一種基於多重PCR的人線粒體全基因組高通量測序方法與流程
2023-05-17 21:09:52 3
本發明涉及生物檢測領域，更具體地涉及人線粒體全基因組高通量測序方法。
背景技術：
線粒體是真核細胞中重要的細胞器，在一些生物進程中有著至關重要的作用，例如氧化應激、代謝、炎症、自噬和凋亡等。儘管線粒體中大多數蛋白質都是由核DNA編碼的，但是線粒體DNA(mtDNA)編碼的蛋白質也發揮著至關重要的作用。
在人類的每一個細胞中，有1000到10000個線粒體存在；在每一個線粒體中又有2-10個線粒體DNA(mtDNA)拷貝。人的線粒體DNA是一個雙鏈閉合環狀DNA，全長16569bp。它含有編碼區和非編碼區，其中編碼區編碼13個蛋白質、22個tRNA和2個rRNA，非編碼區有一個複製起始區和一些轉錄調節因子。
線粒體DNA有許多特點，例如多拷貝，沒有內含子，母系遺傳，進化率高，高度異質性，沒有基因重組等等。線粒體DNA常用於研究遺傳進化，也用來輔助法醫學鑑定。線粒體功能異常會導致一系列疾病，例如帕金森綜合症、糖尿病、阿爾茲海默症候群，也有一些研究發現線粒體DNA突變和一些癌症相關。
到目前為止，已有不少方法可以用來對線粒體DNA進行測序。傳統的富集線粒體DNA的方法是氯化銫密度梯度離心法，該方法可以獲得比較純的線粒體DNA，但該方法費時費力，所需的樣本量非常大，且對樣本的要求較高。還有其他一些方法比如雜交捕獲、長片段PCR，雜交捕獲富集線粒體DNA的方法價格昂貴，操作繁瑣，而長片段PCR方法操作簡單，但對樣本完整性要求比較高。同時也有一些利用多重PCR進行線粒體測序的方法，但已有的方法在較高的且各位點較均一的測序深度下，不能保證線粒體全覆蓋。例如Lakshmi Chaitanya,etc建立的一種利用多重PCR對線粒體DNA進行測序的方法，他們僅在50×的時候能獲得100％mtDNA覆蓋率。
為了檢測線粒體中的低頻突變，需要進行深度測序，即在保證序列覆蓋度的同時，增加測序深度。因此，本領域迫切需要開發能夠深度測序的線粒體DNA測序方法。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種快速、簡單、經濟的線粒體DNA測序方法。該方法是以多重PCR為基礎，富集擴增線粒體DNA，然後對其進行二代測序。
在本發明的第一方面，提供了一種用於線粒體全基因組測序的引物集，所述引物集包括引物子集p1，引物子集p2，引物子集p3和引物子集p4，其中所述各引物子集中含有的引物是不同的，並且所述4個引物子集的全部擴增產物完全覆蓋線粒體DNA；
並且，所述的引物子集p4包括序列如SEQ ID NO.:1-8所示的引物。
在另一優選例中，所述線粒體為人線粒體。
在另一優選例中，所述的引物子集p1，引物子集p2和引物子集p3中的每一個引物子集各自地包括20-70個引物，較佳地30-60個引物。
在另一優選例中，引物子集p1的擴增產物互不重疊(任二個擴增產物互不重疊)。
在另一優選例中，引物子集p2的擴增產物互不重疊。
在另一優選例中，引物子集p3的擴增產物互不重疊。
在另一優選例中，所述引物集的擴增產物之間有重疊區域。
在另一優選例中，用某一引物子集產生的任一個擴增產物與其他子集的一個或多個擴增產物存在重疊區。
在另一優選例中，用引物子集p1產生的任一個擴增產物與其他子集(即引物子集p2，引物子集p3和引物子集p4)的一個或多個擴增產物存在重疊區。
在另一優選例中，用引物子集p2產生的任一個擴增產物與其他子集(即引物子集p1，引物子集p3和引物子集p4)的一個或多個擴增產物存在重疊區。
在另一優選例中，用引物子集p3產生的任一個擴增產物與其他子集(即引物子集p2，引物子集p1和引物子集p4)的一個或多個擴增產物存在重疊區。
在另一優選例中，用引物子集p4產生的任一個擴增產物與其他子集(即引物子集p2，引物子集p3和引物子集p1)的一個或多個擴增產物存在重疊區。
在另一優選例中，所述引物子集p1、引物子集p2和引物子集p3的擴增產物覆蓋引物子集p4的擴增產物未覆蓋的區域。
在另一優選例中，所述引物集中包含的引物所對應的擴增產物的長度為200-400bp。
在另一優選例中，所述的引物子集p1包括序列如SEQ ID NO.:9-52所示的引物。
在另一優選例中，所述的引物子集p2包括序列如SEQ ID NO.:53-98所示的引物。
在另一優選例中，所述的引物子集p3包括序列如SEQ ID NO.:99-146所示的引物。
在另一優選例中，所述的引物集用於人線粒體全基因組高通量測序。
在另一優選例中，所述的引物集用於亞洲人群的線粒體全基因組高通量測序。
在另一優選例中，所述的測序為深度測序。
在另一優選例中，所述的深度測序是指測序深度≥1000倍，較佳地≥3000倍，更佳地≥6000倍。
在本發明的第二方面，提供了一種PCR擴增體系，所述的擴增體系包括：用於擴增的緩衝體系以及本發明第一方面所述的引物集；
其中，所述緩衝體系包括第一緩衝體系、第二緩衝體系、第三緩衝體系、第四緩衝體系；
所述的引物集包括引物子集p1、引物子集p2、引物子集p3和引物子集p4；
並且引物子集p1位於所述第一緩衝體系中，引物子集p2位於所述第二緩衝體系中,引物子集p3位於所述第三緩衝體系中,而引物子集p4位於所述第四緩衝體系中。
在本發明的第三方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒中包括一個或多個容器，和位於所述容器中的本發明第一方面所述的引物集。
在另一優選例中，所述的試劑盒用於人線粒體全基因組高通量測序。
在另一優選例中，所述的測序為深度測序。
在另一優選例中，所述的試劑盒中包括第一容器，和位於所述第一容器中的引物子集p1。
在另一優選例中，所述的試劑盒中包括第二容器，和位於所述第二容器中的引物子集p2。
在另一優選例中，所述的試劑盒中包括第三容器，和位於所述第三容器中的引物子集p3。
在另一優選例中，所述的試劑盒中包括第四容器，和位於所述第四容器中的引物子集p4。
在另一優選例中，所述的引物子集p1中，序列如SEQ ID NO.:9、10所示的引物的濃度C1與序列如SEQ ID NO.:11-52所示的引物的濃度C2之比C1/C2為1.5。
在另一優選例中，所述的引物子集p2中，序列如SEQ ID NO.:53、54、67-70、75-82、87、88、95、96所示的引物的濃度C3與序列如SEQ ID NO.:55-66、71-74、83-86、89-94、97、98所示的引物的濃度C4之比C3/C4為1.5。
在另一優選例中，所述的引物子集p3中，序列如SEQ ID NO.:103、104、115-120、123-126、131-134、137、138、141、142所示的引物的濃度C5與序列如SEQ ID NO.:99-102、105-114、121、122、127-130、135、136、139、140、143-146所示的引物的濃度C6之比C5/C6為1.5。
在另一優選例中，所述的濃度C1、C3、C5為40nM。
在另一優選例中，所述的引物子集p4中引物的濃度為50nM。
在另一優選例中，所述的試劑盒還含有用於擴增的試劑。
