抗masp－2抗體的製作方法

2023-05-19 11:58:46 1

專利名稱：抗masp－2抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗MASP-2抗體和其功能等同物。特別地，本發明涉及能抑制MASP-2的功能的MASP-2抗體。此外，本發明涉及生產所述抗體的方法、抑制MASP-2活性的方法以及包含MASP-2抗體的藥物組合物。
背景技術：
補體系統包含對先天的以及適應性免疫防禦功能有重大意義的酶和非酶蛋白質的複雜系列。直到最近才知道兩種活化模式，經典途徑由抗體-抗原複合物起始，替代途徑由在微生物表面上的某些結構起始。已經描述了補體激活的第三種、新的不依賴抗體的途徑。當甘露聚糖結合凝集素(mannan-binding lectin)(MBL，最初被描述為甘露聚糖結合蛋白3，MBP，參見Ezekowitz，美國專利5,270,199)與碳水化合物結合時起始這個途徑，被稱為MBLectin途徑。
MBL與補體的組分Cl的Clq亞組分在結構上相關，看來是MBL通過相關聯的稱為MASP或p1000的絲氨酸蛋白酶激活補體系統，MASP類似於經典途徑的Clr和Cls組分。這個新的補體激活途徑被稱為MBLectin途徑。根據為這個途徑假定的機制，MBL與在許多微生物包括細菌、酵母、寄生原生動物和病毒表面發現的特殊碳水化合物結構結合，其抗微生物活性來自對末端的、溶胞補體途徑組分的活化，或來自促進吞噬作用。
MASP(MBL-相關絲氨酸蛋白酶)是在結構上與補體途徑的Clr和Cls相似的絲氨酸蛋白酶。MASP-1具有在胰蛋白酶和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶中發現的一類組氨酸環狀結構。已經發現MASP-1參與了MBL的補體激活。已經報導了編碼MASP-1的cDNA克隆，其編碼一推定的19胺基酸的前導肽、隨後是預計形成成熟肽的680個胺基酸殘基。
MASP-2(MBL-相關絲氨酸蛋白酶2)是在結構上也與補體途徑的Clr和Cls類似的絲氨酸蛋白酶。類似於這些，但與MASP-1相反，它沒有在胰蛋白酶和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶中發現的一類組氨酸環狀結構。已經發現MASP-2參與了MBL的補體激活。
在先有技術中已經描述了抗MASP-2的抗體。
WO02/06460描述了人MASP-2。該文件還進一步描述了通過用人MASP-2的N-末端19個胺基酸免疫兔，或用人MASP-2的胺基酸505到523和胺基酸538到556免疫雞來得到的抗MASP-2抗體。
發明概述有意思的是，本發明的發明人已經認識到，抑制MBLectin途徑在治療許多臨床狀況方面是可取的。然而，MBLectin途徑的特定抑制物在先有技術中沒有被很好的表徵，因此存在著對特定抑制物的未被滿足的需求。
本發明公開的是，針對MASP-2的C末端部分的抗體比針對MASP-2N-末端部分的抗體能更有效地抑制MASP-2的活性。本發明還公開了MASP-2表位，其中識別所述表位的抗體對於抑制MASP-2的活性是特別有用的。在以下描述了優選的表位。
一方面本發明涉及特異性地識別以及結合表位的至少一部分的抗體或其功能等同物，所述表位被選自下述的一個或多個參照抗體識別i.按保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；ii.命名為M0545YM029的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；iii.命名為M0545YM035的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；iv.命名為M0545YM046的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；或v.命名為M0545YM048的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體。
因此，本發明的一個目的是提供特異性識別和結合在MASP-2的C-末端部分中的表位或其功能同源物的抗體或其功能等同物。
本發明的進一步的目的是提供包含MASP-2的C-末端片段的分離的多肽，所述多肽對於獲得針對在MASP-2的C-末端中的表位的抗體是有用的。特別地，來自MASP-2的C-末端部分的分離的多肽或其功能同源物是包含下述或由下述組成的多肽i.EGF、CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域；或ii.CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域；或iii.CCP1結構域；或iv.CCP2結構域；或
CCP1和CCP2結構域。
本發明的進一步的目的是提供通過用包含MASP-2的C-末端片段的分離的多肽免疫動物，優選的免疫哺乳動物來生產抑制MASP-2活性的抗體的方法，所述多肽對於獲得針對在MASP-2的C-末端中的表位的抗體是有用的。特別地，來自MASP-2的C-末端部分的分離的多肽或其功能同源物是包含下述或由下述組成的多肽v.EGF、CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域；或vi.CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域；或vii.CCP1結構域和絲氨酸蛋白酶結構域；或viii.CCP2結構域和絲氨酸蛋白酶結構域；或ix.CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域x.絲氨酸蛋白酶結構域本發明的進一步的目的是提供生產特異性識別和結合在MASP-2的C-末端部分中的表位的抗體或其功能同源物的方法，包括向哺乳動物施用MASP-2的C末端部分或其片段或其功能同源物的步驟。本發明還公開了根據該方法生產的抗體。
本發明的更進一步的目的是提供抑制MASP-2的活性的方法，包括步驟1)提供包含MASP-2的組合物；2)提供根據本發明的MASP-2抗體；3)將所述組合物與所述抗體一同孵化，從而抑制MASP-2活性。
對MASP-2的抑制將導致對補體活化的抑制，優選的導致對MBLectin途徑的抑制。因此，抑制MASP-2的活性的抗體可被用於抑制MBLectin途徑的活化，從而所述抗體對於治療以不適當的補體活化、特別是不適當的MBLectin途徑活化為特徵的臨床狀況是有用的。
由此，本發明還涉及抑制MBLectin途徑的方法，優選的所述方法包括使用能抑制MASP-2的活性的抗MASP-2抗體。
本發明的更進一步的目的是提供藥物組合物，所述藥物組合物包含識別MASP-2的C-末端部分中的表位的MASP-2抗體或其功能等同物，以及藥學上可接受的賦形劑。
本發明的又一個目的是提供用於治療臨床狀況的藥物，所述藥物包含識別MASP-2的C-末端部分中的表位的抗體或其功能等同物作為活性成分。
本發明的又一個目的是提供治療臨床狀況的方法，包括向需要治療的個體施用治療有效劑量的、識別MASP-2的C-末端中的表位的抗體或其功能等同物。
本發明的進一步的目的是提供識別MASP-2的C-末端部分中的表位的抗體或其功能等同物的用途，用於製備治療需治療個體的臨床狀況的藥物。


附圖1描繪了指明單個結構域的MASP-2示意圖。
附圖2顯示了人MASP-1、MASP-2、Clr和Cls序列的比對，指明存在的單個結構域是MASP-2。在這四個蛋白質中保守的胺基酸進一步用星號表明。
附圖3描繪了MASP-2抗體在完全血清中對C4沉積作用(deposition)的抑制。
附圖4描繪了不同濃度的MASP-2抗體對C4沉積作用的抑制。
附圖5顯示了C4沉積作用分析。該圖說明了用各種純化的抗MASP-2抗體在人血清中抑制C4沉積作用。
附圖6顯示了利用4種不同抗體在人血清中針對MASP-2的Western印跡的組合。將人血清上樣在每個泳道上。該圖是從四個獨立的Western印跡組合而成的，利用上述泳道中顯示的抗體進行檢測。
附圖7顯示了測定重疊表位的競爭性ELSA的結果。
附圖8說明了NimoAb101抗體(DWE16140-6cons)的輕鏈可變區的序列。
附圖9說明了NimoAb101抗體(DWE16140-3consRev)的重鏈可變區的序列。
附圖10顯示了在NimoAb101抗體(DWE16140-，2，3，4，5，8)的重鏈序列，以及通過BLAST搜索鑑定的同源序列之間的比對。
附圖11顯示了在NimoAb101抗體(DWE16140-6，7，9，10)的輕鏈序列，以及通過BLAST搜索鑑定的同源序列之間的比對。
序列表
SEQ ID 1人MASP-2SEQ ID 2包括可變區的NimoAb101重鏈的一部分SEQ ID 3包括可變區的NimoAb101輕鏈的一部分SEQ ID 4包括可變區的NimoAb101重鏈的一部分SEQ ID 5包括可變區的NimoAb101輕鏈的一部分SEQ ID 6NimoAb101的重鏈的CDR1(也稱為H1)SEQ ID 7NimoAb101的重鏈的CDR2(也稱為H2)SEQ ID 8NimoAb101的重鏈的CDR3(也稱為H3)SEQ ID 9NimoAb101的輕鏈的CDR1(也稱為L1)SEQ ID 10NimoAb101的輕鏈的CDR2(也稱為L2)SEQ ID 11NimoAb101的輕鏈的CDR3(也稱為L3)SEQ ID 12PCR引物SEQ ID 13PCR引物定義術語「MASP-2的C-末端部分」是指包含EGF、CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域的MASP-2的C-末端，其中所述MASP-2的C-末端部分不包括CUB 1結構域。
術語「表位」是指在化合物上的特定位點，即，某一抗體特異性結合的蛋白質。表位可以是線性的，即，肽或表位可以是三維的結構。
發明的詳細說明抗體本發明的一個方面是提供特異性識別或結合MASP-2的C末端部分中的表位或其功能同源物的抗體或其功能等同物，所述表位可以是在以下提及的任何表位。
抗體或其功能等同物可以是本領域已知的任何抗體，例如衍生自哺乳動物或合成抗體的多克隆或單克隆抗體，例如單鏈抗體或包含抗體片段的雜交體。此外，抗體可以是單克隆抗體或人工多克隆抗體的混合物。另外抗體的功能等同物可以是抗體片段，特別是表位結合片段。此外，抗體或其功能等同物可以是模擬抗體的小分子模擬物(mimic)。自然發生的抗體是由重鏈和輕鏈組成的免疫球蛋白分子。在本發明的優選實施方式中，抗體是單克隆抗體。
單克隆抗體(Mab′s)是一種抗體，其中每個抗體分子是類似的，從而識別相同的表位。單克隆抗體一般通過雜交瘤細胞系來生產。製造單克隆抗體和合成抗體的雜交瘤細胞的方法對於本領域技術人員是熟知的。例如，生產抗體的雜交瘤可以通過使生產抗體的B淋巴細胞與永生的B淋巴細胞系融合來製備。例如，根據本發明的單克隆抗體可以按照AntibodiesALaboratory Manual，By EdHarlow and David Lane，Cold Spring HarborLaboratory Press，1988中描述的來製備。所述單克隆抗體可以衍生自任何適當的哺乳動物物種，然而單克隆抗體往往是齧齒動物抗體，例如鼠科或大鼠單克隆抗體。優選的，根據本發明的抗體是單克隆抗體或衍生自單克隆抗體。
多克隆抗體是識別特殊的給定抗原的抗體分子的混合物，因此多克隆抗體能識別所述抗原中的不同表位。通常從預先用抗原免疫了的哺乳動物的血清中純化多克隆抗體。可以按照AntibodiesA Laboratory Manual，ByEdHarlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中描述的任何方法來製備多克隆抗體。多克隆抗體可衍生自任何適合的哺乳動物物種，例如來自小鼠、大鼠、兔、驢、山羊、綿羊、奶牛或駱駝。抗體優選的不源自非哺乳動物物種，即，例如抗體優選的不是雞抗體。例如抗體也可以是人工多克隆抗體，例如在US 5,789,208或US 6,335,163中描述的，通過將它們整體引用把這兩個專利的說明書合併到本申請中。
在本發明的一個實施方式中，抗體是人抗體，例如人單克隆抗體。可以通過例如蛋白質工程、從合成文庫中選擇、或免疫帶有人抗體基因的轉基因小鼠，將人抗體製成人目標分子。做為選擇，抗體可以是人源化抗體。人源化抗體一般是包含來自人抗體的區域和來自非人抗體例如齧齒動物抗體的區域的嵌合抗體。人源化(也稱改形或CDR嫁接)是充分確立了的技術，用於減少異種來源的(一般是齧齒動物)單克隆抗體(mAbs)的免疫原性和改善他們對嫁接嚙齒類CDR的人免疫系統構架的活化作用。在此使用術語「人源化抗體分子」(HAM)來描述具有來自非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點的分子，而該分子的其餘的免疫球蛋白來源的部分中的一些或全部來自人免疫球蛋白。抗原結合位點可包含融合到一個或多個人恆定區的來自非人免疫球蛋白的完整可變區；或嫁接到適當的人類可變區中的構架區上的一個或多個互補決定區(CDR)。人源化MAbs的一種方法涉及生產嵌合抗體，其中將包含一種抗體的完整可變區的抗原結合位點融合到來自第二抗體，優選的人抗體的恆定區。例如，在EP-A-0120694(Celltech Limited)、EP-A-0125023(GenentechInc.)、EP-A-0171496(Res.Dev.Corp.Japan)、EP-A-0173494(Stanford University)和EP-A-0194276(CelltechLimited)中描述了進行這種嵌合化操作的方法。抗體人源化的更複雜的形式涉及重新設計可變區結構域，從而使組成非人抗體結合位點的胺基酸被整合到人抗體可變區的框架中(Jones等，1986)。
根據本發明的抗體也可以是重組抗體。重組抗體是利用重組技術生產的抗體或其片段或其功能等同物。例如，重組抗體可以利用合成文庫或通過噬菌體展示來生產。重組抗體可以根據任何的常規方法來生產，例如在″Recombinant antibodies″，Frank Breitling，Stefan Dbel，Jossey Bass，September 1999中概述的方法。
根據本發明的抗體也可以是雙特異性抗體，即，特異性識別兩種不同表位的抗體。雙特異性抗體通常可以從單克隆抗體或從重組抗體開始製備，例如通過化學交聯或利用重組技術融合兩個雜交瘤的抗體來組合他們的特異性。根據本發明的抗體也可以是三特異性抗體。
