緩激肽b1受體配體的抗體的製作方法
2023-05-19 13:30:16
緩激肽b1受體配體的抗體的製作方法
【專利摘要】本發明公開提供可以特異性結合胰激肽或脫-Arg10-胰激肽的抗體。本公開也提供藥物組合物，及編碼抗胰激肽或脫-Arg10-胰激肽抗體的核酸，用於製備此類抗體或其片段的重組載體及宿主細胞。本發明也提供利用公開的抗體，在體內或體外調節胰激肽或脫-Arg10-胰激肽活性，或檢測胰激肽或脫-Arg10-胰激肽的方法。本公開進一步提供製備可特異性結合脫-Argg-緩激肽和脫-Arg10-胰激肽樣多肽抗體的方法。
【專利說明】緩激肽B1受體配體的抗體
[0001] 對相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年3月28日提交的美國臨時申請61/616, 845及2013年2月4 日提交的法國專利申請1350953的權益。這些申請的內容通過提及完整併入本文。
[0003] 發明背景
[0004] 緩激肽Bl受體涉及炎性疾病和慢性疼痛的發病機理。通過調節組織炎症和腎纖 維化，Bl受體也與急性腎損傷及慢性腎臟疾病的發病機理相關，慢性腎臟疾病是終末期腎 功能衰竭的主要原因。
[0005] 在人類，緩激肽Bl受體的主要激動劑是激肽。激肽是由激肽原蛋白經蛋白水 解裂解產生的生物活性肽。緩激肽Bl受體的主要激肽激動劑是十肽胰激肽，和九肽 脫-ArglO-胰激肽（通過蛋白水解裂解胰激肽的C端精氨酸形成）。因此，可以抑制胰激肽 和脫-ArglO-胰激肽結合緩激肽Bl受體的製劑，具有潛力治療或預防緩激肽Bl受體介導 的病理過程。
[0006] 相應地，有必要在本領域利用可以抑制胰激肽和脫-ArglO-胰激肽結合緩激肽Bl 受體新型製劑，來治療緩激肽Bl受體介導的人類病理過程。
[0007] 發明概述
[0008] 本發明提供的抗體或其片段，可以特異性結合胰激肽和脫-ArglO-胰激肽，並 可阻止胰激肽和脫-ArglO-胰激肽與緩激肽Bl受體的結合。這類抗體對治療胰激肽和 脫-ArglO-胰激肽相關疾病或失調（例如，疼痛或纖維化）特別有效。本發明也提供藥 物組合物，以及可以製備這類抗體或其片段的編碼抗胰激肽和脫-ArglO-胰激肽抗體的 核酸，重組表達載體和宿主細胞。利用本發明所述抗體或其片段檢測或調節胰激肽和 脫-ArglO-胰激肽活性的方法，也包含在本發明中。本發明還提供製備可特異性結合 脫-Arg9-緩激肽和脫-ArglO-胰激肽樣肽的抗體的方法。
[0009] 相應地，一方面本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其：
[0010] a)特異性結合胰激肽或脫-Argio-胰激肽而不結合緩激肽或脫-Arg9-緩激肽；
[0011] b)特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，其KD值小於IxKTiqM;
[0012] c)特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，其Ktjff小於IXIO45T1 ;或
[0013] d)特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽並抑制其結合緩激肽Bl受體。
[0014] 在一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段結合至胰激肽或脫-ArglO-胰激肽 N-末端賴氨酸殘基。
[0015] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段抑制胰激肽或脫-ArglO-胰激肽 結合緩激肽-1受體。
[0016] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合小鼠胰激肽樣肽 (KLP)。
[0017] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含一個重鏈可變區，該重鏈可 變區包含選自下組的HCDR3胺基酸序列：
[0018]a)SEQIDNO:7 [X1YX2X3DX4HAMX5Y],其中
[0019]
[0020] X2是R，D，A，V，L，I，M，F，Y或W，
[0021] X3是Y，F，W或H，
[0022] X4 是D，E或Y，和，
[0023] X5是D或E ;
[0024] b)SEQIDNO:63[X1EyDGX2YX 3X4LDX5]，其中
[0025] X1是W或F
[0026] X2是N或無胺基酸；
[0027] X3是Y或S，
[0028] X4是D或P，和
[0029] X5 是F或Y ;
[0030] c)SEQIDNO：13 ；
[0031] d)SEQ ID NO：32 ；
[0032] e)SEQIDNO：40 ；
[0033] f)SEQ ID NO:47;和
[0034] g)SEQIDNO:55。
[0035] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含選自下組中的HCDR2胺基酸 序列：
[0036]a)SEQ ID NO:8[YFXfXAGNTGYNQKFRG]，其中
[0037] I，M，F，Y或W，和
[0038] X2 是丫，D，E，N或Q ;
[0039] b) SEQ ID NO AdDVX1DPENGDX2X3YAPKFQG],其中
[0040] X1是I或V，
[0041]父2是1'或S，和
[0042] X3為G或D ;
[0043] c)SEQIDNO：14
[0044] d)SEQ ID NO：33 ；
[0045] e)SEQIDNO：41 ；
[0046] f)SEQ ID NO:48;和
[0047] g)SEQIDNO:56。
[0048] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含選自下組中的HCDRl胺基酸 序列：
