新型ω‑3脂肪酸去飽和酶及二十碳五烯酸的製造方法與流程

2023-05-18 04:34:41

本發明涉及具有ω-3去飽和酶活性的新型多肽及編碼該多肽的基因、以及它們用於生成二十碳五烯酸的應用。
背景技術：
：：高度不飽和脂肪酸是具有2個以上不飽和鍵的脂肪酸，可列舉ω-6不飽和脂肪酸的亞油酸(la，18:2n-6)、γ-亞麻酸(gla，18:3n-6)、花生四烯酸(ara，20:4n-6)，ω-3不飽和脂肪酸的α-亞麻酸(ala，18:3n-3)、二十碳四烯酸(eta，20:4n-3)、二十碳五烯酸(epa，20:5n-3)、二十二碳六烯酸(dha，22:6n-3)等。高度不飽和脂肪酸除了作為生物體膜的主要構成成分參與膜的流動性調節之外，作為生物體功能性成分的前體也很重要。ara或epa在高等動物體內是前列腺素、血栓素、白三烯等的前體，dha是腦內存在最多的高度不飽和脂肪酸。epa具有血小板聚集抑制作用、血中中性脂肪減少作用、抗動脈硬化作用、血液粘度降低作用、降血壓作用、抗炎作用、抗腫瘤作用等生理作用，被用於藥品、食品、化妝品、飼料等各種領域。此外，近年來，從預防生活習慣病的觀點來看，推薦積極攝取ω-3不飽和脂肪酸，是需求增加顯著的脂質分子種類。生物體的dha或epa除了從食物攝取以外，在一部分生物中由ala進行生物合成。另一方面，由於人無法生物合成ala，因此dha或epa對於人來說在營養學上是必需脂肪酸。epa主要大量包含於鱈魚、鯡魚、青花魚、鮭魚、沙丁魚、磷蝦等的魚油，利文斯頓島希瓦氏菌(shewanellalivingstonensis)等海洋性低溫細菌，網粘菌綱(labyrinthulomycetes)等的藻類等中。已知從這些生物資源中提取或純化epa的方法。最常進行的是從魚油中純化epa。然而，魚油中的epa含量低，而且來源於魚油的epa根據提取或純化的方法還存在著殘留魚腥味、或被視為心臟病原因的芥酸的含量增加的問題。近年來，關係到能量問題等，在細胞內蓄積脂質的產脂質微生物受到矚目，開發了以微生物學方式生產各種脂質的方法。例如，利用作為絲狀菌的1種的屬於被孢黴屬(mortierella)的微生物的高度不飽和脂肪酸的生產方法的研究正在進行。已知被孢黴屬微生物具有ω-3或ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑，並生產epa(非專利文獻1)。在專利文獻1中揭示了培養產生epa的被孢黴屬微生物而獲得epa的方法。在專利文獻2中揭示了使用對高山被孢黴(mortierellaalpina)施行突變處理而得的突變株來生產ara或epa的方法。在專利文獻3中揭示了使用將由高山被孢黴分離的ω-3去飽和多肽的基因導入酵母中而得的轉化株來生產epa等高度不飽和脂肪酸的方法。但是，被孢黴屬微生物的ω-3去飽和酶的最適溫度低，在菌容易增殖的常溫條件(20℃左右)下無法充分地發揮作用。因此，即使以通常的培養溫度培養被孢黴屬微生物，也無法高效地生產epa。另外，被孢黴屬微生物的ω-3去飽和酶優先與碳鏈長為18的脂肪酸作用，因此利用上述被孢黴屬微生物的以往的方法難以高效地生產碳鏈長為20的epa。因此，需要可以由碳鏈長為20的脂肪酸(例如ara)高效地合成epa的ω-3去飽和酶。專利文獻4中記載了由異絲水黴(saprolegniadiclina)分離的ω-3去飽和酶，專利文獻5中記載了由櫟樹猝死病菌(phytophthoraramorum)分離的δ17去飽和酶，專利文獻6中記載了由瓜果腐黴(pythiumaphanidermatum)分離的δ17去飽和酶。現有技術文獻專利文獻專利文獻1:日本特開昭63-14697號公報專利文獻2:日本特開平11-243981號公報專利文獻3:日本特開2006-055104號公報專利文獻4:日本特表2005-515776號公報專利文獻5:日本特表2009-534032號公報專利文獻6:日本特表2010-508019號公報非專利文獻非專利文獻1:appl.microbiol.biotecnol.,1989,32:1-4。技術實現要素：發明所要解決的技術問題本發明涉及提供即使在20℃以上的常溫下也具有高的酶活性的ω-3去飽和酶、及具有該ω-3去飽和酶且可高效地生產以高濃度含有epa等ω-3不飽和脂肪酸的油脂的產脂質細胞。另外，本發明還涉及提供利用了該產脂質細胞的含有大量epa的油脂的工業生產手段。解決技術問題用的手段發明人經過各種研究，結果發現了，即使在常溫下也對碳數20的脂肪酸具有高ω-3去飽和活性的新型ω-3去飽和酶及編碼該酶的基因。本發明人還發現在導入有編碼上述ω-3去飽和酶的基因的轉化細胞中，在常溫下epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸的生產效率提高。即，本發明提供一種多肽，所述多肽由與seqidno:2所示的胺基酸序列具有80%以上的同源性的胺基酸序列構成，並且具有對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性；此外，本發明還提供編碼上述多肽的多核苷酸；此外，本發明還提供含有上述多核苷酸的載體；此外，本發明還提供導入有上述多核苷酸的轉化細胞；進而，本發明提供含二十碳五烯酸的脂質的生產方法，該方法包括：培養表達上述多肽的細胞；進而，本發明提供二十碳五烯酸的生產方法，該方法包括：純化通過上述方法生產的含二十碳五烯酸的脂質。發明的效果本發明的ω-3去飽和酶在細胞容易增殖的20℃以上的常溫條件下對於碳數20的脂肪酸具有高ω-3去飽和活性，可在epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸的生物合成中發揮作用。因此，如果培養表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞，則該細胞內可高效地生產epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸。epa是在藥品、食品、化妝品、飼料等各種領域中被使用的重要的高度不飽和脂肪酸，所以可適用於epa的工業規模的生產的本發明在該領域非常有用。附圖說明圖1是高山被孢黴(mortierellaalpina)1s-4中的脂肪酸生物合成途徑；圖2是高山被孢黴用轉化二元載體的例子；圖3是實施例3和5中所製作的ω-3去飽和酶基因導入高山被孢黴株的脂肪酸生產量。a:1ml培養液中的各脂肪酸的生產量(mg)，b:1mg乾燥菌體中的各脂肪酸的生產量(mg)，c:相對於總脂肪酸量的各脂肪酸的組成(%)。宿主株:對照，g#18和g#22:實施例3中製作的株，c#14和c#16:實施例5中製作的株。具體實施方式本說明書中，只要沒有另行定義，關於胺基酸序列或核苷酸序列中的胺基酸或核苷酸的缺失、取代、添加或插入所使用的「一個或多個」可以是例如1～20個，較好是1～10個，更好是1～5個，進一步更好是1～4個，又更好是1～3個，又進一步更好是1～2個。此外，本說明書中，胺基酸或核苷酸的「添加」包括在序列的一個末端或兩個末端添加一個或多個胺基酸或核苷酸。