一種西瓜果斑病菌巢式PCR檢測方法與流程
2023-07-26 02:48:07
本發明涉及特異性植物病原菌PCR檢測方法，具體涉及一種西瓜果斑病菌（Acidovorax citrulli）巢式PCR檢測方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
瓜類細菌性果斑病(Bacterial fruit blotch, BFB)是西甜瓜等葫蘆科作物上重要的細菌病害。瓜類細菌性果斑病是一種典型的種傳病害，由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起。該病能侵染葉片、果實和種子，嚴重影響果實的品質和產量，對瓜類生產及相關產業構成了極大的威脅。我國自上世紀90年代首次報導後，現已在新疆、寧夏、河北、內蒙古、北京、福建、海南、山東、吉林、湖南等地大量發生。瓜類細菌性果斑病造成大田西瓜和甜瓜減產甚至絕收，給西甜瓜生產帶來巨大損失，該病害目前的發生已呈上升趨勢。因此建立西瓜噬酸菌的快速、準確的檢測技術是防止該病害發生的重要舉措。
傳統的病原菌檢測技術是在分離和進行進一步的培養從而獲得相應病原物的基礎上，通過形態學觀察和科赫氏法則來判斷病原物的種類。但是，分離，培養全部過程往往都非常消耗時間以及需要大量的勞動力資源。免疫血清學鑑定方法雖然敏感，特異性強，但製備過程耗時耗力。近幾年，以PCR技術為代表的分子檢測方法得到了迅速的發展和應用，PCR快速分子檢測方法普遍具有精度高，快速，有效的特點，而且PCR技術相對特異，敏感。而套式PCR檢測方法擁有比傳統過往PCR分子檢測方法更準確的靈敏度以及更強的特異性。因此，建立西瓜果斑病菌快速分子檢測體系，可以在西瓜發病前或者發病早期對發病植株進行快速準確檢測，對西瓜果斑病害的及時預報，以及控制其產生的病害，保護我國瓜類產業具有重大的意義。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種西瓜果斑病菌巢式PCR檢測方法，其具有特異性強、靈敏度高的特點，可用于田間西瓜果斑病的早期診斷。該技術對於西瓜果斑病菌引起病害顯症之前的早期監測和及時防治具有十分重要的意義。
本發明的目的可通過以下技術方案來實現：
西瓜果斑病菌巢式PCR檢測方法，包括以下步驟：
步驟A、基因組DNA提取：採用CTAB法提取西瓜果斑病菌基因組DNA或發病植物組織DNA；
步驟B、第一輪PCR擴增：以步驟A得到的DNA樣品為模板，採用西瓜果斑病菌VapB-like抗毒素基因引物VapB -1F/ VapB -1R經過PCR擴增得到第一輪PCR產物。
引物序列：VapB-1F：5』-GGGCAATAGCTTGGCGGTTCG-3』；
VapB -1R：5』-CATTGGCCTCGTCCCGGTTGA-3』；
PCR反應體系25μl：基因組DNA 1μl，10×PCR反應緩衝液(含Mg2+) 2.5μl，各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，DNA Taq聚合酶0.5μl (5U/μl)，10 μmol/L的VapB-1F引物1μl，10 μmol/L的VapB-1R引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；PCR擴增程序：94℃預變性4min， 94℃變性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸45sec，共30個循環；72℃延伸10min；4℃保存；
步驟C、第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增產物或者第一輪PCR擴增產物的稀釋液為模板，採用特異性引物VapB-2F/VapB-2R經過PCR擴增得到第二輪PCR擴增產物。
引物序列：VapB-2F：5』-GCGAACGTAGTCGAAGCGCTCG-3』；
VapB-2R：5』-TGGCCTCGTCCCGGTTGAACT-3』；
PCR反應體系25μl：第一輪PCR擴增產物或者第一輪PCR擴增產物的稀釋液1μl，10×PCR反應緩衝液(含Mg2+) 2.5μl，各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，DNA Taq聚合酶0.5μl (5U/μl)，10 μmol/L的VapB-2F引物1μl，10 μmol/L的VapB-2R引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；
PCR擴增程序：94℃預變性4min， 94℃變性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30個循環；72℃延伸8min；4℃保存；
步驟D、PCR擴增產物檢測：取8 μl第二輪PCR擴增產物，採用1%瓊脂糖凝膠，在80 V 電壓下電泳30min，之後置於EB內染色20min後取出，於凝膠成像系統下觀察拍照，如果存在175bp的特異條帶，則確定所檢測的病菌為西瓜果斑病菌。
