一種多肽——二磷酸腺苷核糖二磷酸酶－38.5以及具有這個二磷酸腺苷核糖二磷酸酶的...的製作方法

2023-05-18 14:32:16

專利名稱：一種多肽——二磷酸腺苷核糖二磷酸酶－38.5以及具有這個二磷酸腺苷核糖二磷酸酶的 ...的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物領域，描述了一種純的具有生物活性的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，和具有這個二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的藥學化合物。
在所有的細胞中，二磷酸腺苷核糖(ADP-核糖)是NAD+和(ADP-核糖)蛋白單體的代謝產物，此外，在高等生物中它是多聚二磷酸腺苷核糖以及CADP-核糖的水解產物。如果在體內積聚，它會成為潛在的生物毒素。通過二磷酸腺苷核糖的非酶促糖化能力來調節蛋白質組胺醯基、賴胺醯基以及半胱氨醯基基團，並且還能通過這種能力來連接ATP激活的K+通道。
Nudix水解酶家族的一些成員對於二磷酸腺苷核糖具有高度的專一性，並且在它們底物特定的範圍內包含有二磷酸腺苷核糖。這些水解酶是二磷酸化酶也可能是焦磷酸化酶，它們能夠產生AMP以及5』-磷酸核糖作為產物。這些特異的酶包括NUDT5以及Nudt5等等，它們具有更大的底物專一性並且能以不同的效率對諸如ADP-糖、NADH以及Ap3A等底物進行降解。這些Nudix水解酶可能在保持細胞內的二磷酸腺苷核糖在亞毒素的水平具有重要作用，而Nudix水解酶家族的主要的功能是清理作用。
我們這裡所研究的人類NUDT9基因編碼了一個特殊的鎂離子依賴的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶，它是以兩種結合變體的形式存在的NUDT9α以及NUDT9β。NUDT9α可能具有線粒體N-末端目標信號的作用。由於如上所述二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5蛋白在調節細胞分裂和胚胎發育等機體重要功能中起重要作用，這種蛋白可能構成開發疾病診斷和/或治療藥的基礎。
本發明的另一個目的是提供生產二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的方法。
本發明的另一個目的是提供純化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的方法。
本發明的另一個目的是提供了針對本發明多肽——二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
本發明的另一個目的是提供診斷治療與二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5異常相關的疾病的方法。
本發明也涉及一種藥物組合物，它含有本發明多肽或其模擬物、激活劑、拮抗劑或抑制劑以及藥學上可接受的載體。
本發明還涉及本發明的多肽和/或多核苷酸在製備用於治療原發性高血壓、消化性潰瘍、腎病症候群、支氣管哮喘、震顫麻痺或其它由於二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5表達異常所引起疾病的藥物的用途。
本發明涉及懸浮液的濃縮物，按照本發明在給藥前不久將該濃縮物轉變成浮懸製劑。
這些濃縮物可以具有各種組成。本發明也包括濃縮液和/或懸浮劑與稀釋所需要的溶劑或溶液之間的進一步的組合，由此得到了本發明的懸浮劑。
本發明也涉及另外的表現形式或各種表現形式的結合，所有這些最終都導致了本發明的注射液。
本說明書和權利要求書中使用的下列術語除非特別說明具有如下的含義「生物活性」是指具有天然分子的結構、調控或生物化學功能的蛋白質。類似地，術語「免疫學活性」是指天然的、重組的或合成蛋白質及其片段在合適的動物或細胞中誘導特定免疫反應以及與特異性抗體結合的能力。
「拮抗劑」或「抑制物」是指當與二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5結合時，一種可封閉或調節二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的生物學活性或免疫學活性的分子。拮抗劑和抑制物可以包括蛋白質、核酸、碳水化合物或任何其它可結合二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的分子。
「激動劑」是指當與二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5結合時，一種可引起該蛋白質改變從而調節該蛋白質活性的分子。激動劑可以包括蛋白質、核酸、碳水化合物或任何其它可結合二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的分子。
本發明純化步驟的順序是陽離子交換，親和層析，超濾，凝膠滲透(加上回收組分的超濾)和陰離子交換。
在此純化方法後，用的都是傳統技術。為了儲藏或處理的目的，產物就應該被凍幹。其它對於影響產物濃縮、穩定或其它過程的合適的步驟已經成熟。可以將本發明的酶及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合後用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩衝液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用於疾病治療。
本發明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由製造、使用或銷售藥品或生物製品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5以有效地治療和/或預防具體的適應症的量來給藥。施用於患者的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的量和劑量範圍將取決於許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫生的判斷。
二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5可以以水和/或油注射劑加應用，或作為與某種酸或鹼形成的鹽來使用。以前藥的形式，例如酯，加以應用也是可能的。
