對環境脅迫具有提高的耐性和/或抗性以及增加的生物量產生的植物的製作方法

2023-05-18 09:33:06

專利名稱：對環境脅迫具有提高的耐性和/或抗性以及增加的生物量產生的植物的製作方法
對環境脅迫具有提高的耐性和/或抗性以及增加的生物量產生的植物本發明總地說來涉及與相應的未轉化野生型植物細胞相比，對環境脅迫具有提高的耐性和/或抗性並且生物量產生增加的植物細胞，其通過在植物中增加或產生與非生物脅迫響應和非生物耐性相關的多肽的一種或多種活性。具體而言，本發明涉及適應於在水分不足條件下生長的植物。本發明還涉及製備、篩選並培養這類植物細胞 或植物的方法。在田間條件下，生長、發育、生物量積累和產量方面的植物性能依賴於對環境變化和脅迫的適應能力。如乾旱脅迫、鹽脅迫、熱脅迫和冷脅迫的非生物環境脅迫是植物生長和生產力的主要限制因子(Boyer. 1982. Science 218，443-448)。暴露於熱和/或少水或乾旱條件下的植物通常具有植物材料、種子、果實和其他可食用產物的低產量。由這些脅迫引起的主要作物(如稻、玉蜀黍(玉米)和小麥)的作物損失及作物產量損失表現為重要的經濟和政治因素，並引起許多不發達國家的食品短缺。乾旱、熱、冷和鹽脅迫具有對植物生長而言很重要的共同因素，即水的可用度。植物在其生命周期中通常暴露在環境水含量減少的條件下。大部分植物已進化出在少水或乾燥條件下保護自身的策略。然而，如果幹旱條件的強度太大、持續時間太長的話，其對植物發育、生長和大多數作物產量的影響是極大的。持續暴露於乾旱引起植物代謝的較大變化。這些代謝中的巨大變化最終導致細胞死亡並因此引起產量損失。開發脅迫耐性植物和/或抗性植物是可能解決或調解至少部分這些問題的策略(McKersie 和 Leshem,1994, Stress and Stress Copingin Cultivated Plants, KluwerAcademic Publishers)。然而,開發對這些種類的脅迫表現出抗性(耐性)的新植物品系的傳統植物育種策略相對緩慢，並需要特定抗性的品系與需要的品系雜交。用於脅迫耐性的有限的種質資源和關係較遠的植物物種間雜交的不相容性代表常規培養中遇到的重要問題。另外，引起乾旱、冷和鹽耐性和/或抗性的天然細胞過程是複雜的而且涉及細胞適應的多重機制和大量代謝途徑(McKersie 和 Leshem, 1994.，Stress and Stress Coping inCultivated Plants,Kluwer AcademicPublishers)。脅迫耐性和/或抗性的多成分的特性不僅使得耐性和/抗性育種很大程度上不成功，而且還限制了使用生物技術方法遺傳改造脅迫耐受植物的能力。植物在其生命周期過程中還暴露於熱、冷和鹽脅迫中。保護策略與耐乾旱的保護策略類似。由於一些土壤中的高鹽含量引起細胞可吸收的水分減少，所以其影響類似於在乾旱條件下所觀察到的。另外，低於冰凍溫度時，質外體中開始形成冰並從共質體中奪取水分而導致植物細胞損失水分(McKersie和Leshem, 1994, Stress and Stress CopinginCultivated Plants,Kluwer Academic Publishers)。這些脅迫在生理學上也相互聯繫，並可誘導類似的細胞損傷。例如，乾旱和鹽脅迫主要顯示為滲透脅迫，導致細胞中內環境穩定和離子分布遭到破壞(Serrano等，1999 ；Zhu, 2001a ；ffang等,2003)。經常伴隨高溫、高鹽或乾旱脅迫的氧化脅迫可引起功能蛋白質或結構蛋白質的變性(Smirnoff, 1998)。結果，這些非生物脅迫經常激活類似的信號發放途徑(Shinozaki和Ymaguchi-Shinozaki, 2000 ；Knight和Knight，2001 ；Zhu 2001b, 2002)和細胞響應，例如產生某些脅迫蛋白質、抗氧化劑和可混溶溶質(compatible solute) (Vierling 和 Kimpel, 1992 ；Zhu 等，1997 ；. Cushman和 Bohnert,2000)。目前的研究結果表明乾旱耐性和/或抗性是複雜的定量特性，且目前為止沒有得到真正的鑑別標記。對機制理解的缺乏使得難於設計轉基因方法來提高水脅迫耐性和/或抗性。目前已知許多遺傳和生物技術方法獲得在低水可用度(lowwater availability)的條件下生長的植物。這些途徑一般基於在植物細胞中引入並表達編碼例如在W02004011888、W02006032708、 US20050097640、 US 20060037108、 US20050108791、 Serrano 等(1999;Scientia Horticulturae 78 :261-269)中公開的不同酶以及許多其他酶的基因。例如，抗氧化酶或ROS清除酶的超量表達是改變耐性的ー種可能，例如，表達Mn 超氧化物歧化酶的轉基因苜蓿植物在缺水脅迫後傾向於具有減少的傷害(McKersie等，1996. Plant Physio. 111，1177-1181)。同樣的轉基因植物在田間試驗中有增加的生物量產生(McKersie 等，1999. Plant Physiology, 119 :839-847 ；McKersie 等，1996. PlantPhysiol. 