[0049] a)SEQIDNO:9 [GYSFTDYXJY]，其中 X1 為 N，W或Y;
[0050] b) seq id no :65[Gfnikdyyx1H]，其中 X1是L，或 M;
[0051] c)SEQIDNO：15 ；
[0052] d)SEQ ID NO：34 ；
[0053] e)SEQIDNO：42 ；
[0054] f)SEQ ID NO:49;和
[0055] SEQIDNO:57。
[0056] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含一個輕鏈可變區，該輕鏈可 變區包含選自下組的LCDR3胺基酸序列：
[0057]a)SEQIDNO:10[QQX1X2SX3PX4T],其中
[0058]X1 是Y，F或H，
[0059]X2 是Y，F，H或W，
[0060]X3 是Y，F，T或H，和，
[0061]X4 是W，Y，F，H或L:
[0062]b)SEQIDNO:66 [QX1X2X3SX4PX5T]，其中
[0063]X1 是Q或N，
[0064]X2 是Y，F，D或H，
[0065]X3 是Y，F，H或W，
[0066]X4 是Y，F，T或H，和
[0067]父5是1，丫，？，11或1;
[0068]c)seqidno:69[X1Qgthfpyt]，其中X1 為L或M;
[0069]d)SEQIDNO：16 ；
[0070]e)SEQIDNO：35 ；
[0071]f)SEQIDNO：43 ；
[0072] g)SEQIDNO:50;和
[0073]h)SEQIDNO:58。
[0074] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含選自下組的LCDR2胺基酸序 列：
[0075]a)SEQIDN0:11[WASTRXJ，其中X:是已^』或N;
[0076]b)SEQIDNOATK1ASTRx2]，其中
[0077]X1 是W或G和
[0078]父2是已，0,〇或心
[0079]c)SEQIDNO：17 ；
[0080]d)SEQIDNO：36 ；
[0081]e)SEQIDNO:51;和
[0082]f)SEQIDNO:59。
[0083] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含選自下組的LCDRl胺基酸序 列：
[0084]a)SEQIDNO:12[KSSQSLLX1SSNQKNX2LA],其中
[0085]父1是1，11，￥或卩，和
[0086]X2 是H或Y;
[0087]b)SEQIDNO:68 [KssqslLX1X2SX3QX4NX5LA]，其中
[0088]X1 是W，H，Y或F，
[0089]X2 是S 或G，
[0090]X3 是N 或D，
[0091]父4是1(或R，
[0092]父5是11或Y。
[0093] c) SEQ ID NO :70 [KSSQSLLYSNGXJYLN]，其中X1為K或E ;
[0094] b)SEQ ID NO : 18 ;
[0095] c)SEQ ID NO ：37；
[0096] d) SEQ ID NO :44 ;
[0097] e) SEQ ID NO : 52;和
[0098] f) SEQ ID NO :60。
[0099]在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含一個輕鏈可變區，該輕鏈可 變區包含選自下組的LCDR3胺基酸序列：
[0100] a) SEQ ID NO : 10 [QQ X1X2S X3P X4T],其中
[0101]父丨是丫"或札
[0102]父2是丫，卩，11或評，
[0103] X3是Y，F，T或H，和，
[0104] X4是W，Y，F，H或L:
[0105]b)SEQ ID NO:66 [QX1X2X3SX4PX5T]，其中
[0106]父1是〇或1
[0107]父2是丫，卩，0或11，
[0108] X3是Y，F，H或W，
[0109] X4是Y，F，T或H，和
[0110]父5是1，丫，卩，11或1; tom] c)seq id no :69[X1Qgthfpyt],其中X1為L或M;
[0112] d)SEQ ID NO ：16；
[0113] e)SEQ ID NO ：35；
[0114] f)SEQ ID NO ：43；
[0115] g)SEQ ID NO : 50;和
[0116] h) SEQ ID NO : 58。
[0117] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含選自下組的LCDR2胺基酸序 列：
[0118] a)SEQ ID N0:11[WASTRXJ，其中父丨是已，]』或N;
[0119] b)SEQ ID NO :67 [XIASTRx2]，其中
[0120] X1是W或G和
[0121]父2是已，0,〇或1
[0122] c) SEQ ID NO : 17 ;
[0123] d)SEQ ID NO ：36；
[0124] e)SEQ ID NO :51;和
[0125] f) SEQ ID NO : 59。
[0126] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含選自下組的LCDRl胺基酸序 列：
[0127] a) SEQ ID NO : 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA],其中
[0128]父1是1，11，￥或卩，和
[0129]父2是11或Y;
[0130]b)SEQIDNO:68 [KssqslLX1X2SX3QX4NX5LA]，其中
[0131]父1是評，11，￥或卩，
[0132]父2是3或6，
[0133]X3是N或D，
[0134]X4 是K或R，
[0135]父5是11 或Y。
[0136]c)SEQIDNO:70 [KSSQSLLYSNGXJYLN]，其中X1 為K或E;