在一個優選的實施方式中抗體的功能等同物可以是抗體的片段，優選的是抗原結合片段或可變區。對本發明有用的抗體片段的實例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。對抗體進行木瓜胃蛋白酶消化產生兩個同一的抗原結合片段，稱為Fab片段，每個片段具有單個抗原結合位點，還產生餘下的「Fc」片段，因其易於結晶的能力而這樣稱呼。胃蛋白酶處理產生F(ab′)2片段，其具有兩個能交聯抗原的抗原結合片段，並產生餘下的其他片段(稱為pFc′)。其他的片段可包括雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。在此關於抗體使用的「功能片段」是指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。
優選的抗體片段保持了某些或實質上完全的選擇性結合其抗原或受體的抗體的能力。一些優選的片段定義如下(1)Fab是包含抗體分子的單價抗原結合片段的片段。Fab片段可以通過用木瓜胃蛋白酶消化整個抗體以產生完整的輕鏈和一條重鏈的一部分而產生。
(2)Fab′是抗體分子的片段，可通過用胃蛋白酶處理整個抗體，隨後還原，以產生完整的輕鏈和重鏈的一部分而獲得。每個抗體分子可獲得兩個Fab′片段。Fab′片段不同於Fab片段在於在重鏈CH 1結構域的羧基末端具有額外的幾個殘基，包括一個或多個來自抗體絞鏈區的半胱氨酸。
(3)(Fab′)2是可以通過用胃蛋白酶處理整個抗體而不進行隨後的還原來獲得的抗體片段。F(ab′)2是通過兩個二硫鍵結合在一起的兩個Fab′片段的二聚體。
(4)Fv是包含完整抗原識別和結合位點的最小的抗體片段。這個區域由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區的緊密的、非共價連合的二聚體組成。在這種配置中，每個可變區的三個CDR互相作用以在該VH-VL二聚體的表面確定抗原結合位點。這六個CDR共同賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(或僅包含三個特異於抗原的CDR的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，儘管與完整結合位點相比親合性較低。
在本發明的一個實施方式中，抗體是單鏈抗體(「SCA」)，作為一種遺傳學上融合的單鏈分子，被定義為包含通過適合的多肽接頭連接的輕鏈可變區、重鏈可變區的遺傳工程化的分子。這種單鏈抗體也被稱為「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段。一般的，Fv多肽進一步包含位於VH和VL結構域之間、允許scFv形成用於抗原結合的期望結構的多肽接頭。
也可以憑有用的性質來選擇抗體，例如控制抗體的血清半衰期是可取的。通常，完整抗體分子具有很長的血清餘輝時間(persistence)，而片段(＜60-80kDa)非常快速地經腎過濾。完整抗體的糖基化通常延長血清餘輝時間。由此，如果希望MASP-2抗體的長期作用，MASP-2抗體優選的是完整抗體，而如果希望MASP-2抗體的較短的作用，抗體片段是優選的。
在本發明的另一個實施方式中，抗體的功能等同物是模擬抗體的小分子模擬物。
本發明範圍內的優選抗體是能抑制MASP-2的功能的抗體或其功能等同物。MASP-2的活性可以是MASP-2的絲氨酸蛋白酶活性，例如對C4和/或C2的絲氨酸蛋白酶活性。特別地，優選抗體或其功能等同物能抑制MASP-2的絲氨酸蛋白酶活性。更優選的，是能抑制MBL-MASP-2複合物的C4沉積作用(deposition)的抗體或其功能等同物。根據本發明進一步優選的抗體是能在全血清中抑制C4沉積作用的抗體或其功能等同物。進一步優選的抗體或其功能等同物能夠在來自具有C4解沉積(disposition)活性的個體的全血清中抑制C4沉積作用。用於確定C4沉積作用的有用的化驗在以下描述。
另外，優選的抗體是能抑制MBL-MASP-2複合物的C2沉積作用的抗體或其功能等同物。根據本發明進一步優選的抗體是能在全血清中抑制C2沉積作用的抗體或其功能等同物。進一步優選的抗體或其功能等同物能夠在來自具有C2解沉積(disposition)活性的個體的全血清中抑制C2沉積作用。用於確定C2沉積作用的有用的化驗在以下描述。
由此，優選的抗體或其功能等同物能夠在全血清中抑制C4和/或C2沉積作用，達到少於50％，如少於40％，例如少於30％，如少於25％，例如少於20％，如少於15％，例如少於10％，如少於5％的對照C4沉積作用。優選的，該抗體能夠在全血清中抑制C4沉積作用達到少於30％，優選的少於25％，更優選的少於20％，甚至更優選的少於15％，更優選的少於10％。做為選擇或另外，優選的抗體能夠在全血清中抑制C2沉積作用達到少於30％，優選的少於25％，更優選的少於20％，甚至更優選的少於15％，更優選的少於10％。
在本發明的一個非常優選的實施方式中，抗體選自以登記號03050904保藏的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體組。此外，功能等同物可以是所述抗體的片段，優選的是所述抗體的結合片段。
在本發明的一個實施方式中，抗體或其功能等同物包含特定的高變區，稱為CDR。優選的，該CDR是依照Kabat CDR定義的CDR。例如可以通過與其他抗體進行序列對比來鑑定CDR或高變區。優選的，抗體或其功能等同物包含至少一個，更優選的至少兩個，更優選的全部三個下列重鏈CDR1.附圖10中所示的DWE 16140-4con的H1(SEQ ID 6)；2.附圖10中所示的DWE 16140-4con的H2(SEQ ID 7)；3.附圖10中所示的DWE 16140-4con的H3(SEQ ID 8)；更優選的，該抗體或其功能等同物包含重鏈，所述重鏈包含或由一序列組成，所述序列與SEQ ID 4有至少95％，更優選的至少98％，更優選的至少99％的同源性或同一性。更加優選的，抗體或其功能等同物包含重鏈，所述重鏈包含或由SEQ ID 4中列出的序列組成。
更優選的，該抗體或其功能等同物包含重鏈，所述重鏈包含或由一序列組成，所述序列與SEQ ID 2有至少95％，更優選的至少98％，更優選的至少99％的同源性或同一性。更優選的，該重鏈由附圖10的DWE16140-4序列組成。
MASP-2的功能同源物的同源性百分比可以如在此描述的來確定。最優選的，抗體或其功能等同物包含重鏈，所述重鏈包含或由SEQ ID 2中列出的序列組成。優選的，所述抗體或其功能等同物能夠特異性地識別一表位，所述表位被稱為NimoAb101的抗體所識別。
在本發明的另一個實施方式中，抗體或其功能等同物包含特定的高變區，稱為CDR。優選的，該CDR是依照Kabat CDR定義的CDR。優選的，抗體或其功能等同物包含至少一個，更優選的至少兩個，更優選的全部三個下列輕鏈CDR4.附圖11中所示的DWE16140-10con的L1(SEQ ID 9)；5.附圖11中所示的DWE16140-10con的L2(SEQ ID 10)；6.附圖11中所示的DWE16140-10con的L3(SEQ ID 11)；更優選的，該抗體或其功能等同物包含輕鏈，所述輕鏈包含或由一序列組成，所述序列與SEQ ID 5有至少95％，更優選的至少98％，更優選的至少99％的同源性或同一性。更加優選的，抗體或其功能等同物包含輕鏈，所述輕鏈包含或由SEQ ID 5中列出的序列組成。
更優選的，該抗體或其功能等同物包含輕鏈，所述輕鏈包含或由一序列組成，所述序列與SEQ ID 3有至少95％，更優選的至少98％，更優選的至少99％的同源性或同一性。MASP-2的功能同源物的同源性百分比可以如在此描述的來確定。更加優選的，抗體或其功能等同物包含輕鏈，所述輕鏈包含或由SEQ ID 3中列出的序列組成。更優選的，該輕鏈由附圖10的DWE16140-10con序列組成。優選的，所述抗體或其功能等同物能夠特異性地識別一表位，所述表位被稱為NimoAb101的抗體所識別。
在一個優選的實施方式中，抗體或其功能等同物包含在以上描述的重鏈CDR和輕鏈CDR。更優選的，抗體或其功能等同物包含上述重鏈可變區和上述輕鏈可變區。更優選的，抗體或其功能等同物包含在此描述的重鏈和在此描述的輕鏈。
因而，在本發明的非常優選的實施方式中涉及一種抗體，所述抗體包含選自以下的一個或多個，優選的至少2個，更優選的至少3個，更優選的至少4個，更優選的至少5個，更優選的至少6個CDR1)SEQ ID 6的重鏈的CDR1；2)SEQ ID 7的重鏈的CDR2；3)SEQ ID 8的重鏈的CDR3；4)SEQ ID 9的輕鏈的CDR1；5)SEQ ID 10的輕鏈的CDR1；或6)SEQ ID 11的輕鏈的CDR1；或其功能等同物。此外這個抗體優選的能抑制MASP-2的活性和/或能夠特異性識別以下所述的MASP-2表位。
MASP-2表位和肽MASP-2蛋白質包含許多結構域，稱為CUB 1、EGF、CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域。在附圖1中給出了MASP-2的示意圖。在附圖2中表明了在人MASP-2中各個結構域的位置。據信，與同MBL聯合有關的結構域位於N-末端，而絲氨酸蛋白酶結構域與MASP-2的絲氨酸蛋白酶活性有關。令人驚訝的，對MASP-2的C末端產生的抗體在全血清中比其他針對MASP-2的抗體更有效地抑制MASP-2的活性。
根據本發明的抗體和其功能等同物特異性識別MASP-2的C-末端部分中的表位。「特異性識別」意思是與其他分子或其部分相比，抗體以顯著更高的親合性與所述表位結合。優選的，經Western印跡或ELISA檢測，該抗體僅與所述表位結合。為確保抗體特異性地識別MASP-2的給定片段中的表位，在產生所述抗體的過程中將所述片段用作抗原。在本發明中優選的是，用於免疫的MASP-2抗原長度大於18個胺基酸，例如至少20個，如至少25個，例如至少30個胺基酸。舉例來說，如果抗體識別CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域中的表位，在產生所述抗體的過程中把由CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成的肽用作抗體。
優選的，抗體或其功能等同物特異性地識別MASP-2的C-末端部分中的表位，其中所述C-末端部分包含、或甚至更優選的由EGF、CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。在本發明的一個實施方式中，MASP-2的C-末端部分包含或優選的由CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。在本發明的另一個實施方式中，MASP-2的C-末端部分包含或優選的由CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。在本發明的又一個實施方式中，MASP-2的C-末端部分包含或由CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。在本發明優選的實施方式中，MASP-2的C-末端部分包含或優選的由絲氨酸蛋白酶結構域組成。
在本發明更進一步的實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或優選的由CCP1結構域組成。在本發明又一個實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或優選的由CCP2結構域組成。在本發明再進一步的實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或優選的由CCP1和CCP2結構域組成。
術語「MASP-2」是指本領域技術人員已知的任何MASP-2分子。例如所述MASP-2可以來自哺乳動物，例如MASP-2可以是來自人。在本發明的優選實施方式中，MASP-2是人MASP-2，被確定為SEQ ID 1或與SEQ ID 1有至少50％、優選的至少60％、更優選的至少70％、更優選的至少80％、更優選的至少90％、更優選的至少95％的同源性、或更優選的為同一性的功能同源物。在本發明非常優選的實施方式中，MASP-2是SEQ ID 1的MASP-2。
因此，在優選的實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸136到686或其功能等同物組成，因此所述片段包含人MASP-2的EGF、CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域。
因此，在本發明另一個實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸183到686或其功能等同物組成。因而所述片段包含人MASP-2的CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域。
在本發明的又一個實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸293到362或其功能等同物組成。所述片段包含人MASP-2的CCP1結構域。
在本發明進一步的實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸293到431或其功能同源物組成。所述片段包含人MASP-2的CCP1和CCP2結構域。
在本發明再進一步的實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸363到431或其功能等同物組成。所述片段包含人MASP-2的CCP2結構域。
因此，在本發明更進一步的實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸293到686組成。因而所述片段包含人MASP-2的CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域。
在本發明再進一步的實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸363到686或其功能等同物組成。所述片段(＝CCP2、絲氨酸蛋白酶)在本發明更進一步的實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸445到686或其功能等同物組成。所述片段包含人MASP-2的絲氨酸蛋白酶結構域。