111,1177-1181)。過量產生滲壓劑如甘露糖醇、果聚糖、脯氨酸或甜菜鹼的轉基因植物也對ー些形式的非生物脅迫表現出提高的抗性，並且認為合成的滲壓劑作為ROS清除劑發揮作用(Tarczynski.等 1993Science 259, 508-510 ;Sheveleva,等 1997. PlantPhysiol. 115，1211-1219)。來自谷氧還蛋白和硫氧還蛋白家族的基因的表達賦予對環境脅迫，尤其是對鹽或冷脅迫的提高耐性(EP1529112A)。這些植物比敏感性植物具有更高的種子產量、光合作用和乾物質產生。對這些植物在稀疏養分耗盡(sparsly nutrient disposability)條件下的發育ー無所知。一般而言，所引用的轉化的且脅迫抗性的植物由於植物發育和生理中的不平衡顯示更慢的生長和減少的生物量，因此具有顯著的適應性成本(Kasuga等，1999, Danby和Gehring等，2005)。儘管維持基本的代謝功能，但這也導致嚴重的生物量和產量損失。根/莖幹重比往往隨植物水脅迫發展而增長。這種增長主要是由於莖幹重的相對減少。在許多環境條件下種子產量與地上乾重的比例相對穩定，因此經常可在植物大小與穀粒產量之間獲得強的相關性。因為大多數穀粒生物量依賴於通過植物葉和莖目前儲存的光合生產力，所以這些過程內在相關聯。因此甚至在發育早期階段選擇植物大小已經用作未來潛力的指示物。在一些情況下(US20060037108)，通過停止澆水6到8天進行乾旱處理後觀察到提
高的生物量，主要觀察到更高的莖生物量。仍然需要鑑定在脅迫耐性植物中表達的基因，其具有賦予它的宿主植物和其他植物物種脅迫耐性，尤其是賦予它的宿主植物和其他植物物種對環境脅迫的提高耐性和/或抗性，優選優選在水分短缺的情況下，並賦予増加的生物量產生的能力。本發明的目的是鑑定新方法以在植物或植物細胞中賦予脅迫耐性和/或抗性。非生物脅迫現象的複雜特性使得遺傳優化變得困難。然而，在幾種情況下單個基因，例如轉錄因子或反向轉運蛋白的修飾導致脅迫耐性的顯著提高(Wang等，2003)。本發明的其他目的是處理植物，所述植物在水短缺下相比於相應的未轉化野生型植物，抗水脅迫至少I. O天，優選I. 5天，在少水低或乾燥條件下還顯示出相等，優選增加的生物量產生。還需要鑑定在脅迫耐性植物中表達的基因，所述基因尤其在任何亞最適生長條件下具有賦予脅迫耐性和増加的生物量產生的能力。因此，在第一個實施方案中，本發明提供用於通過増加或產生ー種或多種活性來製備與相應的未轉化野生型植物細胞相比，對環境脅迫具有提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生的轉基因植物細胞的方法，所述活性選自2，3_ ニ羥基-2，3_ ニ氫丙酸苯酯脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧醯基-(醯基載體蛋白)合酶、酸性熱休克蛋白前體、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白質、b0482-蛋白質、b0631-蛋白質、b0753_蛋白質、b0866_蛋白質、bl052-蛋白質、bll61-蛋白質、bl423-蛋白質、bl878-蛋白質、b2226-蛋白質、b2475-蛋白質、纖維ニ糖/熊果苷/水楊苷-特異性PTS酶(IIB組分/IC組分)、限制點蛋白質、CP4-57原噬菌體/RNA合酶LS、ニ氫尿嘧啶核苷合酶、DNA-結合轉錄ニ元調節蛋白質、D-木糖轉運蛋白亞基、Y-Glu-腐胺合酶、葡糖酸轉運蛋白、葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶、穀氨醯胺tRNA 合酶、穀胱甘肽依賴性氧化還原酶、甜菜鹼轉運蛋白亞基蛋白質、糖原合酶、GTP環化水解酶I、熱休克蛋白、熱休克蛋白HtpX、血紅素裂解酶(CcmH亞基)、己糖醒酸(hexuronate)轉運蛋白、組氨酸/賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白亞基蛋白質、HyaA/HyaB-加工蛋白質、內膜蛋白質、L-阿拉伯糖轉運蛋白亞基、Lsm(類似於Sm)蛋白質、L-蘇氨酸3-脫氫酶、甲基こニ醛合酶、多藥運出系統(B亞基)、PTS的N，N' - ニこ醯基殼ニ糖-特異性酶IIA組分、NADH脫氫酶(N亞基)、中性胺基酸運出系統、煙醯胺核苷酸腺苷醯轉移酶、鳥氨酸脫羧酶、泛酸激酶、肽醯基-脯氨酸順反式異構酶A(旋轉異構酶A)、磷酸轉運蛋白、磷脂醯基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、鉀轉運ATP酶(B亞基)、預測的抗微生物肽轉運蛋白亞基、預測的精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白、預測的水解酶、預測的激酶、預測的連接酶、預測的外膜脂蛋白、預測的氧化還原酶(黃素=NADH組分)、預測的孔蛋白、預測的PTS酶(IIB組分/IIC組分)、預測的絲氨酸轉運蛋白蛋白質、預測的轉運蛋白蛋白質、小(40S)核糖體亞基的蛋白質組分、脂多糖鏈的0抗原組分的長度調節物、核糖核酸酶活性調節蛋白質RraA、具有NarP(NarL)的兩組分調節系統中的感受器組氨酸激酶(sensory