本說明書中，胺基酸序列或核苷酸序列的同源性可使用karlin和altschul的算法blast(pro.natl.acad.sci.usa,1993,90:5873-5877)或者fasta(methodsenzymol.,1990,183:63-98)來決定。基於該算法blast，開發了被稱為blastn或blastx的程序(j.mol.biol.,1990,215:403-410)。基於blast，通過blastn來分析核苷酸序列的情況下，參數設為例如score=100，wordlength=12。此外，基於blast，通過blastx來分析胺基酸序列的情況下，參數設為例如score=50，wordlength=3。使用blast和gappedblast程序的情況下，使用各程序的預設參數(defaultparameter)。這些分析方法的具體手法是公知的(參照www.ncbi.nlm.nih.gov)。本說明書中，「嚴格條件」是指同源性高的核苷酸序列彼此之間，例如具有90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性的核苷酸序列彼此之間雜交、而同源性較其低的核苷酸序列彼此之間不雜交的條件。更具體來說，本說明書中的「嚴格條件」是指可根據所要求的同源性的高低而改變合適的條件。越是更高嚴格條件，那麼僅同源性更高的序列雜交。作為低嚴格條件的例子，可列舉5×ssc、5×鄧哈特溶液(denhardt'ssolution)、0.5%sds、50%甲醯胺、32～50℃左右的洗滌條件。作為高嚴格條件的例子，可列舉6×ssc、0.01medta、1×鄧哈特溶液、0.5%sds、55～68℃左右，或者5×ssc、5×鄧哈特溶液、0.5%sds、50%甲醯胺、55～68℃左右的洗滌條件。作為其他影響雜交的要素，還可考慮探針的濃度或長度、反應時間等多種要素。如果是本領域技術人員，則可參照例如sambrook等,《分子克隆實驗指南》第三版，冷泉港實驗室出版社(molecularcloning,alaboratorymanual,3rded,coldspringharborlaboratory)(2001)，對上述的條件或要素進行適當選擇而決定適當的嚴格度。本說明書中，目標胺基酸序列或核苷酸序列上的、與特定的胺基酸序列或核苷酸序列上的特定的位置或區域相對的「對應位置」或「對應區域」可通過將目標胺基酸序列或核苷酸序列與作為基準的特定序列(參照序列)對齊(序列比對,alignment)以使對各胺基酸序列或核苷酸序列中存在的保守胺基酸殘基或核苷酸賦予最大同源性來決定。序列比對可使用公知的算法來實施，其順序是本領域技術人員公知的。例如，序列比對可基於上述的立普曼-帕森(lipman-pearson)法等通過人工操作進行，也可通過以預設設定使用clustalw多序列比對程序(thompson,j.d.等,1994,nucleicacidsres.,22:4673-4680)來進行。或者，還可使用作為clustalw的修訂版的clustalw2或clustalomega。clustalw、clustalw2和clustalomega可在例如歐洲生物信息研究所(europeanbioinformaticsinstitute:ebi[www.ebi.ac.uk/index.html])或國立遺傳學研究所運營的日本dna資料庫(ddbj[www.ddbj.nig.ac.jp/welcome-j.html])的網站上利用。本說明書中，「ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑」是指由亞油酸(la，18:2n-6)生產γ-亞麻酸(gla，18:3n-6)、雙高-γ-亞麻酸(dgla，20:3n-6)、花生四烯酸(ara，20:4n-6)等ω-6高度不飽和脂肪酸的代謝途徑，「ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑」是指由α-亞麻酸(ala，18:3n-3)生產十八碳四烯酸(sda，18:4n-3)、二十碳四烯酸(eta，20:4n-3)、二十碳五烯酸(epa，20:5n-3)等ω-3高度不飽和脂肪酸的代謝途徑(參照圖1)。此外，本說明書中，「高度不飽和脂肪酸」是指碳鏈長為18以上且不飽和鍵數為2以上的長鏈脂肪酸。另外，本說明書中，「c20的ω-3不飽和脂肪酸」是指碳數20的ω-3高度不飽和脂肪酸，作為其例子，可列舉epa、eta。本說明書中，「去飽和活性」是指向脂肪酸鏈中引入碳-碳雙鍵的活性，「去飽和酶」是指具有該去飽和活性的蛋白質或多肽。去飽和活性和去飽和酶根據通過該活性而引入了碳-碳雙鍵的脂肪酸上的位置進一步被分類。例如，「ω-3去飽和活性」是指向自脂肪酸的ω末端起第3位與第4位碳之間引入雙鍵的活性，「ω-3去飽和酶」是指具有該活性且產生ω-3不飽和脂肪酸的酶。例如，ω-3去飽和酶可包括：由la(18:2n-6)向ala(18:3n-3)轉變的轉換酶、由gla(18:3n-6)向sda(18:4n-3)轉變的轉換酶、由dgla(20:3n-6)向eta(20:4n-3)轉變的轉換酶、以及由ara(20:4n-6)向epa(20:5n-3)轉變的轉換酶。本說明書中，「δ17去飽和活性」是指向自脂肪酸的羧基末端起第17位與第18位碳之間引入雙鍵的活性，「δ17去飽和酶」是指具有該活性且產生δ17不飽和脂肪酸的酶。例如，δ17去飽和酶可包括：由dgla(20:3n-6)向eta(20:4n-3)轉變的轉換酶、以及由ara(20:4n-6)向epa(20:5n-3)轉變的轉換酶。「ω-3去飽和酶」和「δ17去飽和酶」對於碳數20的脂肪酸向同樣的位置(自ω末端起第3位與第4位碳之間=自羧基末端起第17位與第18位碳之間)引入不飽和鍵。因此，本說明書中，「對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性」可換言之為「δ17去飽和活性」。本說明書中，「在常溫下具有酶活性」是指酶活性的最適溫度為20℃以上、較好是20～40℃，或者20℃時具有最適溫度下的活性的70%以上、較好是80%以上的活性。例如，本說明書中，酶「在常溫下具有對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性」是指該酶對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性的最適溫度為20～40℃，或者20℃時的該酶對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性相對於該酶在最適溫度下對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性為70%以上，較好是80%以上。本說明書中，對於微生物的功能或特性、性狀(trait,形質)使用的術語「本來」是用來表示該功能或特性、性狀存在於該微生物的野生型中。對照性地，術語「外源」用於表示不是一開始就存在於該微生物中、而是從外部引入的功能或特性、性狀。例如，從外部引入某種微生物的基因為外源基因。外源基因可以是來源於與引入有該基因的微生物同種的微生物的基因，也可以是來源於不同種生物的基因。