Ret寡核苷酸微晶片及其用於檢測遺傳性癌症的方法

2023-05-21 19:03:26 3

專利名稱：Ret寡核苷酸微晶片及其用於檢測遺傳性癌症的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測RET基因突變熱點區中突變的RET寡核苷酸微晶片，其生產方法及其用於檢測遺傳性癌症的方法。
為了檢驗高風險家族成員的種系突變，研製出一種寡核苷酸微晶片(下文稱為「寡晶片(寡晶片)」)。它被用於檢驗高風險家族成員中是否存在種系突變，早期檢測遺傳性癌症，並為種系突變成員提供一種正規的醫學治療方法。該檢驗的結果還緩解了無種系突變家族成員對癌症的恐懼心理。
通常，該技術涉及實驗寡核苷酸與固定在固體基質，即玻璃片或凝膠表面的寡核苷酸雜交。該寡核苷酸塗布的固體基質可以用以下兩種方法製備直接在固體基質表面合成寡核苷酸，或者在固體基質表面固定預先合成的寡核苷酸。前者應用一種光刻寡核苷酸合成技術承載光保護羥基的表面通過光刻掩蔽照射，在光脫保護區產生游離羥基，然後，該羥基與脫氧核糖核苷氨基亞磷酸酯偶聯(Pease，A.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915022～5026，1994)。
在後面的方法中，將攜帶均聚物尾巴的寡核苷酸和末端脫氧核糖核苷醯轉移酶點到尼龍膜上，通過UV照射共價結合(Saiki，R.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230～6234，1989)。還報導了一種改進方法，其在膜的羧基和結合到寡核苷酸5′端的氨基接頭之間形成醯胺鍵，以避免當應用加熱或紫外照射時導致的非特異性固定(Zhang，Y.等，Nucleic Acids Res.193929～3933，1991)。
放射性標記或無標記的目的DNA與上述製備的DNA晶片的雜交方法已經成功用於檢測RAS點突變、囊性纖維化刪除和各種點突變，以及DNA測序(Cantor，C.R.等，Genomics 131378～383，1992)。它還曾被用於檢測基因突變和研究基因多態型(Lipshutz，R.J.等，Biotechniques19442～447，1995)。而且，該技術期望對有效確定腫瘤形成和HLA基因型以及診斷遺傳性疾病提供一種有力的工具(Saiki，R.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230～6234，1989)。
然而，用於檢測基因突變的寡晶片不容易生產，因此，僅有很少一部分寡晶片商業化，例如Affymetrix(Santa Clara，CA 95051)，並且它們的應用僅限於檢測很少幾個基因的突變，例如p53、ATM和BRCA1。Affymetrix銷售的寡晶片應用光刻法直接將寡核苷酸合成到固體基質表面生產。然而，該寡晶片存在一些問題，例如其生產成本較高；需要應用昂貴的設備；不可能在固體基質表面固定純化的高質量寡核苷酸；固體基質表面產生的雜交產物的量不足以定量分析。
另一方面，2型多發性內分泌瘤(MEN2)綜合症以常染色體顯性方式遺傳，並具有高度滲透性。它還有三種亞型，即MEN2A、MEN2B和FMTC(家族性甲狀腺髓樣癌)，RET基因的突變在MEN2綜合症中發揮重要作用在95％以上的MEN2病例中，觀察到RET基因的9個密碼子(密碼子609、611、618、620、630、634、768、804和918)之一發生錯義突變。為了考察RET基因的這些突變熱點區是否存在突變，應用了一些工具例如SSCP(單鏈構象多態型)、PTT(蛋白質截斷實驗)、以及基於凝膠的測序。然而，這些工具相對費時費力，因此有必要研究一種改進的方法。
因此本發明試圖研究以符合上述需要，研製了一種RET寡晶片，它通過用自動微點陣儀將寡核苷酸固定到固體基質表面生產，該寡核苷酸被設計用於檢測RET基因的突變熱點區的錯義突變。本發明的RET寡晶片還能夠用於研究與RET基因有關的信號傳導基質和腫瘤發生。
發明概述因此，本發明的一個目的在於提供一種RET寡晶片，其可以用作檢測RET基因突變和遺傳性癌症的快速可靠的遺傳診斷設備。
按照本發明的一方面，提供了一種用於檢測RET突變的RET寡核苷酸微晶片，其包括固定在固體基質表面的多種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被設計用於檢測RET基因突變熱點區的錯義突變。
按照本發明的另一方面，提供了一種應用所述微晶片檢測遺傳性癌症的方法。


