一種微囊藻毒素-lr多抗免疫親和柱的製備和使用方法
2023-05-18 19:50:26
專利名稱：一種微囊藻毒素-lr多抗免疫親和柱的製備和使用方法
技術領域：
一種微囊藻毒素-LR多抗免疫親和柱的製備和使用方法，屬於免疫親和層析 及微囊藻毒素檢測技術領域。
背景技術：
隨著工農業的發展和城市化進程的加快，工業和生活汙水進入水環境中， 導致水體富營養化程度加劇。水中氮磷等含量增加，引起有毒藍藻水華的頻繁 發生。近年來，我國的飲用水源地如太湖、巢湖、滇池等湖泊， 一些水庫、河 流等均受到藍藻水華的侵襲。2007年4月發布的《長江保護與發展報告》稱， 2003年三峽庫區蓄水至135米之後，12條長江一級支流在回水區不同程度地出 現"水華"現象，並且近幾年有加劇的趨勢。
藍藻水華腐爛後將毒素釋放於水中，其中最主要的是微囊藻毒素(以下簡 稱 MC ) 。 MC 是 一 組環狀七肽， 般結構為環 (-D-Ala-L-X-D-MeAsp-L-Y-Adda-D-Glu-Mdha)，其中L為左旋，D為右旋，X、 Y為可變胺基酸。由於XY的不同及MeAsp和Adda的甲基化或去甲基化產生 的差異，可以形成多種不同的MC異構體。目前已分離、鑑定出70多種MC。
MC引起野生動物和家畜中毒甚至死亡在世界各地都有報導。MC還是潛在 的致癌因子。MC中天然存在最常見的一種微囊藻毒素-LR (以下簡稱MC-LR) 已被發現是蛋白磷酸酶1 (PP1)和蛋白磷酸酶2A (PP2A)的抑制劑。此抑制 作用是因為毒素與酶之間在肝中通過共價鍵和非共價鍵產生特異性結合而引起 的。在小鼠實驗中發現MC-LR是潛在的腫瘤促進因子。1996年巴西發生透析液 受MC汙染的事故，造成50多人死亡。考慮到飲水安全，WHO和我國GB 5749-2006生活飲用水衛生標準規定飲用水中MC-LR的限量為1 (ig/L。
免疫親和柱(IAC)是利用免疫親和層析原理製作的分離分析預裝柱。由於 抗體與抗原作用具有高度專一性，因此通過IAC淨化能夠去除絕大部分雜質。 IAC技術己日漸成熟，在與藻毒素類似的真菌毒素的檢測中已廣泛應用，其中 黃麴黴毒素的免疫親和層析已被列入國標中(GB18980-2003和GB18979-2003)。
目前水中MC-LR的檢測常用HPLC和LC-MS法，因含量低，在進樣前， 一般用固相萃取柱(SPE)富集，但是SPE無特異性，水中雜質多，富集後會引入 許多雜質，幹擾檢測結果，特別是HPLC法，有時測定值與實際值相去甚遠。 LC-MS法雖然檢測限低，測定結果較準確，但是價格昂貴， 一般實驗室沒有。
利用本發明所研製的IAC，通過一次淨化即可除去絕大部分雜質，直接進HPLC就能獲得準確的結果，而一般縣市級疾控中心都有HPLC，能夠滿足
MC-LR日常監測的需求。
發明內容
本發明的目的是提供一種MC-LR多抗免疫親和柱的製備和使用方法，所研 制的IAC是將MC-LR的多抗固定於柱中，從而吸附樣品溶液中的MC-LR，洗 脫後起到富集和淨化的效果，然後進HPLC進行定性定量分析。作為前處理過 程，IAC富集優於現有的SPE法。
本發明的技術方案 一種MC-LR多抗免疫親和柱的製備方法
(1) 以MC-LR與牛血清白蛋白(BSA)偶聯，得到的偶聯物(以下簡稱 MC-LR-BSA)作為人工抗原，兔疫獲得MC-LR抗血清，再採用飽和硫酸銨二 歩沉澱法純化獲得MC-LR多抗；
(2) 瓊脂糖凝膠Sepharose 4B的活化用溴化氰法活化瓊脂糖凝膠 Sepharose 4B，活化過程如下