[0137]b)SEQIDNO：18 ；
[0138]c)SEQIDNO:37;
[0139]d)SEQIDNO：44 ；
[0140]e)SEQIDNO:52;和
[0141]f)SEQIDNO:60。
[0142] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區 含有HCDR3,HCDR2和HCDRl區，HCDR3,HCDR2和HCDRl的胺基酸序列分別如SEQIDNOs 13, 14,和15所示，且根據Kabat，其有一個或多個選自下列位點的胺基酸取代：Hl，H5，H9， Hll，H12,H16,H38,H40,H41，H43,H44,H66,H75,H79,H81，H82A，H83,H87,和H108。
[0143] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區 含有LCDR3,LCDR2和LCDRl區，LCDR3,LCDR2和LCDRl區的胺基酸序列分別如SEQIDNOs 16, 17,和18所示，且根據Kabat，其有一個或多個選自下列位點的基酸取代選自L5,L9， L15,L18,L19,L21，L22,L43,L63,L78,L79,L83,L85,L100 和L104。
[0144] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含有一個重鏈可變區胺基酸序 列，該序列與包含SEQIDNOs: 19, 20, 21，22, 24, 25, 38,45, 53,和61的組的任何序列具有 至少90 % -致性。
[0145] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含有一個輕鏈可變區胺基酸序 列，該序列與包含SEQIDNOs:26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和62的組的任何序列具 有至少90 % -致性。
[0146] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含有一個輕鏈可變區胺基酸序 列，該序列與包含SEQIDNOs:26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和62的組的任何序列具 有至少90 % -致性。
[0147] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含有一個重鏈可變區胺基酸序 列，其選自包含SEQIDNOs:19,20,21，22,24,25,38,45,53，和61的組。
[0148] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含有一個輕鏈可變區胺基酸序 列，其選自包含SEQID勵8:26,27,28,29,29,30,31，39,46,54，和62的組。
[0149] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含有一段選自SEQIDNOs:26， 27,28,29,29,30,31，39,46,54，和62的胺基酸序列。
[0150] 在另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含的重鏈和輕鏈可變區胺基酸 序列分別如SEQIDNO:19 和 26，SEQIDNO:20 和 27;SEQIDNO:21 和 28;SEQIDNO:22 和 28;SEQIDN0:23 和 29;SEQIDN0:24 和 30;SEQIDN0:25 和 31;SEQIDN0:38 和 39;SEQIDNO:45 和 46,SEQIDNO:53 和 54,或SEQIDNO:61 和 62 所示。
[0151] 在另一方面，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，可特異性結合胰激肽或 脫-ArglO-胰激肽，上述抗體或其抗原結合片段，與含重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列分別 如SEQIDNO: 19 和 26,SEQIDNO:38 和 39,SEQIDNO:45 和 46,SEQIDNO:53 和 54,或 SEQIDNO:61和62所示的抗體，競爭性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽。
[0152] 在另一方面，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，與前述 任一權利要求所述的抗體競爭結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，並且不結合緩激肽或 脫-Arg9_緩激膚。
[0153] 在另一方面，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，可特異性結 合胰激肽（KD)或脫-ArglO-胰激肽（DAKD)的一個構象表位，其中KD或DAKD採用一個包括 在4位脯氨酸II型緊密轉角的Pr〇4結節構象。在一個實施例中，KD或DAKD的Pro4結節構 象進一步包含一個S形的胺基酸重複，其將胺基酸鏈的疏水性側鏈排成空間堆積模式。在 另一個實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包括：(a)特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰 激肽而不結合緩激肽或脫-Arg9-緩激肽；(b)特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，KD 值小於IxKTwM; (c)特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，Ktjff小於IXIO4jT1 ;或⑷特 異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽並抑制其結合緩激肽Bl受體。