在另一優選例中，所述用於擴增的試劑包括緩衝劑、dNTP、和擴增酶。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括使用說明書。
在本發明的第四方面，提供了一種人線粒體全基因組高通量測序的方法，所述方法包括步驟：
(a)提供一待測的基因組DNA樣品；
(b)利用本發明第一方面所述的引物集，對待測的基因組DNA樣品進行PCR擴增，從而獲得含擴增產物的混合物；
(c)對得到的擴增產物進行測序分析，從而完成人線粒體全基因組高通量測序。
在另一優選例中，在步驟(b)中，分別利用引物子集p1，引物子集p2，引物子集p3和引物子集p4，對待測的基因組DNA樣品進行PCR擴增，分別獲得第一擴增產物，第二擴增產物，第三擴增產物，第四擴增產物。
在另一優選例中，在步驟(b)中，將第一擴增產物，第二擴增產物，第三擴增產物，第四擴增產物等體積混合，從而獲得所述的擴增產物的總混合物。
在另一優選例中，所述的PCR為多重PCR。
在另一優選例中，所述的方法是非診斷和非治療性方法。
在另一優選例中，所述的方法是體外方法。
在另一優選例中，在步驟(a)中，所述的待測DNA樣品提取自選自下組的樣本：血液、毛髮、和唾液。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
附圖說明
圖1顯示了本發明人線粒體測序方法的引物分布情況。
圖2顯示了每一個樣本測序得到的鹼基數。
圖3顯示了每一個擴增子的平均測序深度。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入地研究，首次意外地發現一種特異性擴增人線粒體的引物集，以及利用所述引物集的測序方法。實驗表明，利用本發明的引物集進行測序，在測序深度為6000×時，只有兩樣樣本的序列覆蓋度為99.9％，其餘均為100％。本發明的方法簡單、快捷，對樣本質量要求不高，測序結果準確可靠，可以實現對線粒體全基因組的深度測序，用於線粒體中低頻突變的檢測。
本發明的方法
本發明提供了一種基於多重PCR的人類線粒體全基因組高通量測序方法，本發明共設計了73對PCR引物，PCR擴增產物長度大多為250bp左右，相鄰引物的擴增產物之間都有重疊區域，確保所有的擴增產物能夠完全覆蓋線粒體DNA(見圖1)。本發明的方法將73對PCR引物分成四組，詳見圖1，其中藍色為第一組引物(Set1，SEQ ID NO.:9-52)，粉色為第二組引物(Set2，SEQ ID NO.:53-98)，綠色為第三組引物(Set3，SEQ ID NO.:99-146)，橙色為第四組引物(Set4，SEQ ID NO.:1-8)，並適當調整每對引物的濃度，以保證個樣本的測序深度基本一致。具體引物信息見表1.
表1PCR引物信息
本發明採用73對引物對線粒體DNA進行多重PCR擴增建庫，然後用illumina HiSeq X 10儀器進行上機測序。整個建庫過程簡單、快捷，對樣本質量要求不高，且所需的樣本量較少，得到的測序結果準確可靠。本發明的方法可以保證序列覆蓋度的同時，增加測序深度，進行深度測序，用於線粒體中低頻突變的檢測。
線粒體突變
線粒體是細胞中提供能量的重要細胞器，在生物體能量轉換和新陳代謝中處於核心地位。人體細胞中線粒體DNA(脫氧核糖核酸)的突變或缺失會引起氧化磷酸化和能量供應的異常，並進而引起近150種人類疾病的發生，比如心血管疾病、糖尿病、耳聾、腫瘤、神經退行性疾病及衰老等。
線粒體DNA的變異包括大片段的插入或缺失，小片段的插入或缺失，點突變。這些變異既可以出現在編碼區，也可以出現在非編碼區。體內活性氧(ROS,reactive oxygen species)的異常增多是引起線粒體DNA鹼基變異或點突變的主要原因。線粒體DNA上的某些區域由於受到活性氧引起的自由基的持續攻擊，產生點突變的頻率明顯高於其它區域，則稱之為突變熱點。比如亮氨酸轉運RNA基因的點突變就是線粒體DNA的一個病原學突變熱點。研究表明，一些編碼基因的點突變與某些特定的疾病有明顯的相關性。比如，在色素性視網膜炎、一些神經疾病和Leigh症候群中，均檢測到ATP合成酶中的亞基6上的點突變。並且，這些疾病的嚴重程度與該基因的點突變頻率密切相關。疾病發生早期線粒體DNA的低頻突變已經發生，但目前尚無有效的高通量檢測方法。
線粒體基因組與核基因組在遺傳上的重要不同是：在一個細胞中，核基因組只有兩個拷貝，一個來自父親，一個來自母親；而線粒體基因組幾乎完全來自母親，並且有上千個拷貝(通常一個細胞有1000-2000個線粒體，一個線粒體有2-10個線粒體DNA拷貝)。這種拷貝數的不同也導致了在DNA突變檢測上的策略不同。對於基因組上某一位置的點突變只可能出現三種情況：均無突變，有一個拷貝發生突變，或者兩個拷貝均發生突變。而對於線粒體DNA來說，情況就要複雜的多，從一個線粒體DNA發生突變，到上千個線粒體DNA均發生突變，其中的突變頻率可以是0.1％～100％中的任何一個比例。而要精確檢測到這種突變頻率的變化，特別是低頻率(0.1％～10％)的點突變，用傳統的桑格測序(Sanger sequencing)是無法進行精確測定的。
從理論上講，要檢測較低頻率的突變，比如說0.4％，則至少需要250倍的測序深度，加上每個點突變至少被檢測到兩次的標準以提高準確性，則至少需要500倍的測序深度，如果需要進一步提高準確性，則需進一步提高測序深度。
本發明的測序方法可以在測序深度設為6000×時，保持極好的序列覆蓋度，使得檢測線粒體DNA的低頻突變成為可能。
二代測序技術
下一代測序技術(Next Generation Sequencing,NGS，也可稱為「二代測序技術」)是近年來新發展的一項基因測序技術，核心特徵是大規模平行測序，可同時對成千上萬條短核苷酸片段進行平行測序。目前下一代測序技術主要應用於全基因組測序，全外顯子測序，全轉錄組測序和針對特定基因的靶向測序。前三者多用於科學研究，後者多用於臨床分子診斷。
本發明的主要優點包括：
(a)本發明的方法可以進行深度測序，用於線粒體中低頻突變的檢測。
(b)本發明的方法操作簡單，實驗結果可靠，靈敏度高。
(c)本發明的方法需要的樣本量較少，且對樣本質量要求較低，可用於降解DNA的測序。
(d)本發明的方法所設計的引物是根據亞洲人的序列進行修改過的，所以該方法可以特異性的對亞洲人群進行線粒體基因組測序。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
通用方法
PCR反應體系：總體積6μL，其中Robust HotStartReadyMiX3μL，DNA模板1μL(至少10ngDNA)，引物2μL(每對引物在體系中的終濃度為50-70nM，見表1)。
擴增條件：95℃預變性2分鐘，95℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，45個循環後，72℃延伸5分，最後4℃終止反應。
用酶切方法純化PCR產物，純化後的PCR產物混合，然後連接後續二代測序平臺所需的接頭，將連有不同接頭的樣本等量混合。混合後的樣本用磁珠純化，並進行割膠回收。
