDNA3. I (+)-neo_hD114、pcDNA3. I (+)-neo_mD114 或 pcDNA3. I (+)-neo_cD114 對 親本CHO細胞進行電穿孔。過度表達人D114和小鼠D114的人胚腎(HEK293)細胞是通過分別使用 pCDNA3. I (+) -neo_hD114 質粒或 pCDNA3. I (+) -neo_mD114 質粒的 Fugene (Roche)於HEK293親本細胞株中進行脂質介導的轉染而產生的。對於所有條件，轉染子均通過添加lmg/mL 遺傳黴素(geneticin) (Invitrogen, Carlsbad CA, USA)來選擇。b)單克隆抗D114 IgG及Fab片段的產生在US 2008/0014196 (Genentech)中，公開了人/小鼠交叉反應性D114 mAb，其由Ridgway等人(2006)使用以顯示大量異種移植模型中VEGF mAb和D114 mAb對腫瘤生長的累加效應。將該抗D114 mAb及其相應的Fab純化，以在生物化學/細胞分析及異種移植模型中針對噬菌體選擇期間的特異性洗脫來評估該抗體(片段)性質。將所公開的D114 mAb的可變重鏈及輕鏈序列克隆入hIgG2aic框架中，在HEK293細胞中短暫表達，且使用蛋白A色譜法自上清液純化。純化的D114 mAb在ELISA及FACS (使用CH0_mD114及CH0_hD114細胞)中顯示對人D114和小鼠D114的結合，在Biacore中顯示對兩種生長因子直系同源物(orthologue)的低於納摩爾的親和性。通過基於回譯(back-translation)及使用Leto』 s基因最佳化軟體(www.entechelon. com)針對大腸桿菌中的表達的密碼子最佳化的基因組裝來構建相應的D114Fab片段。設計用於組裝可變輕鏈(')、可變重鏈(Vh)、恆定輕鏈(Cj 及重鏈(Chi)的恆定域I的寡核苷酸引物，並進行組裝PCR。分別使用限制位點SfiI、AscI及限制位點ΚρηΙ、NotI，將編碼Vl+Cl&Vh+Ch1的cDNA區段克隆入源自pUC119的載體中，該載體含有LacZ啟動子、卡那黴素抗性基因、多克隆位點及雜交glll-pelB前導序列。在Fab編碼序列的框架內，表達載體編碼C-末端HA及His6標籤。Fab片段在大腸桿菌中表達為標記His6的蛋白，且隨後通過固定化金屬親和性色譜法(IMAC)及尺寸排阻色譜法(SEC)從培養基純化。描述了可變重鏈及可變輕鏈的相關胺基酸序列(分別為US 2008/0014196的SEQ ID NO: I及SEQ ID NO:2);完全重鏈及輕鏈的胺基酸序列分別顯示於SEQ ID N0:419及420中。c)用於表位定位的D114突變體的產生為了鑑別包含可由抗Dl 14VHH識別的表位的Dl 14的細胞外域(E⑶)，產生D114E⑶的漸進缺失突變體。使用標準重組DNA技術，產生包含CMV啟動子的哺乳動物表達載體 pSecTag2/Hygro (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),該啟動子位於編碼融合至聚 His 標籤的D114E⑶的一系列巢式缺失片段的聚核苷酸上遊(參見圖2 ;上標為胺基酸域邊界)。這些重組蛋白使用Freestyle 293表達系統(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)(可從其中收集條件培養基)在經短暫轉染的HEK293細胞中表達，並通過IMAC純化。只有缺乏EGF2樣域的Dl 14突變體才顯示對上述人化人/小鼠交叉反應性抗Dl 14 mAb (通過捕獲型抗人IgG塗布的Biacore傳感器晶片來固定)的減弱結合。已知該IgG在該D114域中具有特異性結合表位(專利申請案 Genentech，US 2008/0014196A1)。d)D114報告基因檢測質粒的產生基本上如Struhl 及 Adachi, Cell. 1998 年 5 月 15 ;93 (4) :649_60 所述，基於 Y分泌酶介導的Notchl裂解以及D114刺激後Notchl細胞內域(NI⑶)的核轉位來開發報告基因檢測(importer assay)。將Gal4/VP16編碼序列插入NICD編碼序列中。有效雜交轉錄活化因子GAL4-VP16插入Notchl跨膜域的羧基末端，該因子由融合至單純皰疹病毒轉錄活化域VP16的酵母GAL4DNA結合片段組成。Y分泌酶將該構建體裂解，導致Gal4/VP16 NICD融合蛋白的釋放，其將該蛋白轉位至核，在核中該融合蛋白將結合至(並以轉錄方式激活)含有強力GAL4-UAS啟動子序列的共轉染的螢光素酶報告基因質粒(Struhl, G.及 Adachi, A. ,Cell,第 93 卷，649-660，1998)。將人 Notchl_Gal4/VP16 表達框(expression cassette)克隆於 pcDNA3. I (+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。將 pGL4. 