(a) 取10 mL Sepharose 4B放在布氏漏鬥中抽乾，用30 mL水分兩次洗滌後 抽乾，加少量的0.1 mol/L pH 8.3的NaHC03洗滌，立即轉入100 mL燒杯中， 冰浴下緩慢攪拌；
(b) 在通風櫥內稱取1 g溴化氰，加水10 mL溶解，然後分批加入Sepharose 4B中，邊加邊攪拌，同時測pH值，通過滴加2mol/LNaOH，使pH保持在10.5， 待溴化氰反應完全，pH保持不變，停止攪拌；
(c) 將活化的Sepharose 4B加入小冰塊，迅速倒入布氏漏鬥中，以冰水抽洗 成中性，再迅速以150 mL冷的0.1 mol/L pH 8.3的NaHC03抽洗；
(3) MC-LR多抗免疫親和柱的製備
MC-LR多抗與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B偶聯得到親和吸附劑，填入柱中制 得MC-LR多抗免疫親和柱，操作步驟如下
(d) 偶聯
將上述製備純化好的MC-LR多抗置於pH8.3含有0.5 M NaCl的0.1 M NaHC03的偶聯緩衝液中透析12 h;將上述活化好的Sepharose 4B置於砂芯漏鬥 中用偶聯緩衝液快速抽洗，然後迅速倒入MC-LR多抗溶液中進行偶聯，紫外掃 描監控偶聯過程；用5倍MC-LR多抗溶液體積以上的偶聯緩衝液洗去未偶聯的 MC-LR多抗，得到瓊脂糖-抗體偶聯複合物；收集全部的洗脫液，通過測定其蛋 白質的含量計算未偶聯上MC-LR多抗的量；
(e) 封閉活性基團
將瓊脂糖-抗體偶聯複合物轉入5倍體積pHS.O的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩衝液中，保持2h，以封閉瓊脂糖凝膠中多餘的活性基團；
(f) 洗滌
5步驟(e)得到的瓊脂糖-抗體偶聯複合物依次用5倍偶聯複合物體積的pH4.0 的含0.5 M NaCl的0.1 M醋酸緩衝液和5倍偶聯複合物體積的pH8.0的含0.5 M NaCl的O.l M Tris-HCl緩衝液洗滌，此洗滌過程重複三次；然後用5倍偶聯復 合物體積的PBS洗滌兩次；
(g) 防腐處理
步驟(f)製備好的瓊脂糖-抗體偶聯複合物如需放置一段時間，應使用含有 1/10000疊氮鈉的PBS緩衝液浸泡，然後瀝去多餘的溶液後放入包裝袋或瓶中在
4x:密閉保存；
(h) 裝柱
將步驟(f)或(g)得到的瓊脂糖-抗體偶聯複合物填充入2mL或5mL固 相萃取空柱管中，在負壓下用PBS將凝膠壓緊，即製成MC-LR多抗IAC;
(i) 保存
瓊脂糖-抗體偶聯複合物或填充好的MC-LR多抗IAC切勿冷凍，保存在4°C 的冰箱內；
(j)柱的再生
柱使用後，用4-10個柱床體積pH8.5含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩衝 液，和用4-10個柱床體積pH4.5含0.5 MNaCl的0.1 M醋酸鈉緩衝液輪流清洗 IAC兩次，再用PBS緩衝液充分平衡IAC後保存在4"C冰箱內供下次使用。
用所述方法製備的MC-LR多抗IAC，應用於實際水樣中MC-LR的測定。 取0.2 L受藍藻汙染的水樣先通過0.45 微孔濾膜過濾；IAC先依次用5 mL 甲醇，5mL蒸餾水，5mLPBS預處理；濾液過預處理後的MC-LR多抗IAC; 再依次用5 mLPBS、 5 mL蒸餾水、5 mL 10%甲醇淋洗雜質；最後用5 mL純甲 醇洗脫；洗脫液減壓蒸乾，殘留物用0.2mLPBS溶解後進HPLC分析；同時用 固相萃取柱做對照實驗；