圖1本發明RET寡晶片的外觀；圖2本發明RET寡晶片的一個實施例，它在一個3.7cm×7.6cm的玻璃表面印刻了總共268個寡核苷酸點；圖3用於通過分析雜交反應後來自各寡核苷酸點的信號強度確定極限值的Sigma曲線(SigmaPlot)，其中實線表示極限值，虛線表示背景的平均值；圖4應用本發明的RET寡晶片檢測各密碼子中是否存在RET基因突變，a在外顯子10(密碼子609、611、618、和620)和外顯子11(密碼子630和634)上的雜交b在外顯子13(密碼子768)和外顯子14(密碼子804)上的雜交發明詳述本發明提供了一種用於檢測RET突變的RET寡核苷酸微晶片，它包括用自動微點陣儀固定到固體基質表面的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠檢測RET基因突變熱點區上的錯義突變。
首先，寡核苷酸被設計用於檢測8個密碼子(密碼子609、611、618、630、634、768、和804)上可產生的錯義突變型和一個密碼子918上的錯義突變型。
如上所述，RET基因是形成REN2綜合症的原因，REN2綜合症以常染色體顯性方式遺傳並具有高度滲透性和多種臨床表徵。主要的RET突變限於9個密碼子(密碼子609、611、618、620、630、634、768、804和918)的錯義突變。MEN2綜合症具有3個亞型2A型多發性內分泌瘤(MEN2A)、MEN2B、和家族性甲狀腺髓樣癌(FMTC)。已經鑑定在MEN2A家族中外顯子10(密碼子609、611、618、和620)和外顯子11(密碼子630和634)有98％的錯義突變，在FMTC家族中有85％的錯義突變。已知密碼子768和804的錯義突變是5～10％ FMTC病例的病因。另外，外顯子16(密碼子918)的錯義突變在95％的MEN2B病例中發現。
本發明提供了各種能夠用於檢測上述RET基因突變熱點區錯義突變的寡核苷酸，這些錯義突變在所有檢查病例中的發生機率超過了95％。因此，本發明的RET寡晶片以大於95％的可信度檢測突變是可能的。另外，因為本發明的RET寡晶片中使用的寡核苷酸被設計用來檢測8個密碼子上的所有可能錯義突變，因此檢測這些密碼子上尚未發現的任何錯義突變也是可能的。在密碼子918，發生的主要突變是Met→Thr型突變，因此，本發明使用的寡核苷酸被設計用來檢測這種類型突變。也就是說，本發明人將基因特徵考慮在內特別設計了用於檢測RET基因熱點區突變的寡核苷酸，本發明的RET寡晶片在檢測RET基因突變時具有更高的準確性和效率。
按照本發明的一個方面，本發明的RET寡晶片具有67種點樣並固定到固體基質表面的上的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠檢測RET基因9個熱點上的各種錯義突變。每個寡核苷酸水平點樣4次，以增加測量信號的準確性，結果如表1、圖1和圖2所示。首先點1和50位，然後點26到50位，最後點51到67位。1和50位分別是外顯子10和11的陽性對照。其它寡核苷酸為2-33是外顯子10(密碼子609、611、618、和、620)；34-49是外顯子11(密碼子630和634)；51-58是外顯子13(密碼子768)；59-65是外顯子14(密碼子804)；和66-67是外顯子16(密碼子918)。
具體地說，對於密碼子609、611、618、620、630、634、和768，點了具有7種錯義突變的寡核苷酸(M)和一種野生型寡核苷酸(W)；對於密碼子804，點了具有6種錯義突變的寡核苷酸(M)和一種野生型寡核苷酸(W)；對於密碼子918，點了具有主要突變類型的寡核苷酸(M)和一種野生型寡核苷酸(W)。為了說明得更具體，用於密碼子609、611、618、620、630、和634的是7種如下取代得到的寡核苷酸分別用CGC(精氨酸)、AGC(絲氨酸)、GGC(甘氨酸)、TTC(苯丙氨酸)、TAC(酪氨酸)、TCC(絲氨酸)和TGG(色氨酸)取代TGC(半胱氨酸)。用於密碼子768的是7種如下取代得到的寡核苷酸分別用CAG(穀氨醯胺)、AAG(賴氨酸)、GCG(丙氨酸)、GGG(甘氨酸)、GTG(纈氨酸)、GAC(天冬氨酸)和GAT(天冬氨酸)取代GAG(穀氨酸)。對於密碼子804，使用6種突變的寡核苷酸分別用CTG(亮氨酸)、ATG(蛋氨酸)、TTG(亮氨酸)、GAG(穀氨酸)、GCG(丙氨酸)和GGG(甘氨酸)取代GTG(纈氨酸)。密碼子918的突變體是用ACC(蘇氨酸)取代ATG(蛋氨酸)得到的寡核苷酸。
為各個密碼子都設計了一種野生型寡核苷酸(W)，用於直接與突變型比較。例如，對於密碼子618，點了8個寡核苷酸，一個用於檢測正常鹼基序列，其餘的檢測突變的鹼基序列。總共為9個熱點密碼子上的56種錯義突變型設計了56個突變寡核苷酸和用於野生型和陽性對照的11個寡核苷酸(參見表1a和1b)。設計的陽性對照是針對大多數突變已經被鑑定出來的外顯子10和11的。