31 [Luc2P/Gal4UAS/Hygro]載體(Promega, Madison, WI, USA)用作突光素酶報告基因質粒。e) VEGF109的產生及功能性測試將編碼人血管內皮生長因子同工型VEGF165的受體結合域的cDNA(GenBank AAM03108. I ;AA 殘基 27-135)克隆入 pET28a 載體(Novagen, Madison, WI)中，並在大腸桿菌(BL21 Star DE3)中過度表達為標記His的不溶性蛋白。通過添加ImM IPTG來誘導表達且使其在37°C繼續4小時。離心收集細胞，並通過聲波處理細胞片狀沉澱物使細胞溶解。通過離心分離包涵體。在使用l%Triton X 100 (Sigma-Aldrich)的洗漆步驟之後,使用7. 5M鹽酸胍來溶解蛋白，並使用尿素濃度從6M遞減至OM的緩衝液通過連續多輪過夜透析將其再摺疊。通過使用MonoQ5/50GL(Amersham BioSciences)柱的離子交換色譜,隨後以Superdex75 10/300 GL柱(Amersheim BioSciences)進行凝膠過濾來純化所述再摺疊的蛋白。蛋白純度及均質性由SDSPAGE及蛋白印跡分析法(Westen blot)予以確認。此外，通過ELISA監測對VEGFRl、VEGFR2及貝伐單抗的結合活性。為此，在4°C於96孔MaxiSorp培養板(Nunc, Wiesbaden, Germany)中將I μ 8/!111^重組人\^6 109固定過夜。用酪蛋白溶液(1%)阻斷各孔。將VEGFRl、VEGFR2或貝伐單抗的系列稀釋液添加至塗布VEGF109的培養板中，並使用喊性憐酸酶(AP)接合的Fe特異性羊抗人IgG (Jackson Tmmuno Research LaboratoriesInc.，West Grove, PA, USA)且接著使用底物PNPP (對硝基苯基磷酸)(Sigma-Aldrich)存在下的酶促反應來檢測結合。VEGF109可結合VEGFRl、VEGFR2及貝伐單 抗，表明產生的VEGF109具有活性。f) VEGF165的KLH綴合及KLH綴合的VEGF165的功能性測試根據製造商說明書，使用含有海水養殖鑰孔鑛4血藍蛋白(mariculture keyholelimpet hemocyanin, mcKLH)的 Imject 免疫原 EDC 試劑盒(Pierce, Rockford, IL, USA)，將重組人 VEGF165(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)接合至 mcKLH。通過 SDS-PAGE 確認多肽對mcKLH的有效接合。用ELISA檢驗接合蛋白的功能在4 °C於96孔MaxiSorp培養板(Nunc, Wiesbaden, Germany)中將2yg/mL KLH接合的VEGF165固定過夜。用釀蛋白溶液(1%)阻斷各孔。添加VEGFRl或VEGFR2的系列稀釋液且使用辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)綴合的 Fe 特異性羊抗人 IgG(Jackson Tmmuno ResearchLaboratories Inc. , West Grove, PA, USA)，接著使用底物 TMB(3，3 ' ,5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce，Rockford，IL, USA)存在下的酶促反應來檢測結合。KLH綴合的蛋白仍與VEGFR1、VEGFR2及貝伐單抗相互作用，從而證實仍然可影響VEGF165上的相關表位。實施例I使用來自不同物種的D114免疫來誘導美洲駝(llama)中的體液免疫反應I. I.免疫化在經獸醫學學院的倫理委員會(theEthical Committee of the faculty ofVeterinary Medicine, University Ghent, Belgium)批准之後，通過 6 次肌內注射(以每周一次的間隔，每次給藥 100 或 50 μ g)重組人 D114(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)使4隻美洲駝(命名為第208、209、230、231號)免疫化。用Stimune (Cedi DiagnosticsBV, Lelystad, The Netherlands)調配D114抗原。根據標準方案,通過4次交替皮下注射如上所述產生的過度表達人D114的CHO細胞及過度表達小鼠D114的CHO細胞來使另外三隻美洲駝(命名為第127b、260、261號)免疫化。將細胞再混懸於DPBS中且在注射之前保存在冰上。此外，根據標準方案，通過4次交替肌內注射(以兩周一次的間隔，每次給藥 100 或 50 μ g)重組人 D114 及小鼠 D114(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)來使另外三隻美洲駝(命名為第282、283、284號)免疫化。第O天含有人D114的首次注射液是用弗氏完全佐劑(Complete Freund' s Adjuvant, Difco, Detroit, MI, USA)調配的，而隨後含有人及小鼠D114的注射液是用弗氏不完全佐劑(Incomplete Freund' s Adjuvant,Difco, Detroit, MI, USA)調配的。