作為注射用時，除了水外，肌肉注射的水懸浮液也可以含有液體賦形劑，例如，乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、三甘醇。各種物質的緩衝溶液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、抗壞血酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸和乳酸鹽的緩衝液均可用於調節PH值使之儘量在生理範圍之內(大約PH7.4)或作為緩衝之用。本發明水溶液製劑的PH為4.5-8.5，最好是6.5-7.5。水懸浮液的同滲重摩(osmolality)是200-900 m osmol/kg，最好是260-390mosmol/kg，而且可通過加入氯化鈉、葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、甘露糖醇、蔗糖、木糖醇或這些物質的混合物，來調節到一個適當的等滲條件。
此外，還可以應用一些其他的配方試劑，例如增調劑(如甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、明膠等)，吸附劑，光的遮蔽劑，吸附抑制劑，結晶阻滯劑，絡合劑(如，NaEDTA、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽以及其他鹽)抗氧化劑(抗壞血酸、亞硫酸鹽化含物、L-半胱氨酸、亞硫基二丙酸、硫羥乳酸、單疏代甘油、酸丙酯(propyl gall-ate)等)，防腐劑(PHB酯、酚及其衍生物、有機汞化合物、氯丁醇、苯甲醇、乙醇、1，3-丁二醇、benzalkonium chlorideChlorhexidline salts、苯甲酸及其鹽、山梨酸及其他)。如果合適的話，局部麻醉劑，比如像普魯卡因鹽酸鹽、利多卡因鹽酸鹽諸如此類，可以加進水懸浮液中。
在製備水懸浮液時，必須保顆粒的大小在0.5-150μm。特別為4-40μm。可以通過控制混合活性物質的不同大小顆粒來實現活性物質自肌內懸浮庫的控制釋放。
對於水懸浮液的情形，90％顆粒的大小最好在10-20μm。水懸浮液的粘勵5-500mPa·s，最好是10-130mPa·s。
二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的水懸浮液可以採用不同的方法製備。一種方法是將某種促旋酶抑制劑活性化合物以微粒形式加進水賦形介質中，當然包括已經提及的輔助劑；採用這種工藝時，應該嚴格保證不能使結晶的生長超出上述界限。在某些情況下，活性化合物必須先製作成它的一種穩定的水合物的形式，然後再進一步加工成一種懸浮液。如果最後滅菌不宜用加熱法的話，那麼好必須在無菌條件下進行，使用的活性化合物和輔料要經過預處理。最後，採用輻射滅菌方式是可行的。
二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的水懸浮液還可以通過控制從溶液中沉澱的方法加以製備。例如，將活性化合物溶解某種生理上可耐受的酸中是可行的。這些酸包括鹽酸、甲磺酸、丙酸、琥珀酸、戊二酸、檸檬酸、富馬酸、馬來酸、酒石酸、穀氨酸、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、抗壞血酸、磷酸、己二酸、羥乙酸、硫酸、硝酸、乙酸、蘋果酸、L-天冬氨酸、乳酸、羥乙磺酸、乳糖酸和草酸或者各種胺基酸，如L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨、L-穀氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸和L-絲氨酸，如果需要可以緩慢溫熱至20-80℃通常使用的酸是過量的，例如，根據歐洲專利申請86114131.5和84110474.8的規定。然後，加入一種生理上可以耐受的鹼溶液來調節PH至7(生理PH)，鹼溶液有如氫氧化鈉、氫氧化鉀或麥格魯明(meglumine)，最後活性化合物從溶液中沉澱出來。另一方面，也可以將二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5活性化合物溶解在前述一種鹼的鹼性介質，然後前述的一種酸將其沉澱出來。
然而，酸和鹼溶液可以在不加壓情況合併，也可以加壓，壓力範圍為2到100巴。通過限定條件來控制懸浮液中形成顆粒大小是可能的。實際的沉澱操作也可以使用高速攪拌器，旋轉-固定均化器，高壓均化器(100-1000巴)和其他類似方法以助於均化作用。如果因為可能使顆粒長大而不能在最後滅菌，可以在無菌條件下製備懸浮液，即將預先滅菌並在另一種嚴格滅菌條件下進行無菌過濾的酸和鹼的組分在無菌條件下混合。有時可以應用前述的防腐劑或其結合物，加入一適當的劑量以保無菌製作。最後的滅菌也可以應用了γ-射線滅菌的方式。
另外，還有一種形式可以提供，即這種製劑含有的活性化合物是幹的，沒有液體賦形劑。分裝的液體賦形劑只是在給藥前臨時與處方中的固體組分相混合，在這種情況下必須充分振搖以保證固體顆粒在液相中的均勻分布。
在上述和下面討論的各種肌肉汪射製劑中，油性基質含有水溶性、結晶或無定形的活性化合物，例如以鹽酸鹽乳酸鹽、菜酸鹽、對一甲苯磺酸鹽或其他與生理耐受性好的酸所形成的鹽，基於油性基質的肌肉注射液還可含有表面活性物質，例如呈大豆卵磷脂、雞蛋卵磷脂、腦卵磷脂或油菜卵磷脂形式的各種卵磷脂或其他生理耐受性好的表面活性劑，其濃度為0.1-30％，特別是0.2-10％，尤其是5.5-5.5％W/V，油性基質的肌內注射劑除了含有活性化合物的水溶性鹽以外，還含有過量的生理上可耐受的酸，如乳酸或檸檬酸，其範圍為1-300mmol/L，特別是5-50mmol/L，最好是10-30mmol/L。這種油性基質的肌內注射劑是本發明最特別的目的。
二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的油質懸浮液所含活性化合物是以內鹽的形式或水溶性鹽的形式存在。
油質懸浮液可以含有非水賦形劑，諸如杏仁油、花生油、橄欖油、罌粟子油、芝麻油、棉子油、豆油、玉米油、蓖麻油、油酸乙酯、油酸油酯、十四烷酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、中等鏈長的三甘油酯等。
可以與所提及的物質合併使用的其它賦形劑還有乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、1，3-丁二醇、苯甲醇、各種來源的二乙二醇和三乙二。醇、Pluronic類型的聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚體、聚氧脫 水山梨醇脂肪酸酯、脫水山梨醇脂肪酸酯、甘油-油酸酯、Cremophor EL、imwitor742以及不同種類的卵磷脂諸如大豆卵磷脂、雞蛋卵磷脂、腦卵磷脂和油菜卵磷脂等。
用來作為抗氧劑的有a-、p-、Y-和6-維生素E、棕櫚酸抗壞血酸脂、硬脂酸抗壞血酸酯、L-半胱氨酸、亞硫基二丙酸、硫羥乳酸、巰基乙酸、甲硫代甘油、酸丙酯、丁基羥基茴香醚、丁基羥基甲苯及其他。