在本發明的一個實施方式中，所述表位不在SEQ ID 1的胺基酸505到523和胺基酸538到556之內。
在本發明的一個優選實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或優選的由SEQ ID 1的胺基酸363到385，如370到390，例如380到400，如390到410，例如400到420，如410到430，例如420到440，如430到450，例如440到460，如450到470，例如460到480，如470到490，例如480到500，如490到510，例如500到520，如510到530，例如520到540，如530到550，例如540到560，如550到570，例如560到580，如570到590，例如580到600，如590到610，例如600到620，如610到630，例如620到640，如630到650，例如640到660，如650到670，例如660到686組成，其中所述片段最多包含100個、優選的最多80個、更優選的最多60個、更優選的最多40個胺基酸。
在另一個優選實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸400到420，如410到430，例如420到440，如430到450，例如440到460，如450到470，例如460到480，如470到490，例如480到500，如490到510，例如500到520，如510到530，例如520到540，如530到550組成，其中所述片段最多包含100個、優選的最多80個、更優選的最多60個、更優選的最多40個胺基酸。
在又一個優選實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或優選的由SEQ ID 1的胺基酸410到430，例如420到440，如430到450，例如440到460組成，其中所述片段最多包含100個、優選的最多80個、更優選的最多60個、更優選的最多40個胺基酸。
在另一個非常優選的實施方式中，抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或優選的由胺基酸420到440或430到450組成。
在本發明的一個優選實施方式中，抗體或其功能等同物特異性地識別一表位，所述表位可被命名為M0545YM035的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體識別。
在本發明的另一個優選實施方式中，抗體或其功能等同物特異性地識別一表位，所述表位可被命名為M0545YM029的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體識別。
在本發明的另一個優選實施方式中，抗體或其功能等同物特異性地識別一表位，所述表位可被命名為M0545YM046的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體識別。
在本發明的另一個優選實施方式中，抗體或其功能等同物特異性地識別一表位，所述表位可被命名為M0545YM048的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體識別。
在本發明特別優選實施方式中，抗體或其功能等同物特異性地識別一表位，所述表位可被以保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體識別。
特別地，由以保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞系和命名為M0545YM029和M0545YM035的雜交瘤細胞系生產的抗體識別重疊表位。因而，優選的是，抗體或其功能等同物特異性地識別一表位或其部分，所述表位可被一個或多個選自以下組的抗體識別以保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；命名為M0545YM029的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；或命名為M0545YM035的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體。
根據本發明，當給定抗體識別可被另一個給定抗體識別的表位的至少一部分時，稱為這兩個抗體識別相同的或重疊表位。
本領域技術人員可以用各種化驗來確定一種抗體(也稱為測試抗體)是否與一種特定抗體(也稱為參考抗體)識別相同的或重疊的表位。優選的，該分析包括步驟提供包含可被參考抗體識別的表位的MASP-2或其片段；向所述MASP-2中添加測試抗體和參考抗體，其中測試抗體和參考抗體都用可檢測的標記物標記了。做為選擇，兩種抗體都用不同的可檢測標記物標記；檢測MASP-2上可檢測標記物的存在；從而檢測測試抗體是否可以代替參考抗體。
如參考抗體被替換，測試抗體識別與參考抗體識別的相同或重疊的表位。因而如果用可檢測標記物標記了參考抗體，在MASP-2上的低可檢測信號表明了對參考抗體的替代。因而如果用可檢測標記物標記了測試抗體，在MASP-2上的高可檢測信號表明了對參考抗體的替代。優選MASP-2片段被固定在固體支持物上以便處理。可檢測標記物可以是任何可直接或間接檢測的標記物，例如酶、放射性同位素、重金屬、有色化合物或螢光化合物。在以下的實施例5中描述了「MASP-2競爭性ELISA」，是用於確定測試抗體是否識別與參考抗體識別的相同或重疊的表位的非常優選的方法。本領域技術人員可以很容易地針對特定的討論中的抗體來修改所述方法。
本發明的又一個目的是提供分離的MASP-2多肽用作產生MASP-2抗體的抗原，特別是能在全血清中抑制MASP-2活性的MASP-2抗體。例如所述多肽可用於免疫動物以產生針對該多肽的抗體。
本發明可以使用任何C-末端MASP-2多肽，然而優選的多肽是包含或更優選由MASP-2的EGF、CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成的分離的多肽。因此，根據本發明非常優選的MASP-2多肽包含或更優選的由SEQ ID 1的胺基酸136到686或其功能等同物組成。
在另一個實施方式中，所述分離的MASP-2多肽包含或優選的由CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。因此，優選的MASP-2多肽包含或由SEQ ID 1的胺基酸183到686或其功能等同物組成。
在本發明的又一個實施方式中，所述分離的MASP-2多肽包含或優選的由CCP1結構域組成。因此，優選的多肽包含或更優選的由SEQ ID 1的胺基酸293到362或其功能等同物組成。
在本發明進一步的實施方式中，所述分離的MASP-2多肽包含或優選的由CCP2結構域組成。例如，所述多肽可以包含或更優選的由SEQ ID 1的胺基酸363到431或其功能等同物組成。
在本發明更進一步的實施方式中，所述分離的MASP-2多肽包含或優選的由CCP1和CCP2結構域組成。因此，所述多肽可以包含或更優選的由SEQ ID 1的胺基酸293到431或其功能等同物組成。
C-末端MASP-2多肽優選的長度最多為570個胺基酸，例如所述多肽的長度可在20到570個，如30到500個，例如50到400個，如100到300個，例如150到250個胺基酸的範圍中。
包含預定的胺基酸序列、例如在SEQ ID 1中列出的胺基酸序列的片段，MASP-2多肽或片段的功能等同物或功能同源物，被定義為包含一胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列能被也能識別所述預定的胺基酸序列的抗體識別。術語「功能等同物」和「功能同源物」在此可互換地使用。
根據本發明的功能同源物包含具有胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與在上列出的預定的MASP-2多肽序列具有同源性。例如這種多肽與上述列出的預定多肽序列具有至少約40％、如至少約50％，例如至少約60％，如至少約70％，例如至少約75％，如至少約80％，例如至少約85％，如至少約90％，例如至少約92％，如至少約94％，例如至少約95％，如至少約96％，例如至少約97％，如至少約98％，例如至少約99％的同源性。
優選同源性可以通過任何適當的的算法，或計算機實施的這些算法來計算，所述算法例如在Intelligenetics的PC/Gene程序中的CLUSTAL，或在Wisconsin Genetics軟體包，Genetics Computer Group(GCG)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。此外胺基酸序列之間的同源性也可以藉助公知的矩陣，例如BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85和BLOSUM 90中的任何一個來計算。
根據本發明的功能同源性優選的是具有一胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與上述列出的預定MASP-2多肽序列具有至少約50％、優選的至少約60％、更優選的至少約70％、更優選的至少約75％、更優選的至少約80％、更優選的至少約85％、更優選的至少約90％、更優選的至少約95％、更優選的至少約98％的同源性。
功能同源物可以包含胺基酸序列，所述胺基酸序列包含一個胺基酸被替換為任何其他胺基酸的至少一個替換。例如這種替換可以是保守性胺基酸替換或可以是非保守性替換。優選的，所述替換是保守性替換。
保守性胺基酸替換是用預定胺基酸組中的一個胺基酸替換同組中的另一個胺基酸，其中在預定組中的胺基酸表現出相似的或實質上相似的性質。在此處應用的術語「保守性胺基酸替換」的含義之中，在具有以下特徵的胺基酸組之中一個胺基酸可被另一個胺基酸替換i)極性側鏈(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys)ii)非極性側鏈(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met)iii)脂肪族側鏈(Gly、Ala、Val、Leu、Ile)iv)環狀側鏈(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)v)芳香側鏈(Phe、Tyr、Trp)vi)酸性側鏈(Asp、Glu)vii)鹼性側鏈(Lys、Arg、His)viii)醯胺側鏈(Asn、Gln)ix)羥基側鏈(Ser、Thr)x)含硫側鏈(Cys、Met)，和xi)是單氨基-二羧酸或單氨基-單羧酸-單氨基羧酸的胺基酸(Asp、Glu、Asn、Gln)。
胺基酸的添加或刪除可以是添加或刪除2到5個胺基酸，如5到10個胺基酸，例如10到20個胺基酸，如20到50個胺基酸。然而，添加或刪除超過50個胺基酸，如添加50到200個胺基酸，也包含在本發明的範圍之中。
除此處描述的多肽化合物之外，可以設計空間上相似的化合物來模擬肽結構的關鍵部分，這樣的化合物也可以按照與本發明的肽相同的方式來使用。這可以通過本領域技術人員公知的建模和化學設計技術來實現。例如，可以應用酯化作用及其他烴基化作用來修飾例如二精氨酸肽的主鏈，來模擬四肽結構。應當理解的是，所有這種空間上相似的結構都處於本發明的範圍之中。
具有N-末端烷化和C-末端酯化的肽也被包含在本發明之中。功能等同物還包含糖基化的和共價的或聚合的結合物，包括二聚體或無關的化學部分。通過本領域已知的方法，將官能團連接到位於片段的N-末端和C-末端之一、或兩者上的基團上，來製備這種功能等同物。
因而功能等同物可包含片段，所述片段聯結到脂肪族的或醯基的酯、或羧基末端的醯胺基、烷基胺或包含羧基側鏈的殘基上，例如，聯結到天冬氨酸殘基上的烷基胺的聯結物；含羥基殘基的O-醯基衍生物，和氨基末端胺基酸或含氨基殘基的N-醯基衍生物，例如聯結到Met-Leu-Phe的聯結物。醯基基團的衍生物選自烷基部分(包括C3到C10正常烷基)，從而形成烷醇類，和選自碳環或雜環化合物，從而形成芳醯基類。活性基團優選的是雙官能化合物，所述雙官能化合物本身是已知用於通過反應性側基將蛋白質與不溶性基質交聯的。
此外功能同源物可以是由核酸編碼的多肽，所述核酸能在嚴緊雜交條件下與編碼前述預定MASP-2多肽序列的核酸序列的互補鏈雜交。
在此使用的嚴緊條件是指按照如Southern E.M.1975，J.Mol.Biol.98503-517描述的Southern印跡和雜交中正常應用的嚴緊程度。為此，常規的實踐包括預雜交和雜交的步驟。通常利用包含6×SSPE、5％Denhardt′s、0.5％SDS、50％甲醯胺、100μg/ml變性的鮭魚睪丸DNA(在42℃孵育18小時)，隨後用2×SSC和0.5％SDS(在室溫下和在37℃)洗滌，和用0.1×SSC和0.5％SDS(在68℃孵化30分鐘)來進行這樣的步驟，如Sambrook等，1989，在「Molecular Cloning/a Laboratory Manual」，Cold Spring Harbor)中所描述的，通過引用將其合併在此。
可以通過任何常規方法來確定可被特定抗體識別的表位，例如涉及使用質譜的方法。利用質譜的表位作圖法的非限制性實例包括1.Baerga-Ortiz，A，Hughes，CA，Mandel，JG，Komives，EAEpitopemapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchangemass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conservedprotein.Protein Sci.111300-1308，2002
2.Hochleitner，EO，Borchers，C，Parker，C，Bienstock，RJ，Tomer，KBCharacterization of a discontinuous epitope of the human immunodeficiencyvirus(HIV)core protein p24by epitope excision and differential chemicalmodification followed by mass spectrometric peptide mapping analysis.
