特異性識別egfr突變蛋白的單克隆抗體、製備方法及其應用的製作方法

2023-05-18 16:25:16 2

特異性識別egfr突變蛋白的單克隆抗體、製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體、製備方法及其應用，屬於生物科學和藥物載體領域。利用本發明的方法製備出的三種單克隆抗體分別可以特異性識別十種EGFR?G719A、EGFR?G719C、EGFR?G719S、EGFR?D761Y、EGFR?L858R、EGFR?L861Q、EGFR?A839T、EGFR?N826S、EGFR?G863D以及EGFR?V769L突變蛋白。這十種單克隆抗體可以用於檢測動物或者人體組織中的EGFR蛋白是否含有G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D或者V769L突變，能為臨床上的多種癌症的診斷和治療提供依據。
【專利說明】特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體、製備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物科學和藥物載體領域，特別涉及特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體、製備方法及其作為診斷和治療試劑的應用。
【背景技術】
[0002]EGFR 蛋白(Epidermal Growth Factor Receptor,表皮生長因子受體，也稱為ErbB-1或者HER1)是細胞表面的表皮生長因子受體家族的跨膜受體成員。EGFR與細胞外的表皮生長因子(EGF)結合，從而將細胞外的信號傳導到細胞內。EGFR蛋白的突變在多種人類癌症，例如肺癌、肛門癌、直腸癌、乳腺癌中都存在(Paez JG et al., Science, 304(5676):1497-500 (2004))。這些突變導致EGFR蛋白的持續激活，進而促進細胞的增殖轉化和癌細胞生長。常見的 EGFR 突變蛋白有 G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 和 V769L。
[0003]針對EGFR突變蛋白的抑制劑藥物已經上市，包括易瑞沙? (Iressa?，化學名Genfitinib)、特羅凱 ? (Tarceva?,化學名 Erlotinib)等(Mayumi Onoland MichihikoKuwano，Clin.Cancer Res.12:7242(2006))。這些抑制劑藥物特異性針對突變的EGFR蛋白，因此在使用之前，需要用一種能夠特異性結合突變的EGFR蛋白但是不結合野生型EGFR蛋白的抗體來檢測該病人是否帶有EGFR突變(Pallis AG et al.,Br.J.Cancer.105(1):1-8.(2011))。這種抗體可以被用來快速檢測少量的取自病人的樣品，用於診斷癌症。能夠特異性結合EGFR突變蛋白的抗體也是治療癌症所迫切需要的。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是為解·決上述問題而提供了分別特異性地識別EGFRG719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 和 V769L 突變體蛋白的六種單克隆抗體、製備方法及其應用。利用本發明的方法製備出的單克隆抗體能夠分別特異性地識別G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 和 V769L 突變體蛋白，而不識別野生型EGFR蛋白。
[0005]在一些操作實例中，所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體或者抗原結合部位，其特徵在於，由一條重鏈和一條輕鏈組成；重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的胺基酸序列分別是由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCC C201301、CCTCCC2012127、 CCTCC C2012118、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125、 CCTCC C201315、 CCTCCC201302、CCTCCC201320、CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的CDR1、CDR2以及CDR3的胺基酸序列決定。在進一步的操作實例中，所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體或者抗原結合部位，其特徵在於，由分別包含所述雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區域的胺基酸序列的一條重鏈和一條輕鏈組成。在更進一步的操作實例中，抗體或者抗原結合部位包含上述雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列。
[0006]本發明的單克隆抗體可以是一種人源化的或者嵌合型的抗體。在某些操作實例中，這種單克隆抗體是IgG。
[0007]在一方面，本發明包括保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCCC201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCCC201315,CCTCC C201302,CCTCC C201320,CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細胞。
[0008]本發明包括一種含有所述單克隆抗體或者抗原結合部位的藥物或者可用於藥物的載體。本發明還包括一種含有本發明中提到的單克隆抗體或者其抗原結合部位診斷試劑盒。
[0009]在一些應用實例中，本發明能夠提供一種癌症診斷的方法(例如，肺癌，非小細胞肺癌，直腸癌，結腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，膠質瘤，腦癌)，其主要步驟包括:用本發明所述的單克隆抗體接觸來自於檢測目標的生物學樣本；檢測抗體或者其部分與樣本是否結合；如果抗體與樣本存在結合則表明被檢測對象是癌症，或者存在發展成癌症的風險。
[0010]在另外的應用實例中，本發明提供一種治療腫瘤病人的方法，包括:檢測G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 或者 V769L 突變形式的 EGFR 蛋白是否存在於來自於病人的樣本中；如果其中一個突變存在，則使用一種EGFR抑制劑(例如Genfitinib和Erlotinib)進行治療。本發明還提供一種治療癌症病人(例如,直腸癌,乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌)的方法。該治療方法包括給予病人一種組成成分中含有本發明的單克隆抗體或者其抗原結合部分的藥物。本發明進一步提供一種使用本發明所述單克隆抗體或者其抗原結合部`位作為藥劑治療黑色素癌，直腸癌，甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，或者造血組織癌。
[0011]本發明包括一種純化的核酸分子，其組成為能夠編碼本發明中的特異性結合突變EGFR蛋白的的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈或者抗原結合部分的核酸序列。進一步本發明包括含有該核酸序列的載體；該載體優化為含有包括可以聯繫到該核酸分子的表達調控序列。在一種應用實例中，本發明提供一種含有該核酸分子的宿主細胞。在另一個應用實例中，本發明提供一種能夠產生所述的單克隆抗體或者抗原結合部位的細胞株。本發明還包括一種生產特異性結合突變型而不結合野生型EGFR蛋白的單克隆抗體或者抗原結合部位的方法。其步驟包括:在適當的條件下培養宿主細胞或者本發明中提到的細胞株；純化所述的抗體。
[0012]本發明基於單克隆抗體特異性結合突變型的EGFR蛋白的發現。我們發現這些抗體能夠非常好地優先結合突變的EGFR蛋白(例如帶有G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D或者V769L突變的EGFR蛋白)。這些抗體能夠有效地診斷或者治療癌症等疾病。這些抗體特別能夠有效地檢測生物樣品中微量的EGFR蛋白。
[0013]EGFR