文庫質檢合格後，用illumina HiSeq X 10儀器進行上機測序。每個樣本產生約300M的數據量。
將測序得到的數據與人類線粒體參考序列(修正後的劍橋序列NC_012920.1)進行比對，即可得到樣本線粒體的信息。
實施例1
人線粒體全基因組測序
1、人類全基因組DNA提取：隨機選取96例正常人血液樣本，用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen,Germany)試劑盒提取DNA。
2、引物設計：共設計了73對PCR引物，PCR擴增產物長度大多為250bp左右，相鄰引物的擴增產物之間都有重疊區域，確保所有的擴增產物能夠完全覆蓋線粒體DNA。將73對PCR引物優化改進後，分成四組Set1、Set2、Set3、Set4，進行多重PCR擴增。(見表1)
3、擴增：
PCR反應體系：總體積6μL，其中KAPA2GTM Robust HotStartReadyMiX(KAPA BIOSYSTEMS,USA)3μL，DNA模板1μL(至少10ngDNA)，引物2μL(每對引物在體系中的終濃度為50-70nM，見表1)。
擴增條件：95℃預變性2分鐘，95℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，45個循環後，72℃延伸5分，最後4℃終止反應。
4、將同一模板的四組擴增產物等量混合，用ExonucleaseⅠ,E.coli(New England Biolabs,USA)和Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP(Affymetrix,USA)進行處理，將剩餘的單鏈引物、外來的單鏈DNA以及殘留的dNTPs除去。
5、將(4)中處理好的產物稀釋100倍，連接後續二代測序平臺所需的接頭，將連有不同接頭的樣本等量混合。
6、用磁珠AgencourtAMPureXP(Beckman Coulter,USA)純化(5)中產物。
7、磁珠純化後的產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,Germany)試劑盒，切膠回收300bp-500bp處條帶。
8、檢測上述構建的文庫片段大小及濃度，文庫質檢合格後，用illumina HiSeq X 10儀器進行上機測序，每個樣本產生約300M的數據量。
9、測序結果分析：96個樣本共得到28.2GB的數據，所有樣本測到的鹼基數約為154.39Mbp—574.24Mbp，平均值為304.16Mbp。每個樣本的鹼基數如圖2所示。將測序得到的文件根據接頭進行分類，平均每個樣本測到的總reads為2.11×106，然後將測到的序列與人類線粒體參考序列(修正後的劍橋序列NC_012920.1)進行比對。比對結果發現，能夠匹配到線粒體參考序列上的reads數為2.09×106(99.19％)。當測序深度設為100×時，所有樣本的序列覆蓋度都達到了100％；當測序深度設為6000×時，只有兩樣樣本的序列覆蓋度為99.9％，其餘仍為100％(見表2)。其中，每個擴增子的平均測序深度約為5,806×—62,910×，大多數擴增子的測序深度為20,000×，每個擴增子的平均測序深度如圖3所示。
表2
對比實驗
對比實驗的實驗方法與實施例1基本相同，區別在於對比試驗將表1中包含的73對引物分成了三組，其中，第一組包括序列如SEQ ID NO.:1、2、7-52所示的引物，第二組包括序列如SEQ ID NO.:3、4、53-98所示的引物，第三組包括序列如SEQ ID NO.:5、6、99-146所示的引物。
測序結果發現序列如SEQ ID NO.:1-8所示的引物對應的片段沒有擴增成功。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表
上海添音生物科技有限公司
一種基於多重PCR的人線粒體全基因組高通量測序方法
P2016-1390
146
PatentIn version 3.5
1
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
1
acactgacga catggttcta cagcaagcaa ccgcatccat aa 42
2
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
2
tacggtagca gagacttggt ctttgagaga gtgaggagaa ggc 43
3
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
3
acactgacga catggttcta catcctcact atctgcttca tccg 44
4
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
4
tacggtagca gagacttggt ctgccgttga gttgtggtag tcaa 44
5
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
5
acactgacga catggttcta cattttaata atcaacaccc tcctagc 47
6
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
6
tacggtagca gagacttggt ctctcatagg ccagacttag ggc 43
7
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
7
acactgacga catggttcta caccaccatt agcacccaaa gc 42
8
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
8
tacggtagca gagacttggt ctatcctagt gggtgagggg tg 42
9
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
9
acactgacga catggttcta cacaccctat gtcgcagtat ctgt 44
10
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
10
tacggtagca gagacttggt ctgttaggct ggtgttaggg ttct 44
11
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
11
acactgacga catggttcta cagttcaccc tctaaatcac cacga 45
12
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
12
tacggtagca gagacttggt ctagttttag ctttattggg gaggggg 47