有時，某種要求粘度可以加人像乙醇或苯甲醇稀釋劑和象硬脂酸鋁增稠劑來獲得。由於吸附的增加，所以可以加入某些酸。油懸浮劑的粘度值為5-500mPa·S，最好是10-15Pa·s油懸浮劑的製備是通過將油性賦性劑同其中所包含的輔料和活性化合物相混合來進行，活性化合物已事先用適當的儀器粉碎成所希望順粒大小(參見前面)並將混合物勻化。90％的顆粒大小為0.5-150μm。最好時4-12μm。如果因為活性化合物的顆粒大小可能發生變化而不能在釋放容器中進行最後滅菌的話，那麼懸浮劑必須在無菌條件下製作。同時也指明了含有適當的溶解的輔料的油相的無菌過濾方法，例如通過加熱處理對活性化合物進行滅菌預處理。最後的滅菌也可以應用Y-射線滅菌除了作好的懸浮劑以外，還可以提供一種在給藥前不久進行製作的新鮮的製劑。在這種情況下，活性化合物必須在一個短時間內在振搖裝有製劑的容器時，能夠均勻的懸浮在液體賦性劑中。
用於裝載懸浮液、活性化合物、溶劑和其他的表現形式如懸浮液濃縮物的容器可以用玻璃或塑料製作。此處容器的材質可以含有某些物質，這些物質對於內容物可以起著特殊的保護作用，比如避光或與氧隔絕。對小體積容器，其中的懸浮液在給藥之前必須被抽進注射器之中，在此，也可以把這些容器做成注射系統。
本發明的各種注射劑均被應用於人體或動物體的治療。
下面給出一些疾病的例子，能夠用本發明的化合物預防、緩解或治癒的各種疾病(包括但不限於)二磷酸腺苷核糖(ADP-核糖)是NAD+和(ADP-核糖)蛋白單體的代謝產物，此外，在高等生物中它是多聚二磷酸腺苷核糖以及CADP-核糖的水解產物。如果在體內積聚，它會成為潛在的生物毒素。這些Nudix水解酶包括NUDT5以及Nudt5等等可能在保持細胞內的二磷酸腺苷核糖在亞毒素的水平具有重要作用，而Nudix水解酶家族的主要的功能是清理作用。
我們這裡所研究的人類NUDT9基因編碼了一個特殊的鎂離子依賴的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶，在體內，其表達的異常將導致機體代謝產物的堆積，引起一系列疾病，這些疾病包括但不限於一.心血管疾病心力衰竭，原發性高血壓，動脈粥樣硬化，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，心肌病，病毒性心肌炎等；二.消化系統疾病胃炎，消化性潰瘍，胃癌，潰瘍性結腸炎，Crohn病，肝硬化，原發性肝癌，急性胰腺炎，膽石病等；三.泌尿系統疾病原發性腎小球疾病，慢性腎小球腎炎，腎病症候群，陣發性睡眠性血紅蛋白尿，溶血尿毒症候群，腎盂腎炎，急慢性腎功能不全，腎移植，慢性前列腺炎等；四.呼吸系統疾病上呼吸道感染，支氣管哮喘，呼吸衰竭，成人呼吸窘迫症候群(ARDS)，阻塞性肺氣腫，慢性肺源性心臟病，肺水腫，肺炎等；五.代謝內分泌疾病糖尿病，肝豆狀核變性，慢性淋巴細胞性甲狀腺炎，類風溼關節炎，系統性紅斑狼瘡(SLE)等；六.血液系統疾病缺鐵性貧血，巨幼細胞性貧血，再生障礙性貧血，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷症，海洋性貧血，骨髓增生異常症候群，急性白血病，淋巴瘤，多發性骨髓瘤，彌散性血管內凝血(DIC)等；七.神經系統疾病腦水腫，顱腦損傷，高血壓性腦出血，蛛網膜下腔出血，腦梗死，震顫麻痺，癲癇，病毒性腦炎等；八.新生兒疾病新生兒窒息，新生兒吸入症候群，新生兒缺血缺氧性腦病，新生兒上呼吸道感染，新生兒肺炎，新生兒透明膜病，支氣管肺發育不良，新生兒敗血症，新生兒硬腫症，地中海貧血等；九.外科疾病肺癌，食管癌，胃癌，胸部創傷等；十.婦產科疾病流產，胎膜早破，子宮內膜異位症，妊娠高血壓綜合症，子宮頸癌，外陰惡性腫瘤，子宮內膜癌等；十一.五官科疾病復發性口腔潰瘍，牙髓炎，口腔鱗癌，喉癌，突發性耳聾，老年性白內障等；十二.其他，如多臟器功能失調症候群、休克等；綜合上述，本發明的多肽以及該多肽的拮抗劑，激動劑和抑制劑可直接用於多種疾病的診治，例如原發性高血壓、消化性潰瘍、腎病症候群、支氣管哮喘、震顫麻痺等。下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由所界定的本發明範圍。


圖1為分離的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。39kDa為蛋白質的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產品)的多克隆位點上，轉化DH5α，細菌形成cDNA文庫。用Dyeterminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列資料庫(Genebank)進行比較，結果發現其中一個克隆Nudt的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結果表明，Nudt克隆所含的全長cDNA為1666bp(如Seq ID NO1所示)，從第295bp至1347bp有一個1053bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(如Seq ID NO2所示)。我們將此克隆命名為pBS-Nudt，編碼的蛋白質命名為二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。實施例2用RT-PCR方法克隆編碼二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的基因用胎腦細胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉錄反應合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化後，用下列引物進行PCR擴增Primer15』-GGCAGAGAGAAAGTTACGAGGTTC-3』(SEQ ID NO3)Primer25』-TGATCAAGAATTTATCTTTATTCT-3』(SEQ ID NO4)Primer1為位於SEQ ID NO1的5』端的第1bp開始的正向序列；Primer2為SEQ ID NO1的中的3』端反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產品)。在PE9600型DNA熱循環儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應25個周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR時同時設β-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產品)。DNA序列分析結果表明PCR產物的DNA序列與SEQ ID NO1所示的1-1666bp完全相同。實施例3重組二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的體外表達、分離和純化根據SEQ ID NO1，設計出一對特異性擴增引物，序列如下Primer35』-CCCCATATGATGGCGGGACGCCTCCTGGGAAAG-3』(Seq ID No5)