[0014]本專利所描述的EGFR是指表皮生長因子受體(Epidermal GrowthFactor Receptor, EGFR)的基因或者蛋白(Hunter T and Cooper JA, Annu RevBiochem.54:897-930 (1985))。該基因或者蛋白也被稱為ErbB-1或者HERl。野生型的EGFR蛋白序列包括SEQ ID NO: 7，野生型EGFR蛋白的編碼mRNA序列包括SEQ ID NO:8。
[0015]EGFR是細胞表面的表皮生長因子受體家族的跨膜受體成員，是一種受體酪氨酸激酶。EGFR與細胞外的表皮生長因子(EGF)結合，發生二聚化並激活自身的激酶活性，磷酸化細胞內的一系列下遊蛋白，從而將細胞外的信號傳導到細胞內。
[0016]EGFR蛋白的突變型式包括一個或者多個胺基酸的插入、刪除、替換等。本專利所描述的EGFR G719A突變指的是第719位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)替換的突變；EGFR G719C指的是第719位的甘氨酸(G)被半胱氨酸(C)替換的突變；EGFR G719S指的是第719位的甘氨酸(G)被絲氨酸(S)替換的突變；EGFR D761Y指的是第761位的天冬氨酸(D)被酪氨酸(Y)替換的突變；EGFR L858R指的是第858位的亮氨酸(L)被精氨酸(R)替換的突變；EGFRL861Q指的是第861位的亮氨酸(L)被穀氨醯胺(Q)替換的突變；EGFR A839T指的是第839位的丙氨酸(A)被蘇氨酸(T)替換的突變；EGFR N826S指的是第826位的天冬醯胺(N)被絲氨酸(S)替換的突變；EGFR G863D指的是第863位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)替換的突變；EGFR V769L指的是第769位的纈氨酸(V)被谷亮氨酸(L)替換的突變。
[0017]抗體與抗原結合部位
[0018]本發明包括特異性結合突變型EGFR蛋白但是不結合野生型EGFR蛋白的單克隆抗體。「抗體」或者「免疫球蛋白Ig」指的是由重鏈(H，大約50-70kDa)和輕鏈(L，大約25kDa)通過二硫鍵連結成的四聚體。輕鏈可以是\輕鏈或者K輕鏈。重鏈可以分為U、S、Y、a、e，不同重鏈和輕鏈的組合共同決定抗體的類型分別是IgM、IgD、IgG、IgA或者IgE(Fundamental Immunology Ch.7, Paul, ff., ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y.(1989))。
[0019]每條重鏈(有 時稱為H鏈，或者HC)都含有一個重鏈可變區(也叫Vh)和一個重鏈恆定區(也叫CH)。重鏈恆定區由三個結構與組成，分別SChUCi^pCH3。每條輕鏈(有時也成為L鏈，或者LC)也有一個輕鏈可變區(也叫 ')和輕鏈恆定區(CJ。輕鏈恆定區只含有一個結構與Q，在輕鏈和重鏈內部，可變區和恆定區通過一個大約12個胺基酸左右的「J」形狀的結構連結起來。在重鏈內部還有一個3個胺基酸左右的「D」形區域。重鏈可變區和輕鏈可變區可以進一步被分為超可變區，也叫互補決定區(CDR)以及穿插中間的略微保守的框架區域(FR)。這些區域以此從N端往C端排列為FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每個結構區域的胺基酸序列排序是根據 Kabat(Proteins of Immunological Interest, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD (1987andl991))和 Chothia&Lesk (Chothia&Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987) ; Chothia et al., Nature342:878-883 (1989))的研究結果分類的。
[0020]本發明的內容之一是特異性結合突變型EGFR蛋白的的單克隆抗體的抗原結合部位。「抗原結合部位」是指抗體上使其具有特異性識別並結合抗原(例如EGFR蛋白上一段含有特定突變的多肽片段)的功能的一段抗體片段。目前認為，抗體的抗原結合功能可以通過全長抗體的部分片段來實現。抗體的「抗原結合部位」的特徵在於包含:(I)一個Fab片段，一個包含\、VH、CL, ChI結構域的單價片段；(2) —個F (ab』) 2片段，一個含有通過鉸鏈區的的二硫鍵連接起來的Fab片段的二價片段；(3) —個包含Vh和ChI結構域的Fd片段；(4)抗體單臂包含一個'、VH結構域的Fv片段；(5)—個由Vh結構域組成的dAb片段(Ward etal., (1989) Nature341:544-546) ; (6) —個獨立的互補決定區(CDR)。更進一步地，儘管Fv片段的兩個結構域％和'是由不同的獨立基因編碼的，但是可以用基因重組的方式通過合成一個連結區域將它們連接起來，形成由單鏈蛋白內部的Vh和\配對成單價分子，也稱為單鏈 Fv (scFv) (Bird et al.Science242:423-426 (1988) and Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 (1988))。這種單鏈抗體也包括在「抗原結合部位」的範圍內。抗體的一部分，比如Fab和F(ab』 )2片段，可以從全長的抗體通過常規的技術，比如木瓜酶(papain)或者胃蛋白酶(P^sin)酶消化的方法獲得。它們也可以通過下面描述的標準的DNA重組技術獲得。
[0021 ] 抗EGFR抗體及其抗原結合部位
[0022]本發明的抗體可以用來自於人類EGFR突變蛋白的抗原免疫非人類的動物(例如，小鼠、兔子、大鼠或者倉鼠)來製備。這些抗體也可以通過噬菌體展示技術或者其它的已知的抗體製備技術獲得。抗原可以是純化的多聚多肽或者多肽，也可以是在細胞內表達的多聚多肽或者多肽。
[0023]特定疾病相關的突變的EGFR G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 或者 V769L。
[0024]本發明中特異性結合EGFR G719A突變蛋白的抗體可以通過多肽ETEFKKIKVLASGAFGTV(SEQ ID NO:1)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC201301，名稱為雜交瘤細胞株M116。
[0025]本發明中特異性結合EGFR G719C突變蛋白的抗體可以通過多肽ETEFKKIKVLCSGAFGTV(SEQ ID NO:2)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC2012127，名稱為雜交瘤細胞株M32-8。
[0026]本發明中特異性結合EGFR719S突變蛋白的抗體可以通過多肽ETEFKKIKVLSSGAFGTV(SEQ ID NO:3)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC2012118，名稱為雜交瘤細胞株M20-18。
[0027]本發明中特異性結合EGFR D761Y突變蛋白的抗體可以通過多肽EATSPKANKEILYEAYVM(SEQ ID NO:4)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC201303，名稱為雜交瘤 細胞株M121#l。
[0028]本發明中特異性結合EGFR L858R突變蛋白的抗體可以通過多肽KTPQHVKITDFGRAKLLG(SEQ ID NO:5)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC2012125，名稱為雜交瘤細胞株M85-13。
[0029]本發明中特異性結合EGFR L861Q突變蛋白的抗體可以通過多肽ITDFGLAKQLGAEEKE(SEQ ID NO: 6)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC201315，名稱為雜交瘤細胞株M80-14。
[0030]本發明中特異性結合EGFR A839T突變蛋白的抗體可以通過多肽DRRLVHRDLTARNVLVKTP(SEQ ID NO:7)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC201302，名稱為雜交瘤細胞株M118#7。
[0031]本發明中特異性結合EGFR N826S突變蛋白的抗體可以通過多肽IAKGMSYLEDRRLVHR(SEQ ID NO: 8)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC201320，名稱為雜交瘤細胞株M117-10。