13
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
13
acactgacga catggttcta caaaaactgc tcgccagaac ac 42
14
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
14
tacggtagca gagacttggt cttccacctt cgacccttaa gtt 43
15
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
15
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16
41
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
16
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17
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
17
acactgacga catggttcta caccgcctgt ttaccaaaaa catca 45
18
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
18
tacggtagca gagacttggt ctggacctgt gggtttgtta ggtact 46
19
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
19
acactgacga catggttcta caccaacctc ctactcctca ttgt 44
20
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DNA
人工序列(Artificial Sequence)
20
tacggtagca gagacttggt ctaggcctag gttgaggttg ac 42
21
41
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
21
acactgacga catggttcta cacgaacccc cttcgacctt g 41
22
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
22
tacggtagca gagacttggt ctaggaggtg tatgagttgg tcg 43
23
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DNA
人工序列(Artificial Sequence)
23
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24
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人工序列(Artificial Sequence)
24
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25
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DNA
人工序列(Artificial Sequence)
25
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26
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人工序列(Artificial Sequence)
26
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27
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DNA
人工序列(Artificial Sequence)
27
acactgacga catggttcta catcccatat tgtaacttac tactccg 47
28
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
28
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29
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
29
acactgacga catggttcta caggagtgac tatatggatg cccc 44
30
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
30
tacggtagca gagacttggt ctggcgtgat catgaaaggt ga 42
31
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
31
acactgacga catggttcta caaccacttt caccgctaca cg 42
32
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
32
tacggtagca gagacttggt ctagtgtaag gagtatgggg gtaat 45
33
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
33
acactgacga catggttcta catgagcggg cgcagtgatt at 42
34
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
34
tacggtagca gagacttggt ctaggcgaca gcgatttcta gg 42
35
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DNA
人工序列(Artificial Sequence)
35
acactgacga catggttcta cacgctaaat cccctagaag tccc 44
36
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
36
tacggtagca gagacttggt ctgttggcgg atgaagcaga tag 43
37
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
37
acactgacga catggttcta cagccactaa tagttatgtc atccctc 47
38
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