SEQ ID Nos.4、20、和44中分別描述的三種寡核苷酸被設計具有16個鹼基的較短長度而不是20個鹼基。初步實驗表明當使用20個鹼基的寡核苷酸時，常發生某些G-A錯配(4、20、和44位)，從而表現出非特異性信號。例如，在SEQ ID Nos.4(-GGC-)和8(-TGC-)中描述的寡核苷酸情況下，樣品DNA中的互補序列(-ACG)原則上僅與SEQ ID No.8的寡核苷酸雜交。然而，也可能與表現G-A錯配恆定結合親合力水平的SEQ ID No.4的寡核苷酸非特異性雜交。據報導，G-T和G-A錯配略微使雙鏈不穩定，而A-A、T-T、C-T、和C-A錯配導致顯著不穩定(IkutaS.等，Nucleic Acids Res.15797-811，1987)。還報導提高清洗溫度能夠清晰分辨精確匹配雙鏈與錯配雙鏈(Ikuta S.等，Nucleic Acids Res.15797-811，1987)，當室溫為約60℃時，則不可能充分分辨特異性信號與非特異性信號。因此，為了減少本發明中由於非特異性雜交導致的實驗誤差，寡核苷酸的長度在三個情況下(4、20、和44位)從20個鹼基減少到16個鹼基，以便降低G-A錯配導致的不穩定作用。這些16個鹼基的寡核苷酸用精確匹配寡核苷酸分析。
可以利用包括以下步驟的方法，用自動微點陣儀將多達67個寡核苷酸固定到固體基質表面生產本發明的RET寡晶片1)在微量點樣溶液中混合每一種寡核苷酸，然後分配到平板的孔中；2)用微點陣儀將寡核苷酸點到固體基質表面；3)將寡核苷酸固定到固體基質表面，並清洗；4)將固體基質浸泡到95℃水中，使固定的寡核苷酸變性，然後用硼氫化鈉溶液處理固體基質；和5)清洗並乾燥固體基質。
步驟(1)中使用的每種寡核苷酸優選具有功能基團，該基團可以用於與固體基質表面形成穩定的結合。例如，各寡核苷酸可以連接有含5』氨基功能的12碳間隔區，例如H2N-(CH2)12-寡核苷酸。該氨基可與固體基質表面的醛基發生Schiff鹼反應，在其間形成牢固結合。12碳間隔區通過促進寡核苷酸和螢光標記的目的DNA之間接觸，而增強雜交速率。
步驟(1)中使用的微量點樣溶液可以含有適當的鹽和聚合物，以便有利於將寡核苷酸點到固體基質上。
步驟(2)中使用的固體基質可以用玻璃、改良矽膠、塑料盒、或聚合物例如聚碳酸酯或其凝膠製得。固體基質表面可以塗布化合物，其有助於寡核苷酸與基質底物結合。可以用於塗布的優選化合物具有例如醛基或氨基這樣的功能基團。在一個優選實施方式中，本發明使用了一個用乙醛塗布的玻璃片。
按照步驟(1)和(2)的一個實施方式，將總共268種寡核苷酸用自動針式微點陣儀以指定方式排列到固體基質上。各寡核苷酸點優選為直徑100到500μm的圓形。固體基質的優選實施例是尺寸約為3.7cm×7.6cm的玻璃片，該玻璃片可以容納約100到10000個點。優選地，可以將總共268種寡核苷酸點，直徑各自為130μm，以300μm的間隔排列成多列和多排(參見圖2)。
在步驟(3)中，通過在寡核苷酸的氨基和固體基質的醛基之間經Schiff鹼反應形成共價鍵的方式，將寡核苷酸固定到固體基質表面。游離未反應的寡核苷酸用SDS、SSC、SSPE等從固體基質上清洗除去。
在步驟(4)中，將固定的寡核苷酸變性，通過硼氫化鈉處理減少和滅活保留在固體基質上的未反應醛基。
通過上述方法生產的本發明的RET寡晶片可以有利地檢測基因突變，本發明的方法比任何常規基因突變檢測方法更簡單、更經濟用這些常規方法例如SSCP(單鏈和構象多態型)、PTT(蛋白質截斷實驗)、RFLP(限制性片段長度多態型)、克隆、直接測序等檢查是否存在基因突變平均須花費幾天到數月。然而，當使用本發明的RET寡晶片分析RET基因突變的DNA樣品僅花費不到9小時。另外，本發明的RET寡晶片可以以比常規晶片更少的生產成本更簡單地生產。一旦合成所需的寡核苷酸後，可以大量生產本發明的玻璃片。使用本發明的RET寡晶片所需的試劑量遠遠少於任何常規方法中所需的試劑量本發明的RET寡晶片用針式微點陣儀可容易地生產，而現有的Affymetrix寡晶片必須用複雜和昂貴的光刻技術製備。
另外，用本發明的RET寡晶片純化和修飾寡核苷酸是可能的，相比較而言，通過在固體基質表面直接合成寡核苷酸製備的Affymetrix寡晶片不可能純化或修飾寡核苷酸。因此，本發明的RET寡晶片能夠提供比以前可能得到的更好的實驗準確度。
本發明提供了一種用RET寡晶片檢測遺傳性癌症的方法，包括以下步驟1)從受試患者的血液製備螢光標記的DNA樣品；2)使標記的DNA樣品與RET寡晶片上的寡核苷酸點反應；3)清洗反應後的寡晶片，除去未結合的樣品DNA；4)用螢光讀數儀檢測特定寡核苷酸點的雜交模式；和