[0032]本發明中特異性結合EGFR G863D突變蛋白的抗體可以通過多肽ITDFGLAKLLDAEEKE(SEQ ID NO: 9)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC201304，名稱為雜交瘤細胞株M120。
[0033]本發明中特異性結合EGFR V769L突變蛋白的抗體可以通過多肽EAYVMASLDNPHV(SEQ ID NO: 10)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC201316，名稱為雜交瘤細胞株M122#l。 [0034]本發明進一步包含一種單克隆抗體或者其抗原結合部位，它們包括由保藏號為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCC C201320、CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈胺基酸序列和輕鏈胺基酸序列。在一些操作實例中，本發明中的單克隆抗體或許只包含由保藏號為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCC C201302,CCTCCC201320,CCTCC C201304以及CCTCC C201316的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈胺基酸序列或者輕鏈胺基酸序列。
[0035]在某些操作實例中，本發明的抗EGFR抗體或者抗原結合部位包含一條或者多條由保藏號為 CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCCC2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCC C201320、CCTCC C201304 以及 CCTCCC201316的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈或者CDR的胺基酸序列。在某些操作實例中，抗體或者抗原結合部位包括由保藏號為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCC C201302,CCTCCC201320,CCTCC C201304以及CCTCC C201316的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的所有⑶R1、⑶R2以及⑶R3的胺基酸序列。
[0036]在某些操作實例中，本發明的抗EGFR抗體或者抗原結合部位包含由保藏號為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCC C201320、CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈可變區的胺基酸序列。在特定的操作實例中，抗體或者抗原結合部位同時包含由保藏號為C CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCC C201303,CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCC C201302、CCTCCC201320,CCTCC C201304以及CCTCC C201316的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈可變區的胺基酸序列。
[0037]EGFR的結合特異性[0038]本發明的抗體或者抗原結合部位能夠分別特異性地結合突變型的EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q.EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L蛋白，但是不結合野生型的EGFR蛋白(完全不結合或者在某種程度上不結合)。換言之，該抗體或者抗原結合部位能夠區分突變型和野生型的人類EGFR蛋白。該結合的特異性可以用已知的常用檢測手段進行確認，例如免疫印跡實驗(Westernblot),酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，流式細胞分選，免疫共沉澱，免疫螢光，免疫組織化學染色，表面離子共振(例如BIAC0RE?)或者放射免疫實驗等方法。
[0039]在一些操作實例中，該抗體能夠特異性地優先結合突變型的EGFR蛋白，對於突變型EGFR蛋白的結合能力至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對野生型EGFR蛋白的結合能力。在某些操作實例中，本發明中的抗體或者抗原結合部位特異性結合突變型EGFR蛋白的解離平衡常數Kd至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，至少500倍，或者至少1000倍強於對野生型EGFR蛋白的結合的解離平衡常數(Kd)。解離平衡常數(Kd)可以通過表面離子共振或者流式細胞計數測得。
[0040]本發明的抗體或者抗原結合部位或許只能結合一種EGFR突變蛋白而不能結合其他的 EGFR 突變蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q, EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L 的一種)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFR G719A蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白的結合能力。
[0041]在一些操作實例中，該抗體或許只能結合EGFR G719A蛋白而不結合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFRA839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFRG719A蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R, EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結合能力。
[0042]在一些操作實例中，該抗體或許只能結合EGFR G719C蛋白而不結合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFRA839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFRG719C蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R, EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結合能力。
[0043]在一些操作實例中，該抗體或許只能結合EGFR G719S蛋白而不結合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFRA839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFRG719S蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFRN826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結合能力。
[0044]在一些操作實例中，該抗體或許只能結合EGFR D761Y蛋白而不結合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFRA839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFRD761Y蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR L858R, EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結合能力。
[0045]在一些操作實例中，該抗體或許只能結合EGFR L861Q蛋白而不結合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR A839T、EGFRN826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFR L861Q蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結合能力。