通過本發明提供的ω-3去飽和酶是由與seqidno:2所示的胺基酸序列具有80%以上的同源性的胺基酸序列構成，且在常溫下具有對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性的多肽。作為該多肽的例子，可列舉由以下的胺基酸序列構成，且在常溫下具有對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性的多肽。(a)seqidno:2所示的胺基酸序列；(b)與seqidno:2所示的胺基酸序列具有90%以上、較好是95%以上、更好是98%以上、進一步更好是99%以上的同源性的胺基酸序列；(c)seqidno:2所示的胺基酸序列中，有一個或多個胺基酸被施行了選自缺失、取代、插入和添加的突變而獲得的胺基酸序列；(d)seqidno:4所示的胺基酸序列；(e)與seqidno:4所示的胺基酸序列具有90%以上、較好是95%以上、更好是98%以上、進一步更好是99%以上的同源性的胺基酸序列；(f)seqidno:4所示的胺基酸序列中，有一個或多個胺基酸被施行了選自缺失、取代、插入和添加的突變而獲得的胺基酸序列。對於上述胺基酸序列中的胺基酸的缺失、取代、插入和添加的位置無特別限定，只要在突變後的多肽中保持常溫下的對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性即可。另外，作為本發明的ω-3去飽和酶，可列舉在上述的(a)～(f)所示的胺基酸序列中各胺基酸可被屬於性質類似的胺基酸組的胺基酸取代的蛋白。被類似的胺基酸取代的位置和數目沒有特別限定，只要取代後的多肽中保持常溫下的對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性即可。作為性質類似的胺基酸，可列舉例如甘氨酸和丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸和異亮氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、天冬氨酸和穀氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺、賴氨酸和精氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等。較好是本發明的ω-3去飽和酶為在常溫下、較好是20℃～40℃的溫度下對碳數20的脂肪酸特異性作用的ω-3去飽和酶。seqidno:2和seqidno:4所示的ω-3去飽和酶均為來源於作為鞭毛菌的1種的plectospiramyriandra的酶。blast分析的結果表明，seqidno:2和seqidno:4所示的ω-3去飽和酶相互具有約98.9%的高胺基酸序列同源性；另一方面，是具有與公知的蛋白質極不相同的胺基酸序列的新的多肽。seqidno:2和seqidno:4所示的ω-3去飽和酶的胺基酸序列與來源於水黴(saprolegnia)等的公知的ω-3去飽和酶(例如專利文獻4～6所揭示的ω-3去飽和酶)的胺基酸序列的序列同源性最高為70%。本發明人以plectospiramyriandra的基因組為基礎構建了由編碼ω-3去飽和酶的假定orf構成的多核苷酸。該多核苷酸是由seqidno:1所示的核苷酸序列構成的、編碼seqidno:2所示的本發明的ω-3去飽和酶的多核苷酸。此外，本發明人通過以plectospiramyriandra的mrna為靶的逆轉錄反應，獲得了由seqidno:3所示的核苷酸序列構成的cdna。這是編碼seqidno:4所示的本發明的ω-3去飽和酶的多核苷酸。因此，由seqidno:1或seqidno:3所示的核苷酸序列構成的多核苷酸均為不包含內含子序列的多核苷酸，是與plectospiramyriandra細胞內存在的基因組dna不同的多核苷酸。因此，本發明還提供編碼本發明的ω-3去飽和酶的多核苷酸(以下也稱為本發明的ω-3去飽和酶基因)。作為本發明的ω-3去飽和酶基因的例子，可列舉由以下所示的核苷酸序列構成的、編碼在常溫下具有對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性的多肽的多核苷酸或其互補鏈。(a)seqidno:1所示的核苷酸序列；(b)與seqidno:1所示的核苷酸序列具有90%以上、較好是95%以上、更好是98%以上、進一步更好是99%以上的同源性的核苷酸序列；(c)seqidno:1所示的核苷酸序列中，有一個或多個核苷酸被施行了選自缺失、取代、插入和添加的突變而獲得的核苷酸序列；(d)在嚴格條件下與seqidno:1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；(e)seqidno:3所示的核苷酸序列；(f)與seqidno:3所示的核苷酸序列具有90%以上、較好是95%以上、更好是98%以上、進一步更好是99%以上的同源性的核苷酸序列；(g)seqidno:3所示的核苷酸序列中，有一個或多個核苷酸被施行了選自缺失、取代、插入和添加的突變而獲得的核苷酸序列；或者(h)在嚴格條件下與seqidno:3所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。對於上述核苷酸序列中的核苷酸的缺失、取代、插入和添加的位置無特別限定，只要突變後的多核苷酸所編碼的多肽保持常溫下對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性即可。本發明的ω-3去飽和酶可按照公知的方法、較好是化學合成法或生物學合成法製造。作為化學合成法的例子，可列舉通過常規方法對側鏈官能團進行了保護的各胺基酸依次結合而伸長肽鏈的方法。作為生物學合成法的例子，可列舉由本發明的ω-3去飽和酶基因表達本發明的ω-3去飽和酶後，分離所生成的酶，根據需要進一步純化的方法。以下，對本發明的ω-3去飽和酶基因的生物學合成法進行更詳細的說明。首先，製備本發明的ω-3去飽和酶基因。該基因可基於本發明的ω-3去飽和酶的胺基酸序列、或plectospiramyriandra等微生物的基因組dna的序列信息，按照公知的方法通過化學合成法製造，或者可從上述的plectospiramyriandra等微生物分離。從微生物分離本發明的ω-3去飽和酶基因的情況下，例如可由該微生物的總rna製作cdna文庫，通過從該cdna文庫的篩選來分離作為目標的本發明的基因的cdna。篩選時，基於本發明的基因的核苷酸序列設計探針或引物，選擇與該探針或引物在嚴格條件下雜交的cdna即可。或者，可以通過序列特異性逆轉錄反應，由該微生物的總rna選擇性地合成目標cdna。所選擇的cdna可通過pcr等公知的方法進行擴增。或者，本發明的ω-3去飽和酶基因可以通過利用紫外線照射或位點特異性突變引入之類的公知的突變引入法向按照上述順序分離或合成的基因中引入突變來製作。例如，對於seqidno:1或seqidno:3所示的多核苷酸用公知的方法引入突變，獲得突變多核苷酸。通過考察由該突變多核苷酸表達的多肽的ω-3去飽和活性而選擇編碼具有所期望的活性的多肽的多核苷酸，可獲得本發明的ω-3去飽和酶基因。