histidinekinase)、鈉/質子反向轉運蛋白、剪接因子、蘇氨酸和高絲氨酸運出系統、轉錄調節蛋白質、轉錄抑制蛋白質MetJ、ABC超家族的轉運蛋白亞基/周質結合組分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特異性腺苷脫氨酶、通用應急蛋白質UP12、Yal049c-蛋白質、YCR059C-蛋白質、YEL005C-蛋白質、YER156C-蛋白質、Yfr042w-蛋白質、YGL045W-蛋白質和Y0R024w_蛋白質。在本發明ー個實施方案中，所述蛋白質具有選自以下的活性2，3_ ニ羥基-2，3_ニ氫丙酸苯酯脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧醯基-(醯基載體蛋白)合酶、酸性熱休克蛋白前體、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白質、b0482-蛋白質、b0631-蛋白質、b0753-蛋白質、b0866-蛋白質、bl052-蛋白質、bll61-蛋白質、bl423-蛋白質、bl878-蛋白質、b2226-蛋白質、b2475-蛋白質、纖維ニ糖/熊果苷/水楊苷-特異性PTS酶(IIB組分/IC組分)、限制點蛋白質、CP4-57原噬菌體/RNA合酶LS、ニ氫尿嘧啶核苷合酶、DNA-結合轉錄ニ元調節蛋白質、D-木糖轉運蛋白亞基、Y-Glu-腐胺合酶、葡糖酸轉運蛋白、葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶、穀氨醯胺tRNA合酶、穀胱甘肽依賴性氧化還原酶、甜菜鹼轉運蛋白亞基蛋白質、糖原合酶、GTP環化水解酶I、熱休克蛋白、熱休克蛋白HtpX、血紅素裂解酶(CcmH亞基)、己糖醒酸轉運蛋白、組氨酸/賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白亞基蛋白質、HyaA/HyaB-加工蛋白質、內膜蛋白質、L-阿拉伯糖轉運蛋白亞基、Lsm(類似於Sm)蛋白質、L-蘇氨酸3-脫氫酶、甲基乙二醒合酶、多藥運出系統(B亞基)、PTS的N，N' - 二乙醯基殼二糖-特異性酶IIA組分、NADH脫氫酶(N亞基)、中性胺基酸運出系統、煙醯胺核苷酸腺苷醯轉移酶、鳥氨酸脫羧酶、泛酸激酶、肽醯基-脯氨酸順反式異構酶A (旋轉異構酶A)、磷酸轉運蛋白、磷脂醯基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、鉀轉運ATP酶(B亞基)、預測的抗微生物肽轉運蛋白亞基、預測的精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白、預測的水解酶、預測的激酶、預測的連接酶、預測的外膜脂蛋白、預測的氧化還原酶(黃素=NADH組分)、預測的孔蛋白、預測的PTS酶(IIB組分/IIC組分)、預測的絲氨酸轉運蛋白蛋白質、預測的轉運蛋白蛋白質、小(40S)核糖體亞基的蛋白質組分、脂多糖鏈的O抗原組分的長度調節物、核糖核酸酶活性調節蛋白質RraA、具有NarP(NarL)的兩組分調節系統中的感受器組氨酸激酶、鈉/質子反向轉運蛋白、剪接因子、蘇氨酸和高絲氨酸運出系統、轉錄調節蛋白質、轉錄抑制蛋白質MetJ、ABC超家族的轉運蛋白亞基/周質結合組分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特異性腺苷脫氨酶、通用應急蛋白質UP12、Yal049c-蛋白質、 YCR059C-蛋白質、YEL005C-蛋白質、YER156C-蛋白質、Yfr042w_蛋白質、YGL045W-蛋白質和Y0R024W-蛋白質，並將表II，5和7列中所述的多肽命名為「脅迫相關蛋白質」 SRP。本文使用的術語「環境脅迫」指任何亞最適生長條件，包括但不限於與乾旱、冷或鹽度或其組合相關的亞最適條件。在優選的實施方案中，環境脅迫是乾旱和低含水量。其中乾旱脅迫指任何導致植物缺水或減少植物水供應的任何環境脅迫。在本發明一個實施方案中，術語「對環境脅迫的提高耐性和/或抗性」涉及對水脅迫的提高抗性，其產生為冷和鹽的次級脅迫，當然產生為乾旱過程中的初級脅迫。本文使用的術語「亞最適生長條件」也指有限的養分利用度和亞最適耗盡(disposability)。在一個實施方案中，有限的養分利用度是乾旱和低水含量。在一個實施方案中，有限的養分利用度是選自磷、鉀和氮的養分中的亞最適耗盡。在一個實施方案中，有限的養分利用度是氮的亞最適耗盡。在一個實施方案中，本發明轉基因植物的生物量通過提聞的養分利用率(NUE)得以提聞。可以通過提聞植物養分同化的總效率(例如在提聞總養分吸收和/或運輸方面改善植物總的運輸機制、同化途徑改善等)，和/或通過提高包括，但不限於磷、鉀和氮的養分物的特定養分利用率來顯示植物養分利用率的改善或提高。