Primer45』-CCCGAATTCCTACAACGCATGGCAGTCAGCTTC-3』(Seq ID No6)此兩段引物的5』端分別含有NdeI和BamHI酶切位點，其後分別為目的基因5』端和3』端的編碼序列，NdeI和BamHI酶切位點相應於表達載體質粒pET-28b(+)(Novagen公司產品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-Nudt質粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-Nudt質粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產品)1μl。循環參數94℃ 20s，60℃ 30s，68℃ 2min，共25個循環。用NdeI和BamHI分別對擴增產物和質粒pET-28(+)進行雙酶切，分別回收大片段，並用T4連接酶連接。連接產物轉化用氯化鈣法大腸杆細菌DH5α，在含卡那黴素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養過夜後，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，並進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-Nudt)用氯化鈣法將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產品)。在含卡那黴素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養基中，宿主菌BL21(pET-Nudt)在37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續培養5小時。離心收集菌體，經超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產品)進行層析，得到了純化的目的蛋白二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。經SDS-PAGE電泳，在39kDa處得到一單一的條帶(圖1)。將該條帶轉移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端胺基酸序列分析，結果N-端1 5個胺基酸與SEQ ID NO2所示的N-端15個胺基酸殘基完全相同。
實施例4根據本發明純化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5準備或調整發酵物的濃縮液(centrat)，或其它任何來源(如血清)的不純的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5溶液以便用陽離子交換基質進行層析，同時防止二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的多聚化(通過加入正率酸)和蛋白酶活性(通過加熱或選擇不含損害水平的蛋白酶的酵母)。優選地是加入辛酸鈉(色譜溶液13(CS13)-表2)至終濃度1-10mM，例如約5mM以穩定二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。用乙酸(CS09)調pH至4.3-4.8，優選地為4.5±0.1最優選地為±0.05)，電導率檢測應小於5.5smScm-1。
來源於某些宿主菌株或種的培養物上清含有在後續過程中能降解重組人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的蛋白酶。這種情況下；這種蛋白酶的活性可通過對含有重組人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的培養物上清加熱處理以破壞。通常1-10mM辛酸鈉足以防止重組人的蛋白的熱變性，在60-80℃的溫度下30秒至10分鐘足以使蛋白酶失活。隨後；上清可進一步如前所述地調節。如果不存在蛋白酶的降解作用，優選地省略熱處理。
層析所有的操作均可在室溫下(20±0℃)進行。層析柱中二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的上樣量(g二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基質)取決於用SDS-PAGE(在SP-FF柱的情況下)或GP-HPLC(對所有其它柱)確定的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5滴度(g/L)。每一步驟的過程可用連機的紫外吸收，如在254或280nm測定來監測。
第一步純化步驟中陽離子基質的使用使大部分從酵母發酵中得到低分子量有色物質直接通過柱子，而那些與基質結合的也是弱的結合且能用諸如1M氯化鈉的高離子強度的鹽洗滌液去除。因此；不象陰離子基質，其不可逆地吸附那類物質；陽離子基質可再生並用於純化中第一步的層析的多次循環。因而，這一步驟形成了耐用的商品化的層析方法的基礎。
在本實施例中應用Cibacron藍型柱作為第一步純化對於特異地用於去除一種由於其物理化學特徵；如大小和等電點而難以從二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5中去除的45KDa的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5片段是新穎的。該片段令人吃驚地比全長的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5能更強地與染料結合，因而可將它們分離。
二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5純化中所用的層析液詳細列於表1中。因為在二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5純化中大量使用，並且相對廉價，這種緩衝鹽溶液因其工業上可提供高純度的形式和與其它通常用於緩衝液的如TriS、HEPES或MOPS相比廉價而最適於本方法。其它的緩衝液可代替表2中所列，如相近pKa值的緩衝液(如蘋果酸對乙酸)，但在大多數情況下，價錢如在大範圍的適用性排除了他們的應用。其它的鹽形式的使用取決於其可溶性，可工業上提供及低價格。然而，在CS06和CS10柱中包含四硼酸鹽離子有特殊的益處因為其在與大分子的碳水化合物部分複合和使其與基質中的陰離子基團緊密結合起特別的作用。這一結果可以增加洗脫液中二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的純度。