另外，按上述順序製備的本發明的ω-3去飽和酶基因，較好是結合引入該基因並使之表達的細胞中的密碼子使用頻率，將密碼子最優化。各種生物使用的密碼子的信息可從codonusagedatabase(www.kazusa.or.jp/codon)獲得。例如，結合高山被孢黴(mortierellaalpina)的密碼子使用頻率(www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgispecies=64518)將seqidno:1和seqidno:3所示的ω-3去飽和酶基因進行密碼子最優化的情況下，分別成為seqidno:5和seqidno:6所示的多核苷酸。因此，作為本發明的ω-3去飽和酶基因，可列舉以由上述(a)～(h)所示的核苷酸序列構成的多核苷酸為基礎，結合各種生物的密碼子使用頻率將密碼子最優化而得的多核苷酸。接著，由所製備的本發明的ω-3去飽和酶基因表達本發明的ω-3去飽和酶。該酶可通過無細胞系統來表達，也可將本發明的ω-3去飽和酶基因導入宿主細胞中獲得轉化細胞，使本發明的ω-3去飽和酶在該轉化細胞中表達。作為導入本發明的ω-3去飽和酶基因的宿主細胞，較好是細菌、真菌、藻類等微生物的細胞，但無特別限定。向宿主細胞中導入基因時，可使用包含本發明的ω-3去飽和酶基因的載體。用於導入的載體的種類可根據宿主細胞的種類、或克隆的方法、基因表達的方法等適當選擇。例如，由存在於細胞的基因組外的載體上的基因直接表達本發明的ω-3去飽和酶的情況下，較好是使用表達載體。將本發明的ω-3去飽和酶基因整合至適當的載體中，將所得的包含本發明的ω-3去飽和酶基因的載體導入宿主細胞中。向細胞中導入載體時，可使用電穿孔法、粒子槍(基因槍)法、感受態細胞法、原生質體法、磷酸鈣共沉澱法、根癌農桿菌(agrobacteriumtumefaciens)介導的轉化(atmt)法及其改變法(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)等公知的方法。這時，如果事先向載體中整合適當的標誌基因(markergene)，則能夠以標誌(marker)的表達為指標，選出導入了包含本發明的基因的載體的轉化細胞。通過上述轉化細胞，表達本發明的ω-3去飽和酶。所表達的本發明的ω-3去飽和酶可通過公知的蛋白質的分離或純化法進行分離、以及根據需要進行純化。本發明的ω-3去飽和酶在細胞容易增殖的常溫、例如20℃以上的溫度條件下具有高的ω-3去飽和活性，可在epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸的生物合成中發揮作用。因此，如果在常溫下培養表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞，則該細胞容易增殖，且利用在該增殖了的細胞內表達的本發明的ω-3去飽和酶進行c20的ω-3不飽和脂肪酸的生物合成，因此可高效地生產epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸。因此，本發明提供c20的ω-3不飽和脂肪酸的生產方法，該方法包括：培養表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞。作為c20的ω-3不飽和脂肪酸，可列舉eta和epa，較好是epa。此外，本發明還提供含epa的脂質的生產方法，該方法包括：培養表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞。進而本發明提供epa的生產方法，該方法包括：純化通過上述本發明的含epa的脂質的生產方法生產的含epa的脂質。作為上述表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞，可以是本來就表達該酶的細胞，或者也可以是經過改變而表達該酶的細胞。作為本來就表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞，可列舉plectospiramyriandra。作為經過改變而表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞，可列舉如上述的通過本發明的ω-3去飽和酶基因的導入而獲得了本發明的ω-3去飽和酶的表達能力的轉化細胞。該轉化細胞可以是來源於植物、細菌、真菌、藻類等的任意的細胞，較好是細菌、真菌、藻類等微生物的細胞。或者，可對上述plectospiramyriandra進行改變而使本發明的ω-3去飽和酶的表達提高，並用於本發明的含epa的脂質的生產方法。本發明的含epa的脂質的生產方法中，上述表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞通過本發明的ω-3去飽和酶的作用來生產epa。因此，該細胞不僅具有本發明的ω-3去飽和酶的表達能力，而且本來還具有生產作為該酶的底物的花生四烯酸(ara)的能力，或者經過改變而可生產ara。較好是該細胞本來就具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑，或者經過改變而具有該途徑。更好是該細胞本來就具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑和ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑，或者經過改變而具有該兩個途徑。如圖1所示，通過ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑生成的ara通過ω-3去飽和酶的作用而轉換成epa。或者，dgla等碳數20的ω-6高度不飽和脂肪酸通過ω-3去飽和酶的作用而轉換成eta等碳數20的ω-3高度不飽和脂肪酸，然後由這些ω-3高度不飽和脂肪酸通過ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑生成epa。因此，作為本發明的含epa的脂質的生產方法中使用的細胞的優選例子，可列舉具有表達本發明的ω-3去飽和酶的能力，且具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑而可產生花生四烯酸的產脂質微生物(oleaginousmicroorganisms)。更好是該產脂質微生物還具有ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑。作為這樣的產脂質微生物的例子，可列舉上述的plectospiramyriandra，以及具有通過ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑而產生花生四烯酸的能力的產脂質微生物，較好是還具有ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑，且經過改變而表達本發明的ω-3去飽和酶的產脂質微生物。