3.Hochleitner，EO，Gorny，MK，Zolla-Pazner，S，Tomer，KBMassspectrometric characterization of a discontinuous epitope of theHIV envelopeprotein HIV-gp120 recognized by the human monoclonal antibody 1331A.J.Immunol.1644156-4161，20004.Parker，CE，Tomer，KBMALDI/MS-based epitope mapping of antigensbound toimmobilized antibodies.Mol.BiotechnoL 2049-62，20025.Peter，JF，Tomer，KBA general strategy for epitope mapping by directMALDI-TOF mass spectrometry using secondary antibodies and cross-linking.Anal.Chem.734012-4019，20016.Van De，WJ，Deininger，SO，Macht，M，Przybylski，M，Gershwin，MEDetection of molecular determinants and epitope mapping usingMALDI-TOF mass spectrometry.Clin.Immunol.Immunopathol.85229-235，19977.Yu，L，Gaskell，SJ，Brookman，JLEpitope mapping of monoclonalantibodies by mass spectrometryidentification of protein antigens in complexbiological systems.J.A m.Soc.Mass Spectrom.9208-215，19988.Zhao，Y，Chalt，BTProtein epitope mapping by mass spectrometry.Anal.Chem.663723-3726，1994製備MASP-2抗體的方法可以通過任何本領域技術人員已知的合適方法來生產抗體和其功能等同物。
生產特異性識別和結合MASP-2的C-末端部分中的表位的抗體的一種方法包括向哺乳動物施用MASP-2的C-末端部分或其片段或其功能同源物的步驟。所述MASP-2的C-末端部分或其片段或其功能同源物可以是前述的任何MASP-2片段和肽。特別地，MASP片段可以是任何前述的MASP-2片段，其中所述片段包含表位。向所述哺乳動物施用的MASP-2的C-末端部分或其片段或其功能同源物在此也稱為「MASP-2抗原」。
在一個實施方式中，本發明涉及生產能抑制MASP-2活性的抗體的方法，其中所述抗體特異性地識別MASP-2的C-末端部分中的表位。
MASP-2抗原長度優選的至少18個胺基酸，更優選至少20個，再更優選的至少25個胺基酸。
可以向所述哺乳動物施用MASP-2抗原一次以上，如兩次、例如3次、如3到5次，例如5到10次，如10到20次，例如20到50次，如超過50次。也可能向同一哺乳動物施用不同的MASP-2抗原，可以同時性地也可以按任何順序次序性地施用。
通常，在施用前將MASP-2抗原置於水溶液中或懸浮。此外，MASP-2抗原可以與一個或多個其他化合物混合。例如，MASP-2抗原可以與一個或多個適合的佐劑和/或與一個或多個載運體混合。
佐劑是一種物質，其與施用的抗原的混合物增強或修改了針對所述抗原的免疫反應。例如，佐劑可以選自AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、矽土、明礬、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、高嶺土、石墨、氫氧化鋁、胞壁醯二肽、N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-DMP)、N-乙醯-正胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(N-acetyl-nornuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine)(CGP 11687，也稱為nor-MDP)、N-乙醯胞壁醯基-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺基-L-丙氨酸-2-(1′，2′-二棕櫚醯-sn-丙三氧基-3-羥基磷醯基氧代)-乙胺(CGP 19835A，也稱為MTP-PE)、在2％角鯊烯/Tween-80乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)、脂多糖和它的各種衍生物，包括脂質A、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑、Merck佐劑65、多核苷酸(例如，聚IC和聚AU核苷酸)、來自結核分枝桿菌的蠟D(wax D)，在短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)和布魯氏菌屬的成員中發現的物質、脂質體或其他脂質乳劑、Titermax、ISCOMS、Quil A、ALUN(參見US 58767和5554，372)、脂質A衍生物、霍亂毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基質或GMDP、白細胞介素1、白細胞介素2、Montanide ISA-51或QS-21。用於本發明的優選的佐劑包括弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑。
載運體是支架結構，例如多肽或多醣，抗原能夠與之締合。載運體可以獨立於佐劑存在。載運體的功能可以是，例如增強分子量、特別是MASP-2抗原的分子量，來增強免疫原性，賦予穩定性、增強生物活性或提高血清半衰期。載運體可以是本領域技術人員已知的任何適合的載運體，例如蛋白質或抗原呈遞細胞。載運體蛋白可以是，但不限於鑰孔青貝血藍素、血清蛋白如鐵傳遞蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或卵清蛋白、免疫球蛋白或激素，如胰島素或棕櫚酸。
可以通過任何的適合的方法，例如胃腸外的、口服的或局部的方法來施用MASP-2抗原。然而優選的，抗原是通過注射，例如肌肉內的、皮內的、靜脈內或皮下注射來施用，更優選的通過皮下的或靜脈注射來施用。
哺乳動物可以是任何適合的哺乳動物。往往利用齧齒動物，例如小鼠或大鼠來製備單克隆抗體。可以通過向任何哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、驢、山羊、綿羊、奶牛或駱駝施用MASP-2抗原來製備多克隆抗體。根據本發明的抗體可以是抗體的混合物，例如單克隆抗體的混合物，多克隆抗體的混合物，或兩者的混合物。因此，使用超過一種動物也包含在本發明的範圍之內。
如果抗體是單克隆抗體，抗體生產細胞通常是在免疫之後從所述哺乳動物分離。例如，該方法可包括從所述哺乳動物分離抗體生產細胞、從所述抗體生產細胞製備雜交瘤細胞、培養所述雜交瘤和分離所述雜交瘤生產的抗體的步驟。
例如，所述細胞可以在用MASP-2抗原首次施用之後1天、如2到10天的範圍內、例如10到20天的範圍內、如20到40天的範圍內、例如1到3個月的範圍內、如3到6的範圍內、例如6到12個月的範圍內、如12到24個月的範圍內、例如超過24個月，從所述哺乳動物分離。
抗體生產細胞一般是B細胞，例如所述細胞可以通過切下所述哺乳動物的脾來從所述哺乳動物分離。
一旦從所述哺乳動物分離出抗體產生細胞，可以將該細胞與其他細胞融合以獲得雜交瘤細胞。所述細胞可以是例如癌細胞、如來自白血病的細胞，例如骨髓瘤細胞。在融合之後可以用標準的培養方案來培養所述雜交瘤細胞。可以測試培養基(上清液)是否存在適合的MASP-2抗體，並可以選擇出和培養能生產適合的MASP-2抗體的雜交瘤細胞。
可以用任何的適合的方法進行測試，例如檢測能與MASP-2抗原締合的抗體存在的方法。這種方法包括，但不限於Western印跡、ELISA(酶聯免疫吸附分析)、斑點印跡或TRIFMA。另外的或作為選擇，可以測試所述培養基是否存在能抑制MASP-2活性的MASP-2抗體。確定MASP-2活性的適合的化驗如下述。
一旦鑑定出能生產適合的MASP-2抗體的雜交瘤細胞，可以利用任何標準方案來培養所述細胞，並可以純化由所述細胞生產的抗體。可以利用任何標準的方案來進行抗體的純化，例如利用抗體-Ig抗體、蛋白G或蛋白A的純化方法。
如果該抗體是多克隆抗體，所述抗體例如可以直接從用MASP-2抗原免疫的哺乳動物的血清中直接純化。可以利用任何標準方法來進行抗體的純化，例如利用抗-Ig抗體、蛋白G或蛋白A的純化方法。
例如在AntibodiesA Laboratory Manual，ByEd Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中描述了製備單克隆抗體、單克隆抗體的混合物或多克隆抗體的方法。
在以下的實施例1中描述了製備根據本發明的抗體的方法的一個非限制性實例。
取決於抗體的性質，可以使用幾種其他方法。
在本發明的一個實施方式中，可以利用重組方法生產抗體，例如蛋白質工程方法或通過篩選文庫的方法。文庫可以是合成文庫或包含天然物質的文庫。一種有用的方法是噬菌體展示。通常噬菌體展示涉及在一個或多個噬菌體文庫中篩選編碼有用抗體或其功能等同物的噬菌體。
在本發明的另一個實施方式中，該方法涉及利用動物，例如齧齒動物，如遺傳工程化的小鼠來生產嵌合抗體或另一個物種的抗體，例如人抗體。例如，可以用上述提及的任何MASP-2片段來免疫轉基因動物，如轉基因小鼠，所述轉基因動物攜帶來自另一個物種的抗體基因，如人抗體基因。
可以利用本領域技術人員已知的任何方法斷裂根據本發明的抗體來生產抗體片段。該方法包括，但不限於用一個或多個蛋白水解酶例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，以及還原，或兩者相結合。
抑制MASP-2活性本發明還涉及抑制MASP-2的活性的方法。特別地，該方法包括步驟1)提供包含MASP-2的組合物；
2)提供根據本發明的MASP-2抗體；3)將所述組合物與所述抗體一同孵育，從而抑制MASP-2活性。
該組合物可以是任何包含MASP-2的組合物，例如血清。該MASP-2抗體優選的是能抑制MASP-2活性的MASP-2抗體。
檢測MASP-2活性的化驗可以通過任何適合的化驗來確定MASP-2活性。有用的化驗包括特別的化驗，其中測試MASP-2/MBL複合物的絲氨酸蛋白酶活性。優選的化驗，是確定抑制C2和/或C4沉積作用的化驗。
化驗可以涉及以下步驟，製備其上固定有MBL締合劑的固體表面，使MBL/MASP-2複合物與所述MBL締合劑結合，和篩選對MASP-2催化的反應的抑制作用。
所述固體表面可以是任何有用的固體表面，例如微滴定孔。MBL締合劑可以是MBL以高親合性與之結合的任何化合物，例如MBL抗體、甘露聚糖或甘露糖、然而優選的是甘露聚糖。MBL/MASP-2複合物可以來自任何適合的來源，例如可以是從血清中純化的重組MBL、重組MASP-2或MBL和/或MASP-2。重組MBL/MASP-2可以是全長MBL/MASP-2或其功能片段。此外，重組MBL/MASP-2可以附著於一個或多個其他化合物，例如遺傳標籤。MBL和/或MASP-2可以來自任何適合的物種，例如其可以是人MBL/MASP-2。在本發明的一個實施方式中，MBL/MASP-2複合物存在於全血清中，在進行分析前不被純化。然後所述化驗測試對底物的沉積的抑制，底物例如全血清中的C4。MASP-2催化的反應優選的是對C2和/或C4的沉積。
將需篩選抑制活性的抗體或其功能等同物添加到結合的MBL/MASP-2中。抗體可以是已被純化的，或是例如粗分的雜交瘤細胞培養上清液。優選的還進行未添加抗體的對照。可以以濃度範圍1μg/ml到500μg/ml，優選的5μg/ml到400μg/ml，更優選的10μg/ml到300μg/ml，更優選的15μg/ml到200μg/ml，更優選的20到100μg/ml來添加抗體。
向MBL/MASP-2複合物中添加MASP-2底物。優選的，所述底物是C2或C4，或兩者的混合物。所述底物可以是重組生產的或血清來源的底物。底物在使用前可以是已純化的或是未純化的，但優選的是純化的。為了監視沉積，可以用可檢測標記物，例如用酶、放射性化合物、螢光化合物、染料、重金屬、化學發光化合物等對底物進行標記。
然而優選的是利用特異性結合試劑檢測沉積，例如特異性識別消化的底物的抗體。例如，可以使用識別人類補體C4c的抗體。所述抗體可以用直接的或間接的可檢測標記物來標記。例如，通過酶、放射性化合物、螢光化合物、染料、重金屬、化學發光化合物或親合化合物來標記。親合化合物包括例如其他抗體或生物素，鏈黴抗生物素蛋白。
可以按任何有用的次序進行上述步驟，即，可以在抑制性抗體之前或同時添加底物，可以在固定到固體表面之前使MBL/MASP-2複合物與底物和/或抑制性抗體混合，等等。也可以按照描述的順序進行步驟。
如果在固定化之前混合MBL/MASP-2複合物、底物和抗體，則可以將所述混合體預孵化一給定時間，例如預孵化可以在5分鐘到2小時的範圍內。通常，當MBL/MASP-2複合物存在於血清中、並且沒有預先從血清中純化時，預先混合MBL/MASP-2、底物和抗體。
在本發明的一個優選實施方式中，利用在實施例2和3中描述的任一方法來確定MASP-2的活性。特別地，能抑制C4沉積作用的抗體優選的應能在實施例2和3中的至少一個、優選的在兩個方法中抑制C4沉積作用。能抑制C4沉積作用的抗體更優選的至少應能根據在實施例2中描述的方法抑制C4沉積作用，而能在全血清中抑制C4沉積作用的抗體應能如實施例3中描述的在全血清中抑制C4沉積作用。
藥物組合物和其施用在一個實施方式中本發明涉及包含根據本發明的抗體和其功能等同物的藥物組合物。本發明還涉及包含抗體用於醫治臨床狀況的藥劑、包括施用所述抗體的醫治臨床狀況的方法、或所述抗體用於製備醫治臨床狀況的藥物的用途。
臨床狀況可以是以下提及的任何狀況。需要施用MASP-2抗體的個體可以是患有所述狀況或存在獲得所述臨床狀況的風險的任何個體。優選的，所述個體是人。
醫治可以是療效性的、緩解性的、改善性的和/或預防性的醫治。
本發明的藥物組合物優選的包含藥學有效量的至少一種特異性識別MASP-2的C-末端中的表位的抗體或其功能等同物(在上下文中稱為「MASP-2抗體」)。藥學有效量是MASP-2抗體的數量，其在接受所述藥物組合物的個體中誘導期望的反應。
MASP-2抗體的藥學有效量取決於其施用的個體、特別是所述個體的大小以及臨床狀況和特定的施用模式。然而通常，每一劑量向成人施用在1mg到5000mg的範圍中，優選的10mg到3000mg的範圍，更優選的在50mg到1000mg的範圍，例如100mg到750mg的範圍，如150mg到500mg的範圍，例如200mg到400mg的範圍，如250mg到350mg的範圍，例如約300mg的MASP-2抗體。
本發明的組合物可以是適於腸胃外施用的藥物組合物。這種組合物優選的包括水性的或非水性的無菌注射溶液，其可包含溼潤或乳化劑、抗氧化劑、pH緩衝劑、抑菌化合物和使製劑與體液等滲的溶質，體液優選的是個體的血液；和水性的和非水性的無菌懸浮液，其可包括懸浮劑或增稠劑。該藥物組合物可以存在於單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿瓶和管形瓶，並可以貯藏在凍幹條件下，僅需在使用前當即添加無菌液體載運體。
優選的，本發明的組合物包含一個或多個適合的藥學上的賦形劑，其可以是非無菌的或無菌的，用於細胞、組織或器官，例如適於向個體施用的藥學上的賦形劑。這種賦形劑可以包括，但不限於，鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和這些賦形劑以各種數量的組合。製劑應適合施用的模式。本發明進一步涉及成套的藥物試劑盒，包含一個或多個容器，所述容器裝填有一種或多種本發明的上述組合物的成分。非水賦形劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射的有機酯如油酸乙酯。
優選的，本發明的藥物組合物以可注射的形式製備，可以是液體溶液或懸浮液；此外適於在注射前溶於或懸浮於液體之中的固體形式也處於本發明的範圍之內。該製備物可以是乳化的或免疫原性決定簇，以及根據本發明的膠原凝集素(collectins)和/或膠原凝集素同源物可以被包裹在脂質體中。
MASP-2抗體可以單獨施用或與其他化合物組合施用，可以是同時性的或以任何次序順序性的施用。
施用可以是例如胃腸外的或輸液、快速輸液、鼻咽吸收、皮膚吸收、和腸道的，例如口服。胃腸外的注射可以是例如靜脈的、肌肉內的、皮內的或皮下的注射。優選的，所述施用是通過注射或輸液的胃腸外施用。
