一種抗原檢測方法及其應用的製作方法

2023-05-21 18:57:26

專利名稱：：一種抗原檢測方法及其應用的製作方法一種抗原檢測方法及其應用
技術領域：
：本發明屬於診斷
技術領域：
，具體涉及超微量抗原檢測技術及其在超微量腫瘤抗原一前列腺特異性抗原(PSA)檢測中的應用。
背景技術：
：隨著醫學診斷技術迅速發展，抗原檢測手段也日新月異變化。發展至今，放射性免疫分析法、酶聯免疫分析法和螢光免疫分析法這三大技術是免疫化學、免疫學以及分子生物學中應用最廣的常規抗原分子檢測手段。1959年，美國學者Berson和Yalow建立放射免疫分析(RadioImmunoassay,RIA)法，由於RIA具有靈敏度高、特異性強、簡便等優點，RIA具有一定的生命力，但因為它必須使用放射性核素,需要防護，防止汙染；標記物有效使用時間短，難以實現操作和測量的自動化等，它的進一步發展受到一些局限，因此不少學者進行了新檢測方法探索。1971年，Engvall、Perlaman和Weeman、Schuur兩組學者用酶代替同位素製備酶標記試劑,創立了酶免疫分析技術(EnzymeImmunesorbentAssay,EIA)。至今有二十多種酶已被應用於EIA，其中以辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)為主，EIA除了避免放射性同位素的危害外，更重要的優點是酶標記物有效期更長，但普通的EIA靈敏度不高，而後來發展的螢光免疫分析(ImmunefluorescenceAssay,FIA)和化學發光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)提高靈敏度和檢測法範圍。1992年，Sano等人將免疫測定技術與PCR結合，創建了一種全新的極其敏感的抗原分子檢測技術，即免疫-PCR(lmmune-PCR)。它的出現解決了上述三種抗體標記技術的不足之處，然而，由於此法操作複雜，步驟煩瑣，難以推廣開來。在早期癌抗原及某些神經肽等極微量抗原檢測上，螢光標記及酶標記技術還缺乏足夠的靈敏性。放射性同位素標記技術的靈敏度雖然能達到)jg/ml的數量級，在實際操作中由於需特殊設備和安全防護，因此限制了它在實際過程中的廣泛應用。納米技術的介入為抗原檢測技術的研究發展提供了無窮的想像空間。納米粒子(英文名稱為nanoparticles)是指粒徑在1nm-100nm範圍內的粒子，也稱超微粒子(英文名稱為ultrafineparticles),其處在原子和宏觀物體交界的過渡區域內，具有特殊的性能。納米金粒子本身具有小尺寸效應，表面效應，化學反應活性等獨特的物化特性，而日益收到人們的關注，在生物醫學領域，特別是檢測
技術領域：
具有廣泛的應用前景，納米金溶膠具有特殊的顏色，可以通過弱的相互作用與生物大分子結合，也可以通過化學鍵與生物大分子偶聯，而不改變生物大分子的生物活性，目前常被製備成免疫納米金探針廣泛應用於快速免疫診斷。納米免疫磁性微球是表面結合有單克隆抗體的磁性微球。磁性微球大小和抗體大小相接近，化學性能穩定，不產生凝聚；不與細胞發生非特異性的結合；磁性微球與抗體的結合牢固；磁性微球的大小均勻，磁響應性好，磁性納米材料的含量均勻一致；磁性微球大小適當，不易被細胞所吞噬，所以免疫磁性微球主要用於細胞分離等方面。目前，納米金為代表的診斷技術中，以斑點免疫金銀染色(Dot-immunegoldsilverstaining,Dot—IGSS)，珍王,3免疫金》參ii〖去(Dot-immunegoldfiltrationassay，DIGFA)禾口免疫金層析法(immunechromatography,GICA)，三禾中為主。1989年，Spielberg等最先發展了以納米金為標記物的滲濾試驗，用於檢測愛滋病病毒抗體，確立斑點免疫金滲濾法(Dot-immunegoldfiltrationassay,DIGFA)。