[0046]在一些操作實例中，該抗體或許只能結合EGFR A839T蛋白而不結合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFRL861Q、EGFR N826 S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFRA839T蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結合能力。
[0047]在一些操作實例中，該抗體或許只能結合EGFR N826S蛋白而不結合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFRL861Q、EGFR A839T、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFRN826S蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結合能力。
[0048]在一些操作實例中，該抗體或許只能結合EGFR G863D蛋白而不結合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFRL861Q、EGFR A839T、EGFR N826S以及EGFR V769L)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFRG863D蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S 以及 EGFR V769L)的結合能力。
[0049]在一些操作實例中，該抗體或許只能結合EGFR V769L蛋白而不結合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFRL861Q、EGFR A839T、EGFR N826S以及EGFR G863D)。舉例來說，該抗體特異性地結合EGFRV769L蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強於其對其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S 以及 EGFR G863D)的結合能力。
[0050]在一些操作實例中，本發明中的抗體或者抗原結合部位能夠特異性結合含有SEQID N0:l，2，3，4，5，6，7，8，9或者10的EGFR多肽。在一些操作實例中，本發明的抗體或者抗原結合部位特異性結合保藏號為 CCTCC C20130KCCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCCC20I303,CCTCC C2012125、CCTCC C2013I5,CCTCC C201302,CCTCC C201320,CCTCC C201304或者CCTCC C201316的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的抗原表位或者與其重合的抗原表位。
[0051]生產抗體的重組方法
[0052]本發明包括編碼能夠特異性結合人類突變型的EGFR蛋白但是不能結合野生型EGFR蛋白的單克隆抗體及其抗原結合部位的核酸序列。人類突變的EGFR蛋白包括:G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 以及 V769L。在一些操作實例當中，該核酸分子只編碼單克隆抗體或者抗原結合部位的重鏈或者輕鏈。在另外一些操作實例當中，該核酸分子同時編碼單克隆抗體及其抗原結合部位的重鏈和輕鏈。在一些操作實例中，該核酸分子編碼保藏號為 CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCCC20I303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315、CCTCC C20I302、CCTCC C20I320、CCTCC C201304以及CCTCC C201316的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈、輕鏈、重鏈可變區或者輕鏈可變區。核算可以是純化的核酸分子。
[0053]編碼本發明抗體的核酸分子可以從任何能夠產生該抗體的來源中獲得。例如，核酸可以從保藏號為 CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCC C201320、CCTCC C201304 以及CCTCC C201316的雜交瘤細胞中獲得。分離純化編碼抗體的核酸的方法是一種已知的常見的技術。具體方法可以參見書籍:[美]J.莎姆布魯克D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，第三版，2002年。
[0054]在一些操作實例中，編碼本發明中的單克隆抗體的重鏈的核酸序列可以是由編碼本發明抗體的Vh結構域的核酸序列與一條編碼任意其它來源抗體的重鏈恆定區的組成的同框編碼序列。類似地，一條編碼本發明的抗EGFR蛋白的輕鏈的核酸分子也可以是由編碼本發明抗體的'結構域的核酸序列與一條編碼任意其它來源的抗體的輕鏈恆定區的組成的同框編碼序列。
[0055]在進一步的操作實例中，編碼重鏈可變區(Vh)和/或者輕鏈可變區(')的核酸分子被轉化為全長的抗體編碼基因。在一些操作實例中，編碼Vh或者\結構域的核酸序列被分別通過插入到已經含有重鏈恆定區(Ch)或者輕鏈恆定區(CJ的表達載體中去的方法構建為一個全長抗體基因。這樣構建的全長抗體基因的Ch的片段與Q的片段在載體內部相連接，並且/或者編碼Vh的片段與編碼\的片段在載體內部相連接。在另外的操作實例中，編碼Vh以及/或者\結構域的核酸序列分別通過核酸重組技術被連接到一個編碼Ch的片段和/或者編碼Q的片段上面。編碼人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恆定結構域的基因是已知的。具體參見著作 Kabat et al., Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5th ed., NIH Publ.N0.91-3242，1991。編碼全長重鏈和/或者輕鏈的核酸分子可以在被引入和純化EGFR抗體的細胞株中表達。
[0056]可以使用核酸分子實現重組表達大量的EGFR抗體。也可以用核酸分子來生產嵌合抗體，雙特異性結合抗體，單鏈抗體，免疫粘附劑，雙頭抗體，突變抗體以及抗體衍生物。如果該核酸分子來自於非人類、非轉基因動物，該核酸分子也可能被用來實現抗體的人源化。
[0057]本發明還包括插入有編碼抗體重鏈、輕鏈或者同時編碼本發明的EGFR抗體或者其抗原結合部位的核酸分子。該載體可能適合於在原核宿主細胞,例如酵母細胞、昆蟲細胞或者哺乳動物細胞中表達本發明中的抗體或者其抗原結合部位。
[0058]常見的哺乳動物細胞包括很多永生細胞系都可以用來作為表達宿主。這些細胞系包括但不限於:中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，NSO細胞，SP2細胞，HEK293T細胞，293Freestyle(Invitrogen公司)，NIH3T3細胞，HeLa細胞，幼倉鼠腎細胞(BHK)，非洲綠猴腎細胞，人類肝癌細胞(如HepG2)，以及A549細胞。其它可以用於表達的細胞有昆蟲細胞，包括sf9和sf21細胞。植物宿主細胞包括:菸草，擬南芥，浮萍，玉米，小麥，番茄，水稻來源的細胞。細菌宿主細胞包括大腸桿菌和放線菌。酵母宿主包括裂殖酵母，釀酒酵母，畢赤酵母。
[0059]利用不同的細胞系在不同的培養條件下，或者利用轉基因動物表達的抗體能夠有不同的糖基化模式。但是不論其糖基化模式是怎樣的，所有由所述的核酸或者含有所述核酸的序列編碼的抗體都是本發明的內容。
[0060]嵌合與人源化抗體
[0061]這裡所說的嵌合抗體，其特徵在於有來自於兩種或者更多種不同的抗體的結構域組成的抗體。例如，嵌合抗體的可變區結構域可能是來自於保藏號為CCTCC C201301、CCTCC C2012127,CCTCC C2012118,CCTCC C20I303,CCTCC C2012125,CCTCC C201315,CCTCCC201302,CCTCC C2013 20,CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細胞產生的單克隆抗體，但是其恆定區可能是來自於人類抗體。這種嵌合抗體在作為人類的治療藥物時具有較少的免疫原性。