5)檢查是否存在基因突變。
在步驟(1)中，通過將螢光染料加入到從受試患者得到的血液DNA樣品中製備DNA樣品。可以應用適當軟體用螢光讀數儀分析螢光染料標記的DNA與寡晶片上某寡核苷酸點的雜交。優選的螢光染料包括，但不限於Cy5和Cy3。
在步驟(2)中，將步驟(1)中製備的螢光染料標記的DNA樣品與雜交溶液混合，然後轉移到各種寡核苷酸點中。在45～60℃、水蒸汽飽和的保溫箱中進行雜交反應3-9小時。然後清洗寡晶片，除去未結合的樣品DNA，並乾燥(步驟3)，應用合適的軟體用螢光讀數儀分析產生的螢光(步驟4)。在步驟(5)中，在99％可靠範圍內設置一個最大值作為極限值，認為螢光值高於極限值的任何信號對於突變的存在是陽性的。
本發明的RET寡晶片可以有效地用於診斷諸如MEN2A、MEN2B、FMTC等的遺傳性癌症。因為RET基因屬於受體酪氨酸激酶家族，在細胞信號轉導途徑中起作用，因此本發明的RET寡晶片可以用作研究癌症細胞的有效診斷工具。
下述實施例和實驗例僅為說明的目的提供，並不是想限制本發明的範圍。實施例1用RET寡晶片檢查RET突變(步驟1) RET寡晶片的生產如下生產67種寡核苷酸，設計用於檢測RET基因的9個突變熱點密碼子上的共56種錯義突變(表1a和1b)。SEQ ID Nos.1和50中描述的寡核苷酸10-PC和11-PC為陽性對照，SEQ ID Nos.9、17、25、33、41、49、58、65、和67中描述的寡核苷酸為野生型。其它寡核苷酸各自在一個熱點密碼子上存在SEQ ID Nos.2到8描述的寡核苷酸在密碼子609上有錯義突變；SEQ ID Nos.10到16描述的寡核苷酸在密碼子611上有錯義突變；SEQ ID Nos.18到24描述的寡核苷酸在密碼子618上有錯義突變；SEQ ID Nos.26到32描述的寡核苷酸在密碼子620上有錯義突變；SEQ ID Nos.34到40描述的寡核苷酸在密碼子630上有錯義突變；SEQ ID Nos.42到48描述的寡核苷酸在密碼子634上有錯義突變；SEQ ID Nos.51到57描述的寡核苷酸在密碼子768上有錯義突變；SEQID Nos.59到64描述的寡核苷酸在密碼子804上有錯義突變；和SEQ IDNo.66描述的寡核苷酸在密碼子918上有錯義突變。表1a
表1b
a陽性對照；b突變的；c胺基酸；d野生型所有67個寡核苷酸，各自具有一個5』-末端用可與醛基發生Schiff鹼反應的氨基殘基修飾的12碳間隔區，從MWG-Biotech(Ebrsberg，德國)得到，然後固定到玻璃片上。每種寡核苷酸各20pmole/μl，與微量點樣溶液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)混合，混合比例為1∶1，得到的寡核苷酸10pmol/μl的終體積，將每種寡核苷酸各40μl轉移到96孔平板上。當將該96孔平板置於針式微點陣儀(Microsys 5100 Cartesian，Cartesian Technologies Inc，Irvine，CA)後，將各寡核苷酸印跡到醛基塗布的玻璃片上(26×76×1mm，CEL Associates Inc，Houston，TX)。每點直徑130μm，以300μm的間隔多列多排排列。點印寡核苷酸的玻璃片用0.2％ SDS清洗兩次，然後用蒸餾水清洗一次。將玻璃片浸泡到熱水(95℃)中，使寡核苷酸變性，然後放入硼氫化鈉溶液5分鐘，使未反應的醛基失活。然後，用0.2％ SDS清洗玻璃片2次，用蒸餾水洗一次，離心，乾燥。(步驟2)DNA樣品的製備從與5個MEN2A家族有關的23位個體採集學樣(表2)。23位中22位(SNU-MEN1A-I，II，III，IV)經常規方法確認為MEN2A患者，剩餘的一位(SNU-MEN2A-V)是未知受試者。表2
在表2中，術語「受影響成員」指表現MEN2A臨床症狀的MEN2A患者，術語「基因攜帶者」指未表現MEN2A臨床症狀的突變RET基因攜帶者。
用Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia-biotech Ltd，Uppsala，Sweden)和TRI試劑(Molecular Research Center，Cincinati，OH)，按照生產商的說明，提取各血樣中的總基因組DNA。為了產生螢光標記的DNA樣品，用提取出的DNA作為模版和SEQ ID Nos.68到77中描述的5對引物(MWG-Biotech，Ebersberg，Germany)進行PCR擴增(表3)。按照Takiguchi-Shirahama，S.等，Hum.Genet.95187-190，1995的描述使用外顯子10和11的PCR引物，按照Shuffenecker I.等，Am.J.Hum.Genet.62233-237，1997的描述使用外顯子14的PCR引物，按照Karaga，H.J.等，Eur.J.Endocrinol.139410-415，1998的描述使用外顯子13和16的PCR引物。PCR反應液的組成為100ng基因組DNA、10pmol各種引物、40μM dCTP、20μM螢光染料Cy5-dCTP(MEN)或Cy3-dCTP(Amersham-biotech Ltd.，Buckinghamshire，UK)，體積為25μl。在程序化熱循環儀(Perkin Elmer Cetus 9600；Roche Molecular Systems，Inc.，NJ)中，94℃變性5分鐘開始反應。PCR條件為94℃30秒、60℃30秒、和72℃1分鐘，循環35次，最後在72℃延長7分鐘。每種外顯子單獨擴增。PCR擴增後，用純化試劑盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)純化Cy5-或Cy3-標記的PCR產物，然後用0.25 U DNase I(Takara，Shiga，Japan)在25℃消化10分鐘。剩餘的酶在95℃滅活10分鐘，並通過上述純化程序除去，收集Cy5-或Cy3-標記的DNA樣品。表3
(步驟3)雜交反應和分析將步驟(2)中製備的各外顯子的Cy5-或Cy3-標記的DNA樣品單獨混合，然後重懸浮於預熱的1×UniHyb溶液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)中，至體積為2～4μl。將2μl混合的DNA樣品滴到步驟(1)製備的玻璃片上，然後用一塊蓋玻片覆蓋這塊玻璃片。將這塊玻璃片在飽和蒸汽試管中於60℃保溫3小時進行雜交反應。將該雜交後的玻璃片置於2×SSC+0.2％ SDS緩衝液中室溫下漂洗10～30分鐘，然後，在蒸餾水中漂洗5分鐘，隨後離心和乾燥。用ScanArray Lite(ParkardInstrument Co，Meriden，CT)掃描玻璃片，用定量微點陣分析軟體(QuantArray，version 2.0)分析。為了確定極限值，所有數據用Sigma Plot(SPSS Inc.，San Rafael，CA)進行分析，計算平均值和標準差。
將99％可信度範圍的最大值設置為極限值，分析存在RET各密碼子突變的陽性信號(圖3和4)。圖4(a)顯示外顯子10(密碼子609、611、618、和620)和外顯子11(密碼子630和634)上發生的雜交的範圍。據報導超過95％的MEN2A突變發生在外顯子10和外顯子11。Fig.4(b)表明外顯子13(密碼子768)和14(密碼子804)上的雜交。經鑑定大多數FMTC突變發生在外顯子13和外顯子14上；而觀察到大多數MEN2B突變發生在外顯子16(密碼子918)上。
22個樣品(SNU-MEN2A-I，II，III，IV)的雜交結果與之前的測序數據一致。至於未知的SNU-MEN2A-V樣品，應用本發明的RET寡晶片的雜交實驗表明密碼子634發生了從TGC(半胱氨酸)到TGG(色氨酸)的突變，而不是之前用常規方法確定的野生型序列。為了確定該突變在密碼子634位上，進行克隆和直接測序。將外顯子11的PCR產物連接到PCR-TOPO載體上，用TA克隆系統(Invitrogen，Caelsbad，CA)進行亞克隆。用Taq雙脫氧末端循環測序試劑盒和ABI 377 DNA序列儀(Perkin-Elmer，Foster City，CA)進行雙向測序。結果證實SNU-MEN2A-V樣品在密碼子634上有一個突變(48C634W，TGC→TGG，外顯子11)。也就是說，本發明的RET寡晶片能夠檢測到直接測序辨認錯誤的RET基因突變。
雖然描述和說明了本發明的實施方式，顯然在不偏離僅由所附權利要求範圍限定的本發明實質的情況下，可以進行各種改變和修飾。