38
tacggtagca gagacttggt cttgagagta gctataatga acagcg 46
39
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
39
acactgacga catggttcta cacgccactt atccagtgaa cc 42
40
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
40
tacggtagca gagacttggt ctgtgagtag tagaatgttt agtgagc 47
41
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
41
acactgacga catggttcta cacagccaca tagccctcgt ag 42
42
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
42
tacggtagca gagacttggt cttcaggaga acgtggttac tagc 44
43
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
43
acactgacga catggttcta caccatcctt accaccctcg tt 42
44
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
44
tacggtagca gagacttggt ctactgatta atgtttgggt ctgagt 46
45
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
45
acactgacga catggttcta cattactcat ccgcttccac cc 42
46
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
46
tacggtagca gagacttggt ctaggttgtg gatgatggac cc 42
47
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
47
acactgacga catggttcta catacctaaa actcacagcc ctcgc 45
48
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
48
tacggtagca gagacttggt ctctttttgg gttgaggtga tgatgg 46
49
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
49
acactgacga catggttcta caataacaca cccgaccaca cc 42
50
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
50
tacggtagca gagacttggt ctgccgaagt ttcatcatgc gg 42
51
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
51
acactgacga catggttcta cacccaccct cacacgattc tt 42
52
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
52
tacggtagca gagacttggt ctgtggggag gggtgtttaa gg 42
53
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
53
acactgacga catggttcta cacaccctat gtcgcagtat ctgt 44
54
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
54
tacggtagca gagacttggt ctgttaggct ggtgttaggg ttct 44
55
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
55
acactgacga catggttcta cagttcaccc tctaaatcac cacga 45
56
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
56
tacggtagca gagacttggt ctagttttag ctttattggg gaggggg 47
57
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
57
acactgacga catggttcta caaaaactgc tcgccagaac ac 42
58
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
58
tacggtagca gagacttggt cttccacctt cgacccttaa gtt 43
59
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
59
acactgacga catggttcta caccaagcat aatatagcaa ggac 44
60
41
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
60
tacggtagca gagacttggt ctgagggttc tgtgggcaaa t 41
61
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
61
acactgacga catggttcta caccgcctgt ttaccaaaaa catca 45
62
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
62
tacggtagca gagacttggt ctggacctgt gggtttgtta ggtact 46
63
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
63
acactgacga catggttcta caccaacctc ctactcctca ttgt 44
64
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
64
tacggtagca gagacttggt ctaggcctag gttgaggttg ac 42
65
41
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
65