[0154] 在另一方面，本發明所述抗體或抗原結合片段結合到一種診斷或治療試劑上。
[0155] 在另一方面，本發明提供一種分離的編碼本發明所述抗體或其抗原結合片段的氨 基酸序列的核酸。
[0156] 在另一方面，本發明提供包含有本發明所述核酸的重組表達載體。
[0157] 在另一方面，本發明提供包含有本發明所述重組表達載體的宿主細胞。
[0158] 在另一方面，本發明提供一種生產可特異結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽的抗體 的方法，包括：在可讓宿主細胞產生一種特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽的抗體的 條件下培養本發明所述的宿主細胞。
[0159] 在另一方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含本發明所述抗體或其抗原結合 片段，及一種或多種藥學上可接受的載體。
[0160] 在另一方面，本發明提供一種用於治療胰激肽或脫-ArglO-胰激肽相關的疾病或 失調的方法，其包括給需要的受試者施用本發明所述的藥物組合物。
[0161] 在一個實施例中，所述疾病或失調是慢性疼痛。
[0162] 在另一方面，本發明提供一種產生特異性結合脫-Arg9_緩激肽和脫-ArglO-胰激 肽樣肽的抗體的方法，包括：用包含肽的免疫原免疫動物，其中所述肽含有如SEQIDNo. 11 所示的胺基酸序列，並且其中所述肽的氨基末端的精氨酸通過連接體被間接偶聯到一個載 體基團上，這樣，動物的免疫系統可產生特異性結合脫-Arg9-緩激肽，脫-ArglO-胰激肽和 脫-ArglO-胰激肽樣肽的抗體。
[0163] 在另一個實施例中，本發明所述的方法進一步包括：從所述動物中，分離所述抗 體，分離編碼該抗體的核酸，或表達該抗體的免疫細胞。
[0164] 在一個實施例中，所述載體基團是蛋白質。在另一個實施例中，上述蛋白質是匙孔 血藍蛋白（KLH)。在另一個實施例中，其中所述連接體基團包含：[Gly-Gly-Gly]n，其中n至 少為1。
[0165] 附圖簡述
[0166] 圖1示出了ELISA分析法驗證EEl抗體與激肽結合的結果。
[0167] 圖2示出了差示掃描量熱法測量抗體F151的結果。
[0168] 圖3示出了鼠和人源化F151抗體的可變區的胺基酸序列比對。所有相同的殘基 列在直線上，同源性殘基用" + "號標識，非同源殘基被留為空白。
[0169] 圖4示出了F151抗體/胰激肽複合物的抗原結合位點的電子密度圖。
[0170] 圖5示出了F151抗體/脫-ArglO-胰激肽複合物的抗原結合位點的電子密度圖。
[0171] 圖6示出了結合到胰激肽的F151的Fv亞基的一個條帶球棍表示法。
[0172] 圖7示出了本發明的示例性鼠抗胰激肽抗體的輕鏈可變區的一個胺基酸序列比 對。與胰激肽相互作用的胺基酸殘基以星號標識。
[0173] 圖8示出了本發明的示例性鼠抗胰激肽抗體的重鏈可變區的一個胺基酸序列比 對。與胰激肽相互作用的胺基酸殘基以星號標識。
[0174] 圖9示出了體內試驗確定EEl抗體對福馬林誘導的急性炎性痛的作用結果。
[0175] 圖10示出了體內試驗確定EEl抗體對弗氏完全佐劑（CFA)誘導的機械性超敏反 應的作用結果。
[0176] 圖11示出了體內試驗確定EEl抗體對弗氏完全佐劑（CFA)誘導的熱超敏性的作 用結果。
[0177] 圖12示出了體內實驗確定EEl抗體對CCI誘導的機械性超敏性的作用結果。
[0178] 圖13示出了體內試驗確定EEl抗體對CCI誘導的熱超敏性的作用結果。
[0179] 圖14示出了用於產生人源化F151變種HC3a/LC3a的VL和VH表達構建體示意 圖，構建體有限制性DNA的核酸內切酶位點，推導的酶切位點序列以粗體和下劃線表示。圖 A示出了輕鏈，圖B示出了重鏈。
[0180] 圖15示出了F151重鏈（A)和輕鏈⑶胺基酸序列與最接近的人源胺基酸序列的 比對。
[0181] 圖16示出了F151重鏈（A)和輕鏈⑶與VHl亞家族的重鏈基因座（1-08&1-18) 和輕鏈基因座（VIV-B3)的比對。CDR區和遊標區域表示為粗體，人源化突變表示為下劃 線。
[0182] 圖17示出了當胰激肽（KD)結合到F151抗體時，其主鏈多肽骨架構象的（A)二級 和（B)三級結構，F151抗體含有在4位脯氨酸處II型緊密轉角（C)。
[0183] 發明詳述
[0184] 本發明提供可特異性結合胰激肽和脫-ArglO-胰激肽並阻止胰激肽和 脫-ArglO-胰激肽與緩激肽Bl受體結合的抗體。這類抗體對治療胰激肽和脫-ArglO-胰 激肽相關的疾病或失調特別有效（例如，疼痛）。本發明也提供藥物組合物，及用於製備 這類抗體或其抗原結合片段的編碼抗胰激肽和脫-ArglO-胰激肽抗體的核酸，重組表達載 體及宿主細胞。本發明也包括：利用本發明所述抗體在體外或體內檢測或調節胰激肽和 脫-ArglO-胰激肽活性的方法。
[0185]I.定義
[0186] 便於本發明更好地被理解，首先定義一些術語。
[0187] 本文所用術語"胰激肽"，指包含或由胺基酸序列KRPPGFSPFR(SEQIDNO. 1)構成 的多肽。
[0188] 本文所用術語"脫-ArglO-胰激肽"，指包含或由胺基酸序列KRPPGFSPF(SEQID NO. 2)構成的多肽。
[0189] 本文所用術語"小鼠胰激肽"或"胰激肽樣肽"，指包含或由胺基酸序列 RRPPGFSPFR(SEQIDNO. 3)構成的多肽。
[0190] 本文所用術語"小鼠脫-ArglO-胰激肽"或"脫-ArglO-胰激肽樣肽"，指包含或由 胺基酸序列RRPPGFSPF(SEQIDNO. 4)構成的多肽。