[0062]在一些操作實例中，本發明抗體的人源化抗體是一種將本發明中的來源於老鼠的抗體的CDR結構域插入到人類受體抗體中去。因此，嵌合抗體的FR和恆定區域來自於人類。這種含有人類FR區域的人源化EGFR抗體在人類身上比只是恆定區來自於人類的嵌合抗體具有更小的免疫原性。在一些操作實例中，人源化抗體的CDR序列可以是來自於保藏號為 CCTCC C20130KCCTCC C2012127,CCTCC C2012118,CCTCC C201303,CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCC C201302,CCTCC C201320,CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細胞產生的單克隆抗體。抗體人源化的方法是一種已知的成熟技術。
[0063]修飾與標籤抗體
[0064]本發明還包括以上所描述的抗EGFR單克隆抗體或其抗原結合部位被至少一種額外分子或集團修飾而成的抗體。該修飾可以是用於純化或者檢測該抗體的，以及/或者增強其治療效果。例如，抗體或者抗原結合部位可以連接到一種檢測試劑、標籤、細胞毒性試劑、藥物分子以及/或者蛋白或多肽，以便接到該抗體或者其抗原結合部位與其它一種分子(例如親和素核心區域，或者多聚組氨酸標籤)的結合。常見的檢測標籤包括但不限於:放射性同位素(例如125I，131I，35S or3H)，螢光複合物(例如螢光素，二氯三嗪氨螢光素，異硫氰酸螢光素，羅丹明，5- 二甲氨基-1-萘磺醯氯苯，螢光素PE，稀土發光物，傘形酮，丹磺醯氯)，以及酶(例如辣根過氧化物酶，O-半乳糖苷酶，β -半乳糖苷酶，螢光素酶，鹼性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，乙醯膽鹼酯酶)。在進一步的操作實例中，本發明所述抗體或者其部分可以被標記生物素，或者已經證明可以被另一個報告分子(例如亮氨酸拉鏈配對區域，二抗結合位點，金屬集合結構域，表位標籤)識別的多肽表位。在更進一步的操作實例中，任意一種抗體或者其部分可以利用聚乙烯醇(PEG)，甲基或乙基或者糖基經行修飾。
[0065]抗EGFR抗體或者其抗原結合部位的診斷用途
[0066]本發明的一個方面是使用所述的抗EGFR抗體或者其抗原結合部位作為一種癌症診斷試劑。癌症指的是任意一種惡性腫瘤，包括任何階段和級別的癌症。可能用本發明的單克隆抗體診斷的癌症具體例子包括但是不限於:肺癌，非小細胞肺癌，直腸癌，結腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，膠質瘤，腦癌。
[0067]診斷包括檢測癌症的發展程度，確認癌症的存在，或者癌症的分型或分類。在一些操作實例中，本發明可以提供一種診斷目標中癌症的方法，其步驟包括:用本發明所述的抗EGFR單克隆抗體接觸來自於檢測目標的生物學樣本；檢測抗體或者其部分與樣本是否結合；如果抗體與樣本存在結合則表明被檢測主體是癌症，或者存在發展成癌症的風險。檢測的樣本可以是血液，血清，淋巴，組織(例如穿刺或者甲醛和石蠟固定的包被切片)。
[0068]抗體結合到樣本上與否可以用常見的的已知技術檢測，包括但是不限於:ELISA，RIA,流式細胞，免疫細胞化學，免疫組織化學，免疫螢光，免疫印跡，或者免疫共沉澱。抗EGFR抗體或者其部分也可以用一種可以檢測的標記物直接標記。如果抗體沒有被標記，則可以使用一種能夠結合EGFR抗體並能夠被檢測到的二抗或者其它分子。根據已有的常識，特定的二抗能夠特異性地結合特定的種類和亞型的一抗。例如，如果抗EGFR抗體是一種小鼠IgG，則二抗必須是一種標記的抗小鼠IgG的抗體。其它能夠結合抗體的分子包括但是不限於Protein A和Protein G。他們都有多種商業化的形式。例如來自Pierce公司的Protein A和Protein G。適合用來標記抗體或者二抗的分子包括但是不限於:酶,輔基,突光材料，發光材料，磁性材料以·及放射性材料(見上文描述)。在一些操作實例中，本發明的抗體或者其部分可以提供在一種包含檢測抗體結合試劑的試劑盒中。
[0069]抗EGFR抗體或者其部分還可以用來檢查癌症病人的發展進程，然後決定採取哪一種治療治療方案。例如在治療方案的伴隨檢測中。醫務人員可能根據EGFR突變的檢測結果來決定對特定病人最優的治療方案。治療方案可以是手術,放射性治療,藥物治療(包括化學治療與靶向治療)，或者以上多種治療方式的結合。舉例來說，本發明包括一種治療癌症病人的方法，其特徵在於包括:檢查來自病人的生物樣本是否帶有EGFR G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 或者 V769L 突變；如果存在某種突變則對病人給予EGFR抑制劑治療。EGFR抑制劑可能是一種反義RNA (antisense RNA),小幹涉RNA (siRNA)，微小RNA (miRNA)藥物，抗EGFR單克隆抗體藥物。在給予病人抗EGFR物的靶向治療之前檢測是否存在EGFR突變對於治療十分有意義。
[0070]抗EGFR抗體及其抗原結合部位的治療應用
[0071]本發明同樣提供一種抗體及其抗原結合部位作為治療性藥物的應用包括用本發明的抗體或者其部分作為治療人類的應用，以及使用抗體或者其部分作為製造用於治療人類癌症藥物的應用。這些人類癌症包括直腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。詳細的癌症種類亦可參閱上文的描述。[0072]在一些操作實例中，醫務人員給予能夠對特定疾病達到有效劑量的本發明的抗體或者部分，一般是一種嵌合的或者人源化的抗體或者部分，從而實現減緩或者治療該疾病，防止癌症轉移或者進一步發展。抗體的給藥方式可以是例如:注射或者浸注。抗體或者部分的劑量可以由醫務人員決定，大致範圍為0.1到100毫克/公斤體重，更優地為0.5到50毫克/公斤體重，更優地為I到20毫克/公斤體重，更優地為I到10毫克/公斤體重。治療的效果可以通過監測例如腫瘤體積縮小的程度來說明。
[0073]本發明的治療性藥物的成分除了所述的單克隆抗體或者其部分以外，可能包括一種可接受的藥劑載體。可接受的藥劑載體其特徵在於，可以是一種溶劑，分散劑，包被劑，抗菌劑和抗真菌劑，滲透平衡劑和吸附延緩劑，其特徵是具有生理兼容性。在很多情況下，優先的載體包括滲透平衡劑，例如糖類，多聚醇如甘露醇，山梨醇，氯化鈉組分。其它可以接受的藥劑材料包括溼潤劑或者少量的輔劑，例如溼潤劑，乳化劑，保護劑或緩衝液，它們能夠增加抗體的保質期或者效果。
[0074]在一些操作實例中，本發明的抗EGFR抗體或者其部分被與其它一種和/或者多種治療藥物，診斷藥物，或者預防劑混合在一起。治療藥物包括但不限於具有不同細微特異性差異的結合不同靶標的抗EGFR抗體，以及EGFR抑制劑，例如抑制劑可以是西妥昔單抗(cetuxmab)，中白尼單抗(panitumumab)，Necitumumab, Nimotuzumab,吉非替尼(gefitinib),厄洛替尼(erlotinib)，拉帕替尼(Iapatinib),凡德他尼(Vandetanib),PF299804, R05083945, ABT-806，AP-26113，Afatinib(BIBW2992), Canertinib (C1-1033),Neratinib (HK1-272)，CP-724714，TAK-285，AST-1306，ARRY334543, Lapatinib, Arry-380,Dacomitinib (PF-299804)，WH1-P154，Desmethyl Erlotinib (CP-473420), DesmethylErlotinib (0S1-420)，AZD8931, AEE788 (NVP-AEE788)，Pelitinib (EKB-569)，CUDC-101,WZ804, WZ4002, WZ3146, XL647, PD-153035， PD-174265， PD158780, BMS-599626(AC480)，Lavendustin A, Lavendustin C, BIBU-1361, Hypericin, BIBX-1382, DAPH, ErbstatinAnalog, JNJ28871063, R0106-9920, GW2974, GW583340,PD-153035,PD-158780,PD-168393，Tyrphostin AG-183, Tyrphostin AG-99, Tyrphostin AG-825, Tyrphostin B42 (AG-490),Tyrphostin AG-494, Tyrphostin AG-555, Tyrphostin AG-527, Tyrphostin AG-528,Tyrphostin AG-835, TyrphostinAG-1478, Tyrphostin RG-14620, Daphnetin, BPIQ,BPIQ-1，BPIQ-1I，CL-387, 785，`EGFR Inhibitor (K00598a), LFM-Al2,Pelitinib,PKC-412，PP3 (5334-30-5)，SU5402, HDS029, WH1-P154, TAK165, Vatalanib。