Beggs等最先將金膠用於人絨毛膜促性腺激素(HCG)的測定(BeggsM，NovotnyM,SampedroS,efa/.Aself-performingchromatographyimmunoassayforthequantitativedeterminationofHCGinurineandserum.Clin.Chem.,1990，36(6):1084-1085.)由於納米金為代表的診斷試劑盒與放免、酶標試劑盒相比，具有操作使用安全、簡便、快速等優點，因此近些年來金標診斷試劑盒日益流行，在某些項目上已逐漸替代了放免、酶標試劑盒，如早孕試劑條等。生物探針是具有放射性或非放射性標記的寡核苷酸，用於從大量核酸樣品中找出互補的目標序列，然後用放射自顯影或其他顯色法(如連接的酶作用於可顯色底物)顯示目標序列所在位置。納米金可通過Au-S共價鍵與核酸分子作用，在DNA的識別和檢驗方面展示出極具應用價值的成果，納米金可通過Au-S共價鍵與硫醇修飾的寡核苷酸結合，二硫蘇糖醇(DTT)或巰基乙醇(MCE)作為還原劑可將寡核苷酸替換下來，形成的納米金生物核酸探針可應用於核酸或蛋白晶片檢測診斷技術(HHHD,MirkinCA.Thebio-barcodeassayforthedetectionofproteinandnucleicacidtargetsusingDTT-inducedligandexchange.NATUREPROTOCOLS,2006,1(1):324-337.)。發明專利申請公開說明書(公開號CN1339609A;國別中國；公開日2002年3月13日)就公開了一種納米金標記基因探針，其中採用採用納米金與烷硫醇修飾的核酸結合形成探針，其一般用於診斷型晶片領域。納米金標記抗體，並可通過銀顯影放大信號。DuanL等利用納米金標記作為報告分子，建立一種同時快速檢測乙型，C型肝炎病毒的蛋白晶片(抗體晶片)檢測法，與常規酶聯免疫分析(ELISA)檢測法相比，無明顯差異(DuanL,WangY,LiSS,efa/.RapidandsimultaneousdetectionofhumanhepatitisBvirusandhepatitisCvimsantibodiesbasedonaproteinchipassayusingnano-goldimmunologicalamplificationandsilverstainingmethod.fi/WC/nfec〖￡)/s.2005;5:53)。而在免疫磁性微球方面，其是近年來發展迅速的新技術，主要用於分離濃縮等試驗，磁性粒子能與蛋白質以共價方式結合而不影響其活性，所以常用來俘獲特定蛋白或分離蛋白。原理如下將某抗體標記磁性微粒，放入含目的抗原的溶液中，經充分混合反應後，形成抗原抗體磁性微粒混合物，使溶液通過磁場，由於磁性微粒被吸附而使目的抗原截留下來，也可根據磁性強弱確定抗體或抗原量的多少。基於納米金和免疫磁性微球特性的結合，美國西北大學納米技術研究所ChadA.Mirkin教授領導的研究小組在2003年建立了以DNA標記免疫檢測為基礎的"生物條碼核酸晶片檢測法"(NamJM,ThaxtonCS,MirkinCA.Nanoparticle-BasedBio-BarCodesfortheUltrasensitiveDetectionofProteins.SCIENCE,2003,301:1884-1886)。其做法具體採用雙抗體夾心法檢測血清中超微量前列腺癌特異性抗原，利用納米金生物探針上的寡核苷酸片段進行放大檢測信號，從而獲知超微量抗原水平,檢測下限比傳統ELISA法低至6個數量級，不僅適用於DNA還適用於蛋白抗原。