[0191] 本文所用術語"緩激肽"，指包含或由胺基酸序列RPPGFSPFR(SEQIDNO. 5).構成 的多肽。
[0192] 本文所用術語"脫-Arg9-緩激肽"，指包含或由胺基酸序列RPPGFSPF(SEQID NO. 6)構成的多肽。
[0193] 本文所用術語"抗體"，指包括四條多肽鏈的免疫球蛋白分子及其多聚體（例如Ig M)，免疫球蛋白分子的兩條重（H)鏈和兩條輕（L)鏈通過二硫鍵相互連接。每條重鏈包含 一個重鏈可變區（簡寫為Vh或VH)和一個重鏈恆定區（簡寫為Ch或CH)。重鏈恆定區包含 三個結構域，CH1，CH2,CH3。每條輕鏈包含一個輕鏈可變區（簡寫為VJ和一個輕鏈恆定區 (簡寫為Q或CL)。輕鏈恆定區包含一個結構域（Ql)。V1^P'可進一步細分為高變區，稱 為互補決定區（CDRs)，及散布的更加保守的，稱為骨架區（FR)。每個'包含三個CDRs 和四個FRs，從N端至C端按以下順序排列：FR1，CDR1，FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。
[0194] 本文所用術語抗體的"抗原結合片段"包括：任何天然存在的、酶法製得的、合成的 或遺傳工程製備的多肽或糖蛋白，這些多肽或糖蛋白可特異性結合抗原形成複合物。抗體 的抗原結合片段可以源自，例如，通過使用任何適宜的標準技術從全抗體分子獲得，如蛋白 水解消化或重組基因工程技術，該技術涉及操縱和表達編碼抗體可變區和可選的恆定結構 域的的DNA。非限制性的抗原結合部分的實施例包括：（i)Fab片段；（ii)的F(ab'）2片段； (iii)Fd片段；（iv)Fv片段；（v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和（vii)模仿抗體 高變區（例如，分離的互補決定區（CDR))的胺基酸殘基構成的最小識別單位。"抗原結合 片段"的表述中也包括其它工程分子，如雙體，三體，四體和微體。
[0195] 本文所用術語"⑶R"或"互補決定區"，指從重鏈和輕鏈多肽鏈可變區中所發現 的不連續的抗原結合位點。Kabat等?J.Biol.Chem. 252, 6609-6616 (1977)和Kabat等 Sequencesofproteinofimmunologicalinterest. (1991),及Chothia等.J.Mol. Biol. 196:901-917(1987)和MacCallum等?J.Mol.Biol. 262:732-745(1996)中已經描述過 這些具體區域，相互比較起來，其中的定義包含一定的重疊及胺基酸殘基亞群。根據以上引 用的參考文獻定義所確定的構成CDR的胺基酸殘基，展示用於比較。在本發明的一個實施 例中，術語"⑶R"是根據Kabat的定義，即基於序列比較所確定的一個⑶R。
[0196] 本文所用術語"框架（FR)胺基酸殘基"，指在Ig鏈框架區的胺基酸。本文所用的 術語"構架區"或"FR區"，包含的胺基酸殘基：是可變區的一部分，但不是CDR(例如，根據 Kabat定義的⑶Rs)的一部分。因此，可變區框架長度約為100-120個胺基酸之間，但它僅 包括⑶R外的那些胺基酸。
[0197] 本文所用術語"特異性結合"，指抗體或其抗原結合片段結合抗原的能力表示為 平衡解離常數（Kd)，至少約IX10 - 6M,IX10_7M，IX10_8M，IX10_9M，IX10_1QM，IX10_nM，IXKT12M,或者更高。該術語也包括指：抗體或其抗原結合片段結合所述抗原的親和力至少 在非特異性抗原的兩倍以上。應當理解，然而，抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合兩個 或更多的抗原，這些抗原與序列相關（例如，胰激肽或脫-ArglO-胰激肽和小鼠胰激肽或 脫-ArglO-胰激肽）。
[0198] 本文所用術語"抗原"，指被抗體或其抗原結合片段識別的結合位點或表位。
[0199] 本文所用術語"載體"，意指一個可以轉運與其相連的另一個核酸分子的核酸分 子。一種類型的載體是"質粒"，指的是可以把另外的DNA片段連接到它上邊的環狀雙鏈DNA 環。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些 載體可以在它們所導入的宿主細胞中自主複製（例如，具有複製原點的細菌性載體和附加 型哺乳動物載體）。其他載體（例如，非附加型哺乳動物載體）導入宿主細胞時可以被整 合到宿主細胞的基因組中，因而隨著宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與它們 可操作連接的基因的表達。此類載體，在本文中稱為"重組表達載體"（或簡稱為"表達載 體"）。一般來說，用於重組DNA技術的表達載體通常是質粒。術語"質粒"和"載體"可以 互換使用。然而，本發明也意圖包括此類其他形式的表達載體，如病毒載體（例如複製缺陷 型逆轉錄病毒，腺病毒和腺相關病毒），它們可以發揮與質粒等效的功能。
[0200] 本文所用術語"宿主細胞"，意指導入了重組表達載體的細胞。但是應當理解的是， 這個術語不僅意指特定的主細胞，還指這種細胞的子代。因為在隨後的傳代中由於突變或 環境影響可以發生某些修飾，此種後代細胞實際上不等同於親本細胞，但仍包括在本文所 用術語"宿主細胞"的範圍之內。
[0201] 本文所用術語"治療"（〃treat〃），"治療"（"treating")和"治療"（"treatment") 是指本文所述的治療性或預防性措施。"治療" ("treatment")的方法採用給具有胰激肽或 脫-ArglO-胰激肽相關的疾病或失調（例如炎性疾病）或傾向於患這類疾病或失調的受試 者施用本發明的抗體或其抗原結合片段，來預防，治癒，延遲該疾病或失調、或復發性疾病 或失調，降低其嚴重程度，或改善其一種或多種症狀，或延長受試者在無此類治療情況下預 期的存活期。
[0202] 本文所用術語"胰激肽或脫-ArglO-胰激肽相關疾病或失調"，包括疾病狀態和/ 或疾病狀態相關症狀，在其發現胰激肽或脫-ArglO-胰激肽水平或活性變化。示例性胰激 肽或脫-ArglO-胰激肽相關疾病或失調包括，但不限於，疼痛和纖維化。