植物養分對植物生長和發育至關重要，並因此也對植物產品的數量和質量至關重要。由於養分吸收以及養分利用的效率對植物產量和產品質量的強大影響，所以向土壤傾倒大量的肥料以優化植物生長和質量。在本發明中，例如並優選通過以下方法確定對有限養分可用度的增強耐性為了高流通量目的，在具有有限氮供應的瓊脂平板上篩選植物的生物量產生(改編自Estelle和Somerville, 1987)。該篩選流水線由兩個等級組成。如果與野生型植物相比生物量產生顯著提高，轉基因植物進行後續等級的篩選。對於每一等級，重複數量和統計嚴緊性增加。為了播種，在牙籤的幫助下從Eppendorf管中取出在冰箱(_20°C)中儲存的種子，並將其轉移到上述具有有限氮供應(0.05mM KN03)的瓊脂平板上。將種子播種後，平板在黑暗中4°C進行分層2-4天。分層後，試驗植物在16小時光照，8小時黑暗周期中於20°C，60%的大氣溼度和大約400ppm的CO2濃度中生長22到25天。所用的光源產生了與太陽層析相似的光，其具有大約IOOil EAi2S的光強度。10到11天後，所述植物個體化。在20-25天生長後，通過轉基因植物的莖和根生物量產生與野生型對照植物相比，來評估在氮限制條件下的提高生長。與野生型植物相比顯示生物量產生顯著提高的轉基因品系進行後續等級的以下實驗在擬南芥(Arabidopsis thaliana)的情況下,在含養分耗竭土(nutrientdep leted soil, ^ Einheitserde Typ 0」，30% 泥土，Tantau, Wansdorf 德國)和沙I Kv v)的混合物的盆中播種種子。通過在4°C下黑暗中4天的周期誘導萌發。隨後植物在標準生長條件(16小時光照和8小時黑暗的光周期，20°C，60%相對溼度，和200 ii E的光子通量密度)下生長。栽培並培養植物，尤其是每隔一天用N耗竭的養分液澆水。所述N耗竭的養分液例如含有beneath water。
權利要求
1.通過增加或產生選自以下的一種或多種活性來製備轉基因植物細胞、植物或其部分的方法，所述轉基因植物細胞、植物或其部分與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比具有對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生2，3- 二羥基-2，3- 二氫丙酸苯酯脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧醯基-(醯基載體蛋白)合酶、酸性熱休克蛋白前體、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白質、b0482-蛋白質、b0631-蛋白質、b0753-蛋白質、b0866-蛋白質、bl052-蛋白質、bll61-蛋白質、bl423-蛋白質、bl878-蛋白質、b2226-蛋白質、b2475-蛋白質、纖維二糖/熊果苷/水楊苷-特異性PTS酶(IIB組分/IC組分)、限制點蛋白質、CP4-57原噬菌體/RNA合酶LS、二氫尿嘧啶核苷合酶、DNA-結合轉錄二元調節蛋白質、D-木糖轉運蛋白亞基、Y -Glu-腐胺合酶、葡糖酸轉運蛋白、葡萄糖-I-磷酸胸苷轉移酶、穀氨醯胺tRNA合酶、穀胱甘肽依賴性氧化還原酶、甜菜鹼轉運蛋白亞基蛋白質、糖原合酶、GTP環化水解酶I、熱休克蛋白、熱休克蛋白HtpX、血紅素裂解酶(CcmH亞基)、己糖醒酸轉運蛋白、組氨酸/賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白亞基蛋白質、HyaA/HyaB-加工蛋白質、內膜蛋白質、L-阿拉伯糖轉運蛋白亞基、Lsm(類似於Sm)蛋白質、L-蘇氨酸3-脫氫酶、甲基乙二醒合酶、多藥運出系統(B亞基)、PTS的N，N' - 二乙醯基殼二糖-特異性酶IIA組分、NADH脫氫酶(N亞基)、中性胺基酸運出系統、煙醯胺核苷酸腺苷醯轉移酶、鳥氨酸脫羧酶、泛酸激酶、肽醯基-脯氨酸順反式異構酶A(旋轉異構酶A)、磷酸轉運蛋白、磷脂醯基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、鉀轉運ATP酶(B亞基)、預測的抗微生物肽轉運蛋白亞基、預測的精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白、預測的水解酶、預測的激酶、預測的連接酶、預測的外膜脂蛋白、預測的氧化還原酶(黃素=NADH組分)、預測的孔蛋白、預測的PTS酶(IIB組分/IIC組分)、預測的絲氨酸轉運蛋白蛋白質、預測的轉運蛋白蛋白質、小(40S)核糖體亞基的蛋白質組分、脂多糖鏈的O抗原組分的長度調節物、核糖核酸酶活性調節蛋白質RraA、具有NarP(NarL)的兩組分調節系統中的感受器組氨酸激酶、鈉/質子反向轉運蛋白、剪接因子、蘇氨酸和高絲氨酸運出系統、轉錄調節蛋白質、轉錄抑制蛋白質MetJ、ABC超家族的轉運蛋白亞基/周質結合組分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特異性腺苷脫氨酶、通用應急蛋白質UP12、Yal049c-蛋白質、YCR059C-蛋白質、YEL005C-蛋白質、YER156C-蛋白質、Yfr042w-蛋白質、YGL045W-蛋白質和Y0R024w-蛋白質。