2006年，研究小組成功應用此法同時檢測PSA，HCG，AFP(StoevaSI,LeeJS,SmithJE'efa/.MultiplexedDetectionofProteinCancerMarkerswithBiobarcodedNanoparticleProbes.丄AM.CHEM.SOC.2006,128:8378-8379.)，另外，他們還用此法檢測腦脊液中微量ADDL蛋白，而普通檢測方法難以檢測到ADDL，闡明了死後被診斷為老年痴呆患者的腦脊液中高於健康個體的ADDL蛋白濃度，有利於老年痴呆症的早期診斷。(GeorganopoulouDG，l_eiChang,Nam識efa/.Nanoparticle-baseddetectionincerebralspinalfluidofasolublepathogenicbiomarkerforAlzheimer'sdisease.PNAS，2005，102(7):2273-2276)該方法目前還只存在與實驗研究階段，所用的抗原樣本為標準樣本，而臨床檢測時需要用到血清樣本，所以需要對血清的稀釋度進行研究，另外該方法操作複雜，需要用計算機晶片技術進行檢測，檢測成本較高。
發明內容為了解決上述的技術問題，本發明基於納米技術和免疫學檢測技術的結合，將納米金和免疫磁性微球同時運用到檢測技術中，即提供一種簡單的採用核酸條碼(nucleicacidcodes)標識的抗原診斷檢測方法，將抗原分子的檢測轉換為對核酸條碼標識的檢測，無需特殊的儀器設備，操作簡單快捷，靈敏度高，特異性好，易於自動化，有廣泛的應用前景。本發明的目的是這樣實現的，即建立基於製備免疫磁性微球和納米金探針的雙抗體夾心法檢測前列腺特異性抗原，通過檢測核酸條碼的量而放大檢測蛋白抗原的信號，從而獲知超微量蛋白質檢測水平。要求檢測反應中抗原抗體的能特異性結合，而通用核酸條碼片段又可以達到非酶促信號放大，提高檢測靈敏度的效果。'本發明包括二方面的內容核酸條碼標識的檢測方法和核酸條碼標識檢測的應用，其創新點在於核酸片段可標記抗原抗體反應，將超微量抗原的檢測轉化為對核酸片段的檢測，雙抗體夾心和核酸條碼信號的放大，大大提高檢測靈敏度。本發明適用於各類抗原物質的檢測，包括早期癌抗原及某些神經肽等極微量抗原的檢測。本發明的具體技術方案如下一種微量抗原檢測方法，所述的抗原包括所有的抗原，不局限於PSA抗原。其操作步驟如下，1、免疫磁性微球的製備所述免疫磁性微球是由海藻酸鈉磁性微球表面修飾相應抗體而構成，該抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，每亳克磁性微球連接的抗體含量為70|jg~i50Mg，其中以含有羧基的生物可降解的高分子材料海藻酸鈉交聯形成高分子包裹層，包裹層內還包含納米磁性材料，用反相微乳法在高速攪拌和超聲的條件下製備磁性微球，然後在化學交聯劑的作用下，將高分層上再連接單克隆抗體，形成免疫磁性微球，製得的免疫磁性微球的粒徑範圍在300nm1|jm左右。其具體製備方法如下(1)磁性微球的製備取一定量的海藻酸鈉和Fe304溶於蒸餾水中，微熱使之充分溶解後，超聲15分鐘後形成磁流體混合液，調節混合液的pH為10左右，升溫至6(TC。超聲和高速攪拌的條件下，將一定量混合液逐滴加入到溫度為60。C的AOT/正庚烷油相中，形成透明的灰黑色反相微乳體系。在超聲和攪拌的條件下將30%的CaCl2溶液加入到微乳體系中,再逐滴加入一定量的環氧氯丙烷，繼續攪拌35小時，進行磁分離後，依次用丙酮、乙醇和蒸餾水洗滌，然後離心分選，真空冷凍乾燥後保存。(2)免疫磁性微球的製備取1mg製備好的磁性微球，PBS定容到4ml，加入水溶性3mg6mg的EDC和6mg10mg的sufl-NHS，充分混勻，室溫反應15min,加入0.1-0.2mg/ml的6-氨基己酸，輕搖3h,加入600ijl，20叩/ml30ijg/ml測試抗原的抗體，輕輕攪拌5h10h，加入0.2M含0.2%BSA的甘氨酸溶液封閉，磁分離洗滌，加入儲存液4"C保存待用。