序列表110國立癌中心120RET寡核苷酸微晶片及其用於檢測遺傳性癌症的方法130PCA11254/PJG16067170KopatentIn 1.71210121121212DNA213人工序列22022310-PC4001ggggattaaa gctggctatg g 21210221121212DNA213人工序列220223609M-(R)4002ctatggcacc cgcaactgct t 21210321121212DNA213人工序列220223609M-(S)4003ctatggcacc agcaactgct t 21210421116212DNA213人工序列220223609M-(G)4004tggcaccggc aactgc 16210521122212DNA213人工序列220223609M-(F)4005ctatggcacc ttcaactgct tc 22210621122212DNA213人工序列220223609M-(Y)4006ctatggcacc tacaactgct tc 22210721121212DNA213人工序列220223609M-(S)4007tatggcacct ccaactgctt c 21210821121212DNA213人工序列220223609M-(W)4008tatggcacct ggaactgctt c 21210921121212DNA213人工序列220223609M-(C)4009tatggcacct gcaactgctt c 212101021120212DNA213人工序列220223611M-(R)40010acctgcaacc gcttccctga 202101121121212DNA213人工序列220223611M-(S)40011cacctgcaac agcttccctg a 212101221120212DNA213人工序列220223611M-(G)40012acctgcaacg gcttccctga 202101321121212DNA213人工序列220223611M-(F)40013acctgcaact tcttccctga g 212101421121212DNA213人工序列220223611M-(Y)40014acctgcaact acttccctga g 212101521121212DNA213人工序列220223611M-(S)40015acctgcaact ccttccctga g 212101621121212DNA213人工序列220223611M-(W)40016acctgcaact ggttccctga g 212101721121212DNA213人工序列220223611W-(C)40017acctgcaact gcttccctga g 212101821120212DNA213人工序列220223618M-(R)40018aggagaagcg cttctgcgag 202101921121212DNA213人工序列220223618M-(S)40019gaggagaaga gcttctgcga g 212102021116212DNA213人工序列220223618M-(G)40020gagaagggct tctgcg 162102121120212DNA213人工序列220223618M-(F)40021aggagaagtt cttctgcgag 202102221120212DNA213人工序列220223618M-(Y)40022aggagaagta cttctgcgag 202102321120212DNA213人工序列220223618M-(S)40023aggagaagtc cttctgcgag 202102421120212DNA213人工序列220223618M-(W)40024aggagaagtg gttctgcgag 202102521121212DNA213人工序列220223618W-(C)40025gaggagaagt gcttctgcga g 212102621120212DNA213人工序列220223620M-(R)40026aagtgcttcc gcgagcccga 202102721120212DNA213人工序列220223620M-(S)40027aagtgcttca gcgagcccga 202102821120212DNA213人工序列220223620M-(G)40028aagtgcttcg gcgagcccga 202102921120212DNA213人工序列220223620M-(F)40029aagtgcttct tcgagcccga 202103021120212DNA213人工序列220223620M-(Y)40030aagtgcttct acgagcccga 202103121120212DNA213人工序列220223620M-(S)40031aagtgcttct ccgagcccga 202103221120212DNA213人工序列220223620M-(W)40032aagtgcttct gggagcccga 202103321120212DNA213人工序列220223620W-(C)40033aagtgcttct gcgagcccga 202103421120212DNA213人工序列220223630M-(M)40034gatccactgc