[0203] 本文所用術語"有效量"，指施用與受試者時，結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽的 抗體或其抗原結合片段的量，足以對如本文所述的胰激肽或脫-ArglO-胰激肽相關疾病或 失調，產生治療，預防或診斷的效果。治療有效量根據受試者和用於治療的疾病情況，受 試者體重和年齡，疾病狀況的嚴重程度，給藥方式等不同而變化，可由本領域普通技術人 員容易地確定。本發明所述抗體或其抗原結合片段的施用劑量範圍，例如，從約Ing到約 10,OOOmg,約Iug到約5,OOOmg,約Img到約1，OOOmg,約IOmg到約100mg。劑量方案可進 行調整以提供最佳治療反應。有效量也指抗體或其抗原結合片段的毒性或有害作用（即副 作用）最小或受益效果更明顯時的量。
[0204] 本文所使用術語"受試者"，包括任何人或非人類動物。
[0205] 本文所用術語"表位"，指抗原決定簇，其可與被稱為互補位的抗體分子的可變區 特異性的抗原結合位點相互作用。一個單一的抗原可以具有一個以上的表位。因此，不同 的抗體可結合到一個抗原上不同的區域，並且可以具有不同的生物效應。表位可以是構象 的或線性的。構象表位是由線性多肽鏈上不同片段在空間上靠近的胺基酸所產生的。線性 表位是由多肽鏈的相鄰胺基酸殘基產生的。
[0206] 這裡應當注意的是，本說明書和所附權利要求書中所用單數形式〃a，〃〃an，〃及 "the〃包括相關複數，除非上下文另有明確說明。
[0207] II.抗胰激肽或脫-ArglO-胰激肽抗體
[0208] -方面，本發明提供抗體或其片段，可以特異性結合胰激肽和脫-ArglO-胰激肽。 本發明的示例性的抗體的VH，VL和CDR列於表1
[0209] 表1.代表性抗胰激肽或脫-ArglO-胰激肽抗體的VH，VL和⑶R胺基酸序列
[0210]
【權利要求】
1. 一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其： a) 特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽而不結合緩激肽或脫-Arg9-緩激肽； b) 特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，KD值小於lxlO^M ; c) 特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，K#小於1 X 10Y1 ;和/或 d) 特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽並抑制其結合緩激肽B1受體。
2. 前述任一權利要求所述抗體或其抗原結合片段，結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽的 N-末端賴氨酸殘基。
3. 前述任一權利要求所述抗體或抗原結合片段，抑制胰激肽或脫-ArglO-胰激肽結合 緩激肽-1受:體。
4. 前述權利要求所述抗體或其抗原結合片段，特異性結合小鼠胰激肽樣肽（KLP)。
5. 前述任一權利要求所述抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區 包含選自下組的HCDR3胺基酸序列： a) SEQ ID NOJKJ X2X3D X4HAM X5Y]，其中 父2是1?，0，八，V，L，I，M，F，Y 或 W， 乂3是丫，卩，1或11， 乂4是0，￡或￥，和， X5是D或E ; b) SEQ ID NOASD^EYDGXJXALDXJ，其中 Xi是W或F X2是N或無胺基酸； 父4是0或P，和 X5是F或Y ; c) SEQ ID NO ：13 ； d) SEQ ID NO ：32 ； e) SEQ ID NO ：40 ； f) SEQ ID NO :47 ;和 g) SEQ ID NO ：55 〇
6. 前述任一權利要求所述抗體或其抗原結合片段，進一步包含選自下組的HCDR2氨基 酸序列： a) SEQ ID NOAEYFXiPXWGNTGYNQKFRG]，其中 V，L，I，M，F，Y 或 W，和 b) SEQ ID NOAdDWXiDPENGDXJJAPKFQG]，其中 父1是1或乂， &是1'或5，和 X3為G或D ; c) SEQ ID NO ：14 d) SEQ ID NO ：33 ； e) SEQ ID NO ：41 ； f) SEQ ID NO :48 ;和 g) SEQ ID NO ：56 〇
7. 前述任一權利要求所述抗體或其抗原結合片段，進一步包含選自下組的HCDR1氨基 酸序列： a) SEQ ID NO :9 [GYSFTDYXJY]，其中 Xi 為 N，W 或 Y ; b) SEQ ID NO :65 [GFNIKDYYX^]，其中 Xi 是 L，或 M ; c) SEQ ID NO ：15 ； d) SEQ ID NO ：34 ； e) SEQ ID NO ：42 ； f) SEQ ID NO :49 ;和 g) SEQ ID NO :57。
8. 前述任一權利要求所述抗體或其抗原結合片段，進一步包括輕鏈可變區，該輕鏈可 變區包含選自下組的LCDR3胺基酸序列： a) SEQ ID N0:10[QQ X&S X3P X4T]，其中 父2是丫，？，11或1， X4 是 W，Y，F，H 或 L: b) SEQ ID NOAetQXAXsSX^XJ]，其中 Xi是Q或N， 父2是丫，卩，0或11， 乂4是￥，？，1'或11，和 父5是1，丫，？，11或1; c) SEQ ID NO :69 [XiQGTHFPYT]，其中 Xi 為 L 或 M ; d) SEQ ID NO :16 ; e) SEQ ID NO :35 ; f) SEQ ID NO ：43 ； g) SEQ ID NO :50 ;和 h) SEQ ID NO :58。