層析可使用軸流式柱(axial flow columns)，如由Pharmacia提供的那種，或輻流式柱(radial flow columns)，如由Sepragen提供的那種。在本實施例中，所用的柱子都是軸流式。
緩衝溶液可按下述濃度扼配製；或者配製濃縮的貯存液，使用時即時混和或稀釋。
表1 用於純化實施例中的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的層析溶液
陽離子交換層析二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是用陽離子交換層析，從至少是酵母蛋白(如果二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是來源於酵母發酵的重組人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5和其它抗原，低分子量雜質和色素化合物中純化和濃縮。本方法採用的是商品化的陽離子交換基質，如SP-瓊脂糖FF，SP-多孔微球矽膠(Spenerosil)，CM-瓊脂糖FF，CM-纖維素，SE-纖維素或S-葡聚糖凝膠。優選的基質是SP-瓊脂糖FF(Pharmacia)床高5-25cm，優選地為10-15cm，本實施例為12.scm，柱的上樣量為10至50g二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基質；優選地為40±10g二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基質。基質以緩衝液平衡以去除鹼性貯存液，緩衝液優選地應具足夠的緩衝能力以降低ph至約pH6.0、如CS01的緩衝液用於去除柱中的CS07貯存液；然而，任何PH小10於6.0的緩衝液都可使用。當柱流出液的PH值約6對時，即可判斷為平衡完成。
調整的濃縮液(centrate)以一定的流率加入層析柱，例如以1.0-8.0cm/min；優選地為4.0-7.0cm/min，本實施例為6.36cm/min，然後以一種溶液洗滌柱子以去除殘留的雜質。這種洗滌溶液應為PH＜6.0並且電導率15低於5mScm-1』；優選地低於3mScm-1以防二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5被洗脫。合適的溶液是CS01。前面的步驟都以6.36cm/min的流率進行；對於洗脫和所有隨後的步驟流率降至0.5-5cm/min，優選地為2.0-4.0c./min。本實施例為3.18cm/min，以減少洗脫的體積、增加離子強度將有效地洗脫二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5；使用電導率範圍在5-10mscm-1的溶液，優選地為6-8mscm-1，本實施例使用CS02。當紫外吸收信號上升至1.0A280/cm以上時開始收集二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，直至紫外吸收信號降至0.6A280/Cm或收集的最大體積達65倍柱體積時為止。層析柱然後用CS03和04清洗，貯藏於CS07。
親和層析這一步進一步純化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，以去除45KDa二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5N-末端片段，酵母抗原(如果二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是來源於酵母發酵的重組人{多肽名稱})和色素。親和基質可包括任何型的結合二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5Cibacron0藍染料，如活性藍2，Procion藍HB，藍瓊脂糖，藍丙烯醯基和其它蒽醌型化合物。該基質優選地是下述的「Delta藍瓊脂糖」基質。這可降低基質產生藍浸出液的程度和增強基質的鹼穩定性以有助於洗滌和去熱原。和商品化的基質相比，進一步改進的基質是在染料(活性藍2)和基質之間引入一間隔基團，1，4—二氨基丁烷。這對於二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5純品的洗脫而言；間隔基團的長度是合適的。
活性藍結構中鄰位，間位或對位異構體或任何其混合物都可使用。優選的異構體是鄰位SO3型，但難以製備理想的純度，故使用間位異構體。氨丁酞一活性藍2的製備達到用分析型高效液相色譜測定至少整個峰區佔98％的純度。還可通過使用粗的商品化的染料，其必須純化氨丁醯衍生的染料，或使用純的合成的染料。在後一種方法中，開始用的染料物質應在分析型高效液相色譜280nm測定純度至少為98％。這種材料由ACL，Isle of Man提供。通過加熱混和物至60℃，使活性藍2與1，4-二氨基丁烷在水中反應，然後以混合物中純化修飾的染料，如通過沉澱。然後氨丁醯-活性藍2與基質偶合，例如與3-氯-1-2-環氧丙烷活化的瓊脂糖CL-6B(Pharmacia，瑞典)偶合。見Porath等(1971)色譜雜誌(J.Chromatog)60，167-177。這種Delta藍瓊脂糖(DBA)基質的染料的含量優選地是50±5mmol/g乾重。
藍基質的使用本方法使用DBA；床高10-30cm，優選地為20-30cm(本實施例為25Cm，柱的上樣量為7.14g重組人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基質；優選地為8-12g/L(本實施例為10±1g二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基質)。所有步驟以0.3-2.cm/min的流率進行，優選地為1.-2.0Cm/min。本實施例中為153cm/min。DBA在來源自CS07的CS01中平衡；當柱中流出液的ph約為9.5時，平衡完成。層析之前；SP-FF的洗脫液用氨調節…約為8.5-9.5，優選地PH9.0，然後上樣至層析柱。上樣完畢後；層析柱以1-5倍體積的電導率10-30mScm-1；優選地是15-25mSm-1的緩衝液洗滌以去除雜質，例如用CS12，優選地以5倍體積。二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5用電導率大於100mScm-1，優選地為125-165mScm-1的高離子強度的緩衝液洗脫，例如用CS03。當紫外信號(A280/cm)升至高於0.4對時開始收集洗脫液，在信號再次低於0.4時停止。層析柱再用CS04洗滌並貯存於CS07。