以下操作步驟是對免疫磁性微球的分析A.用透射電子顯微鏡(TEM)和光鏡進行形貌的定性檢測。B.採用流式細胞儀檢測抗體活性情況取1mg磁性微球凍幹品稀釋並按上述方法連接包被150pg小鼠IgG，定容為5mg/ml免疫磁性微球。取5試管，分別加入0.01M，pH7.4的PBS1ml，5mg/ml免疫磁性微球80(jl(磁性微球包被小鼠lgG)，充分混勻，加入一定量FITC標記的羊抗小鼠lgG，37'C避光分別輕搖0.5h、1h、2h，3h，磁場分離，濃度為0.01M，pH為7.4的PBS重複洗滌三次，用流式細胞儀檢測免疫磁性微球抗體活性情況。2、納米金生物探針的製備所述的納米金探針是由大小粒徑為10nm50nm納米金微粒表面靜電吸附抗體，共價結合核酸條碼(nucleicacidcodes)片段而構成。所述的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。所述的核酸條碼片段為單鏈DNA或RNA分子，其長度為10~50bp，其一端被巰基修飾，另一端被生物素、螢光基團標記。所述的核酸條碼片段靠近巰基的一端包含有垸氫和多個單一鹼基形成的基團。製備納米金探針時，納米微粒表層覆蓋有通過Au-S共價鍵牢固結合的核酸條碼片段，二硫蘇糖醇(DTT)或巰基乙醇(MCE)作為還原劑將核酸條碼片段替換下來。納米金微粒表面靜電吸附抗體，並易於交連結合的活性基團-巰基(-SH),對核酸條碼分子進行硫醇修飾。為了克服寡核苷酸單鏈分子連接時候的空間位阻問題，核酸條碼片段-SH端增加了垸氫基團，並連接了10個腺嘌呤(A)作為"手臂"以有活動空間，另外所連接的寡核苷酸片段為10bp-50bp，過長的片段容易纏繞在金納米粒子表面。其具體操作步驟如下，(1)膠體金的製備將100ml0.01。/。的HAuCI4溶液加熱至沸騰；高速攪拌條件下(1200rpm)快速加入5ml濃度為1%的檸檬酸三鈉(上海國藥，Na3C6H5Or2H20)，繼續加熱攪拌30min，自然冷卻，用超純水恢復至原體積。用0.22濾膜過濾，4°C避光保存備用。用透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米金粒子的形貌，用雷射散射儀測定其大小和粒徑分布，用紫外-可見光分光光度計掃描觀察吸收峰值，並根據朗伯-比爾定律估算納米金的濃度。(2)納米金生物探針的製備取上述5ml納米金溶膠(約3.5nM)，用Na2C03調pH值至9左右。按比例加入與待測抗原的抗體(7pg/ml)和一定量的硫醇(3'-端硫醇、垸硫醇)修飾的寡核苷酸(ssDNA)(稀釋至13.2pg/ml)，隨即旋渦混勻，輕搖3h，低i避光靜置過夜，使溶液中納米金粒子和抗體、寡核苷酸(ssDNA)能夠充分作用。加入0.01M磷酸鹽緩衝液(PBS)(pH7.4)，10。/。(W/V)的十二烷基硫酸鈉(SDS)使其終濃度為0.01%，旋渦混勻，置於搖床中30min,逐漸加入1.2M的NaCI溶液，使濃度至0.15M，邊加邊旋渦混勻，.靜置平衡3h以上，穩定ssDNA的連接。最後，加入5yo(W/V)的牛血清白蛋白(BSA)使最終濃度為1%，混勻平衡。取上述製備好的納米金探針，12000r/min，40min，4。C，傾去上清液除去未結合的抗體和寡核苷酸，0.01MPBS(pH7.4)和0.15MNaCI溶液(含0.1%BSA，0.01%SDS)重複洗滌紅色油狀沉澱，磷鴇酸負染，透射電鏡(TEM)對探針進行形貌大小定性觀察，紫外-可見光分光光度計波長掃描分析。用免疫金銀染色光鏡觀察分析納米金探針的形貌，用斑點免疫金滲濾測定納米金探針上抗體的活性。