2.權利要求I的方法，其中增加或產生至少一種下述多肽的活性，所述多肽包含選自以下的多肽 (i)包含表II或表IV第列5或第7列分別描述的多肽、共有序列或至少一個多肽基序的多肽；或 ( )包含表I第列5或第7列中描述的多核苷酸的核酸分子的表達產物， (iii)或(i)或(ii)的功能等價物。
3.權利要求I或2的方法，其中增加或產生至少一種下述核酸分子的表達，所述核酸分子包含選自以下的核酸分子 a)編碼表II第列5或第7列所示多肽的核酸分子； b)表I第列5或第7列所示的核酸分子； c)核酸分子，其作為遺傳密碼簡併性的結果衍生自表II第列5或第7列所示的多肽序列，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生。
d)核酸分子，其與包含表I第列5或第7列所不的核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%的同一性，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生； e)編碼多肽的核酸分子，所述多肽與(a)到(C)的核酸分子編碼的多肽的胺基酸序列具有至少30%的同一性，並具有包含表I第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生； f)核酸分子，其與(a)到(C)的核酸分子在嚴格的雜交條件下雜交，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生； g)編碼多肽的核酸分子，所述多肽可在針對(a)到(e)的一個核酸分子編碼的多肽而產生的單克隆或多克隆抗體的幫助下分離，並具有包含如表I第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性； h)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含如表IV第7列所示的共有序列或一個或多個多肽基序，並優選具有包含如表II或表IV第5列所不的多核苷酸的核酸分子代表的活性； h)編碼多肽的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列所示蛋白質代表的活性，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生； i)包含多核苷酸的核酸分子，其通過使用表III第7列中的引物擴增cDNA文庫或基因組文庫獲得，並優選具有包含表II或表IV第5列所不的多核苷酸的核酸分子所代表的活性，所述引物在其5』末端不以核苷酸ATA開始； 和 j)在嚴格的雜交條件下，通過使用包含(a)或(b)核酸分子或其片段的互補序列的探針篩選合適的核酸文庫獲得的核酸分子，所述片段具有與(a)到(e)中表徵的核酸分子序列互補的核酸分子的至少15nt,優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,並編碼具有包含如表II第5列所示多肽的蛋白質所代表的活性的多肽。
4.權利要求I的方法產生的轉基因植物細胞、植物或其部分，所述轉基因植物細胞、植物或其部分與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比具有對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生。
5.權利要求4的轉基因植物細胞、植物或其部分，其來自單子葉植物。
6.權利要求4的轉基因植物細胞、植物或其部分，其來自雙子葉植物。
7.權利要求4的轉基因植物細胞、植物或其部分，其中所述植物選自玉蜀黍、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、大豆、花生、棉花、油菜籽油菜，包括卡諾拉油菜和歐洲油菜、玉米、木薯、胡椒、向日葵、亞麻、琉璃苣、紅花、亞麻子、報春花、油菜籽、蕪青、萬壽菊、茄科植物、馬鈴薯、菸草、茄子、番茄、野豌豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬物種、油椰、椰子，多年生草、飼料作物和擬南芥。
8.權利要求4的轉基因植物細胞、植物或其部分，其來自裸子植物，優選來自雲杉、松樹和冷杉。
9.權利要求5到8中任一項的轉基因植物產生的種子，其中所述種子在遺傳上是轉基因純合的，所述轉基因賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生，產生與相應的未轉化野生型植物相比對環境脅迫提高的耐性和增加的生物量產生。
10.包含選自以下的核酸分子的分離的核酸分子 a)編碼表IIB第列5或第7列所示的多肽的核酸分子； b)表IB第列5或第7列所示的核酸分子； c)核酸分子，其作為遺傳密碼簡併性的結果衍生自表II第列5或第7列所示的多肽序列，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生。