acactgacga catggttcta cacgaacccc cttcgacctt g 41
66
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
66
tacggtagca gagacttggt ctaggaggtg tatgagttgg tcg 43
67
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
67
acactgacga catggttcta caacctctac ttctacctac gcct 44
68
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
68
tacggtagca gagacttggt cttggctgat ttgcgttcag ttg 43
69
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
69
acactgacga catggttcta cacctcctta ttcgagccga gc 42
70
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
70
tacggtagca gagacttggt cttgctaagg gagggtagac tgt 43
71
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
71
acactgacga catggttcta catcccatat tgtaacttac tactccg 47
72
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
72
tacggtagca gagacttggt ctgaaaagaa agatgaatcc tagggc 46
73
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
73
acactgacga catggttcta caggagtgac tatatggatg cccc 44
74
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
74
tacggtagca gagacttggt ctggcgtgat catgaaaggt ga 42
75
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
75
acactgacga catggttcta caaccacttt caccgctaca cg 42
76
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
76
tacggtagca gagacttggt ctagtgtaag gagtatgggg gtaat 45
77
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
77
acactgacga catggttcta catgagcggg cgcagtgatt at 42
78
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
78
tacggtagca gagacttggt ctaggcgaca gcgatttcta gg 42
79
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
79
acactgacga catggttcta cacgctaaat cccctagaag tccc 44
80
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
80
tacggtagca gagacttggt ctgttggcgg atgaagcaga tag 43
81
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
81
acactgacga catggttcta cagccactaa tagttatgtc atccctc 47
82
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
82
tacggtagca gagacttggt cttgagagta gctataatga acagcg 46
83
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
83
acactgacga catggttcta cacgccactt atccagtgaa cc 42
84
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
84
tacggtagca gagacttggt ctgtgagtag tagaatgttt agtgagc 47
85
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
85
acactgacga catggttcta cacagccaca tagccctcgt ag 42
86
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
86
tacggtagca gagacttggt cttcaggaga acgtggttac tagc 44
87
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
87
acactgacga catggttcta caccatcctt accaccctcg tt 42
88
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
88
tacggtagca gagacttggt ctactgatta atgtttgggt ctgagt 46
89
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
89
acactgacga catggttcta cattactcat ccgcttccac cc 42
90
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
90
tacggtagca gagacttggt ctaggttgtg gatgatggac cc 42
91
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
91
acactgacga catggttcta catacctaaa actcacagcc ctcgc 45
92
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
92
tacggtagca gagacttggt ctctttttgg gttgaggtga tgatgg 46
93