gcgacgagct 202103521120212DNA213人工序列220223630M-(S)40035gatccactga gcgacgagct 202103621120212DNA213人工序列220223630M-(G)40036gatccactgg gcgacgagct 202103721120212DNA213人工序列220223630M-(F)40037gatccactgt tcgacgagct 202103821120212DNA213人工序列220223630M-(Y)40038gatccactgt acgacgagct 202103921120212DNA213人工序列220223630M-(S)40039gatccactgt ccgacgagct 202104021120212DNA213人工序列220223630M-(W)40040gatccactgt gggacgagct 202104121120212DNA213人工序列220223630W-(C)40041gatccactgt gcgacgagct 202104221120212DNA213人工序列220223634M-(R)40042gacgagctgc gccgcacggt 202104321120212DNA213人工序列220223634M-(S)40043gacgagctga gccgcacggt 202104421116212DNA213人工序列220223634M-(G)40044cgagctgggc cgcacg 162104521120212DNA213人工序列220223634M-(F)40045gacgagctgt tccgcacggt 202104621120212DNA213人工序列220223634M-(Y)40046gacgagctgt accgcacggt 202104721120212DNA213人工序列220223634M-(S)40047gacgagctgt cccgcacggt 202104821120212DNA213人工序列220223634M-(W)40048gacgagctgt ggcgcacggt 202104921120212DNA213人工序列220223634W-(C)40049gacgagctgt gccgcacggt 202105021120212DNA213人工序列22022311PC40050ccgctgtcct cttctccttc 202105121120212DNA213人工序列220223768M-(Q)40051tccccgagtc agcttcgaga 202105221121212DNA213人工序列220223768M-(K)40052ctccccgagt aagcttcgag a 212105321120212DNA213人工序列220223768M-(A)40053tccccgagtg cgcttcgaga 202105421120212DNA213人工序列220223768M-(G)40054tccccgagtg ggcttcgaga 202105521120212DNA213人工序列220223768M-(V)40055tccccgagtg tgcttcgaga 202105621120212DNA213人工序列220223768M-(D)40056tccccgagtg accttcgaga 202105721121212DNA213人工序列220223768M-(D)40057tccccgagtg atcttcgaga c 212105821120212DNA213人工序列220223768W-(E)40058tccccgagtg agcttcgaga 202105921120212DNA213人工序列220223804M-(L)40059ctcctcatcc tggagtacgc 202106021121212DNA213人工序列220223804M-(M)40060cctcctcatc atggagtacg c 212106121121212DNA213人工序列220223804M-(L)40061cctcctcatc ttggagtacg c 212106221120212DNA213人工序列220223804M-(E)40062ctcctcatcg aggagtacgc 202106321120212DNA213人工序列220223804M-(A)40063ctcctcatcg cggagtacgc 202106421120212DNA213人工序列220223804M-(G)40064ctcctcatcg gggagtacgc 