d)核酸分子，其與包含表I第列5或第7列所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%的同一性，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生； e)編碼多肽的核酸分子，所述多肽與(a)到(C)的核酸分子編碼的多肽的胺基酸序列具有至少30%的同一性，並具有包含表I第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生； f)核酸分子，其與(a)到(C)的核酸分子在嚴格的雜交條件下雜交，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生； g)編碼多肽的核酸分子，所述多肽可在針對(a)到(e)的一個核酸分子編碼的多肽而產生的單克隆或多克隆抗體的幫助下分離，並具有包含如表I第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性； h)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含如表IV第7列所示的共有序列或一個或多個多肽基序，並優選具有包含如表II或表IV第5列所不的多核苷酸的核酸分子代表的活性； h)編碼多肽的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列所示的蛋白質代表的活性，並賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生； i)包含多核苷酸的核酸分子，其通過使用表III第7列中的引物擴增CDNA文庫或基因組文庫獲得，並優選具有包含表II或表IV第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性，所述引物在其5』末端不以核苷酸ATA開始； 和 j)在嚴格雜交條件下，通過使用包含(a)或(b)核酸分子或其片段的互補序列的探針篩選合適的核酸文庫獲得的核酸分子，所述片段具有與(a)到(e)中表徵的核酸分子序列互補的核酸分子的至少15nt,優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,並編碼具有包含如表II第5列所示的多肽的蛋白質所代表的活性的多肽。
其中(a)到(j)的所述核酸分子在至少一個或多個核苷酸上不同於表IA的第列5或第7列中所述序列，並優選編碼至少一個或多個胺基酸不同於表IIA的第列5或第7列中所述蛋白質序列的蛋白質。
11.引起權利要求10所述的核酸分子表達的核酸構建體，其包含一個或多個調節元件，由此宿主細胞中所述核酸的表達產生與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量產生。
12.包含權利要求10所述的核酸分子或權利要求11所述的核酸構建體的載體，其中宿主細胞中所述編碼核酸的表達產生與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量產生。
13.宿主細胞，其已經穩定或瞬時轉化了權利要求12所述的載體或權利要求10中所述的核酸分子或權利要求11所述的核酸構建體，並且因轉化顯示與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量產生。
14.用於產生多肽的方法，其中所述多肽在權利要求13所述的宿主細胞中表達。
15.權利要求14所述的方法產生的多肽或權利要求10所述的核酸分子編碼的多肽，其中所述多肽在一個或多個胺基酸上不同於表II中所示的序列。
16.抗體，其特異性結合權利要求15所述的多肽。
17.植物組織、繁殖材料、收穫材料或植物，其包含權利要求13所述的宿主細胞。
18.用於鑑定在植物細胞、植物或其部分，植物或其部分中賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量產生的化合物的方法，其包括以下步驟 a)培養植物細胞；植物或其部分，其維持下述多肽的植物表達，所述多肽由權利要求10的核酸分子編碼，賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量產生；能夠與所述多肽在合適條件下相互作用的未轉化野生型植物或其部分和讀出系統，所述合適條件允許所述多肽與所述讀出系統在化合物或包含大量化合物的樣品存在下相互作用，且所述讀出系統能夠提供響應化合物在下述條件下與所述多肽結合的可檢測信號，所述條件允許所述讀出系統和權利要求10的核酸分子編碼的多肽表達，所述多肽賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量產生；未轉化野生型植物或其部分； b)通過檢測所述讀出系統產生的信號的存在或缺失或增加鑑定所述化合物是否是有效的激動劑。