9. 前述任一權利要求所述抗體或其抗原結合片段，進一步包含選自下組的LCDR2氨基 酸序列： a) SEQ ID NOdUMSTRXj，其中 X :是已』』或N; b) SEQ ID NOjTD^ASTRXj，其中 Xi是1或G，和 父2是￡，0,〇或心 c) SEQ ID NO ：17 ； d) SEQ ID NO ：36 ； e) SEQ ID NO :51 ;和 f) SEQ ID NO ：59 〇
10. 前述任一權利要求所述抗體或其抗原結合片段，進一步包含從下組中選出的 IXDR1胺基酸序列： a) SEQ ID N0:12[KSSQSLL XfSNQKN X2LA]，其中 X :是^札丫或F，和 X 2是11或Y; b) SEQ ID NOASKSSQSLLXASXsQXJXsLA]，其中 父1是1，11，￥或卩， X 2是S或G， X3是N或D， X 4是K或R， X 5是11或Y。 c) SEQ ID NO :70 [KSSQSLLYSNGXJYLN]，其中 Xi 為 K 或 E ; b) SEQ ID NO ：18 ； c) SEQ ID NO ：37 ； d) SEQ ID NO ：44 ； e) SEQ ID NO :52 ;和 f) SEQ ID NO :60。
11. 權利要求1-4任一所述抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區 含有選自下組的IXDR3胺基酸序列： a) SEQ ID N0:10[QQ X&S X3P X4T]，其中 父2是丫，？，11或1， X4 是 W，Y，F，H 或 L: b) SEQ ID NOAetQXAXsSX^XJ]，其中 Xi是Q或N， 父2是丫，卩，0或11， 乂4是￥，？，1'或11，和 父5是1，丫，？，11或1; c) SEQ ID NO :69 [XiQGTHFPYT]，其中 Xi 為 L 或 M ; d) SEQ ID NO :16 ; e) SEQ ID NO :35 ; f) SEQ ID NO ：43 ； g) SEQ ID NO :50 ;和 h) SEQ ID NO :58。
12. 權利要求11所述抗體或其抗原結合片段，進一步包含選自下組的LCDR2胺基酸序 列： a) SEQ ID NOdUWASTRXj，其中 X :是已』』或N; b) SEQ ID N0:67[X2ASTRX2]，其中 Xi是1或G，和 父2是￡，0,〇或心 c) SEQ ID NO ：17 ； d) SEQ ID NO ：36 ； e) SEQ ID NO :51 ;和 f) SEQ ID NO ：59 〇
13. 權利要求12所述抗體或其抗原結合片段，進一步包含選自下組的LCDR1胺基酸序 列： a) SEQ ID NOdSKSSQSLLXiSSNQKN X2LA]，其中 X :是^札丫或F，和 X 2是11或Y; b) SEQ ID NOASKSSQSLLXASXsQXJXsLA]，其中 父1是1，11，￥或卩， X 2是S或G， X3是N或D， X 4是K或R， X 5是11或Y。 c) SEQ ID NO :70 [KSSQSLLYSNGXJYLN]，其中 Xi 為 K 或 E ; b) SEQ ID NO ：18 ； c) SEQ ID NO ：37 ； d) SEQ ID NO ：44 ； e) SEQ ID NO :52 ;和 f) SEQ ID NO :60。
14. 權利要求1-4任一所述抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區 含有HCDR3, HCDR2和HCDR1區，HCDR3, HCDR2和HCDR1區的胺基酸序列分別如SEQ ID NOs 13, 14,和15所示，且根據Kabat，有一個或多個選自下列位點的胺基酸取代：H1，H5, H9， Hll，H12, H16, H38, H40, H41，H43, H44, H66, H75, H79, H81，H82A，H83, H87,和 H108。
15. 權利要求14所述抗體或其抗原結合片段，其進一步包含輕鏈可變區，該輕鏈可變 區含有LCDR3, LCDR2和LCDR1區，LCDR3, LCDR2和LCDR1區的胺基酸序列分別如SEQ ID NOs 16, 17,和18所示，且根據Kabat，有一個或多個選自下列位點的胺基酸取代：L5, L9, L15， L18, L19, L21，L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 和 L104。
16. 權利要求1-4任一所述抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區 含有LCDR3, LCDR2和LCDR1區，LCDR3, LCDR2和LCDR1區的胺基酸序列分別如SEQ ID NOs 16, 17,和18所示，且根據Kabat，有一個或多個選自下列胺基酸位點的取代：L5, L9, L15， L18, L19, L21，L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 和 L104。
17. 權利要求1-4任一所述抗體或其抗原結合片段，其包含一個重鏈可變區胺基酸序 列，該序列與包含3￡0 1〇勵8:19,20,21，22,24,25,38,45,53，和61的組的任何序列具有 至少90 % -致性。
18. 權利要求17所述抗體或其抗原結合片段，其進一步包含一個輕鏈可變區胺基酸序 列，該序列與包含SEQ ID NOs :26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和62的組中任何序列具 有至少90 % -致性。
19. 權利要求1-4任一所述抗體或其抗原結合片段，其包含一個輕鏈可變區胺基酸序 列，該序列與包含SEQ ID NOs :26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和62的組中的任何序列 具有至少90 % -致性。