本發明具有以下技術優勢和積極效果
1、靈敏度高：本發明檢測靈敏度為0.5 fg西瓜果斑病菌基因組DNA，較常規PCR靈敏度提高了1000倍。
2、特異性強：本發明針對性的檢測出西瓜果斑病菌，能從西瓜果斑病菌基因組中擴增出175bp的單一目的條帶，而燕麥食酸菌燕麥亞種、野油菜黃單胞菌錦葵致病變種、丁香假單胞菌、大黃歐文氏菌、方氏棒形桿菌、解澱粉歐文氏菌等30個參試菌株基因組DNA和西瓜植物組織DNA中均無擴增產物，受其他菌類幹擾小，準確率高。
3、實用性好：本發明可用於西瓜果斑病潛伏期或者感病初期時的病害檢測。對病害的早期診斷和及時防治報具有十分重要的意義。
4、操作簡便快速：應用本發明方法，對帶西瓜果斑病菌的植物組織進行病菌DNA提取、PCR擴增和常規的瓊脂糖電泳後即可判定結果，無需對擴增產物進行限制性內切酶酶切。一般整個檢測過程可在8小時內完成。
附圖說明
圖1是西瓜果斑病菌VapB特異性引物的特異性驗證結果。其中，M：DL2000 DNA Marker，1為陽性對照，2-3是不同來源地的西瓜果斑病菌的DNA，6：燕麥食酸菌燕麥亞種，7：野油菜黃單胞菌錦葵致病變種，8：丁香假單胞菌，9：大黃歐文氏菌，10：方氏棒形桿菌，11：解澱粉歐文氏菌，12：陰性對照。
圖2是西瓜果斑病菌VapB靈敏性驗證結果。其中，M為DL2000 DNA Marker，1-9：5.0 ng/μL，5.0×10-1ng/μL，5.0×10-2ng/μL，5.0×10-3ng/μL，5.0×10-4ng/μL，5.0×10-5ng/μL，5.0×10-6ng/μL，5.0×10-7ng/μL，5.0×10-8ng/μL的不同濃度西瓜果斑病菌DNA。
圖3是發病組織VapB特異性檢測結果。其中，M為2000 DNA marker，1，8：健康植物組織，2：陽性對照，3-4：發病潛伏期植物組織，5-7，9：分別為發病植物組織。
具體實施方式
以下結合實施例具體闡述本發明。
實施例1西瓜果斑病菌的巢式PCR檢測
1. 樣品DNA提取
1.1 提取菌體DNA
將西瓜果斑病菌接種於LB液體培養基，28℃、200rpm過夜培養。用CTAB法提取細菌基因組DNA，具體操作如下：
1) 取1.5ml 培養物於2.0ml離心管中，12000rpm離心2min；
2) 棄上清液，加入567μl TE緩衝液重新懸浮菌體，加入30μl 10%SDS溶液和3μl 20mg/ml 的蛋白酶K，輕輕混勻，於37℃溫育1h；
3) 加入100μl 5mol/L NaCl溶液，充分混勻，再加入80ul CTAB/NaCl 溶液，混勻後65℃溫育10min；
4) 加入800μl的酚/氯仿/異戊醇溶液（三者體積比為25:24:1），混勻後12000rpm離心5min；
5) 取上清液轉入新的1.5ml離心管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉澱下來，12000rpm離心15 min；
6) 棄上清液，加入1000μl 無水乙醇，混勻，12000 rpm 離心 5 min；
7) 棄上清液，在超淨工作檯上自然晾乾，加入60 μl ddH2O溶解DNA，於－20℃保存備用。
1.2 提取待檢植物組織樣品DNA
1)稱取荔枝發病組織100mg，加入液氮研磨成粉末，轉入2.0ml離心管中；
2)加入1000μl CTAB/NaCl 溶液，於65℃水浴30min，每各10min混勻一次，12000rpm離心10min；
3)取上清液800μl於2.0ml離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液（三者體積比為25:24:1），混勻後12000rpm離心5min；
4)取上清液750μl於2.0ml離心管中，加入等體積的氯仿/異丙醇溶液（體積比為24:1），混勻，12000rpm離心5min；
5)取上清液500μl於2.0ml離心管中，加入50μl預冷的3mol/L NaAC溶液(PH=5.2)，混勻，加入50μl預冷的異丙醇，混勻，於－20℃放置30min；
6)4℃10000rpm離心5min，棄上清液，加入1000μl 預冷的75%無水乙醇洗滌沉澱2次，在用無水乙醇洗滌1次，在超淨工作檯上自然晾乾，加入60 μl ddH2O溶解DNA，於－20℃保存備用。
2. 第一輪PCR擴增
以提取的DNA樣品為模板，採用西瓜果斑病菌VapB-like抗毒素基因引物VapB -1F/ VapB -1R經過PCR擴增得到第一輪PCR產物。
引物序列：VapB-1F：5』-GGGCAATAGCTTGGCGGTTCG-3』
VapB -1R：5』-CATTGGCCTCGTCCCGGTTGA-3』