3、核酸條碼標識的建立所述的核酸條碼標識法，採用了免疫磁性微球和納米金探針，所述的納米金探針的核酸條碼為抗原檢測標識信號。所述的核酸條碼標識法的建立包括如下步驟(1)免疫磁性微球與含目的抗原的物質混合，輕搖孵育，磁分離洗滌；(2)重新懸浮，加入納米金探針，輕搖孵育，磁分離洗滌，留聚集物；(3)加入還原劑還原出核酸條碼片段；(4)低溫超速離心，作用獲取核酸條碼片段。'更具體的步驟為(1)免疫磁性微球、待測抗原混合，混合，37。c輕搖孵育；(2)磁場分離，重複洗滌，稀釋液懸浮；(3)加入納米金探針，混合，37。c輕搖孵育；(4)磁場分離，重複洗滌；(5)加入DTT，混勻，純化，去結合聚集物，檢測上清液；所述核酸條碼標識法，DTT的加入終濃度不超過0.01M;所述的抗原為PSA抗原時，其更進一步具體的操作步驟為將標準psa抗原稀釋至1CM000倍，取10ij18CHjI，510mg/ml的免疫磁性微球，加入稀釋的PSA標準抗原1ng500ng，超純水定容至1ml，37。c輕搖1h，磁場分離，0.01M，pH7.4PBS(含0.2。/。BSA)重複洗滌三次，分別加入核酸條碼法稀釋液和體積比為1:2~1:16(免疫磁性微球和納米金探針的體積比)的納米金探針，37°C，200500r/min輕搖1h3h，磁場分離，核酸條碼法洗滌液重複洗滌，最後定容至50iJl，加入DTT至終濃度為0.01M，作用3h10h，12000r/min,0.5h1h，4'C條件下離心獲取上清液。免疫磁性微球結合抗原的最適作用條件為37。C，垂直輕搖混勻1h。納米金探針結合抗原的最適作用時間為37。C孵育1h，2Q0400r/min輕搖。採用方陣滴定法確定免疫磁性微球和納米金探針反應最適比例。採用流式細胞儀梯度摸索法檢測納米金探針結合抗原最適反應時間。4、核酸條碼標識的檢測所述的核酸條碼標識的檢測方法包括酶放大檢測法、螢光定量法、核酸晶片檢測法。所述核酸條碼的檢測，通過生物素-鏈酶親和素放大系統檢測信號的強弱(相對灰度值)獲知標識分子(抗原)檢測情況。所述生物素-鏈酶親和素放大系統檢測步驟可以為(1)尼龍膜點樣，8(TC烘烤24h;(2)按照試劑盒要求配置相應的洗滌液體，封閉液，平衡液等，洗滌液輕搖5min去液，加入封閉液，室溫輕搖30min，去液；(3)加入鹼性磷酸酶標記的鏈黴親合素的稀釋液體，37'C輕搖30min，去液；(4)洗滌液重複洗滌23次，每次室溫輕搖10min再去液體；(5)加入平衡液，室溫輕搖10min，去液體；(6)加入反應液顯色1015min，蒸餾水終止反應，觀察結果；製作核酸條碼標識法標準曲線來評估其核酸條碼標識法的準確性，並確定其相應的PSA濃度範圍。製作核酸條碼標識法標準曲線來評估核酸條碼標識法靈敏度，並確定其相應的PSA濃度範圍。做臨床核酸條碼標識法檢測抗原時的最適血清稀釋度。做核酸條碼標識法準確性實驗檢測和重複性檢測。本發明還提供一種通過核酸條瑪法在臨床血清標本檢測PSA抗原檢測的應用，根據核酸條碼標識法檢測本底值與標準條帶對照，以PSAMng/ml為陽性檢測標準，PSAWng/ml為陰性標準。通過核酸條碼標識法與ELISA和RIA對比驗證該方法的準確性步驟。本發明的有如下使用效果(1)將檢測效率檢測靈敏度提高至23個數量級，達到普通免疫學檢測技術(ELISA)無法比擬的靈敏度，能對臨床微量腫瘤標誌物、微量激素、心臟疾病等微量蛋白質準確快捷檢測的目的。並且，由於檢測中不需要生物活性大分子的參與，試劑的運輸保存相對容易；(2)由於納米金和磁性微球製備技術成熟，整個操作過程簡單，容易實現高通量檢測自動化操作。(3)本發明初步應用於前列腺特異性抗原(PSA)的檢測，對不同的檢測物只需變換對應的抗體或寡核苷酸便是一種新試劑盒。