HPLC的測定條件儀器為Waters 600高效液相色譜儀配合Waters 996 二極 管陣列檢測器；色譜柱為Kromasil 100-5C18， 150x4.6 mm， 5,;流動相為含 0.05%甲酸的去離子水乙腈體積比為60 : 40，流速為1 mL/min;柱溫為30°C; 進樣量20 (iL;檢測波長為240 nm。
本發明的有益效果MC-LR多抗免疫親和柱能將MC-LR與其它雜質分離。 在HPLC圖中顯示MC-LR的峰與其它雜質峰分開，不至影響測定結果，而一般 SPE淨化由於雜質太多，在HPLC圖中MC-LR峰甚至難以分辨。由於MC-LR 多抗與MC-LR能夠特異性結合使IAC有很好的特異性， 一次淨化能除去絕大部 分幹擾物。而SPE無特異性，不能除去幹擾物，會影響最後的測定結果。
圖1 MC-LR標樣HPLC譜圖。圖2 MC-LR多抗免疫親和柱淨化水樣HPLC譜圖。 圖3固相萃取柱淨化水樣HPLC譜圖。
具體實施例方式
MC-LR與牛血清白蛋白(BSA)偶聯物，以下簡稱MC-LR-BSA; MC-LR 與卵清蛋白(OVA)偶聯物，以下簡稱MC-LR-OVA。 實施例l: MC-LR多抗的製備
1、 完全抗原的合成
(1) MC-LR-BSA免疫原的合成
完全抗原MC-LR-BSA的合成採用水溶性碳二亞胺法，利用l-乙基-3 (3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDC)作為"橋聯劑"，使MC-LR的羧基(-COOH)與 EDC反應生成中間產物，再與BSA蛋白分子上的氨基反應，製成完全抗原 MC-LR-BSA偶聯物作為免疫原。合成方法如下
0.5 mg MC-LR溶於0.5 mL甲醇，分為0.25 mL的兩等份，通氮氣，在35°C 下揮發至千。 一份含有0.25 mg MC-LR的殘餘物溶於lmL PBS (pH7.4)緩衝 液中，力口入5mgEDC，振蕩至完全溶解，用0.1M鹽酸溶液將pH值調至5， 室溫下緩慢攪拌5 min。將1.4 mg BSA溶於3 mL PBS緩衝液中，振蕩至完全溶 解，然後逐滴加入上述MC-LR溶液中，在室溫下保持lh。然後4。C下過夜。將 混合物於fC下在0.1 mol/L pH7.4的PBS中透析72 h，每隔6 h換透析液1次。 冷凍乾燥後於-2(TC保存。
(2) MC-LR-OVA檢測抗原的合成
用混合酸酐法完成MC-LR與載體蛋白OVA的交聯，合成MC-LR-OVA完 全抗原作為檢測抗原。合成方法如下
一份含有0.25 mg MC-LR的殘餘物加入0.5 mL l,4-dioxane，振蕩使其溶 解，再加入7 |iL氯甲酸異丁酯和12 |iL三丁胺，將此混合物輕微振蕩然後在4°C 下保持30min。 0.9 mg OVA溶於3 mL碳酸氫鈉緩衝液(pH 9.0)中。將上述 MC-LR溶液逐滴加入到溶解的OVA中，並於4"C輕微攪拌4 h，整個過程維持 pH在9.0。然後，將混合物於4。C下在0.1 mol/L pH7.4的PBS中透析72 h，每 隔6 h換透析液1次。冷凍乾燥後於-2(TC保存。
2、 MC-LR多抗的製備與純化
用合成的MC-LR-BSA作為免疫原，免疫得到MC-LR抗血清。 採用飽和硫酸銨二步沉澱法純化得到的抗血清，操作如下
(1) 取lOmL抗血清與等體積的PBS(pH7.4)混合，攪拌下逐滴加入10 mL 飽和硫酸銨，4'C過夜，使免疫球蛋白充分沉澱。