應按需要頻度施用MASP-2抗體，因此MASP-2抗體可以施用超過一次，如至少兩次，例如至少3次，如至少4次，例如至少5次，如在1到100的範圍內，例如在1到50次的範圍內，如在1到25次的範圍內，例如在1到10次的範圍內。
優選的，在兩次施用之間有至少1天，如至少2天，例如至少3天，如至少5天，例如至少一周，如至少2周，例如至少一個月，如至少6個月，例如至少1年，如至少2年，例如至少3年，如至少5年，例如至少10年。
臨床狀況根據本發明的臨床狀況可以是任何的狀況，其可以通過施用MASP-2抗體被有療效地、改善性地或預防性地醫治。
本發明一個優選實施方式的臨床狀況是慢性的炎性疾病。慢性的炎性疾病可以是例如自體免疫性炎症狀況。
自體免疫性炎症狀況(在此也稱為「自體免疫失調」)可以被寬鬆地歸類入那些主要局限於特定器官或組織和那些影響整個身體的疾病。器官特異性失調(和受影響的器官)的實例包括多發性硬化(包被在神經突起上的髓鞘質)、I型糖尿病(胰腺)、橋本氏甲狀腺炎(甲狀腺)、惡性貧血(胃)、阿狄森氏病(腎上腺)、重症肌無力(神經肌肉接點上的乙醯膽鹼受體)、類風溼性關節炎(關節襯面)、葡萄膜炎(眼)、銀屑癬(皮膚)、格-巴二氏綜合症(神經細胞)和葛雷夫斯氏病(甲狀腺)。系統性的自體免疫疾病包括系統性紅斑狼瘡、腎小球腎炎(glomeronephritis)和皮肌炎。
在本發明的一個實施方式中，優選的臨床狀況選自類風溼性關節炎或系統性紅斑狼瘡。
自體免疫失調的其他實例包括哮喘、溼疹、異位皮炎(atopicaldermatitis)、接觸性皮炎、其他溼疹性皮炎、脂溢性皮炎、鼻炎、扁平地衣、天皰瘡(Pemplugus)、大皰性類天皰瘡、大皰性表皮鬆解、蕁麻疹、血管性水腫、脈管炎、紅斑、皮膚嗜曙紅細胞增多、局限性脫髮、動脈硬化、原發性膽汁性肝硬變和腎病症候群。相關的疾病包括腸炎、如腹部疾病(coeliacdisease)、直腸炎、嗜曙紅性胃腸炎、肥大細胞增生病、炎症性腸病、Chrohn′s病和潰瘍性結腸炎，以及與食物有關的過敏。
在本發明的另一個實施方式中，臨床狀況以大塊(massive)的細胞喪失為特徵，例如由於程序性細胞死亡或壞死。所述壞死或程序性細胞死亡可以由許多種因素誘導。
在本發明的優選實施方式中，臨床狀況是缺血性/重灌注性損傷。缺血可以由各種原因引發，例如在中風、心肌梗塞、大手術或器官移植之後。因而，臨床狀況可以是由例如中風、心肌梗塞、大手術或或器官移植引起的缺血性/重灌注性損傷。
因此，臨床狀況可以是缺血性/重灌注性損傷，其是PTCA(經皮腔內冠狀動脈成形術)或CABG(冠狀動脈旁路移植術)的結果。此外，臨床狀況可以是缺血性/重灌注性損傷，其是急性心肌梗塞或腦缺血的結果。
實施例實施例1單克隆抗MASP-2抗體對雌性Wistar大鼠(8周齡)皮下注射3μg在完全弗氏佐劑中乳化的重組人MASP-2CCP1-CCP2-絲氨酸蛋白酶結構域(CCP1/2-SP)(Rossi等，2001)，用在不完全的弗氏佐劑中的3μgCCP1/2-SP強化三次。在移除脾臟前三天，靜脈內給予鹽水中的3μg CCP1/2-SP對大鼠進行強化。脾細胞懸浮物與小鼠骨髓瘤細胞(X63-Ag8.653)的融合和在小鼠飼養細胞上的培養已有描述(Liu等，2001)。
為了檢測上清液中的抗MASP-2抗體，微量滴定板(FluoroNunc，Nunc，Kamstrup，Denmark)用在100μl 15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mMNaN3、pH 9.6(包被緩衝液)中的1μg甘露聚糖(Nakajima和Ballou，1974)4℃過夜包被。用在200μl10mM Tris-HCl、140mM NaCl、1.5mM NaN3，pH7.4(TBS)中的200μg人血清白蛋白(HSA)在室溫下1小時，封閉剩餘的蛋白結合位點。
用含0.05％(v/v)Tween 20和5mM CaCl2的TBS(TBS/Tw/Ca2+)洗滌加樣孔，隨後用在100μl TBS/Tw/Ca2+中的0.5μg MBL/MASP製備物4℃下孵化過夜。
洗滌以後，向加樣孔中添加在TBS/Tw/Ca2+中稀釋了5倍的雜交瘤上清液，在室溫下孵化2小時。通過添加在100μlTBS/Tw、25μMEDTA中的用銪(Perkin Elmer，Gaithersburg，USA)標記的50ng兔抗大鼠Ig抗體(Dako，Glostrup，Denmark)(Hemmila等，1984)，來檢測結合的抗MASP-2抗體。置室溫下1小時後，洗滌加樣孔，通過添加200μl增強溶液(Perkin Elmer)，在DELFIA螢光計(PerkinElmer)上讀取時間分辨的螢光作用，來檢測結合的銪。選擇出的陽性培養物通過有限稀釋克隆兩次，在60％(v/v)DMEM、30％(v/v)胎牛血清、10％(v/v)DMSO中冷凍。
在SDS-PAGE上分離MBL/MASP製備物，隨後印跡到PVDF膜上。在印跡上測試選定的抗體對MASP-2的識別。
如以下的實施例2中描述的，通過篩選對MASP-2催化的C4沉積作用的抑制來鑑定抑制性抗體。
產生選擇出的抗體的雜交瘤細胞系的培養物上清液在10,000g離心15分鐘，用10mM Na2HPO4、10mM EDTA，pH 7對上清液進行緩衝。使一百毫升上清液流經1ml抗牛Ig柱(每毫升CNBr活化的瓊脂糖4B珠(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)5mg抗牛Ig(Dako))，所述柱在含10mM EDTA的1.5mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mMKCl、pH 7.4(PBS)(PBS/EDTA)中平衡。流出物經過1ml蛋白G瓊脂糖(AmershamBioscience)柱，所述柱預先用0.1M甘氨酸、pH 2.5洗滌，用PBS/EDTA再平衡。柱用30ml PBS/EDTA洗滌，用0.1M甘氨酸、pH 2.5洗脫。將洗脫物以0.5ml的餾分收集到40μl 1M Tris-HCL、pH 8.5中。
實施例2對抑制MASP-2催化的C4沉積作用的分析該分析由三個步驟組成(1)製備甘露聚糖包被的微量滴定孔，(2)使rMBL和rMASP-2與甘露聚糖包被的加樣孔結合，(3)篩選對MASP-2催化的C4沉積作用的抑制。
1)製備甘露聚糖包被的微量滴定孔96孔微量滴定板(FluroNunc，Nalgene Nunc Int.，Denmark)用包被緩衝液(Na2CO33.18g/L；NaHCO35.86g/L；利用HCl調整pH值到9.6)中的甘露聚糖(10mg/L，Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)包被，4℃過夜。在TBS(10mM Tris、150mM NaCl，利用HCl調整pH值到7.4)中洗滌加樣孔兩次。然後在添加了1mg/mL人白蛋白(State Serum Institute，Copenhagen Denmark)的如上的緩衝液中在室溫下孵化1小時來封閉加樣孔。在TBST+Ca2+(10mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.05％Tween 20、利用HCl調整pH值到7.4，以後稱之為洗滌緩衝液)中洗滌加樣孔3次，就可以使用。
2)rMBL和rMASP-2與甘露聚糖包被的加樣孔的結合通過在額外添加1mg/mL人白蛋白(State Serum institute，CopenhagenDenmark)的上述洗滌緩衝液中在4℃下孵化過夜，將0.8ng/孔的重組純化的人His-標記的MASP-2和1ng/孔的重組純化的人MBL結合到甘露聚糖包被的微量滴定孔上。在洗滌緩衝液中洗滌加樣孔3次，就可使用。
3)篩選對MASP-2催化的C4沉積作用的抑制在額外添加1mg/mL人白蛋白(State Serum Institute，CopenhagenDenmark)的上述洗滌緩衝液中，向結合至甘露聚糖包被的微滴定加樣孔的rMBL/rMASP-2中添加需篩選抑制活性的物質(例如，雜交瘤細胞培養物上清液、純化的抗體)。在洗滌緩衝液中洗滌加樣孔3次，與在巴比妥鈉(5mM)、NaCl(181mM)、CaCl2(2.5mM)、MgCl2(1.25mM)、pH 7.4的緩衝液中的純化的人補體成分C4(約1.5-2ng/mL)37℃孵化1.5小時，在使用前添加1mg/mL的人白蛋白(State Serum Institute，Copenhagen Denmark)。在洗滌緩衝液中洗滌加樣孔3次，添加0.89mg/L生物素化的兔抗人補體成分C4c(Dako，Denmark，根據標準程序進行生物素化)。在室溫下孵化加樣孔1小時，在洗滌緩衝液中洗滌3次。以0.1mg/L的濃度將銪標記的鏈黴抗生物素蛋白(Wallac，Turku，Finland)添加到上述洗滌緩衝液中，不同之處在於不添加鈣並包括50μM EDTA。在室溫下孵化加樣孔1小時，在洗滌緩衝液中洗滌3次。加樣孔通過增加100μJ Delfia增強溶液(Perkin Elmer Wallac，Norton，USA)顯影，在定軌搖床上室溫下孵化5分鐘。在Wallac Victor 2dMulti計數器1420(Wallac，Turku，Finland)上對加樣孔計數。
與沒有添加抑制物質的加樣孔相比降低的計數值可以視為抑制作用。
實施例3分析在全血清中對MASP-2催化的C4沉積作用的抑制在上述巴比妥緩衝液中將需分析的血清樣品稀釋250倍(終濃度)，添加C4(1.5-2ng/mL，終濃度)。添加需要篩選抑制活性的物質(例如，純化的抗體)，在37℃孵化樣品5分鐘至2小時。正常的孵化是15分鐘。向如上述製備的甘露聚糖包被的微量滴定加樣孔中添加100μl，在37℃孵化1.5小時。在上述洗滌緩衝液中洗滌加樣孔3次，添加0.89mg/L生物素化的兔抗人補體成分C4c(Dako，Denmark，根據標準程序進行生物素化)。在室溫下孵化加樣孔1小時，在洗滌緩衝液中洗滌3次。以0.1mg/L的濃度將銪標記的鏈黴抗生物素蛋白(Wallac，Turku，Finland)添加到上述洗滌緩衝液中，不同之處在於不添加鈣並包括50μM EDTA。在室溫下孵化加樣孔1小時，在洗滌緩衝液中洗滌3次。加樣孔通過增加100μL Delfia增強溶液(Perkin Elmer Wallac，Norton，USA)顯影，在定軌搖床上室溫下孵化5分鐘。在Wallac Victor 2dMulti計數器1420(Wallac，Turku，Finland)上對加樣孔計數。
附圖3說明了在利用以保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體、PBS或甘露糖進行抑制分析後獲得的Eu3計數值。在所有測試的血清中抗體能夠很大程度抑制C4沉積作用。
附圖4說明了以抗體濃度的函數的方式，以保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體在全血清中對C4沉積作用的抑制。
實施例4藥物組合物根據本發明的藥物組合物的一個劑量單位可以包含300mg MASP-2抗體，所述抗體由以保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞系生產，按照實施例1中所描述的進行純化，配製在10mM Tris-緩衝液、pH 7.4和140mM NaCl中。
藥物組合物經過Planova 75N和Planova 35N濾膜過濾以除去任何病毒，用0.22μm濾膜無菌過濾。
這種製劑適於向人類成年人腸胃外施用。
實施例5抑制性的抗huMASP-2鼠單克隆抗體的生產和表徵免疫接種免疫四隻小鼠(6-8周齡)。總共進行四次注射注射(每動物每次注射50μg抗原)。在0天用等份(v/v)的完全弗氏佐劑和10μg His-標記的人MASP2(N039-76C)注射小鼠。隨後用等份(v/v)不完全弗氏佐劑和抗原進行三次強化，強化間隔三周。利用針對MASP-2的ELISA測試選出在最後一次注射10天後反應最好的小鼠。
雜交，融合利用常規的方法進行融合。利用PEG(聚乙二醇)將反應最好的動物的脾的淋巴細胞與細胞系Sp2/O-Ag-14融合，獲得的雜交瘤接種到在HAT培養基中的96孔平板上。
在篩選之前更換培養基2-3次。通常的，雜交瘤克隆在3-5周內就可用於篩選。通過C4沉積作用分析測試上清液中抑制性抗體的存在。通過有限稀釋對雜交瘤進行亞克隆。
根據抑制活性篩選出785個初級克隆，選出50個抑制性克隆用於亞克隆。再次篩選亞克隆的抑制性，對顯示出最大抑制活性的克隆再次進行亞克隆。在2到3次亞克隆之後，保留了4個感興趣的抑制性克隆(見以下表1)。
抑制C-4沉積作用的分析緩衝液B1/HSA巴比妥鈉(5mM)、NaCl(181mM)、CaCl2(2.5mM)、MgCl2(1.25mM)，pH 7.4的巴比妥鈉緩衝液，在使用前添加1mg/mL人白蛋白(State Serum Institute，Copenhagen Denmark)。
分析由三個步驟組成(1)製備甘露聚糖包被的微量滴定孔，(2)抗體與人血清的預孵化，(3)測量MASP-2催化的C4沉積作用。
製備甘露聚糖包被的微量滴定孔96孔微量滴定板(FluroNunc，Nalgene Nunc Int.，Denmark)用包被緩衝液(Na2CO33.18g/L；NaHCO35.86g/L；利用HCl調整pH值到9.6)中的甘露聚糖(10mg/L，Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)包被，在室溫下過夜。在TBS(10mM Tris、150mM NaCl，利用HCl調整pH＝7.4)中洗滌加樣孔兩次。然後在唯一不同之處在於添加了1mg/mL人白蛋白(StateSerum Institute，Copenhagen Denmark)的如上的緩衝液中在室溫下孵化1小時來封閉加樣孔。在TBST(10mM Tris、150mMNaCl、0.05％Tween 20、利用HCl調pH＝7.4)中洗滌加樣孔3次，就可以使用。
抗體與人血清的預孵化需測試的抗體在B1/HSA中連續稀釋。將每個稀釋度的100μL轉移到96孔Nucleon表面平板的加樣孔中。將×125稀釋的(最終250×)100μL完全人血清與純化的人補體成分C4(約3-4mg/L)一起添加到每個加樣孔中。在37℃孵化15分鐘。然後將100μL抗體-人血清混合物轉移到先前製作的甘露聚糖包被的平板上。
MASP-2催化的C4沉積作用的測量然後在37℃孵化甘露聚糖包被的平板1.5小時。在洗滌緩衝液TBST+Ca(10mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.05％Tween 20、利用HCl調pH＝7.4)中洗滌加樣孔3次，添加在TBST+Ca中稀釋了的0.89mg/L生物素化的兔抗人補體成分C4c(Dako，Denmark，根據標準程序進行生物素化)。在室溫下孵化加樣孔1小時，在洗滌緩衝液中洗滌3次。以0.1mg/L的濃度將銪標記的鏈黴抗生物素蛋白(Wallac，Turku，Finland)添加到上述洗滌緩衝液中，不同之處在於不添加鈣並包括50μM EDTA。在室溫下孵化加樣孔1小時，在洗滌緩衝液中洗滌3次。加樣孔通過添加100μL Delfia增強溶液(Perkin Elmer Wallac，Norton，USA)顯影，在定軌搖床上室溫下孵化5分鐘。在Wallac Victor 2dMulti計數器1420(Wallac，Turku，Finland)上對加樣孔計數。
Western印跡人血清(0.15μg/泳道)在NuPage 4-12％Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠上電泳，轉移到PVDF膜上。用0.5％明膠在孵化緩衝液(5X250mM Tris；750mMNaCl；25mM EDTA；0.5％IGEPAL CA-630，pH 7.4)中封閉印跡，與單克隆抗體一同孵化，隨後與HRP-共軛的兔抗小鼠IgG(DAKO Po260)孵化。用SuperSignal West Pico Chemiluminescent試劑盒(Pierce Inc.)檢測印跡。
MASP-2競爭性ELISA包被緩衝液PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，8.1mMNa2HPO4，用NaOH調pH＝7.2)封閉緩衝液包含1mg/ml HSA的TBS(10mM Tris，150mM NaCl，利用HCl調pH＝7.4)洗滌緩衝液TBST+Ca(10mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.05％Tween 20，利用HCl調pH＝7.4)ELISA平板的包被在包被緩衝液[PBS，pH 7.2]中將MASP-2抗原稀釋到1μg/ml。向微量滴定板的每個加樣孔添加100μl MASP-2包被溶液。平板在室溫下孵化1小時。清空微量滴定板，用封閉緩衝液填滿平板的加樣孔，在室溫下孵化1小時。清空微量滴定板，用洗滌緩衝液填滿每個加樣孔。清空微量滴定板。重複三次。用洗滌緩衝液填滿加樣孔，保存在4℃。