中間體超濾這一步為進行凝膠滲透層析而濃縮二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。超濾裝置中的纖維素型濾膜(最小分子量截留低於或相當於30,000，例如10,000)用於濃縮DBA洗脫液以保持二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5濃度20-120g/L，優選地為80-100g/L。使用後，濾膜以水或表3中的CS03或CS05衝洗去殘留的蛋白質，並以0.1M的氫氧化鈉清洗。濾膜可貯存於20mM的氫氧化鈉中。凝膠滲透層析。這一步純化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是針對酵母蛋白(如果二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是來源於酵母發醇的重組人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，色素和二聚化的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5並進行緩衝液交換的步驟。本方法使用商品化的凝膠滲透基質，如交聯葡聚糖凝膠G100；G150，G250，Sephacryl S-100，S-200或S-300，Toyopearl HW50S或瓊脂糖凝膠6或12。優選地，基質為SePhacryl-200HR(Pharmacia)凝膠床高度大於60cm，最好在90cm(3×30cm)。層折柱在CS05中平衡並以0.1-1.5cm/min，優選地為0.5-1.0cm/min的流率進行層析，在本實施倒流率為0.75cm/min；然後當層析柱的ph達到9.5時，將中間體超濾所得的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5上樣至層析柱。上樣體積約相當2-9％細層析柱體積，優選地為5-8％，本實施例為柱體積的7.5％。二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5組分分三部分收集棄去最初小量的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5二聚體直至A280/Cm上升至指針滿偏(FSD)的10％；這時開始連續收集回收的組分直至達滿偏的90％；然後所收集的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5作為初級產品組分。這一連續收集直至A280降至5％滿偏值之下，之後的流出液再直接棄去。回收初級產品組分分開收集。重複這一步驟直至所有原料上樣至層析柱。
S-200HR回收超濾一種標稱截流分子量等於或小於30,000，或如本實施例所用的10,000的纖維素型濾膜置於超濾裝置中，用以濃縮匯集的回收組分至保留濃度為20-120g/L二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5；優選地為80-110g/L。使用後的濾膜按中間體超濾中所述方法處理。
另一種選擇是，在本方法的任何超濾步驟中，標稱截流分子量30.000的聚醚楓或PVDF膜可代替纖維素型的濾膜。這種膜由Amicon和Millipore提供。最好選用適宜NaOH貯存和清洗的濾膜。
S-200HR回收超濾保留物的純化。從回收超濾所得的保留物上樣至和初級S-200純化同樣的層析柱，從每個峰收集產物組分；然後與前面收集的大量的初級產物組分混和。重複這一步驟直至所有的原料上樣至層析柱。
陰離子交換層析這一步的目的是純化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5以去除至少酵母抗原(如果二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是來源自酵母發酵的重組人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5和含色素的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。本方法使用的陰離子交換基質，如QMA-多孔微球矽膠(SPherosil)，DEAE-SPherodex，Q-Hvper D，DEAE-纖維素，QAE-纖維素或W-DMAE或DEAE分級凝膠(Fractogel優選地。基質用商品化的陰離子交換基質二乙氨基乙基瓊脂糖凝膠-FF(DEAE Sepharose-FF)(Phannacia)，床高在5-25cm範圍內根據方便選擇，優選地為10-15cm，如12.scm，柱的上樣量為每升基質10-60g，優選地為35±15g/L基質。層析柱首先以強的緩衝液平衡將pH迅速降至工作範圍，如pH4.5-6.0，優選地為約出5.5的乙酸鈉，以CS11為例。使用濃的緩衝液之後，在加S200洗脫液於柱子之前，用一種低電導率，即範圍在1-4mSm-1。優選地為2.5-3.5mSm-1。例如CS08的溶液平衡層析柱。所用的線性流率為1.0-8.0cm/min，優選地為3.0-7.0cm/min，本實施例為4.4cm/min。上樣完畢後，層析柱以5-30mM範圍，優選地是15-25mM的四硼酸鈉溶液洗滌，例如用CS10。這導致洗脫二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5組分之前，任何含碳水化合物的雜質更強地粘附在層析柱上。用任何範圍在10-20mScm-1的高離子強度的溶液可有效地洗脫，優選地用CS06。當A280/cm達到0.4時開始連續收集洗脫液直至吸收峰降至0.8以下。
因此，在本實施例中；純化步驟的順序是陽離子交換，親和層析，超濾，凝膠滲透(加上回收組分的超濾)和陰離子交換。
實施例6 藥劑的配製本發明獲得含有二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的製劑後。既然該物質在凍幹後仍具有活性，可適合製成注射劑。
用生理鹽水和/或其他合適的稀釋液配製含有二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5凍乾粉的注射液。
一些賦形劑可作為藥物的組成部分，諸如甘露醇、乳糖、糖膠、葡萄糖、蔗糖及其他混合物。其他的一些載體、填充物及諸如此類可以使用。混合物亦可。
根據本發明，實驗中乳糖被作為注射藥的賦形劑。
在製備注射劑中，PH值通過常規酸或鹼調定。酸包括醋酸等。鹼包括氫氧化鈉等。混合物亦可。
還需要一種或多種穩定劑比如白蛋白等。