上述經過改變而表達本發明的ω-3去飽和酶的產脂質微生物可通過向具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑並具有產生花生四烯酸的能力，較好是還具有ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑的產脂質微生物中導入本發明的ω-3去飽和酶基因而獲得。向該產脂質微生物中導入本發明的ω-3去飽和酶基因可按照關於向宿主細胞中導入基因而在上文中記載的順序來進行，以下說明更具體的順序。作為適合導入本發明的ω-3去飽和酶基因的產脂質微生物的例子，可列舉plectospira屬菌、酵母菌、和被孢黴(mortierella)屬、毛黴(mucor)屬、傘狀黴(umbelopsis)屬等的絲狀菌等，但並不限於這些例子。作為酵母菌，可列舉子囊菌酵母(ascomycetousyeast)、擔子菌酵母(basidiomycetousyeast)、裂殖酵母(fissionyeast)、芽殖酵母(buddingyeast)等。作為上述中優選的例子，可列舉高山被孢黴(mortierellaalpina，以下的本說明書中有時稱為m.alpina)、mortierellachlamydospora、長枝被孢黴(mortierellaelongata)、微小被孢黴(mortierellaexigua)、喜溼被孢黴(mortierellahygrophila)、mortierellaepigama、mortierellaacrotona、小被孢黴(mortierellaminutissima)、木棲柱被孢黴(mortierellalignicola)、mortierellaclonocystis、矮被孢黴(mortierellanana)、土生被孢黴(mortierellahumicola)、貝勒被孢黴(mortierellabainieri)、透明被孢黴(mortierellahyaline)、mortierellaglobalpina、矮小傘黴(umbelopsisnana)、深黃傘形黴(umbelopsisisabellina)等被孢黴屬微生物，更優選列舉高山被孢黴(m.alpina)、mortierellaclonocystis、矮被孢黴(mortierellanana)、土生被孢黴(mortierellahumicola)、貝勒被孢黴(mortierellabainieri)、透明被孢黴(mortierellahyaline)、mortierellaglobalpina等。另外，上述適合導入本發明的基因的產脂質微生物只要具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑並具有產生花生四烯酸的能力，還可以是上述的plectospira屬、酵母和被孢黴(mortierella)屬、毛黴(mucor)屬、傘狀黴(umbelopsis)屬等的微生物的突變株。該突變株不需要表達本發明的ω-3去飽和酶以外的ω-3去飽和酶，所以可以是缺少該微生物本來具有的ω-3去飽和酶的缺損株。作為這樣的突變株或缺損株的例子，可列舉m.alpina1s-4(agric.biol.chem.,1987,51(3):785-790)、m.alpinast1358(biosci.biotechnol.biochem.,2010,74:908-917)等。上述產脂質微生物的突變株或缺損株可通過常規方法，例如採用甲磺酸乙酯(ems)、甲磺酸甲酯(mms)、n-甲基-n-硝基-n-亞硝基胍(j.gen.microbiol.,1992,138:997-1002)、5-溴脫氧尿苷(brdu)、順鉑、絲裂黴素c等誘變劑進行的處理、或採用放射線照射、紫外線照射、高熱處理等的突變誘發、或者採用rnai的基因表達抑制等來獲得。本發明的ω-3去飽和酶基因可被導入上述微生物的基因組內，或者也可在整合於表達載體的狀態下導入基因組外。不論哪種情況下，都較好是本發明的ω-3去飽和酶基因與包含該基因的載體一起導入。用於基因導入的載體可由本領域的技術人員根據導入基因的微生物的種類、或克隆的方法、基因表達的方法等適當選擇。例如，作為針對被孢黴(mortierella)屬微生物向基因組外導入基因所使用的載體，可列舉pd4載體(appl.environ.microbiol.,2000,66(11):4655-4661)、pdzeo載體(j.biosci.bioeng.,2005,100(6):617-622)、pdura5載體(appl.microbiol.biotechnol.,2004,65(4):419-425)、pdx載體(curr.genet.,2009,55(3):349-356)、pbig3ura5(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)等。另外，較好是上述載體中包含用於使所整合的本發明的基因表達的啟動子序列或轉錄終止信號序列，或者用於選擇導入有目標基因的轉化體的選擇標誌基因。作為啟動子，較好是高表達啟動子。例如，作為被孢黴屬微生物用的優選高表達啟動子，可列舉來源於m.alpina的pp3啟動子和ssa2啟動子、以及對這些啟動子的序列進行取代、缺失、添加等而改變了的啟動子，但只要可使導入的基因高表達，並不限於這些例子。作為選擇標誌基因，例如可列舉卡那黴素抗性基因、鏈黴素抗性基因、萎鏽靈(carboxin)抗性基因、博來黴素(zeocin)抗性基因、潮黴素抗性基因等耐藥性基因；與亮氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、賴氨酸等胺基酸營養缺陷型突變(auxotrophicmutation)互補的基因，與尿嘧啶、腺嘌呤等核酸鹼基營養缺陷型突變互補的基因等。作為優選的選擇標誌基因的例子，可列舉與尿嘧啶營養缺陷型突變互補的基因。例如，開發有m.alpina的尿嘧啶營養缺陷型突變株(biosci.biotechnol.biochem.,2004,68:277-285)。對於這樣的尿嘧啶營養缺陷株，作為選擇標誌基因可以使用乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶基因(ura3基因)、或者乳清核苷酸焦磷酸化酶基因(ura5基因)。對於用於構建載體的順序或所使用的試劑種類、例如限制酶或連接酶等的種類，無特別限定。本領域的技術人員可按照通常的知識，或者適當使用市售品來構建載體。可用於向m.alpina中導入本發明的ω-3去飽和酶基因的轉化二元載體的例子示於圖2。該載體中，在作為恆定的高表達啟動子的ssa2啟動子的下遊連接有編碼本發明的ω-3去飽和酶的多核苷酸(pmd17xxmod)，還整合有作為終止子的sdhb終止子、作為轉化體的選擇標誌的ura5基因。作為將本發明的ω-3去飽和酶基因直接導入微生物的基因組內的方法，可列舉同源重組法。準備同時包含本發明的基因和作為導入目的地的基因組的互補序列的載體，若將該載體導入到微生物中，則通過同源重組將本發明的ω-3去飽和酶基因整合至該微生物的基因組上的靶位置。可根據需要向該載體中同時整合上述的啟動子序列、轉錄終止信號序列或者選擇標誌基因。