[0075]本發明的藥劑組成可能含有一種「治療有效劑量」或者「預防有效量」的本發明的抗體或者抗原結合部位。「治療有效劑量」是指在一定的療程和劑量下，要達到有治療效果的有效藥物量。抗體及其抗原結合部分的治療有效劑量可能根據多種因素，例如疾病進程，年齡，性別，體重，以及抗體或者抗體部分能夠在個體內所引起的反應能力而有所不同。治療有效劑量也包含了該抗體或者抗原結合部位的有利作用強於任何毒性或者不利作用的意思。「預防有效量」是指在一定的療程和劑量下，要達到有預防效果的有效藥物量。通常由於預防藥物都是在疾病發生之前或者疾病早期使用，因此預防有效量可能會小於治療有效量。
[0076]除非特別聲明，這裡所用的所有的技術或者科學屬於都與一般熟知本發明領域的人員的常識相一致。可效仿的方法和材料在下面將進行詳細描述，儘管與這裡描述的相似或者同樣的方法和材料也可以用來檢驗本發明。所有的參考文獻都詳細列出。儘管引用了大量的文獻，但是這些引用並不表明承認任何文獻是該領域的常識。本專利描述過程中使用的「包含」 「包括」應當被理解為表明包含所述的完整對象或者群體對象，而不是排除任何其他的對象或者群體對象。材料、方法和實例僅是為了說明本發明的技術方案，並非限制。
[0077]以下實例是為了描述本發明的方法與材料。對描述的條件或參數適當的修改或者同等替換通常符合本領域技術人員的明顯常識，因此依然屬於本發明的精神和範圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0078]圖1顯示保藏號為CCTCC C201301的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR G719A蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR G719A蛋白；
[0079]圖2顯示保藏號為CCTCC C2012127的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR G719C蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR G719C蛋白；[0080]圖3顯示保藏號為CCTCC C2012118的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR G719S蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR G719S蛋白；
[0081]圖4顯示保藏號為CCTCC C201303的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR D761Y蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR D761Y蛋白；
[0082]圖5顯示保藏號為CCTCC C2012125的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR L858R蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR L858R蛋白；
[0083]圖6顯示保藏號為CCTCC C201315的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR L861Q蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR L861Q蛋白；
[0084]圖7顯示保藏號為CCTCC C201302的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR A839T蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR A839T蛋白；
[0085]圖8顯示保藏號為CCTCC C201320的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR N826S蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR N826S蛋白；
[0086]圖9顯示保藏號為CCTCC C201304的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR G863D蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR G863D蛋白；
[0087]圖10顯示保藏號為CCTCC C201316的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR V769L蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型EGFR V769L蛋白；
[0088]圖11顯示保藏號為CCTCC C201301的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR G719A蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR G719A蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結合，並且只在表達EGFR G719A蛋白的細胞(下面)中出現；
[0089]圖12顯示保藏號為CCTCC C2012127的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR G719C蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR G719C蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結合，並且只在表達EGFR G719C蛋白的細胞(下面)中出現；
[0090]圖13顯示保藏號為CCTCC C2012118的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR G719S蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR G719S蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結合，並且只在表達EGFR G719S蛋白的細胞(下面)中出現；
[0091]圖14顯示保藏號為CCTCC C201303的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR D761Y蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR D761Y蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結合，並且只在表達EGFR D761Y蛋白的細胞(下面)中出現；
[0092]圖15顯示保藏號為CCTCC C2012125的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR L858R蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR L858R蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR 蛋白的結合，並且只在表達EGFR L858R蛋白的細胞(下面)中出現；
[0093]圖16顯示保藏號為CCTCC C201315的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR L861Q蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR L861Q蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結合，並且只在表達EGFR L861Q蛋白的細胞(下面)中出現；