圖表說明圖1是本發明的免疫磁性微球透射電鏡圖；圖2是本發明的流式細胞儀檢測免疫磁性微球抗體活性示意圖；圖3是本發明的納米金微粒透射電鏡圖；圖4是本發明的納米金探針透射電鏡圖；圖5是本發明的納米金溶膠和納米金探針紫外-可見分光光度計掃描曲線圖;圖6是本發明的免疫金銀染色法透射電鏡圖；圖7是本發明的核酸條碼標識法過程示意圖；圖8是本發明的免疫磁性微球和納米金探針不同反應比例的示意圖；圖9是本發明的納米金探針結合抗原不同反應時間的示意圖；圖10是本發明的是核酸條碼標識法標準曲線的相關性示意圖；圖11是本發明的核酸條碼標識法靈敏度的示意圖；圖12是本發明的核酸條碼標識法血清稀釋的檢測結果示意圖；圖13.核酸條碼標識法臨床血清標本檢測示意14是本發明的核酸條碼標識法、ELISA、RIA對比驗證相關性分析結果示意圖；'表1是本發明的核酸條碼標識法回收性實驗檢測結果；表2是本發明的核酸條碼標識法重複性檢測結果；表3是本發明的核酸條碼標識法臨床血清標本檢測結果；表4是本發明的核酸條碼標識法、ELISA、RIA三種方法檢測結果；表5是本發明的核酸條碼標識法與ELISA對比驗證吻合度分析結果；表6是本發明的核酸條碼標識法與RIA對比驗證吻合度分析結果。具體實施方式本發明結合納米技術和免疫學檢測技術，將免疫磁性微球和納米金探針巧妙組合，利用核酸條瑪法檢測抗原，將微量蛋白抗原的檢測轉化為對核酸條碼的檢可用於本發明的核酸條碼片段的檢測沒有特別限制，代表性例子包括(但並不限於)酶放大檢測法(生物素鏈酶親合素)、螢光定量法、核酸晶片檢測法等。可用於本發明的識別分子沒有特別限制，代表性例子包括(但並不限於)抗體(識別抗原)、抗原(被抗體識別)、受體(識別配體)、配體(識別受體)等。本發明提供一種微量抗原檢測方法，所述的抗原包括所有的抗原，不局限於PSA抗原。下面以PSA抗原為例，給出其優選的檢測步驟步驟1、免疫磁性微球的製備海藻酸鈉Fe304:6CTC的AOT/正庚烷油相30%的CaCl2溶液環氧氯丙烷的配比？取一定量的海藻酸鈉和Fe3Cu溶於蒸餾水中，微熱使之充分溶解後，超聲15分鐘後形成磁流體混合液，調節混合液的pH為10，升溫至6CTC。超聲和高速攪拌的條件下，將一定量混合液逐滴加入到溫度為6CTC的AOT/正庚烷油相中，形成透明的灰黑色反相微乳體系。在超聲和攪拌的條件下將30%的CaCI2溶液加入到微乳體系中,再逐滴加入一定量的環氧氯丙烷，繼續攪拌5小時，進行磁分離後，分別用丙酮、乙醇和蒸餾水洗滌，然後離心分選，真空冷凍乾燥後保存。磁球EDC:sufl-NHS:PSA單克隆抗體的配比？取1mg製備好的磁球，PBS定容到4ml，加入水溶性EDC和sufl-NHS，充分混勻，室溫反應15min,加入6-氨基己酸，輕搖3h,加入600|jl，2030|jg/mlPSA單克隆抗體，輕輕攪拌5h10h，以0.2M甘氨酸溶液(含0.2%BSA)封閉，磁分離洗滌，加入儲存液4'C保存待用。用透射電子顯微鏡(TEM)和光鏡進行形貌的定性檢測，觀察到的免疫磁性微球透射電鏡圖如圖1所示。採用流式細胞儀檢測抗體活性情況，如圖2所示，實驗結果所得磁性微球有較好分散性，粒徑均勻，磁響應性好，，交聯抗體後流式細胞術檢測98.3%的磁性微球具免疫活性。步驟2、納米金探針的製備(1)納米金膠的製備檸檬酸三鈉HAuCl4量的配比？用檸檬酸三鈉(上海國藥)還原HAuCl4法製備膠體金。將100ml0.01%的HAuCI4溶液加熱至沸騰；高速攪拌條件下(1200rpm)快速加入5ml1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5Or2H20)，繼續加熱攪拌30min，自然冷卻，用超純水恢復至原體積。0.22pm濾膜過濾，《C避光保存備用。