製備每20000安瓿含75國際單位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，製法如下適量的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5凍乾粉末溶於700ml冷水中，如必須，可用醋酸或氫氧化鈉(視情況而定)，將PH值調至6.2-6.8。然後通過0.2微米的小孔過濾器過濾消毒。200克乳糖溶於2立升冷水中，注射用，如上法過濾消毒後加入二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5溶液中。將冷水加至15立升，然後將溶液等分至0.75ml/安瓿，並在消毒凍幹器凍幹。這樣所得的安瓿含有75國際單位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5和10ml乳糖。
每安瓿含有150國際單位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是首選劑量。
根據進一步的配製實例，每安瓿還需含有1mg人白蛋白作為賦形劑乳糖的穩定劑。
這些特例對本發明進行了描述，但可以理解此外在本發明的所及範圍內還有許多可變性。
序列表(1)一般信息(ii)發明名稱二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5及其編碼序列，以及含有其成分的藥學化合物(iii)序列數目6(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度1666bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11 GGCAGAGAGAAAGTTACGAGGTTCGTGGCCGCGGTTTCCCCAGGCAGCTGGCGCTGGAGG61 CTTCGGCGTCACGTGCTGGTCTGGATTTTTCTCGATGCACTGGGGAAAGCGGTGGACTCT121 TATCGTGGGAGGGCTCTTGATCTGTGATTTATAGATAGGCACAGGGAACCCAACGGCAGA181 CAGGTCCTAGTGCCCATCAGATACCCGCGGCCGGGACTCGGAGCTGTGGGGTGTGGGGAG241 GCGGAGGCACCAACTAAGAGCGACCTAGCATCGCAAAGCCGCCTCGGGGCGCTCATGGCG301 GGACGCCTCCTGGGAAAGGCTTTAGCCGCGGTGTCTCTCTCTCTGGCCTTGGCCTCTGTG361 ACTATCAGGTCCTCGCGCTGCCGCGGCATCCAAGCGTTCAGAAACTCGTTTTCATCTTCT421 TGGTTTCATCTTAATACCAACGTCATGTCTGGTTCTAATGGTTCCAAAGAAAATTCTCAC481 AATAAGGCTCGGACGTCTCCTTACCCAGGTTCAAAAGTTGAACGAAGCCAGGTTCCTAAT541 GAGAAAGTGGGCTGGCTTGTTGAGTGGCAAGACTATAAGCCTGTGGAATACACTGCAGTC601 TCTGTCTTGGCTGGACCCAGGTGGGCAGATCCTCAGATCAGTGAAGGTAATTTTTCTCCC661 AAGTTTAACGAAAAGGATGGGCATGTTGAGAGAAAGAGCAAGAATGGCCTGTATGAGATT721 GAAAATGGAAGACCGAGAAATCCTGCAGGACGGACTGGACTGGTGGGCCGGGGGCTTTTG781 GGGCGATGGGGCCCAAATCACGCTGCAGATCCCATTATAACCAGATGGAAAAGGGATAGC841 AGTGGAAATAAAATCATGCATCCTGTTTCTGGGAAGCATATCTTACAATTTGTTGCAATA901 AAAAGGAAAGACTGTGGAGAATGGGCAATCCCAGGGGGGATGGTGGATCCAGGAGAGAAG961 ATTAGTGCCACACTGAAAAGAGAATTTGGTGAGGAAGCTCTCAACTCCTTACAGAAAACC1021 AGTGCTGAGAAGAGAGAAATAGAGGAAAAGTTGCACAAACTCTTCAGCCAAGACCACCTA1081 GTGATATATAAGGGATATGTTGATGATCCTCGAAACACTGATAATGCATGGATGGAGACA1141 GAAGCTGTGAACTACCATGACGAAACAGGTGAGATAATGGATAATCTTATGCTAGAAGCT1201 GGAGATGATGCTGGAAAAGTGAAATGGGTGGACATCAATGATAAACTGAAGCTTTATGCC1261 AGTCACTCTCAATTCATCAAACTTGTGGCTGAGAAACGAGATGCACACTGGAGCGAGGAC1321 TCTGAAGCTGACTGCCATGCGTTGTAGCTGATGGTCTCCGTGTAAGCCAAAGGCCCACAG1381 AGGAGCATATACTGAAAAGAAGGCAGTATCACAGAATTTATACTATAAAAAGGGCAGGGT1441 AGGCCACTTGGCCTATTTACTTTCAAAACAATTTGCATTTAGAGTGTTTCGCATCAGAAT1501 AACATGAGTAAGATGAACTGGAACACAAAATTTTCAGCTCTTTGGTCAAAAGGAATATAA1561 GTAATCATATTTTGTATGTATTCGATTTAAGCATGGCTTAAATTAAATTTAAACAACTAA1621 TGCTCTTTGAAGAATCATAATCAGAATAAAGATAAATTCTTGATCA(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度350個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO21 Met Ala Gly Arg Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ala Ala Val Ser Leu16 Ser Leu Ala Leu Ala Ser Val Thr Ile Arg Ser Ser Arg Cys Arg31 Gly Ile Gln Ala Phe Arg Asn Ser Phe Ser Ser Ser Trp Phe His46 Leu Asn Thr Asn Val Met Ser Gly Ser Asn Gly Ser Lys Glu Asn61 Ser His Asn Lys Ala Arg Thr Ser Pro Tyr Pro Gly Ser Lys Val76 Glu Arg Ser Gln Val Pro Asn Glu Lys Val Gly Trp Leu Val Glu91 