[0094]圖17顯示保藏號為CCTCC C201302的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR A839T蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR A839T蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結合，並且只在表達EGFR A839T蛋白的細胞(下面)中出現；
[0095]圖18顯示保藏號為CCTCC C201320的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR N826S蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR N826S蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結合，並且只在表達EGFR N826S蛋白的細胞(下面)中出現；
[0096]圖19顯示保藏號為CCTCC C201304的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR G863D蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR G863D蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結合，並且只在表達EGFR G863D蛋白的細胞(下面)中出現；
[0097]圖20顯示保藏號為CCTCC C201316的細胞株產生的抗體特異性結合EGFR V769L蛋白，卻不能結合野生型的EGFR蛋白的免疫螢光實驗圖譜。綠色螢光蛋白(GFP)信號分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR V769L蛋白(下面)的表達。紅色螢光信號能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結合，並且只在表達EGFR V769L蛋白的細胞(下面)中出現。【具體實施方式】
[0098]實施例1
[0099]特異性結合EGFR突變蛋白的單克隆抗體的生產
[0100]含有EGFR突變蛋白胺基酸序列的多肽通過合成獲得。詳細的多肽序列在下表中列出，相對野生型蛋白的突變胺基酸加下劃線標示:
[0101]表1突變的EGFR多肽
[0102]
EGFR突變~j多肽序列(突變胺基酸加下劃線)

G719AETEFKKIKVLASGAFGTV(SEQ ID NO:1)

G719CETEFKKIKVLCSGAFGTV(SEQ ID NO:2)

G719SETEFKKIKVLSSGAFGTV(SEQ ID NO:3)

D761YEATSPKANKEILYEAYVM(SEQ ID NO:4)

L858RKTPQHVKITDFGRAKLLG(SEQ ID NO:5)

L861QITDFGLAKQLGAEEKE(SEQ ID NO:6)

A839TDRRLVHRDLTARNVLVKTP(SEQ ID NO:7)

N826SIAKGMSYLEDRRLVHR(SEQ ID NO:8)

G863DITDFGLAKLLDAEEKE(SEQ ID NO:9)

V769LEAYVMASLDNPHV(SEQ ID NO:10)
[0103]每條合成的多肽都被偶聯到琥拍醯化鑰孔慽血蘭蛋白(keyhole Iimpethemocyanin,KLH)上，用來免疫小鼠，並利用弗氏佐劑混合增強免疫效果。將用以上多肽免疫的抗EGFR G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R和L861Q小鼠的脾臟細胞分別與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞通過聚乙烯醇(PEG)介導融合。用ELISA實驗篩選陽性克隆。陽性克隆細胞注射到相同品系的小鼠腹腔，產生腹水。從腹水中純化抗體。
[0104]通過用含有突變的EGFR蛋白的多肽免疫小鼠產生的雜交瘤細胞保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC，湖北省武漢市武漢大學，430072).雜交瘤細胞的名稱和保藏編號在下表中列出。
[0105]表2抗EGFR雜交瘤細胞株 以及保藏編號
[0106]
抗體及其特異性j保藏編號
Ant1-EGFR G719A~CCTCC C201301
【權利要求】
1.特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體，其特徵在於，不能識別EGFR野生型蛋白的單克隆抗體，或者抗原結合蛋白，該單克隆抗體特異性識別的EGFR突變蛋白包括:第719位的甘氨酸(Glycine，G)突變為丙氨酸(Alanine，A)的突變蛋白(EGFR G719A);第719位的甘氨酸(G)突變為半胱氨酸(C)的突變蛋白(EGFR G719C);第719位的甘氨酸(Glycine, G)突變為絲氨酸(Serine，S)的突變蛋白(EGFR G719S);第761位的天冬氨酸(Asparatic Acid, D)突變為酪氨酸(Tyrosine, Y)的突變蛋白(EGFR D761Y);第 858 位的亮氨酸(Leucine，L)突變為精氨酸(Arginine，R)的突變蛋白(EGFR L858R);第861位的亮氨酸(Leucine, L)突變為穀氨醯胺(Glutamine, Q)的突變蛋白(EGFR L861Q);第839位的丙氨酸(Alanine，A)突變為蘇氨酸(Threonine, T)的突變蛋白(EGFR A839T);第826位的天冬醯胺(Asparagine, N)突變為絲氨酸(Serine, S)的突變蛋白(EGFR N826S);第863位的甘氨酸(Glycine,G)突變為天冬氨酸(Asparatic Acid,D)的突變蛋白(EGFR G863D);第769位的纈氨酸(Valine, V)突變為谷亮氨酸(Leucine，L)的突變蛋白(EGFR V769L)。
2.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID NO:1的EGFR蛋白。
3.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID N0:2的EGFR蛋白。
4.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID N0:3的EGFR蛋白。
5.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID N0:4的EGFR蛋白。
6.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID N0:5的EGFR蛋白。
7.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID N0:6的EGFR蛋白。
8.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID N0:7的EGFR蛋白。
9.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID N0:8的EGFR蛋白。
10.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID N0:9的EGFR蛋白。
11.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，特異性結合於含有多肽序列SEQ ID NO: 10的EGFR蛋白。
12.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，包括抗原結合部位，由一條重鏈和一條輕鏈組成；重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的胺基酸序列分別是由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCC C20I303,CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCCC201302,CCTCC C201320,CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的胺基酸序列決定。
13.根據權利要求12所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，包括抗原結合部位，所述雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體重鏈和輕鏈的組成分別包含重鏈和輕鏈的可變區域。