關於向微生物中導入載體的手段，本領域的技術人員可根據微生物或載體的種類適當選擇。例如，向被孢黴屬微生物等真菌類中導入載體的情況下，可列舉電穿孔法、粒子槍(基因槍)法、atmt法及其改變法(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)等，較好是atmt法及其改變法，但只要可獲得穩定保持目標性狀的轉化體，基因導入法並不限於這些方法。另外，本發明的含epa的脂質的生產方法中所使用的、表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞，可施行激活其ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑這樣的改變。例如，通過向該細胞中導入編碼δ12去飽和酶的基因而使該酶高表達，可促進該細胞內的由油酸向亞油酸的轉變，可激活ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑。該途徑的激活會使作為本發明的酶底物的ω-6高度不飽和脂肪酸量增加，故其結果是epa的產生得到促進。或者，通過向表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞中導入編碼δ15去飽和酶的基因而使該酶高表達，可促進由la向ala、或由gla向sda的轉變，可激活ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑。另外，還可向表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞中導入編碼δ12去飽和酶的基因和編碼δ15去飽和酶的基因這兩者。本發明的含epa的脂質的生產方法中，通過以上順序得到的表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞被接種於液體培養基或固體培養基中進行培養。關於培養的條件，可由本領域的技術人員根據細胞的種類進行最優化。例如，該細胞為真菌的情況下，可將菌株的孢子、菌絲、或者預先培養而得的預培養液接種於上述培養基中進行培養。作為培養基的碳源，可列舉葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性澱粉、玉米澱粉、甘油、甘露醇、脂質、烷烴、烯烴等，但並不限於這些例子。作為氮源，可列舉蛋白腖、酵母提取物、麥芽提取物、肉提取物(肉膏)、酪蛋白胺基酸、玉米漿、大豆蛋白、脫脂大豆、棉籽粕、麥麩等天然氮源，除此之外，還可列舉尿素等有機氮源、以及硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨等無機氮源，但並不限於這些例子。另外，還可添加大豆油、椰油、玉米油等脂質。添加的脂質較好是大豆油、玉米油等含大量亞油酸的油脂，更好是大豆油。此外，作為微量營養源，還可適當添加磷酸鹽、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅等無機鹽、或者維生素等。這些培養基成分只要是不妨礙所培養的微生物生長的濃度即可，無特別限定。例如，在培養基中碳源可為0.1～40質量%、較好是1～25質量%，氮源可為0.01～10質量%、較好是0.1～10質量%的濃度。在培養m.alpina或其突變株的情況下，可優選使用後述的czapek培養基、czapek-dox培養基、葡萄糖/酵母提取物(以下也稱為「gy」)培養基、sc培養基等。或者，對於被孢黴屬微生物用的培養基，還可參考公知的文獻(例如國際公開第98/29558號)。培養基的ph值可為4～10，較好是6～9。培養可以是通氣攪拌培養、振蕩培養或靜置培養。為了促進上述細胞的增殖以增加epa的產量，較好是該細胞的培養在最適生長溫度下進行。例如，該細胞可在約5～60℃、較好是約10～50℃、更好是約10～40℃、進一步更好是約20～40℃、又更好是約20～30℃下進行培養。例如，細胞為m.alpina或其突變株的情況下，優選在約10～40℃、較好是約20～40℃、更好是約20～30℃下進行培養。該細胞的培養期間可以是例如2～20天，較好是2～14天。需要說明的是，對於被孢黴屬微生物的培養方法，還可參考公知的文獻(例如日本特開平6-153970號公報)。通過按照上述順序培養表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞，從而在該細胞內生產出含有大量epa的脂質。培養結束後，對培養液實施離心分離、過濾等常用的手段來分離細胞。例如，將培養液離心分離或過濾而除去液體部分，對所分離的細胞進行清洗後，通過冷凍乾燥、風乾等進行乾燥，獲得乾燥細胞。可通過有機溶劑提取等公知的方法，由該細胞提取作為目標的脂質。作為有機溶劑，可列舉己烷、醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、環己烷、苯、甲苯、二甲苯等高度不飽和脂肪酸的溶解性高且可與水分離的溶劑。或者，也可以將這些有機溶劑組合使用。通過減壓等從提取物中蒸餾除去有機溶劑，可提取目標脂質。或者，也可不乾燥細胞而由溼細胞進行脂質的提取。所得的脂質可適當使用脫膠、脫酸、脫臭、脫色、柱處理、蒸餾等普通方法進一步純化。上述提取的脂質中，除了作為本發明的方法的目標物的epa以外，還包含成為夾雜物的各種脂肪酸。因此，可進一步純化上述脂質而獲得純度更高的epa。還可從脂質直接分離epa，但較好是暫且將脂質中的脂肪酸轉變成其與低級醇的酯衍生物後，分離作為目標的epa的酯衍生物。酯衍生物可根據碳數、雙鍵的數量、位置的不同等，通過使用各種分離純化操作來進行分離，因此可容易地獲得目標脂肪酸的酯衍生物。然而，與epa碳數相同且雙鍵數量差一個的花生四烯酸難以與epa分離，因此較好是在含有epa的脂質中花生四烯酸少。酯衍生物較好是乙酯衍生物。酯化可使用含有鹽酸、硫酸、bf3等酸催化劑、或者甲醇鈉、氫氧化鉀等鹼催化劑的低級醇。可以將銀配合物法(例如日本專利第2786748號、日本專利第2895258號、日本專利第2935555號、日本專利第3001954號)、柱層析法、低溫結晶法、尿素添加分離法等單獨或組合使用，由所得的酯衍生物分離作為目標的epa的酯衍生物。將分離的epa的酯衍生物用鹼水解後，用醚、乙酸乙酯等有機溶劑提取，從而可純化epa。epa可以以鹽的形式進行純化。在以工業規模進行基於本發明的含有大量epa的脂質的生產的情況下，例如可在罐中等大規模培養表達本發明的ω-3去飽和酶的產脂質微生物，用壓濾機等過濾，回收細胞，乾燥後，用球磨機等將細胞粉碎，用有機溶劑提取脂質。此外，還已知多種以工業規模提取微生物中的成分加以利用的方法、由脂質純化epa的方法，也可將這些方法適當改變而用於本發明的方法。為了使用本發明的ω-3去飽和酶生產eta，較好是在上述表達本發明的ω-3去飽和酶的細胞中降低δ5去飽和酶的活性。由此，該細胞主要生產eta代替epa。細胞的δ5去飽和酶活性的降低例如可通過在δ5去飽和酶缺損株中表達本發明的酶、或者用rnai抑制細胞中的δ5去飽和酶的表達來實現。細胞的培養、由細胞提取含eta的脂質、eta的純化的順序與上述的epa的情形同樣。