(2) 4000g離心20min，棄去上清。用10 mL PBS溶解沉澱，再逐滴加入 5mL飽和硫酸銨溶液，4。C過夜。重複第二步過程一次。用10mLPBS溶解末次離心所得沉澱物裝入透析袋。 4。C透析三天充分除鹽(每天換液4次)。透析純化的蛋白質冷凍乾燥後即為 MC-LR多抗，將其保存在一20。C下。
實施例2:瓊脂糖凝膠Sepharose 4B的活化
用溴化氰法活化瓊脂糖凝膠Sepharose 4B。溴化氰法活化效果好、偶聯率高、 對抗體影響小，活化過程如下
(1) 取10 mL Sepharose 4B放在布氏漏鬥中抽乾，用30 mL水分兩次洗滌後 抽乾，加少量的O.l mol/LpH8.3的NaHC03洗滌，立即轉入100 mL燒杯中， 冰浴下緩慢攪拌。
(2) 在通風櫥內稱取1 g溴化氰，加水10mL溶解，然後分批倒入瓊脂糖中， 邊加邊攪拌，同時測pH值，通過滴加2mol/LNaOH，使pH保持在10.5左右。 待溴化氰完全反應完全，pH基本保持不變，即可停止攪拌。
(3) 將活化的Sepharose 4B加入小冰塊，迅速倒入布氏漏鬥中，以冰水抽洗 成中性，再迅速以150mL冷的0.1 mol/LpH8.3的NaHC03抽洗。
實施例3: MC-LR多抗IAC的製備
MC-LR多抗與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B偶聯得到親和吸附劑，填入柱中制 得MC-LR多抗免疫親和柱，操作步驟如下
(1) 偶聯
將上述製備純化好的MC-LR多抗置於pH 8.3含有0.5 M NaCl的0.1M NaHC03緩衝液的偶聯緩衝液中透析12 h。將上述活化好的Sepharose 4B凝膠置 於砂芯漏鬥中用偶聯緩衝液快速抽洗，然後迅速倒入MC-LR多抗溶液中進行偶 聯，紫外掃描監控偶聯過程。用5倍體積以上的偶聯緩衝液洗去未偶聯的抗 MC-LR多抗，得到瓊脂糖-抗體偶聯複合物。收集全部的洗脫液，通過測定其蛋 白質的含量計算未偶聯上MC-LR多抗的量。
(2) 封閉活性基團
將瓊脂糖-抗體偶聯複合物轉入5倍體積pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩衝液中，保持2h，以封閉瓊脂糖凝膠中多餘的活性基團。
(3) 洗滌
步驟(2)得到的瓊脂糖-抗體偶聯複合物用5倍偶聯複合物體積的pH 4.0 的含0.5MNaCl的0.1 M醋酸緩衝液和5倍偶聯複合物體積的pH 8.0的含0.5 M NaCl的O.l M Tris-HCl緩衝液洗滌，此洗滌過程重複三次。然後用5倍偶聯復 合物體積的PBS洗滌兩次。
(4) 防腐處理
步驟(3)製備好的瓊脂糖-抗體偶聯複合物如需放置一段時間，應使用含有 1/10000疊氮鈉的PBS緩衝液浸泡，然後瀝去多餘的溶液後放入包裝袋或瓶中在4'C密閉保存。
(5) 裝柱
將步驟(3)或(4)得到的瓊脂糖-抗體偶聯複合物填充入2mL或5mL固 相萃取空柱管中，在一定負壓下用PBS將凝膠壓緊，即製成MC-LR多抗IAC。
(6) 保存
瓊脂糖-抗體偶聯複合物或填充好的藻毒素IAC切勿冷凍，保存在4'C的冰 箱內。
(7) 柱的再生
柱使用後，用4-10個柱床體積pH8.5含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩衝 液，和用4-10個柱床體積pH4.5含0.5 MNaCl的0.1 M醋酸鈉緩衝液輪流清洗 IAC兩次，再用PBS緩衝液充分平衡IAC後保存在4。C冰箱內供下次使用。
實施例4:湖水水樣中MC-LR的檢測