用透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米金粒子的形貌，觀察到的納米金在透射電鏡下的圖像如圖3所示，用雷射散射儀測定其大小和粒徑分布,用紫外-可見光分光光度計掃描觀察吸收峰值，如圖5中a曲線所示，測得納米金在518nm有最大的吸收峰，粒度均勻，分散性良好，主要分布範圍在10士3nm。並根據朗伯-比爾定律估算納米金的濃度，金膠大概的濃度為3.7nM。(3)納米金探針的製備量的配比？將連接有3'-端硫醇的ssDNA片段0.5OD溶解在超純水中，備用。取5ml納米金溶膠(約3.7nM)，用Na2C03調pH值至9左右。按比例加入適量PSA抗體和一定量3-端硫醇修飾的ssDNA(稀釋至13.2|jg/ml)，隨即旋渦混勻，輕搖3h，低溫避光靜置過夜，使溶液中納米金粒子和抗體、SSDNA能夠充分作用。加入0.01MPBS(pH7.4)，10。/0(VWV)的SDS使其終濃度為0.01%，旋渦混勻，置於搖床中30min，逐漸加入1.2M的NaCI溶液使終濃度至0.15M，邊加邊旋渦混勻，靜置平衡3h以上，穩定ssDNA的連接。最後，加入5。/o(W/V)的牛血清白蛋白(BSA)使最終濃度為1%，混勻平衡。下面是對納米金探針的分析和表徵取上述製備好的納米金探針，12000r/min，40min，4。C，傾去上清液除去未結合的抗體和寡核苷酸，0.01MPBS(pH7.4)和0.15MNaCI溶液(含0.1%BSA，0.01%SDS)重複洗滌紅色油狀沉澱，磷鎢酸負染，透射電鏡(TEM)對探針進行形貌大小定性觀察，觀察到的結果如圖4所示。紫外-可見光分光光度計波長掃描分析，如圖5中曲線b所示，結果所得的納米金探針溶液大概濃度在3nM，穩定性良好，連接抗體和核酸條碼片段後最高吸收峰發生6nm漂移。用免疫金銀染色光鏡觀察分析納米金探針的形貌，觀察到的結果如圖6所示，用斑點免疫金滲濾測定納米金探針上抗體的活性，結果顯示納米金探針上抗體的活性良好。，步驟3:核酸條碼標識的建立將標準PSA抗原稀釋至50倍，取40yl，5mg/ml的免疫磁性微球，加入稀釋的PSA標準抗原500ng，超純水定容至1ml，37。C輕搖1h，磁場分離，0.01M,pH7.4PBS(含0.2。/。BSA)重複洗滌三次，分別加入核酸條碼法稀釋液(量的多少？)和體積比為1:2(免疫磁性微球和納米金探針的體積比)的納米金探針，37°C，400r/min輕搖1h，磁場分離，核酸條碼法洗滌液重複洗滌，最後定容至50ijI，加入DTT至終濃度為0.01M，作用3h，12000r/min，30min，4。C條件下離心獲取上清液。如圖7所示，採用方陣滴定法確定二者反應最適比例將免疫磁性微球定至510mg/ml，納米金生物探針的定至1015nM，二者以1:2、1:4、1:8、1:16的體積比，雙抗夾心法檢測500ng,100ng，1ng系列稀釋的PSA抗原取10|jI，20|jI,40|jI,80|jI,5mg/ml的免疫磁性微球，分別加入稀釋的PSA標準抗原(1ng，100ng，500ng)，超純水定容至1ml，37。C輕搖1h，磁場分離，0.01M，pH7.4PBS(含0.2。/。BSA)重複洗滌三次，分別加入核酸條碼法稀釋液和相應體積比例納米金探針，37"C輕搖1h，磁場分離，核酸條碼法洗滌液重複洗滌，最後定容至50jjI，加入DTT至終濃度為0.01M，作用5h或低溫過夜。取上述作用管，12000r/min，30min，輕取含Bio-ssDNA的上清液，重複純化得到Bio-ssDNA。利用鹼性磷酸酶標記的鏈黴親合素檢測試劑盒檢測Bio-ssDNA，根據相同PSA濃度檢測信號的強弱(相對灰度值)和不同PSA濃度的信號比較確定二者反應的最適工作比例。如圖8所示，40|ji免疫磁性微球與8CM的納米金探針反應比例信號強度最好，即二者1:2的反應體積下，背景色最弱。取4支小試管，分別加入一定量的PSA標準抗原，0.01M,pH7.4PBS稀釋至1ml，加入5mg/ml的免疫磁球40pl，37。