20. 權利要求1-4任一所述抗體或其抗原結合片段，其包含一個重鏈可變區胺基酸序 列，其選自包含 SEQ ID NOs :19,20,21，22,24,25,38,45,53，和61的組。
21. 權利要求20所述抗體或其抗原結合片段，其進一步包含一個輕鏈可變結構域氨區 基酸序列，其選自包含 SEQ ID NOs :26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和 62 的組。
22. 權利要求1-4任一所述抗體或其抗原結合片段，其包含的胺基酸序列選自包含SEQ ID NOs :26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和 62 的組。
23. 權利要求1-4任一所述抗體或其抗原結合片段，其包含的重鏈和輕鏈可變區氨基 酸序列分別如 SEQ ID NO :19 和 26，SEQ ID NO :20 和 27 ;SEQ ID NO :21 和 28 ;SEQ ID NO : 22 和 28 ;SEQ ID NO :23 和 29 ;SEQ ID NO :24 和 30 ;SEQ ID NO :25 和 31 ;SEQ ID NO :38 和 39 ;SEQ ID NO :45 和 46, SEQ ID NO :53 和 54,或 SEQ ID NO :61 和 62 所示。
24. -種抗體或其抗原結合片段，可特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，其中所述 抗體或其抗原結合片段，與含重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列分別如SEQ ID NO :19和26, SEQ ID NO :38 和 39, SEQ ID NO :45 和 46, SEQ ID NO :53 和 54,或 SEQ ID NO :61 和 62 所示的 抗體，競爭性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽。
25. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，與前述任一權利要求所述的抗體競爭 性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，並且不結合緩激肽或脫-Arg9-緩激肽。
26. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，可特異性結合胰激肽（KD)或 脫-ArglO-胰激肽（DAKD)的一個構象表位，其中KD或DAKD採用一個包括在4位脯氨酸II 型緊密轉角的Pro4結節構象。
27. 權利要求26所述抗體或抗原結合片段，其中KD或DAKD的Pro 4的結節構象還包 括一個S形的胺基酸重複，其將胺基酸鏈的疏水性側鏈排成空間堆積模式。
28. 權利要求26或27所述的抗體或抗原結合片段，其 (a) 特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽而不結合緩激肽或脫-Arg9-緩激肽； (b) 特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，KD值小於lXl〇-1QM ; (c) 特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽，K#小於1 X 10Y1 ;和/或 (d) 特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽並抑制其結合緩激肽B1受體。
29. 前述任一權利要求所述的抗體，結合至一種診斷性或治療性試劑。
30. -種分離的核酸，其編碼前述任一權利要求所述的抗體或其抗原結合片段的氨基 酸序列。
31. -種重組表達載體，其包含權利要求30所述的核酸。
32. -種宿主細胞，其包含權利要求31所述的重組表達載體。
33. -種生產可特異結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽的抗體的方法，包括：在可讓宿主 細胞產生一種特異性結合胰激肽或脫-ArglO-胰激肽的抗體的條件下培養權利要求32所 述的宿主細胞。
34. -種藥物組合物，其包含權利要求1-28任一所述抗體或其抗原結合片段，及一種 或多種藥學上可接受的載體。
35. -種用於治療胰激肽或脫-ArglO-胰激肽相關的疾病或失調的方法，包括給需要 的受試者施用權利要求34所述的藥物組合物。
36. 權利要求35所述的方法，其中所述疾病或失調是慢性疼痛。
37. -種產生特異性結合脫-Arg9-緩激肽和脫-ArglO-胰激肽樣肽的抗體的方法，包 括：用包含肽的免疫原免疫動物，其中所述肽含有如SEQ ID No. 11所示的胺基酸序列，並且 其中所述肽的氨基末端的精氨酸通過連接體被間接偶聯到一個載體基團上，這樣，動物的 免疫系統可產生特異性結合脫-Arg9-緩激肽，脫-ArglO-胰激肽和脫-ArglO-胰激肽樣肽 的抗體。
38. 權利要求37所述的方法，進一步包括從所述動物中，分離抗體，分離編碼該抗體的 核酸，或表達該抗體的免疫細胞。
39. 權利要求37所述的方法，其中所述載體基團是蛋白質。
40. 權利要求39所述的方法，其中所述蛋白質是匙孔血藍蛋白（KLH)。
41. 權利要求40所述的方法，其中所述連接體基團包含：[Gly-Gly-Gly]n，其中n至少 為1。
【文檔編號】C07K16/26GK104334578SQ201380027405
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2012年3月28日
【發明者】H·李, D·科米諾斯, J·張, A·普裡斯克, M·達文森, N·鮑林, G·薩布拉馬尼安, X·陳 申請人:賽諾菲