PCR反應體系25μl：基因組DNA 1μl，10×PCR反應緩衝液(含Mg2+) 2.5μl，各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，DNA Taq聚合酶0.5μl (5U/μl)，10 μmol/L的VapB-1F引物1μl，10 μmol/L的VapB-1R引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；PCR擴增程序：94℃預變性4min， 94℃變性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸45sec，共30個循環；72℃延伸10min；4℃保存；
2. 第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增產物或者第一輪PCR擴增產物的稀釋液為模板，採用特異性引物VapB-2F/VapB-2R經過PCR擴增得到第二輪PCR擴增產物。
引物序列：VapB-1F：5』-GCGAACGTAGTCGAAGCGCTCG-3』
VapB-2R：5』-TGGCCTCGTCCCGGTTGAACT-3』
PCR反應體系25μl：第一輪PCR擴增產物或者第一輪PCR擴增產物的稀釋液1μl，10×PCR反應緩衝液(含Mg2+) 2.5μl，各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，DNA Taq聚合酶0.5μl (5U/μl)，10 μmol/L的VapB-2F引物1μl，10 μmol/L的VapB-2R引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；
PCR擴增程序：94℃預變性4min， 94℃變性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30個循環；72℃延伸8min；4℃保存；
4. PCR擴增產物檢測
取8 μl第二輪PCR擴增產物，採用1%瓊脂糖凝膠，在80 V 電壓下電泳30min，之後置於EB內染色20min後取出，於凝膠成像系統下觀察拍照，如果存在175bp的特異條帶，則確定所檢測的病菌為西瓜果斑病菌。
實施例2 巢式PCR靈敏度試驗
利用10倍稀釋的方法將提取的西瓜果斑病菌初始濃度為50 ng/μL的DNA，分別稀釋成5.0 ng/μL，5.0×10-1ng/μL，5.0×10-2ng/μL，5.0×10-3ng/μL，5.0×10-4ng/μL，5.0×10-5ng/μL，5.0×10-6ng/μL，5.0×10-7ng/μL，5.0×10-8ng/μL，5.0×10-9ng/μL不同濃度進行套式PCR。分別取各濃度的DNA 1μl 作為模板，按實施例1的步驟，依次進行第一輪和第二輪兩輪PCR擴增。經兩輪PCR擴增所得產物的電泳結果見圖2。本發明巢式PCR檢測靈敏度是0.5 fg西瓜果斑病菌基因組DNA，較常規PCR靈敏度提高了100倍。
實施例3：發病組織中西瓜果斑病菌的檢測
1．樣品採集：植物組織樣品採自福建福州不同地區超市及農貿市場。
2．DNA提取及檢測
發病植物組織採用NaOH快速裂解法提取西瓜果斑病菌DNA。具體過程如下：(1)將西瓜組織洗淨、晾乾，剪取發病部位；(2)按1mg病葉加入10μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）計量，將組織充分磨碎成糊，在12,000g離心機中離心5min；(3)取上清20μl與等體積的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍液，分別取1μl原液、 10倍、100倍、1000倍液作為PCR模板進行擴增。
按實施例1的步驟2和步驟3依次進行第一輪和第二輪兩輪PCR擴增。兩輪擴增後的產物電泳結果見圖3。其中，M為2000 DNA marker，1：健康植物組織，2：陽性對照，3-7：分別為發病植物組織，8-11：分別為發病潛伏期植物組織。由圖3可見，利用巢式PCR對35個樣品進行檢測時均擴增出175bp的目的條帶，健康組織和陰性對照均無擴增產物。這表明，本發明可用於西瓜果斑病潛伏期或者感病初期時的病害檢測。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
SEQUENCE LISTING
福建省農業科學院植物保護研究所
一種西瓜果斑病菌巢式PCR檢測方法
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PatentIn version 3.3
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DNA
人工序列
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DNA
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DNA
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DNA
人工序列
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tggcctcgtc ccggttgaac t 21