通過本發明得到的epa、eta或它們的鹽可用於人或非人動物用的藥品、化妝品、食品、飼料等的製造。作為該藥品的劑型，可列舉例如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑、幹糖漿劑、溶液劑、懸浮劑等口服製劑，灌腸劑、栓劑等經腸製劑，點滴劑，注射劑，外用劑，經皮、經黏膜、經鼻劑，吸入劑，貼劑等。此外，作為該化妝品的形態，可列舉霜、乳液、洗劑、懸浮液、凝膠、粉末、面膜、薄片、貼布、棒、餅等化妝品通常可採用的任意形態。較好的是，上述藥品或化妝品可以是用於血小板聚集抑制、血中中性脂肪減少、抗動脈硬化、血液粘度降低、降血壓、抗炎、抗腫瘤的藥品或者化妝品。上述藥品或化妝品含有epa、eta或它們的鹽作為有效成分。上述藥品或化妝品還可含有作為藥物可接受的載體或作為化妝品可接受的載體，例如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、表面活性劑、ph調節劑、分散劑、乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑、醇、水、水溶性高分子、香料、甜味劑、矯味劑、酸味劑等，還可根據需要含有其他有效成分，例如藥效成分、化妝成分等。上述藥品或化妝品可通過根據劑型向epa、eta或它們的鹽中配合上述載體或其他有效成分，按照常規方法進行調製而製造。上述藥物或化妝品中的epa或eta的含量根據其劑型而不同，通常為0.1～99質量%、較好是1～80質量%的範圍。上述飲食品或飼料含有epa、eta或它們的鹽作為有效成分。這些飲食品或飼料可以是以血小板聚集抑制作用、血中中性脂肪減少作用、抗動脈硬化作用、血液粘度降低作用、降血壓作用、抗炎作用、抗腫瘤作用等效果為目的，並標識了該內容的健康食品、功能性飲食品、特定保健用飲食品、患者用飲食品，用於家畜、賽馬、觀賞動物等的飼料，寵物食品等。上述飲食品或飼料的形態無特別限定，包括可配合epa、eta或它們的鹽的所有形態。例如，作為該飲食品的形態，可以是固態、半固態或液態，或者可列舉片劑、咀嚼片、粉劑、膠囊、顆粒、飲料、凝膠、糖漿、經管經腸營養用流食等各種形態。作為具體的飲食品的形態的例子，可列舉綠茶、烏龍茶或紅茶等茶飲料，咖啡飲料、清涼飲料、果凍飲料、運動飲料、乳飲料、碳酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、發酵乳飲料、粉末飲料、可可飲料、酒精飲料、純淨水等飲料，黃油、果醬、人造奶油等塗抹食品類、撒在飯上的粉狀食品(ふりかけ)、蛋黃醬、起酥油、卡仕達醬、調味品類、麵包類、米飯類、面類、義大利麵、味噌湯、豆腐、牛乳、酸奶、湯或沙司類、點心(例如餅乾或曲奇類、巧克力、糖果、蛋糕、冰淇淋、口香糖、片劑(tablet))等。上述飼料能夠以與飲食品幾乎相同的組成或形態使用，所以本說明書中關於飲食品的記載對於飼料也同樣可以適用。上述飲食品或飼料可通過配合epa、eta或它們的鹽、以及飲食品或飼料的製造中所用的其他飲食品原材料、各種營養素、各種維生素、礦物質、胺基酸、各種油脂、各種添加劑(例如呈味成分、甜味劑、有機酸等酸味劑、表面活性劑、ph調節劑、穩定劑、抗氧化劑、色素、香料)等，按照常規方法進行調製而製造。或者，可以通過向通常所食用的飲食品或飼料中配合epa、eta或它們的鹽來製造本發明所述的飲食品或飼料。上述飲食品或飼料中的epa或eta的含量根據食品的形態而不同，通常為0.01～80質量%、較好是0.1～50質量%、更好是1～30質量%的範圍。實施例以下，使用實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明的技術範圍並不限定於以下的實施例。(培養基)gy培養基：2%(w/v)葡萄糖、1%酵母提取物；czapek-dox瓊脂培養基：3%蔗糖、0.2%nano3、0.1%kh2po4、0.05%kcl、0.05%mgso4･7h2o、0.001%feso4･7h2o、2%瓊脂，ph6.0；ypd培養基：將多聚蛋白腖(polypeptone)20g、酵母提取物10g、腺嘌呤0.4g、瓊脂20g和葡萄糖20g在1000ml水中稀釋；lb-mg瓊脂培養基：1%胰蛋白腖、0.5%酵母提取物、85mmnacl、0.5mmmgso4･7h2o、0.5mmnaoh、1.5%瓊脂，ph7.0；基本培養基(mm)：10mmk2hpo4、10mmkh2po4、2.5mmnacl、2mmmgso4･7h2o、0.7mmcacl2、9μmfeso4･7h2o、4mm(nh4)2so4、10mm葡萄糖，ph7.0；誘導培養基(im)：向mm中加入0.5%(w/v)甘油、200μm乙醯丁香酮、40mm2-(n-嗎啉基)乙磺酸(mes)，調至ph5.3；sc培養基：5.0g不含胺基酸和硫酸銨的酵母氮源(yeastnitrogenbasew/oaminoacidsandammoniumsulfate)(difco)、1.7g(nh4)2so4、20g葡萄糖、20g瓊脂、20mg腺嘌呤、30mg酪氨酸、1.0mg甲硫氨酸、2.0mg精氨酸、2.0mg組氨酸、4.0mg賴氨酸、4.0mg色氨酸、5.0mg蘇氨酸、6.0mg異亮氨酸、6.0mg亮氨酸、6.0mgl-苯丙氨酸。實施例1ω-3去飽和酶的鑑定將plectospiramyriandra在gy培養基10ml中在28℃下振蕩培養5天，回收菌體。將收集的菌體放入2ml管中，使用珠粒振蕩器(yasuikikai)以1700rpm、10秒×2次的條件將其破碎。用isogen(bio-rad)按照產品指南由破碎的菌體提取mrna。將所提取的mrna用primescripttmiihighfidelityrt-pcrkit(takara)和引物[5'-gaaatggccgacgtgaacacctcctcgc-3'(seqidno:7)和5'-ctatgcgcgcttggtgagcacctcgc-3'(seqidno:8)]進行逆轉錄，製備seqidno:3所示的cdna。該cdna編碼seqidno:4所示的胺基酸序列的多肽。接著，由seqidno:3的序列，進行plectospiramyriandra的基因組dna搜索，鑑定對應的基因組dna序列。進而，從該基因組dna序列除去內含子設計多核苷酸，以它為基礎化學合成dna。設計的多核苷酸由seqidno:1的核苷酸序列構成，編碼seqidno:2所示的胺基酸序列的多肽。seqidno:2與seqidno:4在全胺基酸序列355個殘基中有4個胺基酸不同(胺基酸序列同源性約98.9%)。將上述中製備的cdna(seqidno:3)整合至酵母表達用載體pye22m(biosci.biotech.biochem.,1995,59:1221-1228)中，通過電穿孔法將該載體導入釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)invsc1株(色氨酸營養缺陷型的產油酵母)中，進行了轉化。對於上述中製備的合成dna(seqidno:1)也同樣地構建載體，製作轉化株。將各轉化株在ypd培養基中在28℃下培養1天，由整合的cdna表達多肽。