用洗滌緩衝液適當地稀釋鼠抗體(最終0.2和1.0μg/ml)。在洗滌緩衝液中稀釋生物素化的NimoAb101(最終0.2μg/ml)。向MASP-2包被的平板添加稀釋的鼠抗體(100μl/加樣孔)。平板在室溫下孵化1小時。清空微量滴定板。
通過用洗滌緩衝液完全填滿加樣孔並清空來洗滌微量滴定板。該步驟重複兩次以總共三次洗滌。
以0.1mg/L的濃度將銪標記的鏈黴抗生物素蛋白(Wallac，Turku，Finland)添加到上述洗滌緩衝液中，不同之處在於不添加鈣並包括50μMEDTA。加樣孔在室溫下孵化1小時。清空微量滴定板，用洗滌緩衝液洗滌加樣孔三次。加樣孔通過添加100μL Delfia增強溶液(Perkin Elmer Wallac，Norton，USA)顯影，在定軌搖床上室溫下孵化5分鐘。在Wallac Victor 2dMulti計數器1420(Wallac，Turku，Finland)上對加樣孔計數。
結果表1指出了如上述鑑定的生產抑制性抗體的四個雜交瘤。
表1

新抗體的效力將四個描述的雜交瘤克隆轉換到無血清生長，通過MEP HyperCel提純從培養物上清液中純化抗體。如上述通過C4-沉積作用分析確定在完全人血清中抑制凝集素途徑的能力。結果在附圖5中顯示。
從該數據可以斷定，在抑制MASP-2活性方面，該抗體(035)比NimoAb101至少更有效3.9倍，而抗體(029)至少更有效30倍。對照抗體(002)是在篩選最有可能與MASP-2的N-末端結合的抗體過程中獲得的非抑制性抗體。抗體(046)和(048)也能抑制，但比NimoAb101的效力要低。
表位作圖Western印跡進行Westerns以區別抗體對N-末端A鏈(二聚作用和MBL結合部分)或對C-末端B鏈(MASP-2的絲氨酸蛋白酶部分)的結合。在還原SDS-PAGE上電泳人血清，用四種抗體分離物進行免疫檢測。全長未活化的MASP-2將展現出74kDa的帶，A鏈和B鏈分別展現出47kDa和27kDa的帶。附圖6顯示利用不同的鼠抗體在人血清中對MASP-2的Western印跡的結果。
從印跡可以斷定，所有四個抗體都識別27kDa帶(B鏈)，而A鏈(47kDa)不能被檢出。因而所有四種抗體都識別B鏈上的線性表位。
競爭性ELISA為了闡明這些抗體是否與大鼠抗體NimoAb101共用相同的表位，我們進行了競爭性ELISA。利用生物素化的NimoAb101與兩種不同濃度(0.2和1.0μg/ml)的小鼠抗體競爭，ELSA針對重組His-標記的MASP-2。
結果在附圖7中顯示。抗體與NimoAb101競爭越多，EU3+信號越低。從而可以斷定，抗體029(NimoAb108)和035(NimoAb104)很好地與NimoAb101抗體競爭，因而它們肯定共用了表位的至少一部分。
實施例6鑑別和克隆在以ECACC保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞中表達的抗體NimoAb101的VH和VL區域。
抗體的特異性存在於重鏈和輕鏈的可變域中的互補決定區(CDR)。為了表徵單克隆抗體Nimoab101，克隆了VH和VL結構域可變區。
使用的縮寫
VH＝Ig的重鏈可變區；VL＝Ig的輕鏈可變區CDR＝互補決定區；CDR1、CDR2和CDR3＝三個位於VH或VL的區域，從氨基末端數起。
FR＝構架區；FR3＝在VH或VL上的第三個構架區，從氨基末端數起scFv＝單鏈Fv片段；cDNA(互補DNA)＝在鹼基序列上與RNA鏈互補的單鏈DNA分子5′RACE＝cDNA5′端的快速擴增材料和方法總RNA和mRNA的分離將以ECAAC號03050904保藏的細胞系的雜交瘤細胞分配到4個試管中。使細胞沉澱，移除上清液。
將兩個試管在-80℃冷凍。
將兩個試管用於利用GenEluteTM哺乳動物總RNA試劑盒RTN70提純RNA。分光光度測定RNA濃度。也利用使用NucleoSpinRNA II試劑盒目錄號740955.20Macherey-Nagel的總RNA提純法來提純總RNA。分光光度測定產物。
用NucleoTrapmRNA試劑盒目錄號740655Macherey-Nagel從總RNA中分離Poly(A)RNA。
純化的mRNA在H2O(無RNase)中洗提，立即保藏在-80℃。
cDNA的構建5』RACE利用SMART RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech)根據廠家的說明進行cDNA末端的5′快速擴增(RACE)。GRT被用於逆轉錄(RT)，用G3進行擴增。
在該方法中使用的基因特異性引物是

質粒構建PCR片段的克隆親本質粒pCR2.1-TOPO(In Vitrogen TOPO TA克隆試劑盒)利用Topo反應將純化的PCR片段克隆到載體中。
序列分析利用標準測序引物M13F和M13R，按兩種方向，對來自VL的四個重組克隆的質粒袖珍製備物、和來自VH的六個重組克隆的質粒袖珍製備物的DNA進行插入物測序。利用VNTI重疊群表達，將來自每個質粒的兩個各自的序列裝配到重疊群中。將重疊群共有序列的可信部分輸入到NTI DNA資料庫文件中。
鑑定和翻譯有關的IgG開放閱讀框。
序列比對和blast檢索計算機分析利用重疊群序列組件用來自Informax Inc.的VectorNTI進行序列分析。
利用NCBI主頁(http://www.ncbi.nlm.nib.gov)和歐洲生物信息學研究所(EBI)(http://www.ebi.ac.uk/Tools/homology.html)進行BLAST檢索。
蛋白質比對利用ALIGN組件用來自Informax Inc.的VectorNTI軟體包進行所有的比對。用CLUSTALW和GeneDoc進行IgG VL和VH蛋白的多重比對和編輯。
結果和討論抗體Nimoab101是針對人MASP-2的CCP1-CCP2-SP亞基產生的。利用從文獻(1)修改的與恆定區CHl和CL雜交的引物，和與銜接子雜交的引物，其中銜接子已摻入到cDNA基因的5′末端，通過對雜交瘤mRNA的PCR，我們擴增了Fab片段的基因。純化的VL和VH PCR產物被克隆入pCR2.1-TOPO載體，用M13F和M13R引物測序。所有的VH序列和所有的VL序列都是相同的。序列在附圖8到10中顯示。
Kabat CRD定義輕鏈CDR1殘基24-34CDR2殘基50-56CDR3殘基89-97
重鏈CDR1殘基31-35CDR2殘基50-65CDR3殘基95-102將序列與以公開的抗體可變區數據對比表明，NimoAb101VL基因包含編碼19個胺基酸殘基的前導肽的57個核苷酸的前導序列，而NimoAb101VH基因具有60個鹼基長度的前導序列，編碼20個殘基的前導肽。
輕鏈是(大鼠-小鼠-人)κ鏈亞型的典型成員，而重鏈與資料庫中的其他重鏈不同。其在CDR H3(殘基100以後，Kabat編號方式)中有6個胺基酸的插入。
參考文獻1)Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains，發表於the Spinger Verlag Laboratory Manual on Antibody Engineering，編輯StefanDuebel和Roland Kontermann生物保藏以下生物材料已經被保藏在布達佩斯條約認可的保藏機構。
能產生針對MASP-2、可抑制MASP-2活性的抗體的雜交瘤細胞系，已經以保藏號03050904保藏在歐洲細胞培養物保藏所(ECACC)，Salisbury，Wiltshire SP4OJG，United Kingdom。該細胞系是來自大鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞的融合物的雜交瘤細胞系。這個雜交瘤細胞系生產單克隆抗體，在此稱為NimoAb101或NimoAb101N128-71B。細胞於2003年5月9日保藏。
稱為M0545YM035S2(在此也稱M0545YM035)的雜交瘤細胞系已經被保藏在德國微生物和細胞培養物保藏所(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany。該細胞系是來自大鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞的融合物的雜交瘤細胞系。鑑定參考是N162-91A-01到12。該雜交瘤細胞系生產單克隆抗體，在此被稱為NimoAb104或「035」或Ab035。細胞於2004年5月6日保藏。
稱為M0545YM029S2(在此也稱M0545YM029)的雜交瘤細胞系已經被保藏在德國微生物和細胞培養物保藏所(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany。該細胞系是來自鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞的融合物的雜交瘤細胞系。鑑定參考是N162-90C-01到12。該雜交瘤細胞系生產單克隆抗體，在此被稱為NimoAb108或「029」或Ab029。細胞於2004年5月6日保藏。
稱為M0545YM046S2(在此也稱M0545YM046)的雜交瘤細胞系已經被保藏在德國微生物和細胞培養物保藏所(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany。該細胞系是來自鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞的融合物的雜交瘤細胞系。鑑定參考是N162-90D-01到12。該雜交瘤細胞系生產單克隆抗體，在此被稱為NimoAb109或「046」或Ab046。細胞於2004年5月6日保藏。
稱為M0545YM048S2(在此也稱M0545YM048)的雜交瘤細胞系已經被保藏在德國微生物和細胞培養物保藏所(DSMZ)，MascheroderWeg 1b，D-38124Braunschweig，Germany。該細胞系是來自鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞的融合物的雜交瘤細胞系。鑑定參考是N162-90E-01到12。該雜交瘤細胞系生產單克隆抗體，在此被稱為NimoAb110或「048」或Ab048。細胞於2004年5月6日保藏。
參考文獻Hemmila，I.，Dakubu，S.，Mukkala，V.M.，Siitari，H.and Lovgren，T.(1984)Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays.AnalBiochem 137，335-43.
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序列表110內蒂穆恩公司(NatImmune A/S)120抗MASP-2抗體130P 772 PC0016013170PatentIn version 3.12101211686212PRT213人(Homo sapiens)400SEQ ID 1Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr1 5 10 15Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser20 25 30Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr35 40 45Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe50 55 60Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser65 70 75 80Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp85 90 95Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser100 105 110
Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr115 120 125Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val130 135 140Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu145 150 155 160Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn165 170 175Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg180 185 190Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu195 200 205Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile210 215 220Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu225 230 235 240Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly245 250 255Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn260 265 270Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly275 280 285
Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala His Ala Cys Pro Tyr Pro Met290 295 300Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu305 310 315 320Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln325 330 335Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly340 345 350Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro355 360 365Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly370 375 380Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe385 390 395 400Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly405 410 415Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro420 425 430Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly435 440 445Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly450 455 460
Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr465 470 475 480Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp485 490 495Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala500 505 510Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly515 520 525Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile530 535 540Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser545 550 555 560Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr565 570 575Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile580 585 590Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro595 600 605Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly610 615 620Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu
625 630 635 640Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly645 650 655Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val660 665 670Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe675 680 6852102211142212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 2Met Ser Phe Ser Asn Thr Leu Val Phe Leu Leu Phe Leu Leu Lys Gly1 5 10 15Ile Leu Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Leu Val Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Asn Phe Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Ile Tyr His Ala65 70 75 80Asp Thr Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr His Ser Arg Tyr Ile Pro Tyr Leu115 120 125Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser130 135 1402103211132212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 3Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr1 5 10 15Asp Ala Ile Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Cys20 25 30Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Ala Ser Asp Asp35 40 45Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ser Pro50 55 60Gln Leu Leu Ile Phe Asp Gly Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Met Lys85 90 95Ser Leu Gln Phe Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn
100 105 110Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg115 120 125Ala Asp Ala Ala1302104211156212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 4Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met Asn Trp Ile20 25 30Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser35 40 45Gly Gly Thr Tyr Ile Tyr His Ala Asp Thr Leu Lys Gly Arg Phe Thr50 55 60Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser65 70 75 80Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr85 90 95His Ser Arg Tyr Ile Pro Tyr Leu Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro115 120 125Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr145 150 1552105211159212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 5Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Cys Ala Ser Leu Gly Glu1 5 10 15Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Ala Ser Asp Asp Ile Tyr Ser Asn Leu20 25 30Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe35 40 45Asp Gly Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Met Lys Ser Leu Gln Phe Glu65 70 75 80Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr85 90 95Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Met Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly115 120 125Ala Thr Val Val Cys Phe Val Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile Ser130 135 140Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Gln Arg Asp Gly Val Leu145 150 15521062119212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 6Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met1 521072119212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 7Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Ile1 5210821114212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 8Gly Pro Tyr His Ser Arg Tyr Ile Pro Tyr Leu Met Asp Ala1 5 10
210921111212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 9Arg Ala Ser Asp Asp Ile Tyr Ser Asn Leu Ala1 5 10210102117212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 10Asp Gly Asn Arg Leu Ala Asp1 5210112119212PRT213Rattus norvegicus400SEQ ID 11Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr1 52101221126212DNA213人工的220221misc_feature223PCR引物40012ctcattcctg ttgaagctct tgacga 262101321121
212DNA213人工的220221misc_feature223PCR引物40013aggcttgcaa tcacctccac a 21
PCT/RO/134表 PCT/RO/134表(1998年7月)
PCT/RO/134表(1998年7月)
PCT/RO/134表(1998年7月)
PCT/RO/134表(1998年7月)
PCT/RO/134表(1998年7月)
保藏的微生物Deposited Microbial Organisms以下條款適用在本專利申請中所涉及到的所有被保藏的微生物.
For all deposited microbial organisms mentioned in the present patentapplication the following applies.
歐洲EUROPE在歐洲專利所指定的國家中，直至該歐洲專利被授權並公開，或直至該申請被駁回、或撤回、或被視為撤回之日，被保藏的微生物樣本方可僅以發放樣本給專家的方式，所述專家由樣本要求人委任，並得到i)申請人和/或ii)歐洲專利局許可(無論何種情況適用)。(歐洲專利公約實施細則第28條第4款)In respect to those designations in which a European Patent is sought asample of the deposited microorganism will be made available until thepublication of the mention of the grant of the European patent or until the dateon which application has been refused or withdrawn or is deemed to bewithdrawn，only by the issue of such a sample to an expert nominated by theperson requesting the sample，and approved either i)by the Applicant and/or ii)by the European Patent Office，whichever applies.(Rule 28(4)EPC).
加拿大CANADA申請人要求直至一申請被授予加拿大專利，或直至該申請被駁回、或放棄並不再恢復、或撤回之日，加拿大專利委員方可批准將本申請所涉及的被保藏的生物材料的樣本提供給由專利委員委任的一位獨立專家。申請人必須於為國際申請公開所做的技術準備結束之前以書面聲明的形式通知國際局。
The applicant requests that，until either a Canadian patent has been issued onthe basis of an application or the application has been refused，or isabandoned and no longer subject to reinstatement，or is withdrawn，theCommissioner of Patents only authorizes the furnishing of a sample of thedeposited biological material referred to in the application to an independentexpert nominated by the Commissioner，the applicant must，by a writtenstatement，inform the lnternational Bureau accordingly before completton oftechnical preparations for publication of the international application.
挪威NORWAY申請人在此要求直至一申請公開予公眾查閱(通過挪威專利局)，或直至挪威專利局在未經公開予公眾查閱的情況下作出最終決定，對本領域專家提供樣本的行為才能生效。申請人必須最遲於該申請根據《挪威專利法》第22節和33節(3)款的規定被公開之時，向挪威專利局提交該生效請求。如果申請人已經提交了該請求，任何由第三方作出的索要樣本的請求必須指明所要使用的專家。該專家可以是被列在由挪威專利局擬定的公認專家的名單之上的任何人，也可為在個案中得到申請人認可的任何人。
The applicant hereby requests that，until the application has been laid open topublic inspection(by the Norwegian Patent Office)，or has been finally decidedupon by the Norwegian Patent Office without having been laid open inspection，the furnishing of a sample shallon ly be effected to an expert in the art.Therequest to this effect shall be filed by the applicant with the Norwegian PatentOffice not later than at the time when the ap plication is made available to thepublic under Sections 22and 33(3)of the Norwegian Patents Act.If such arequest has been filed by the applicant，any request made by a third party forthe furnishing of a sample shall indicate the『expert to be used.That expertmay be any person entered on the list of recognized experts drawn up by theNorwegian Patent Office or any person approved by the applicant in theindividual case.
澳大利亞AUSTRALIA申請人在此做出通告只有在申請被授予專利權之前，或者在申請失效、被駁回或撤回之前，提供微生物樣本給與本發明無利益關係的本領域技術人員的行為才能生效(澳大利亞專利法實施細則3.25(3)款)。
The applicant hereby gives notice that the furnishing of a samp le of amicroorganism shal only be effected prior to the grant of a patent，or prior tothe lapsing，refusal or withdrawal of the application，to a person who is a skilledaddressee without an interest in the invention(Regulation 3.25(3)of theAustralian Patents Regulations).
芬蘭FINLAND申請人在此要求直至一申請公開予公眾查閱(通過芬蘭國家專利與註冊委員會)，或直至芬蘭國家專利與註冊委員會在未經公開予公眾查閱的情況下作出最終決定，對本領域技術人員提供樣本的行為才能生效。
The applicant hereby requests that，until the application has been laid open topublic inspection(by the National Board of Patents and Registration)，or hasbeen finally decided upon by the National Board of Patents and Registrationwithout having been laid open to public inspection，the furnishing of a sampleshall only be effected to an expert in the art.