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
93
acactgacga catggttcta caataacaca cccgaccaca cc 42
94
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
94
tacggtagca gagacttggt ctgccgaagt ttcatcatgc gg 42
95
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
95
acactgacga catggttcta cacccaccct cacacgattc tt 42
96
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
96
tacggtagca gagacttggt ctgtggggag gggtgtttaa gg 42
97
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
97
acactgacga catggttcta cacaccctat gtcgcagtat ctgt 44
98
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
98
tacggtagca gagacttggt ctgttaggct ggtgttaggg ttct 44
99
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
99
acactgacga catggttcta caaatctcat caatacaacc cccgc 45
100
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
100
tacggtagca gagacttggt ctttgctgcg tgcttgatgc ttg 43
101
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
101
acactgacga catggttcta cagactacga aagtggcttt aacata 46
102
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
102
tacggtagca gagacttggt ctactttgta gccttcatca gggt 44
103
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
103
acactgacga catggttcta catggacgaa ccagagtgta gc 42
104
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
104
tacggtagca gagacttggt ctttggctct ccttgcaaag tt 42
105
40
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
105
acactgacga catggttcta catccgcata agcctgcgtc 40
106
40
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
106
tacggtagca gagacttggt ctaccgcggc cgttaaacat 40
107
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
107
acactgacga catggttcta caaaggttcg tttgttcaac gatt 44
108
41
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
108
tacggtagca gagacttggt cttaggaggt tggccatggg t 41
109
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
109
acactgacga catggttcta cacctttaac ctctccaccc ttatca 46
110
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
110
tacggtagca gagacttggt cttatgttgt gtagagttca ggggaga 47
111
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
111
acactgacga catggttcta cacgattccg ctacgaccaa ct 42
112
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
112
tacggtagca gagacttggt ctggtatggg cccgatagct ta 42
113
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
113
acactgacga catggttcta cactctacca tctttgcagg cac 43
114
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
114
tacggtagca gagacttggt ctttttgtca tgtgagaaga agcag 45
115
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
115
acactgacga catggttcta cataaactcc agcaccacga cc 42
116
44
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
116
tacggtagca gagacttggt ctgggagtag tgtgattgag gtgg 44
117
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
117
acactgacga catggttcta catcacctcg gagctggtaa aa 42
118
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
118
tacggtagca gagacttggt cttaacgttg tagatgtggt cgt 43
119
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
119
acactgacga catggttcta cacacagcag ttctacttct cct 43
120