19.用於製備農用組合物的方法，其包括權利要求18的方法的步驟，和將在權利要求18中鑑定的化合物配製成可用於農業應用的形式的步驟。
20.組合物，其包含權利要求10的核酸分子、權利要求15的多肽、權利要求11的核酸構建體、權利要求12的載體、權利要求18的化合物、權利要求16的抗體，以及任選地農業上可接受的載體。
21.如表II，優選表IIB中所示的分離的多肽，其選自酵母，優選釀酒酵母，或大腸桿菌，優選大腸桿菌K12，和/或集胞藻屬物種PCC 6803。
22.產生與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比具有對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生的轉基因植物細胞、植物或其部分的方法，其中對環境脅迫的耐性和/或抗性和増加的生物量產生通過表達權利要求10的核酸編碼的多肽而提高，所述表達導致與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量產生，其包括a)用權利要求12的表達載體轉化植物細胞、或植物部分，和 b)從所述植物細胞或植物的部分產生轉基因植物，所述轉基因植物與相應的未轉化野生型植物相比具有對環境脅迫提高的耐性和增加的生物量產生。
23.通過增加或產生選自以下的脅迫相關蛋白質(SRP)的一種或多種活性產生轉基因植物的方法，所述轉基因植物在環境脅迫條件下與相應的未轉化野生型植物相比具有增加的生物量2，3- 二羥基-2，3- 二氫丙酸苯酯脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧醯基-(醯基載體蛋白)合酶、酸性熱休克蛋白前體、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白質、b0482-蛋白質、b0631-蛋白質、b0753-蛋白質、b0866-蛋白質、bl052_蛋白質、bll61_蛋白質、bl423_蛋白質、bl878_蛋白質、b2226-蛋白質、b2475-蛋白質、纖維二糖/熊果苷/水楊苷-特異性PTS酶(IIB組分/IC組分)、限制點蛋白質、CP4-57原噬菌體/RNA合酶LS、二氫尿嘧啶核苷合酶、DNA-結合轉錄二元調節蛋白質、D-木糖轉運蛋白亞基、Y -Glu-腐胺合酶、葡糖酸轉運蛋白、葡萄糖-I-磷酸胸苷轉移酶、穀氨醯胺tRNA合酶、穀胱甘肽依賴性氧化還原酶、甜菜鹼轉運蛋白亞基蛋白質、糖原合酶、GTP環化水解酶I、熱休克蛋白、熱休克蛋白HtpX、血紅素裂解酶(CcmH亞基)、己糖醛酸轉運蛋白、組氨酸/賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白亞基蛋白質、HyaA/HyaB-加工蛋白質、內膜蛋白質、L-阿拉伯糖轉運蛋白亞基、Lsm(類似於Sm)蛋白質、L-蘇氨酸3-脫氫酶、甲基乙二醛合酶、多藥運出系統(B亞基)、PTS的N，N' -二乙醯基殼二糖-特異性酶IIA組分、NADH脫氫酶(N亞基)、中性胺基酸運出系統、煙醯胺核苷酸腺苷醯轉移酶、鳥氨酸脫羧酶、泛酸激酶、肽醯基-脯氨酸順反式異構酶A (旋轉異構酶A)、磷酸轉運蛋白、磷脂醯基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、鉀轉運ATP酶(B亞基)、預測的抗微生物肽轉運蛋白亞基、預測的精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白、預測的水解酶、預測的激酶、預測的連接酶、預測的外膜脂蛋白、預測的氧化還原酶(黃素=NADH組分)、預測的孔蛋白、預測的PTS酶(IIB組分/IIC組分)、預測的絲氨酸轉運蛋白蛋白質、預測的轉運蛋白蛋白質、小(40S)核糖體亞基的蛋白質組分、脂多糖鏈的O抗原組分的長度調節物、核糖核酸酶活性調節蛋白質RraA、具有NarP(NarL)的兩組分調節系統中的感受器組氨酸激酶、鈉/質子反向轉運蛋白、剪接因子、蘇氨酸和高絲氨酸運出系統、轉錄調節蛋白質、轉錄抑制蛋白質MetJ、ABC超家族的轉運蛋白亞基/周質結合組分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特異性腺苷脫氨酶、通用應急蛋白質UP12、Yal049c-蛋白質、YCR059C-蛋白質、YEL005C-蛋白質、YER156C-蛋白質、Yfr042w-蛋白質、YGL045W-蛋白質和Y0R024w_蛋白質。
24.權利要求22的方法，其包括 a)用權利要求12的表達載體轉化植物細胞或植物的部分，並 b)從所述植物細胞或植物的部分產生轉基因植物，所述轉基因植物與相應的未轉化野生型植物相比具有對環境脅迫提高的耐性和增加的生物量產生。
25.選自權利要求10的核酸的SRP編碼核酸分子用於製備植物細胞的用途，所述植物細胞與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或植物部分相比具有對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生。