1、 HPLC的測定條件
高效液相色譜儀為Waters 600配合Waters 996 二極體陣列檢測器，色譜柱 為Kromasil 100-5C18 (150x4.6 mm, 5 pm),流動相為含0.05%甲酸的去離子 水乙月青=60: 40 (v/v)，流速為lmL/min，柱溫為30°C，進樣量20 pL,檢測 波長為240 nm。
2、 實際水樣中MC-LR的測定
水樣2007年5月份取自太湖水域。0.2 L受藍藻汙染的太湖水樣先通過0.45 )im微孔濾膜過濾，濾液過製備的MC-LR的多抗和單抗IAC (柱子分別用5 mL 甲醇，5mL蒸餾/K， 5mLPBS預處理)。分另U用5mLPBS、 5 mL蒸餾水、5 mL 10%甲醇淋洗雜質，最後用5 mL純甲醇洗脫。洗脫液減壓蒸乾，殘留物用0.2 mL PBS溶解後進HPLC分析。同時用固相萃取柱做對照實驗。
圖1 3分別為MC-LR標樣、MC-LR多抗免疫親和柱淨化水樣、固相萃取 柱淨化水樣的HPLC譜圖。由圖2和圖3可知， 一次淨化的效果，IAC明顯優 於固相萃取柱(圖3雜質峰多於圖2)。 MC-LR多抗免疫親和柱能將MC-LR的 峰與其它雜質峰分開，不至影響測定結果，而SPE淨化由於雜質太多，MC-LR 峰甚至難以分辨。由於MC-LR多抗與MC-LR能夠特異性結合使IAC有很好的 特異性， 一次淨化能除去絕大部分幹擾物。而固相萃取柱無特異性，不能除去 幹擾物，而影響最後的測定結果。
一份湖水水樣，HPLC法檢測其中MC-LR的含量。IAC淨化，兩次平行測 定結果為0.209 pg/L和0.224 jug/L,固相萃取柱淨化測定結果為0.032昭/L，測 定結果偏差較大。
權利要求
1、一種微囊藻毒素-LR多抗免疫親和柱的製備方法，其特徵是(1)以微囊藻毒素-LR，以下簡稱MC-LR，與牛血清白蛋白BSA偶聯，偶聯物以下簡稱MC-LR-BSA，作為人工抗原，兔疫獲得MC-LR抗血清，再採用飽和硫酸銨二步沉澱法純化獲得MC-LR多抗；(2)瓊脂糖凝膠Sepharose4B的活化用溴化氰法活化Sepharose4B，活化過程如下(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏鬥中抽乾，用30mL水分兩次洗滌後抽乾，加少量的0.1mol/L pH8.3的NaHCO3洗滌，立即轉入100mL燒杯中，冰浴下緩慢攪拌；(b)在通風櫥內稱取1g溴化氰，加水10mL溶解，然後分批加入Sepharose4B中，邊加邊攪拌，同時測pH值，通過滴加2mol/LNaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反應完全，pH保持不變，停止攪拌；(c)將活化的Sepharose 4B加入小冰塊，迅速倒入布氏漏鬥中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L pH8.3的NaHCO3抽洗；(3)微囊藻毒素-LR多抗免疫親和柱的製備MC-LR多抗與瓊脂糖凝膠Sepharose4B偶聯得到親和吸附劑，填入柱中製得MC-LR多抗免疫親和柱，操作步驟如下(d)偶聯將上述製備純化好的MC-LR多抗置於pH8.3含有0.5M