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
120
tacggtagca gagacttggt cttgtgctca cacgataaac cct 43
121
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
121
acactgacga catggttcta caacctacgc caaaatccat ttcac 45
122
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
122
tacggtagca gagacttggt ctcttcgaat gtgtggtagg gtg 43
123
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
123
acactgacga catggttcta caaggtcaac gatccctccc tt 42
124
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
124
tacggtagca gagacttggt cttcgtgtag cggtgaaagt gg 42
125
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
125
acactgacga catggttcta cacaaccgac taatcaccac cca 43
126
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
126
tacggtagca gagacttggt ctgggtgtag gtgtgccttg tg 42
127
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
127
acactgacga catggttcta caccactcca taacgctcct ca 42
128
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
128
tacggtagca gagacttggt ctgatttagc ggggtgatgc ct 42
129
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
129
acactgacga catggttcta caccaatgct aaaactaatc gtccca 46
130
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
130
tacggtagca gagacttggt cttggttcac tggataagtg gcg 43
131
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
131
acactgacga catggttcta cacccatcgc tgggtcaata gt 42
132
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
132
tacggtagca gagacttggt ctgtaagtcc gtgggcgatt at 42
133
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
133
acactgacga catggttcta cacaacagag gcttacgacc cc 42
134
46
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
134
tacggtagca gagacttggt ctactgataa taaaggtgga tgcgac 46
135
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
135
acactgacga catggttcta cacgatatcg gtttcatcct cgcct 45
136
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
136
tacggtagca gagacttggt ctctattttc tgctaggggg tggaa 45
137
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
137
acactgacga catggttcta caaacaggtc aacctcgctt cc 42
138
47
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
138
tacggtagca gagacttggt ctagaaataa aatgtgcata gtgggga 47
139
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
139
acactgacga catggttcta caccctgacc cctctccttc at 42
140
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
140
tacggtagca gagacttggt ctggtgtggt cgggtgtgtt at 42
141
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
141
acactgacga catggttcta cacctcttcc tacacatcgg gc 42
142
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
142
tacggtagca gagacttggt ctaagaatcg tgtgagggtg gg 42
143
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
143
acactgacga catggttcta caatttcgcc cactaagcca atc 43
144
45
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
144
tacggtagca gagacttggt ctgggtgcta atggtggagt taaag 45
145
42
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
145
acactgacga catggttcta cagagtgcta ctctcctcgc tc 42
146
43
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
146
tacggtagca gagacttggt ctagatactg cgacataggg tgc 43