1.2.美洲駝中誘導的免疫反應的評估為了通過ELISA評估動物中對抗人D114的免疫反應的誘導，在第O天(免疫前)、第21天及第43天(收集外周血液淋巴細胞[PBL]的時間)從美洲駝208、209、230和231收集血清；在第O天及第51天從美洲駝127b、260和261收集血清；且在第O天、第28天及第50天從美洲駝282、283和284收集血清。簡言之，2μ g/mL重組人 D114 或小鼠 Dl 14 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)在 4 °C 於 96 孔 MaxiSorp 培養板(Nunc, Wiesbaden, Germany)中固定過夜。用酪蛋白溶液(1%)阻斷各孔。在添加血清稀釋液之後，使用辣根過氧化酶(HRP)綴合的山羊抗美洲駝免疫球蛋白(BethylLaboratories Inc.，Montgomery, TX, USA),接著使用底物 TMB (3，3' ,5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce, Rockford, IL , USA)存在下的酶促反應來檢測經特異性結合的免疫球蛋白，從而顯示誘導對抗D114的顯著抗體依賴性免疫反應。抗體反應是由表達常規抗體的B細胞譜系及表達僅有重鏈的抗體的B細胞譜系來發動，因為經特異性結合的免疫球蛋白可用特異性識別常規美洲駝IgGl抗體或僅有重鏈的美洲駝IgG2或IgG3抗體的抗體來檢測(表
2-A)。在所有注射小鼠D114的美洲駝中，抗體反應由表達常規抗體及僅有重鏈的抗體的、特異性針對小鼠D114的B細胞發動。另外，經細胞免疫的動物的血清效價是通過對過度表達人及小鼠D114的HEK293細胞進行FACS分析來確認的(表2-B)。各美洲駝的D114血清效價反應見於表2中。表2 :抗體介導的對抗DLL4的特異性血清反應A) ELISA (重組蛋白，塗布於固相上)
n/d:未測定B)FACS(HEK293細胞上的天然表達的蛋白)

權利要求
1.一種雙特異性結合分子，其包含D114結合組分及VEGF結合組分。
2.權利要求I的雙特異性結合分子，其中該D114結合組分和該VEGF結合組分分別包含至少一個D114結合免疫球蛋白單一可變域和至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變域。
3.權利要求2的雙特異性結合分子，其中所述免疫球蛋白單一可變域為VHH。
4.權利要求2或3的雙特異性結合分子，其中該VEGF結合組分位於N端。
5.權利要求2至4中任一項的雙特異性結合分子，其中該Dl14結合組分和該VEGF結合組分分別包含至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變域和至少一個Dl 14結合免疫球蛋白單一可變域，其中每一個所述免疫球蛋白單一可變域具有四個框架區和三個分別為CDR1、⑶R2和⑶R3的互補決定區， 其中 a)所述至少一個D114結合免疫球蛋白單一可變域的CDR3具有選自以下的胺基酸序列i.如SEQ ID NO: I 中所不的 Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro TyrXaa Tyr AspXaa，其中 位置8的Xaa為Arg、Ala或Glu ； 位置11的Xaa為Leu或Glu ;及 位置14的Xaa為Tyr或His ;及 ii.如SEQ ID N0:2 中所不的 Asp Arg Tyr He Trp Ala Arg Gln Gly GluTyr TrpGly Ala Tyr Xaa Asp Tyr,其中 Xaa 為 Gin、Ala 或 Tyr ;且 其中 b)所述至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變域的⑶R3具有如SEQID NO: 3中所不的胺基酸序列 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu AlaAsp Thr Tyr XaaTyr,其中 Xaa 為 Asp 或 Glu, 其中該VEGF結合免疫球蛋白單一可變域能夠以彡60%的抑制率阻斷人重組VEGF165與人重組VEGFR-2的相互作用。
6.權利要求5的雙特異性結合分子，其中該免疫球蛋白單一可變域為VHH，其由親本免疫球蛋白單一可變域VHH任選在親和力成熟後進行序列最優化而獲得。
7.權利要求6的雙特異性結合分子，其中所述結合D114的VHH從具有胺基酸序列選自SEQ ID NO:4-20及表5中所示序列的親本VHH獲得。
8.權利要求7的雙特異性結合分子，其中該親本VHH具有SEQID N0:10中所示的胺基酸序列。