NaCl的0.1MNaHCO3的偶聯緩衝液中透析12h；將上述活化好的Sepharose4B置於砂芯漏鬥中用偶聯緩衝液快速抽洗，然後迅速倒入MC-LR多抗溶液中進行偶聯，紫外掃描監控偶聯過程；用5倍MC-LR多抗溶液體積以上的偶聯緩衝液洗去未偶聯的MC-LR多抗，得到瓊脂糖-抗體偶聯複合物；收集全部的洗脫液，通過測定其蛋白質的含量計算未偶聯上MC-LR多抗的量；(e)封閉活性基團將瓊脂糖-抗體偶聯複合物轉入5倍體積pH8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl緩衝液中，保持2h，以封閉瓊脂糖凝膠中多餘的活性基團；(f)洗滌步驟(e)得到的瓊脂糖-抗體偶聯複合物依次用5倍偶聯複合物體積的pH4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸緩衝液和5倍偶聯複合物體積的pH8.0的含0.5MNaCl的0.1M Tris-HCl緩衝液洗滌，此洗滌過程重複三次；然後用5倍偶聯複合物體積的PBS洗滌兩次；(g)防腐處理步驟(f)製備好的瓊脂糖-抗體偶聯複合物如需放置一段時間，應使用含有1/10000疊氮鈉的PBS緩衝液浸泡，然後瀝去多餘的溶液後放入包裝袋或瓶中在4℃中密閉保存；(h)裝柱將步驟(f)或(g)得到的瓊脂糖-抗體偶聯複合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在負壓下用PBS將凝膠壓緊，製成MC-LR多抗免疫親和柱，即MC-LR多抗IAC；(i)保存瓊脂糖-抗體偶聯複合物或填充好的MC-LR多抗IAC切勿冷凍，保存在4℃的冰箱內；(j)柱的再生柱使用後，用4-10個柱床體積pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl緩衝液，和用4-10個柱床體積pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸鈉緩衝液輪流清洗IAC兩次，再用PBS緩衝液充分平衡IAC後保存在4℃冰箱內供下次使用。
2、權利要求1所述方法製備的MC-LR多抗免疫親和柱的使用方法，其特 徵是實際水樣中MC-LR的測定，取0.2 L受藍藻汙染的水樣先通過0.45 微 孔濾膜過濾；IAC先依次用5 mL甲醇，5 mL蒸餾水，5 mL PBS預處理；濾液 過預處理後的MC-LR多抗IAC;再依次用5 mL PBS、 5 mL蒸餾水、5 mL 10 %甲醇淋洗雜質；最後用5mL純甲醇洗脫；洗脫液減壓蒸乾，殘留物用0.2mL PBS溶解後進HPLC分析；同時用固相萃取柱做對照實驗。
全文摘要
一種微囊藻毒素-LR(MC-LR)多抗免疫親和柱(IAC)的製備和使用方法，屬於免疫親和層析及微囊藻毒素(MC)檢測技術領域。本發明所研製的IAC是將MC-LR多抗固定於柱中，從而吸附樣品溶液中的MC-LR，洗脫後起到富集和淨化的效果，然後進HPLC進行定性定量分析。作為前處理過程，IAC富集優於現有的固相萃取(SPE)法。在HPLC圖中顯示MC-LR多抗IAC能將MC-LR的峰與其它雜質峰分開，不至影響測定結果，而SPE淨化由於雜質太多，MC-LR峰甚至難以分辨。由於MC-LR多抗與MC-LR能夠特異性結合使IAC有很好的特異性，一次淨化能除去絕大部分幹擾物。而SPE無特異性，不能除去幹擾物，會影響最後的測定結果。
文檔編號G01N30/50GK101446575SQ20081024251
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月29日 優先權日2008年12月29日
發明者磊 周, 張敬平, 戴維傑, 毛雲中, 堅 湯, 肖付剛, 鈕偉民 申請人:無錫市疾病預防控制中心