需要說明的是，在該培養條件下，該產油酵母本來的ω-3去飽和酶並未表達。接著，向培養基中添加各種ω-6不飽和脂肪酸：亞油酸(la，18:2n-6)、γ-亞麻酸(gla，18:3n-6)、雙高-γ-亞麻酸(dgla，20:3n-6)或者花生四烯酸(ara，20:4n-6)並在28℃下培養2天，然後通過氣液色譜法(glc)測定通過ω-3去飽和而生成的對應的ω-3不飽和脂肪酸：α-亞麻酸(ala，18:3n-3)、十八碳四烯酸(sda，18:4n-3)、二十碳四烯酸(eta，20:4n-3)或者二十碳五烯酸(epa，20:5n-3)的量。其結果是，碳數20的dgla和ara均轉換成了對應的ω-3不飽和脂肪酸，但碳數18的la和gla未轉換成對應的ω-3不飽和脂肪酸。由此確認，上述合成dna(seqidno:1)所編碼的多肽(seqidno:2)和上述cdna(seqidno:3)所編碼的多肽(seqidno:4)均為在常溫下對碳數20的脂肪酸具有底物特異性作用的ω-3去飽和酶(即δ17去飽和酶)(表1)。[表1]*1:轉換率(%)=[生成物的量/(反應後的底物的量+生成物的量)]×100。實施例2ω-3去飽和酶基因導入用載體的製作結合m.alpina將seqidno:1的核苷酸序列進行密碼子最優化，獲得seqidno:5所示的多核苷酸。在該seqidno:5所示的多核苷酸的cds的上遊和下遊構建spei和bamhi位點，克隆至spma-rq(ampr)質粒中。將製備的質粒用spei和bamhi限制酶進行處理，將所得的基因的片段與包含作為恆定高表達啟動子的ssa2啟動子的質粒pbig35(由京都府立大學提供的pbig2rhph2改變而成，記載於appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)連接，構建表達盒。再使該表達盒與尿嘧啶營養缺陷型型標誌基因(ura5)串聯連接，構建轉化用二元載體、pbigssa2ppmd17genome-intronmod(圖2)。實施例3ω-3去飽和酶基因導入株的製作將m.alpina(尿嘧啶營養缺陷型株)在含0.05mg/ml尿嘧啶的czapek-dox瓊脂培養基中進行培養，收集培養物，然後用miracloth(calbiochem)進行過濾，從而製作m.alpina的孢子懸浮液。通過以下說明的atmt法(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)，向該m.alpina(尿嘧啶營養缺陷型株)中導入實施例2中構建的pbigssa2ppmd17genome-intronmod載體，製作ω-3去飽和酶導入株。通過電穿孔法向根癌農桿菌(agrobacteriumtumefaciensc58c1，由京都府立大學提供)中導入上述二元載體pbigssa2ppmd17genome-intronmod，在lb-mg瓊脂培養基中，在28℃下培養48小時。通過pcr法選出包含該載體的根癌農桿菌。將具有該載體的根癌農桿菌用基本培養基(mm)培養2天，以5800×g進行離心分離，加入新鮮的誘導培養基(im)，製作懸浮液。用旋轉振蕩器在28℃下誘導培養該懸浮液8～12小時，直至od660由0.4變成3.7。將培養後的菌懸浮液100μl與等量的上述m.alpina懸浮液(108ml-1)混合，塗布於承載有硝基纖維素膜(直徑70mm，硬化低灰級50，whatman)的共培養培養基(與im同樣的組成，但含有5mm葡萄糖和1.5%瓊脂來代替10mm葡萄糖)，在23℃下培養2～5天。共培養後，將該膜移至不含尿嘧啶、而含有50g/ml頭孢噻肟和50g/ml壯觀黴素、0.03%尼羅藍a(sigma)的sc培養基中，在28℃下培養5天。將來自可視的真菌集落的菌絲移至新鮮的不含尿嘧啶的sc培養基中。將可在不含尿嘧啶的sc培養基中增殖，但在包含5-氟乳清酸(5-foa)的gy培養基中無法增殖的菌體判斷為穩定保持性狀的ω-3去飽和酶基因導入株。為了選擇穩定保持性狀的轉化體，進行該操作3次。實施例4ω-3去飽和酶基因導入用載體的製作結合m.alpina將seqidno:3的核苷酸序列進行密碼子最優化，獲得seqidno:6所示的多核苷酸。除了使用該seqidno:6所示的多核苷酸以外，與實施例2同樣地進行操作，構建轉化用二元載體pbigssa2ppmd17cdnamod(圖2)。實施例5ω-3去飽和酶基因導入株的製作除了使用pbigssa2ppmd17cdnamod作為基因導入用載體以外，通過與實施例3同樣的順序製作ω-3去飽和酶導入株。實施例6由ω-3去飽和酶基因導入株生產ω-3不飽和脂肪酸將實施例3和5中得到的ω-3去飽和酶基因導入m.alpina株分別在4ml的gy培養基中在28℃下以120rpm需氧培養3、7和10天。作為對照，將未導入該ω-3去飽和酶基因的m.alpina株同樣地進行培養。通過抽濾從各培養液中回收菌體，在120℃下乾燥3小時。向乾燥菌體中加入含0.5mg/ml的內標(m.alpina無法進行生物合成的碳數23的飽和脂肪酸)的二氯甲烷溶液1ml和鹽酸甲醇2ml，通過55℃、2小時的溫浴將脂肪酸甲酯化。向反應液中加入蒸餾水1ml和己烷4ml，提取己烷層，進行減壓離心，回收脂肪酸甲酯。將所回收的樣品溶解於氯仿，通過氣液色譜法(glc)測定樣品中的脂肪酸組成。glc使用島津公司制gc-2010、使用glsciences公司制毛細管柱tc70(0.25mm×60m)，以柱溫180℃、氣化室溫度250℃、檢測器溫度250℃、載氣he、補充氣體(make-upgas)n2、h2流量40ml/min、空氣流量400ml/min、分流比50、分析時間30min的條件進行。對於所提取的各脂肪酸的量，根據glc圖的峰面積值以內標的脂肪酸量作為基準進行定量，算出每1ml培養液和每1mg乾燥菌體的各脂肪酸的量。進而，求出各脂肪酸相對於總脂肪酸量的比例。其結果是，實施例3和實施例5的ω-3去飽和酶基因導入株中，分別可見最多40.8%和39.6%的epa的蓄積(圖3)。另一方面，對照株中未產生epa(無法測定蓄積)。實施例7ω-3去飽和酶活性的比較在保有本發明的ω-3去飽和酶的plectospiramyriandra與被報導保有δ17去飽和酶的異絲水黴(saprolegniadiclina)(例如專利文獻4)之間，比較對於碳數20的脂肪酸的ω-3去飽和活性。另外，對於其他8種異絲水黴相似菌(類縁菌)也考察了ω-3去飽和活性。將表2中記載的plectospiramyriandra(nbrcno.32548)、異絲水黴(nbrcno.32710)及其他8種菌株分別在5ml的gy培養基中在28℃下培養7天，通過氣液色譜法(glc)測定培養後的培養基中作為ω-3去飽和酶的產物的epa(20:5n-3)和作為其底物的ara(20:4n-6)的量。其結果是，如表2所示，對於plectospiramyriandra而言，與異絲水黴及其相似菌相比，epa相對於ara的含有比率高。由這些結果提示，plectospiramyriandra的ω-3去飽和酶是由ara向epa的轉換效率高，可高效地產生epa的酶。[表2]。當前第1頁12當前第1頁12