9.權利要求8的雙特異性結合分子，其中所述結合D114的VHH由具有SEQID NO: 10中所示序列的VHH衍生的親和力成熟的VHH進行序列最優化而獲得，其中該親和力成熟的VHH選自具有SEQ ID NO: 21-27及表16中所示的胺基酸序列的VHH。
10.權利要求9的雙特異性結合分子，其中該親和力成熟的VHH具有SEQID N0:22中所示的胺基酸序列，且其中該序列最優化的VHH具有選自SEQ ID NO: 34及35以及表23中所示序列的胺基酸序列。
11.權利要求7的雙特異性結合分子，其中該親本VHH具有SEQID NO: 12中所示的胺基酸序列。
12.權利要求11的雙特異性結合分子，其中所述結合D114的VHH已由具有SEQIDNO: 12中所示序列的VHH衍生的親和力成熟的VHH進行序列最優化而獲得，其中該親和力成熟的VHH選自具有SEQ ID NO: 28-33及表17中所示的胺基酸序列的VHH。
13.權利要求12的雙特異性結合分子，其中該親和力成熟的VHH具有SEQID N0:32中所示的胺基酸序列，且其中該序列最優化的VHH具有選自SEQ ID N0:40及41中所示序列的胺基酸序列。
14.權利要求6的雙特異性結合分子，其中所述結合VEGF的VHH源自具有序列選自SEQID NO:42-44及表32中所示序列的VHH。
15.權利要求14的雙特異性結合分子，其中所述結合VEGF的VHH由具有SEQID NO: 43中所不氣基酸序列的VHH進行序列最優化而獲得。
16.權利要求15的雙特異性結合分子，其中該序列最優化的VHH具有選自SEQIDNO:63及64以及表59中所示序列的胺基酸序列。
17.權利要求3的雙特異性結合分子，其中該結合VEGF的組分為雙互補位VHH，其中形成該雙互補位VHH的構建塊的VHH與非重疊表位結合。
18.權利要求17的雙特異性結合分子，其中至少一個VHH能夠以>60%的抑制率阻斷重組人VEGF與重組人VEGFR-2之間的相互作用，且其中至少一個VHH能夠以彡60 %的抑制率阻斷該相互作用。
19.權利要求18的雙特異性結合分子，其中具有抑制率<60%的該VHH為具有SEQIDNO:45中所示序列的VHH的序列最優化的變異體。
20.權利要求19的雙特異性結合分子，其中該VHH具有SEQID NO:65及66以及表63中所示的序列或SEQ ID NO:67中所示的序列。
21.權利要求5的雙特異性結合分子，其包含 a)具有序列選自SEQID NO:35或41中的序列的VHH作為該D114結合組分，及 b)以下作為該VEGF結合組分 i)具有SEQID N0:64中所示序列的VHH，或 ii)包含具有SEQID NO: 64中所示序列的VHH及具有SEQ ID NO: 67中所示序列的VHH的雙互補位VHH。
22.權利要求I至21中任一項的雙特異性結合分子，其包含一個或多個連接子分子和/或半衰期延長部分。
23.權利要求22的雙特異性結合分子，其中該半衰期延長部分共價連接至或融合至免疫球蛋白單一可變域，且選自Fe部分、白蛋白、白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域或聚氧化烯分子。
24.權利要求21或22的雙特異性結合分子，其具有SEQID NO:81中所示的胺基酸序列。、
25.權利要求21或22的雙特異性結合分子，其具有SEQID NO:82中所示的胺基酸序列。
26.權利要求21或22的雙特異性結合分子，其具有SEQID NO:83中所示的胺基酸序列。
27.權利要求21的雙特異性結合分子，其具有SEQID NO:84中所示的胺基酸序列。
28.權利要求21或22的雙特異性結合分子，其具有SEQID N0:85中所示的胺基酸序列。
29.權利要求21或22的雙特異性結合分子，其具有SEQID NO:86中所示的胺基酸序列。
30.一種核酸分子，其編碼權利要求I至29中任一項的雙特異性結合分子或包含其的載體。
31.一種宿主細胞,其含有權利要求30的核酸分子。
32.一種藥物組合物，其含有至少一種權利要求I至29中任一項的VEGF結合分子作為活性成分。
33.權利要求32的藥物組合物，其用於治療與VEGF介導的血管生成作用相關的疾病。
34.權利要求32的藥物組合物，其用於治療癌症及癌性疾病。
35.權利要求32的藥物組合物，其用於治療眼病。
全文摘要
本發明涉及雙特異性結合分子，特別是免疫球蛋白單一可變域，例如VHH及域抗體，其在一個分子中包含VEGF結合組分及Dll4結合組分。本發明涉及含有所述雙特異性結合分子的藥物組合物，及其在治療與VEGF和Dll4介導的血管生成作用相關的疾病的用途。本發明涉及編碼所述雙特異性結合分子的核酸、宿主細胞及其製備方法。
文檔編號C07K16/18GK102639566SQ201080054891
公開日2012年8月15日 申請日期2010年10月1日 優先權日2009年10月2日
發明者A.格什溫, D.範胡裡克, E.伯吉斯, E.德塔沃尼爾, J.科爾克曼, J.鮑克尼厄, P.麥切爾斯 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司