202106521120212DNA213人工序列220223804W-(V)40065ctcctcatcg tggagtacgc 202106621124212DNA213人工序列220223918M-(T)40066cagttaaatg gacggcaatt gaat242106721124212DNA213人工序列220223918W-(M)40067cagttaaatg gatggcaatt gaat242106821128212DNA213人工序列220223Exon-10F40068gtaggaattc gacacgagcc tggggagc282106921130212DNA213人工序列220223Exon-10R40069catcgaattc ttgttggacc tcagatgtgc 302107021130212DNA213人工序列220223Exon-11F40070gtaggaattc gcagcctgta cccagtggtg 302107121129212DNA213人工序列220223Exon-11R40071catcgaattc accggaagag gagtagctg 292107221139212DNA213人工序列220223Exon-13F40072taatacgact cactataggg cttccaggag cgatcgttt392107321136212DNA213人工序列220223Exon-13R40073atttaggtga cactatagca ccctgcagct ggcctt 362107421119212DNA213人工序列220223Exon-14F40074tggctcctgg aagacccaa 192107521119212DNA213人工序列220223Exon-14R40075tgcacgcacc ttcatctcg 192107621143212DNA213人工序列220223Exon-16F40076taatacgact cactataggg agagttagag taacttcaat gtc 432107721137212DNA213人工序列220223Exon-16R40077atttaggtga cactatagta acctccaccc caagaga 3權利要求
1.一種用於檢測RET突變的RET寡核苷酸微晶片，包括固定在固體基質表面的多種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被設計用來檢測RET基因突變熱點的錯義突變型。
2.權利要求1的RET寡核苷酸微晶片，其中熱點是密碼子609、611、618、620、630、634、768、804和918。
3.權利要求1的RET寡核苷酸微晶片，其中寡核苷酸被設計用來檢測密碼子609、611、618、620、630、634、和768上的7種錯義突變，密碼子804上的6種錯義突變，密碼子918上的一種錯義突變，9種各密碼子的野生型，和2種外顯子10和11的陽性對照。
4.權利要求3的RET寡核苷酸微晶片，其中密碼子609的錯義突變的寡核苷酸為SEQ ID Nos.2到8描述的那些，密碼子611的錯義突變為SEQ ID Nos.10到16，密碼子618的錯義突變為SEQ ID Nos.18到24，密碼子620的錯義突變為SEQ ID Nos.26到32，密碼子630的錯義突變為SEQ ID Nos.34到40，密碼子634的錯義突變為SEQ ID Nos.42到48，密碼子768的錯義突變為SEQ ID Nos.51到57，密碼子804的錯義突變為SEQ ID Nos.59到64，和密碼子918的錯義突變為SEQ ID No.66。
5.權利要求1至4中任何一個的RET寡核苷酸微晶片的生產方法，包括1)將各種寡核苷酸混合到微量點樣溶液中，然後分配到平板的孔中；2)用微量點陣儀將寡核苷酸點到固體基質的表面；3)將寡核苷酸固定到固體基質表面，並清洗；4)將固體基質浸泡到95℃水中，使固定的寡核苷酸變性，然後用硼氫化鈉溶液處理固體基質；和5)清洗和乾燥固體基質。
6.權利要求5的生產方法，其中步驟(1)中使用的每種寡核苷酸具有一個5』氨基修飾的12碳間隔區。
全文摘要
本發明設計一種用於檢測RET基因突變熱點區突變的RET寡核苷酸微晶片,其生產方法及其用於檢測遺傳性癌症的方法,其中有選擇地設計了特定寡核苷酸,用來檢測RET基因突變熱點上的各種錯義突變。
文檔編號G01N33/53GK1422963SQ0210530
公開日2003年6月11日 申請日期2002年2月21日 優先權日2001年11月19日
發明者樸在甲, 金日鎮, 姜曉貞, 樸在賢 申請人:國立癌中心