14.根據權利要求12所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，包括抗原結合部位，包含有所述的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈胺基酸序列。
15.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體，其特徵在於，包括抗原結合部位，是一種人源化或者嵌合型抗體。
16.根據權利要求2至13及15任一項所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，所述單克隆抗體是一種IgG。
17.根據權利要求1所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體，其特徵在於，保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的保藏號為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCCC2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCCC201320、CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的十株雜交瘤細胞。
18.特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，該單克隆抗體或者抗原結合部位的藥物，以及可以藥用的載體。
19.特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，一種診斷EGFR突變的診斷試劑盒，其組成含有權利要求1至14所述的任意一種單克隆抗體或者抗原結合部位。
20.特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，一種診斷腫瘤的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)用權利要求1至14所述的任意一種單克隆抗體或者抗原結合部位接觸需要檢測的生物樣本； (2)檢測單克隆抗體或者抗原結合部位是否與樣本發生結合，而結合指示樣本存在癌症或者發展成癌症的風險。
21.根據權利要求20所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，所述診斷方法中，常見的癌症類型包括:肺癌，非小細胞肺癌，直腸癌，結腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，膠質瘤，腦癌。
22.特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，一種治療癌症病人的方法，其特徵在於: (1)檢測來自於病人的生物學樣品中是否含有EGFRG719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 或者 V769L 突變； (2)如果存在上述突變，對該病人給予EGFR蛋白抑制劑的治療。
23.根據權利要求22所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，所述治療方法中，EGFR蛋白抑制劑包括:反義RNA (antisense RNA)，小幹涉RNA (siRNA)，微小RNA (miRNA)藥物，抗EGFR單克隆抗體藥物。EGFR抑制劑可以是西妥昔單抗(cetuxmab)，中白尼單抗(panitumumab)，Necitumumab, Nimotuzumab,吉非替尼(gefitinib),厄洛替尼(erlotinib)，拉帕替尼(Iapatinib),凡德他尼(Vandetanib),PF299804, R05083945, ABT-806，AP-26113，Afatinib (BIBW2992), Canertinib (C1-1033),Neratinib (HK1-272)，CP-724714，TAK-285，AST-1306，ARRY334543, Lapatinib, Arry-380,Dacomitinib(PF-299804)， WH1-P154, Desmethyl Erlotinib(CP-473420), DesmethylErlotinib (0S1-420)，AZD8931, AEE788(NVP-AEE788)，Pelitinib(EKB-569)，CUDC-1Ol,WZ804, WZ4002, WZ3146, XL647, PD-153035, PD-174265， PD158780, BMS-599626(AC480)，Lavendustin A, Lavendustin C, BIBU-1361, Hypericin, BIBX-1382, DAPH, ErbstatinAnalog, JNJ28871063,RO 106-9920,GW2974,GW583340,PD-153035,PD-158780，PD-168393，Tyrphostin AG-183, Tyrphostin AG-99, Tyrphostin AG-825, Tyrphostin B42 (AG-490),Tyrphostin AG-494, Tyrphostin AG-555, Tyrphostin AG-527, Tyrphostin AG-528,Tyrphostin AG-835, Tyrphostin AG-1478, Tyrphostin RG-14620, Daphnetin, BPIQ,BPIQ-1，BPIQ-1I，CL-387, 785，EGFR Inhibitor (K00598a),LFM-Al2,Pelitinib,PKC-412，PP3 (5334-30-5)，SU5402, HDS029, WH1-P154, TAK165, Vatalanib0
24.根據權利要求22所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，所述治療癌症病人的方法，給予病人含有權利要求11的組成成分的藥物。
25.根據權利要求22或24所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，所述治療癌症病人的方法中，常見的癌症類型包括:直腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。
26.特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，將權利要求1至15的單克隆抗體或者抗原結合部位用於癌症治療藥物的生產過程，常見的癌症種類包括:黑色素癌，直腸癌，甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，或者造血組織癌。
27.特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，一種純化的核酸分子，包含能夠編碼權利要求1至15所述單克隆抗體的重鏈或者其一個抗原結合部位，或者能夠編碼輕鏈或者其一個抗原結合部位，或者能夠同時編碼二者的核酸序列。
28.根據權利要求27所述的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，一種載體分子，含有可以聯繫到該核酸分子的表達調控序列。
29.根據權利要求27的特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，一種宿主細胞，含有該核酸分子。
30.特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，包含權利要求1至14的一種細胞株，其含有所述的單克隆抗體或者其抗原結合部位。
31.特異性識別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特徵在於，一種生產單克隆抗體或者其抗原結合部位的方法，所生產的抗體或者抗原結合部位特異性結合人類突變的EGFR蛋白，而不結合人類野生型的EGFR蛋白，其步驟包括: (1)根據權利要求29，在適當的條件下培養該宿主細胞，或者根據權利要求30，在釋放的條件下培養該細胞株； (2)提純所述的抗體部分。
【文檔編號】A61K45/00GK103626871SQ201310137856
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年4月19日 優先權日:2013年4月19日
【發明者】黃文俊 申請人:武漢紐斯特生物技術有限公司