英國UNITED KINGDOM申請人在此要求僅對專家提供微生物樣本。申請人必須於該申請國際公開的技術準備結束之前向國際局提交該生效請求。
The applicant hereby requests that the furnishing of a sample of amicroorganism shall only be made available to an expert.The request to thiseffect must be filed by the applicant with the lntemational Bureau before thecompletion of the technical preparations for the international publication of theapplication.
丹麥DENMARK申請人在此要求直至一申請公開予公眾查閱(通過丹麥專利局)，或直至丹麥專利局在未經公開予公眾查閱的情況下作出最終決定，對本領域專家提供樣本的行為才能生效。申請人必須最遲於該申請根據《丹麥專利法》第22節33(3)款的規定被公開之時，向丹麥專利局提交該生效請求。如果申請人已經提交了該請求，任何由第三方作出的索要樣本的請求必須指明所要使用的專家。該專家可以是被列在由丹麥專利局擬定的公認專家的名單之上的任何人，也可為在個案中得到申請人認可的任何人。
The applicant hereby requests that，until the application has been laid open topublic inspection(by the Danish Patent Office)，or has been finally decidedupon by the Danish Patent office without having been laid open to publicinspection，the furnishing of a sample shall only be effected to an expert in theart.The request to this effect shall be filed by the applicant with the DanishPatent Office not later that at the time when the application is made availableto the public u nder Sections 22and 33(3)of the Danish Patents Act.If such arequest has been filed by the applicant，any request made by a third party forthe furnishing of a sample shall indicate the expert to be used.That expert maybe any person entered on a list of recognized experts drawn up by the DanishPatent Office or any person by the applicant in the individual case.
瑞典SWEDEN申請人在此要求直至一申請公開予公眾查閱(通過瑞典專利局)，或直至瑞典專利局在未經公開予公眾查閱的情況下作出最終決定，對本領域專業人員提供樣本的行為才能生效。申請人必須在從優先權日起16個月期限屆滿前向國際局提交該生效請求(最好列在由PCT申請人指南第I冊附件Z生成的PCT/RO/134表中)。如果申請人已經提交了該請求，任何由第三方作出的索要樣本的請求必須指明所要使用的專家。該專家可以是被列在由瑞典專利局擬定的公認專家的名單之上的任何人，也可為在個案中得到申請人認可的任何人。
The applicant hereby requests that，until the application has been laid open topublic inspection(by the Swedish Patent Office)，or has been finally decidedupon by the Swedish Patent Office without having been laid open to publicinspection，the furnishing of a sample shall only be effected to an export in theart.The request to this effect shall be filed by the applicant with theInternational Bureau before the expiration of 16months from the priority date(preferably on the Form PCT/RO/134reproduced in annex Z of Volume l of thePCT Applicant’s Guide).If such a request has been filed by the applicant anyrequest made by a third party for the furnishing of a sample shall indicate theexpert to be used.That expert may be any person entered on a list ofrecognized experts drawn up by the Swedish Patent Office or any personapproved by an applicant in the individual case.
荷蘭NETHERLANDS申請人要求直至一荷蘭專利的授權公告被公開，或直至該申請被駁回、或撤回、或失效之日，微生物僅可以通過以發放樣本的方式根據《荷蘭專利法規》第3IF(1)款的規定由專家獲得。申請人必須於該申請根據《荷蘭專利法》第22C節或第25節的規定被公開之前，向荷蘭工業產權局提交該生效請求，以這兩個日期中較早的一日期為準。
The applicant hereby requests that until the date of a grant of a Netherlandspatent or until the date on which the application is refused or withdrawn orlapsed，the microorganism shall be made available as provided in the 3IF(1)ofthe Patent Rules only by the issue of a sample to an expert.The request to thiseffect must be furnished by the applicant with the Netherlands lndust rialProperty Office before the date on which the application is made available tothe public under Section 22C or Section 25of the Patents Act of the Kingdomof the Netherlands，whichever of the two dates occurs earlier.
權利要求
1.特異性地識別和結合MASP-2的C-末端部分中的表位的抗體或其功能等同物，其中所述抗體或其功能等同物特異性地識別表位的至少一部分，所述表位被選自下述的一個或多個參照抗體識別vi 以保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；vii 命名為M0545YM029的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；viii 命名為M0545YM035的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；ix 命名為M0545YM046的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；或x命名為M0545YM048的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體。
2.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
3.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體是鼠單克隆抗體。
4.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體已經被人源化。
5.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體是人單克隆抗體。
6.根據權利要求1的抗體，其中所述功能等同物是抗體的結合片段。
7.根據權利要求6的抗體，其中所述片段選自Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv片段。
8.根據權利要求1的抗體，其中所述功能等同物是單鏈抗體。
9.根據權利要求1的抗體，其中所述功能等同物是模擬抗體的小分子模擬物。
10.根據權利要求1的抗體，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。
11.根據權利要求1的抗體，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由絲氨酸蛋白酶結構域組成。
12.根據權利要求1的抗體，其中MASP-2是如SEQ ID 1所確定的人MASP-2。
13.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸363到686組成。(＝CCP2，絲氨酸蛋白酶)
14.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體特異性地識別和結合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸445到686組成。(＝絲氨酸蛋白酶)
15.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體能抑制C4沉積作用。
16.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體能在全血清中抑制C4沉積作用。
17.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體能在全血清中抑制C4沉積作用，達到比對照C4沉積作用的20％還要低。
18.根據權利要求15到17的任何一個的抗體，其中所述抗體能在全血清中抑制C4沉積作用，所述全血清來自具有C4解沉積活性的個體。
19.根據權利要求18的抗體，其中所述抗體以濃度範圍1μg/ml到500μg/ml存在。
20.權利要求1的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含或由與SEQ ID 4有至少90％同源性的序列組成。
21.權利要求1的抗體，其中所述抗體包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含或由與SEQ ID 5有至少90％同源性的序列組成。
22.權利要求1的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含或由與SEQ ID 4有至少90％同源性的序列組成，所述輕鏈可變區包含或由與SEQ ID 5有至少90％同源性的序列組成。
23.包含重鏈可變區的抗體或其抗原結合片段，所述重鏈可變區包含或由與SEQ ID 4有至少90％同源性的序列組成。
24.包含輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段，所述輕鏈可變區包含或由與SEQ ID 5有至少90％同源性的序列組成。
25.包含重鏈可變區和輕鏈可變區的抗體，所述重鏈可變區包含或由與SEQ ID 4有至少90％同源性的序列組成，所述輕鏈可變區包含或由與SEQID 5有至少90％同源性的序列組成。
26.包含一個或多個選自以下的CDR的抗體或其抗原結合片段1)SEQ ID 6的重鏈的CDR1；2)SEQ ID 7的重鏈的CDR2；3)SEQ ID 8的重鏈的CDR3；4)SEQ ID 9的輕鏈的CDR1；5)SEQ ID 10的輕鏈的CDR2；或6)SEQ ID 11的輕鏈的CDR3。
27.生產特異性識別和結合MASP-2的C-末端部分中的表位的抗體或其功能同源物的方法，包括向哺乳動物施用MASP-2的C-末端部分或其片段或其功能同源物的步驟。
28.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由EGF、CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。
29.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由CUB2、CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。
30.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或其片段包含或由CCP1、CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。
31.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或其片段包含或由CCP2和絲氨酸蛋白酶結構域組成。
32.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或片段包含或由絲氨酸蛋白酶結構域組成。
33.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由SEQ ID 1的胺基酸136到686組成。(＝EGF、CUB2、CCP1、CCP2、絲氨酸蛋白酶)
34.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由SEQ ID 1的胺基酸183到686組成。(＝CUB2、CCP1、CCP2、絲氨酸蛋白酶)
35.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸293到686組成。(＝CCP1、CCP2、絲氨酸蛋白酶)。
36.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸363到686組成。(＝CCP2，絲氨酸蛋白酶)
37.根據權利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或片段包含或由SEQ ID 1的胺基酸445到686組成。(＝絲氨酸蛋白酶)。
38.根據權利要求27的方法，其中所述哺乳動物是齧齒動物。
39.根據權利要求27的方法，其中所述方法進一步包括從所述哺乳動物分離抗體生產細胞，從所述抗體生產細胞製備雜交瘤細胞，培養所述雜交瘤，和分離所述雜交瘤生產的抗體。
40.根據權利要求27到39的任何一個的方法，其中所述表位是可被選自以下的一個或多個參考抗體識別的表位i以保藏號03050904保藏的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；ii 命名為M0545YM029的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；iii 命名為M0545YM035的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；iv 命名為M0545YM046的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體；或v命名為M0545YM048的雜交瘤細胞系生產的單克隆抗體。
41.根據權利要求40的方法，其中所述方法進一步包括鑑定和選擇識別所述表位的抗體。
42.根據權利要求40所述的方法，其中所述方法進一步包括通過進行以下步驟選擇識別所述表位的測試抗體1)提供包含可被所述參考抗體識別的表位的MASP-2或其片段；和2)向所述MASP-2中添加測試抗體和所述參考抗體，其中測試抗體或參考抗體用可檢測的標記物標記，或兩種抗體都用不同的可檢測標記物標記；和3)檢測MASP-2上可檢測標記物的存在4)從而檢測測試抗體是否能替換參考抗體5)選擇能替換參考抗體的測試抗體。
43.根據權利要求27到42的任何一個的方法，其中所述方法進一步包括測試所述抗體是否能抑制C4沉積作用，和選擇的抗體是否能抑制C4沉積作用。
44.根據權利要求27到42的任何一個的方法，其中所述方法進一步包括測試所述抗體是否能在全血清中抑制C4沉積作用，和選擇的抗體是否能在全血清中抑制C4沉積作用。
45.根據權利要求27到44的任何一個的方法生產的抗體。
46.抑制MASP-2的活性的方法，包含步驟1)提供包含MASP-2的組合物；2)提供根據權利要求1到25和44中任何一個的抗體；3)將所述組合物與所述抗體一同孵化，從而抑制MASP-2活性。
47.根據權利要求46的方法，其中所述組合物是血清。
48.一種藥物組合物，包含根據權利要求1到26和45中任何一個的抗體或其功能等同物和藥學上可接受的賦形劑。
49.用於醫治臨床狀況的藥物，包含作為活性成分的根據權利要求1到26和45中任何一個的抗體或其功能等同物。
50.根據權利要求49的藥物，其中所述臨床狀況是缺血性/再灌注性損傷。
51.醫治臨床狀況的方法，包含向需醫治的個體施用治療有效劑量的、根據權利要求1到26和45中任何一個的抗體或其功能等同物。
52.根據權利要求51的醫治方法，其中所述臨床狀況是慢性炎症性疾病。
53.根據權利要求51的醫治方法，其中所述臨床狀況是自體免疫炎症狀況。
54.根據權利要求51的醫治方法，其中所述臨床狀況是以由於程序性細胞死亡導致的大塊細胞喪失為特徵的臨床狀況。
55.根據權利要求51的醫治方法，其中所述臨床狀況是缺血性/再灌注性損傷。
56.根據權利要求55的方法，其中所述損傷是PTCA(經皮腔內冠狀動脈成形術)或CABG(冠狀動脈旁路移植術)的結果。
57.根據權利要求55的醫治方法，其中所述損傷是急性心肌梗塞或腦缺血的結果。
58.根據權利要求51的醫治方法，其中所述臨床狀況選自類風溼性關節炎或系統性紅斑狼瘡。
59.根據權利要求1到26和45中任何一個的抗體或其功能等同物的用途，用於製備用於醫治需醫治個體中的臨床狀況的藥物。
60.根據權利要求59的用途，其中所述臨床狀況是缺血性/再灌注性損傷。
61.根據權利要求60的用途，其中所述損傷是PTCA(經皮腔內冠狀動脈成形術)或CABG(冠狀動脈旁路移植術)的結果。
62.根據權利要求60的用途，其中所述損傷是急性心肌梗塞或腦缺血的結果。
63.根據權利要求59的用途，其中所述臨床狀況選自類風溼性關節炎或系統性紅斑狼瘡。
全文摘要
本發明涉及抗MASP－2抗體和其功能等同物。特別地，本發明涉及能抑制MASP－2的功能的MASP－2抗體。本發明還公開了MASP－2表位，其中識別所述表位的抗體對於抑制MASP－2活性是特別有用的。本發明還涉及生產所述抗體的方法，抑制MASP－2活性的方法，以及包含該MASP－2抗體的藥物組合物。
文檔編號A61P37/06GK1798769SQ200480015520
公開日2006年7月5日 申請日期2004年5月12日 優先權日2003年5月12日
發明者弗萊明·拉森, 烏拉·沃勒斯 申請人:內蒂穆恩公司