26.選自權利要求10的核酸的SRP編碼核酸分子或其部分作為選擇植物或植物細胞的標記的用途，所述植物或植物細胞與相應的未轉化野生型植物細胞；未轉化野生型植物或其部分相比具有對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量產生。
27.選自權利要求10的核酸的SRP編碼核酸分子或其部分作為檢測植物或植物細胞中脅迫的標記的用途。
28.權利要求I的轉化植物細胞，其中所述環境脅迫選自鹽、乾旱、溫度、金屬、化學、病原性和氧化脅迫，或其組合。
29.權利要求I的轉化植物細胞，其中所述環境脅迫是乾旱和/或乾燥。
30.包含編碼具有選自以下的脅迫相關蛋白質(SRP)的活性的多肽的核酸分子的轉基因植物細胞2，3- ニ羥基-2，3- ニ氫丙酸苯酯脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧醯基-(醯基載體蛋白)合酶、酸性熱休克蛋白前體、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白質、b0482-蛋白質、b0631-蛋白質、b0753-蛋白質、b0866-蛋白質、bl052_蛋白質、bll6ト蛋白質、bl423_蛋白質、bl878_蛋白質、b2226-蛋白質、b2475-蛋白質、纖維ニ糖/熊果苷/水楊苷-特異性PTS酶(IIB組分/IC組分)、限制點蛋白質、CP4-57原噬菌體/RNA合酶LS、ニ氫尿嘧啶核苷合酶、DNA-結合轉錄ニ元調節蛋白質、D-木糖轉運蛋白亞基、Y -Glu-腐胺合酶、葡糖酸轉運蛋白、葡萄糖-I-磷酸胸苷轉移酶、穀氨醯胺tRNA合酶、穀胱甘肽依賴性氧化還原酶、甜菜鹼轉運蛋白亞基蛋白質、糖原合酶、GTP環化水解酶I、熱休克蛋白、熱休克蛋白HtpX、血紅素裂解酶(CcmH亞基)、己糖醛酸轉運蛋白、組氨酸/賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白亞基蛋白質、HyaA/HyaB-加工蛋白質、內膜蛋白質、L-阿拉伯糖轉運蛋白亞基、Lsm(類似於Sm)蛋白質、L-蘇氨酸3-脫氫酶、甲基こニ醛合酶、多藥運出系統(B亞基)、PTS的N，N' - ニこ醯基殼ニ糖-特異性酶IIA組分、NADH脫氫酶(N亞基)、中性胺基酸運出系統、煙醯胺核苷酸腺苷醯轉移酶、鳥氨酸脫羧酶、泛酸激酶、肽醯基-脯氨酸順反式異構酶A (旋轉異構酶A)、磷酸轉運蛋白、磷脂醯基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、鉀轉運ATP酶(B亞基)、預測的抗微生物肽轉運蛋白亞基、預測的精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白、預測的水解酶、預測的激酶、預測的連接酶、預測的外膜脂蛋白、預測的氧化還原酶(黃素NADH組分)、預測的孔蛋白、預測的PTS酶(IIB組分/IIC組分)、預測的絲氨酸轉運蛋白蛋白質、預測的轉運蛋白蛋白質、小(40S)核糖體亞基的蛋白質組分、脂多糖鏈的O抗原組分的長度調節物、核糖核酸酶活性調節蛋白質RraA、具有NarP(NarL)的兩組分調節系統中的感受器組氨酸激酶、鈉/質子反向轉運蛋白、剪接因子、蘇氨酸和高絲氨酸運出系統、轉錄調節蛋白質、轉錄抑制蛋白質MetJ、ABC超家族的轉運蛋白亞基/周質結合組分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特異性腺苷脫氨酶、通用應急蛋白質UP12、Yal049c-蛋白質、YCR059C-蛋白質、YEL005C-蛋白質、YER156C-蛋白質、Yfr042w-蛋白質、YGL045W-蛋白質和Y0R024w_蛋白質， 其中所述多肽賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量產生，優選當所述多肽超量表達時賦予與相應的未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比對環境脅迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量產生。
31.權利要求I或29的植物，其具有 i)在下述條件下的増加的生物量產生，所述條件中的水將限制未轉化野生型植物細胞、植物或其部分的生長， ii)在下述乾旱和/或乾燥條件下的増加的生物量產生，所述乾旱和/或乾燥條件將限制未轉化野生型植物細胞、植物或其部分的生長，和/或 iii)在下述低溼度條件下的增加的生物量產生，所述低溼度條件將限制未轉化野生型植物細胞、 植物或其部分的生長。
全文摘要
本發明總地說來涉及與相應的未轉化野生型植物細胞相比，對環境脅迫具有提高的耐性和/或抗性並且生物量產生增加的植物細胞，其通過在植物中增加或產生與非生物脅迫響應和非生物耐性相關的多肽的一種或多種活性。
文檔編號C07K14/195GK102770542SQ200880100182
公開日2012年11月7日 申請日期2008年5月19日 優先權日2007年5月22日
發明者O·布萊辛, O·蒂姆, P·普齊奧 申請人:巴斯夫植物科學有限公司