Trp Gln Asp Tyr Lys Pro Val Glu Tyr Thr Ala Val Ser Val Leu106 Ala Gly Pro Arg Trp Ala Asp Pro Gln Ile Ser Glu Gly Asn Phe121 Ser Pro Lys Phe Asn Glu Lys Asp Gly His Val Glu Arg Lys Ser136 Lys Asn Gly Leu Tyr Glu Ile Glu Asn Gly Arg Pro Arg Asn Pro151 Ala Gly Arg Thr Gly Leu Val Gly Arg Gly Leu Leu Gly Arg Trp166 Gly Pro Asn His Ala Ala Asp Pro Ile Ile Thr Arg Trp Lys Arg181 Asp Ser Ser Gly Asn Lys Ile Met His Pro Val Ser Gly Lys His196 Ile Leu Gln Phe Val Ala Ile Lys Arg Lys Asp Cys Gly Glu Trp211 Ala Ile Pro Gly Gly Met Val Asp Pro Gly Glu Lys Ile Ser Ala226 Thr Leu Lys Arg Glu Phe Gly Glu Glu Ala Leu Asn Ser Leu Gln241 Lys Thr Ser Ala Glu Lys Arg Glu Ile Glu Glu Lys Leu His Lys256 Leu Phe Ser Gln Asp His Leu Val Ile Tyr Lys Gly Tyr Val Asp271 Asp Pro Arg Asn Thr Asp Asn Ala Trp Met Glu Thr Glu Ala Val286 Asn Tyr His Asp Glu Thr Gly Glu Ile Met Asp Asn Leu Met Leu301 Glu Ala Gly Asp Asp Ala Gly Lys Val Lys Trp Val Asp Ile Asn316 Asp Lys Leu Lys Leu Tyr Ala Ser His Ser Gln Phe Ile Lys Leu331 Val Ala Glu Lys Arg Asp Ala His Trp Ser Glu Asp Ser Glu Ala346 Asp Cys His Ala Leu(4)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3GGCAGAGAGAAAGTTACGAGGTTC(5)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4TGATCAAGAATTTATCTTTATTCT(6)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度33鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CCCCATATGATGGCGGGACGCCTCCTGGGAAAG(7)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度33鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CCCGAATTCCTACAACGCATGGCAGTCAGCTTC
權利要求
1.一種分離的多肽-二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，其特徵在於它包含有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於所述多肽、類似物或衍生物的胺基酸序列具有與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列至少95％的相同性。
3.如權利要求2所述的多肽，其特徵在於它包含具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的多肽。
4.如權利要求1所述的多肽，在每毫克凍乾粉末中含有大概6200國際單位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的這樣規格下，具有特有的活性。
5.與權利要求1所述的多肽相關的能夠進行治療的藥學化合物，和藥學上的賦形體。
6.如權利要求5所述的藥學化合物，它的賦形體是乳糖。
7.如權利要求5所述的藥學化合物，它的一個計量單位中含有75個國際單位的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。(如另有一個計量單位，可作為權利要求8)
8.如權利要求1所述的多肽，在每毫克凍乾粉末中含有6200國際單位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的這樣規格下，具有特有的活性。
9.二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的肌內注射劑，其中含有0.05-70％的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，適當時，可作為與酸和鹼形成的鹽或作為前藥，製劑形式為水性或油性懸浮液。
10.根據權利要求9的肌內注射劑在於{多肽名稱}顆粒的大小為0.5-150μm，最好為4-40μm。
11.根據權利要求9的肌內注射劑的其特徵在於它們的同滲重摩(osmolality)是200-900 m osmol/kg，最好是260-390 m osmol/kg。
12.根據權利要求9、10、11的肌內注射劑，其特徵是它們含有2.5-50％(重量)的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。
13.根據權利要求9的肌內注射劑在治療人體和動物體方法的應用。
全文摘要
本發明公開了一種多肽－二磷酸腺苷核糖二磷酸酶－38.5,和具有這個二磷酸腺苷核糖二磷酸酶的藥學化合物。本發明還公開了此多肽用於治療多種疾病的方法,如原發性高血壓、消化性潰瘍、腎病症候群、支氣管哮喘、震顫麻痺等。本發明還公開了編碼這種新的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶－38.5的多核苷酸的用途。
文檔編號C07K16/40GK1382798SQ0111277
公開日2002年12月4日 申請日期2001年4月26日 優先權日2001年4月26日
發明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海博德基因開發有限公司