C輕搖1h,磁場分離，0.01M,pH7.4PBS(含0.2%BSA)重複洗漆，分別加入核酸條碼法稀釋液和80pl納米金探針，37"C分別輕搖0.5h，化，2h，3h，磁場分離,條碼核酸標識法洗滌液重複洗滌，最後定容至50pl，加入DTT至終濃度為0.01M，作用5h或低溫過夜。低溫超速離心獲取Bio-ssDNA。按上述方法利用鹼性磷酸酶標記的鏈黴親合素檢測Bio-ssDNA，同時做好陰性對照，用成像系統檢測信號的強弱(相對灰度值)，以陽性/陰性值最大時的反應時間作為納米金探針結合抗原的最適作用時間。如圖9顯示，在37'C輕搖孵育的條件下，不同的反應時間，結果檢測有差異，而納米金探針結合抗原的最適時間也為化。4、核酸條碼標識的檢測(1)尼龍膜點樣，8CTC烘烤3h;(2)按照試劑盒要求配置相應的洗滌液體，封閉液，平衡液等，洗滌液輕搖5min去液，加入封閉液，室溫輕搖30min，去液；(3)加入鹼性磷酸酶標記的鏈黴親合素的稀釋液體，37"C輕搖30min，去液；(4)洗滌液重複洗滌3次，每次室溫輕搖10min再去液體；(5)加入平衡液，室溫輕搖10min，去液體；(6)加入反應液顯色15min，蒸餾水終止反應，觀察結果；依據上述的核酸條碼標識建立和檢測的步驟，取13ngPSA標準品，加以PBS度成系列梯度的PSA標準品，按照核酸條碼標識法檢測，整個操作過程具體如下取5mg/ml免疫磁性微球40pl，與系列PSA標準品混合定容至1ml，37°C輕搖1h，磁場分離，0.01M，pH7.4PBS(含0.2。/。BSA)重複洗滌，再加入10nM納米金探針80iJl，37'C輕搖1h，磁場分離，核酸條碼法洗滌液重複洗滌，最後定容至50ij1，加入dtt至終濃度為0.1M，作用3h，低溫超速離心獲取上清液。剪取5x8cm尼龍膜，吸取上清液點樣，8CTC烘烤34h，按上述方法利用鹼性磷酸酶標記的鏈黴親合素檢測Bio-ssDNA，直接裸眼判定檢測結果，並用成像系統進行灰度值統計分析，灰度分析軟體進行數據對比分析，以PSA標準品濃度為橫坐標，以相對應的灰度值為縱坐標繪製標準曲線，觀察曲線線形及檢出限，每一次試驗每一個數據結果都來自4個重複方陣的平均值，重複四次檢測。每次測定標本均應帶一標準曲線。如圖10所示，標準曲線在PSA濃度為100fg/ml1pg/ml之間線形關係良好，R-0.9759,相關係數較好。採用上述步驟作靈敏度的初步評估。0.01M,pH7.2PBS中系列稀釋的已知濃度為100ng/ml的PSA陽性血清標本濃度分別為100ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、1pg/ml、100fg/ml、10fg/ml、1fg/ml、100ag/ml、10ag/ml、1ag/ml、0;按照上述核酸條碼法操作流程，檢測PSA抗原，直接裸眼判定該法的檢測靈敏度，並進行灰度值的比較測定和分析。如圖11所示，稀釋至100fg/ml以下後，檢測點的信號強度大大減少，當稀釋至1fg/ml時候，幾乎看不到檢測點的存在。依上述核酸條碼標識建立和檢測步驟作最適血清稀釋度的檢測取已知PSA濃度為90ng/ml的陽性血清，依次取1|jI、，、20mI、40|jI、80|jI、100|jI，分別用含"/。BSA的PBS稀釋至1ml，系列稀釋比例分別為1:1000、1:100、1:50、1:25、1:12.5、1:10，重複三次作血清稀釋度測定。按照上述核酸條碼標識法操作加入免疫磁性微球和納米金探針，檢測血清，根據標準曲線比對相對灰度值獲得劑量反應曲線。如圖12所示，血清作1:1001:50稀釋時，目測檢測結果比較好，與標準曲線對比，灰度值較高。為使用方便，採用1:50稀釋作為試驗用血清工作濃度。依上述的核酸條碼標識建立和檢測步驟作準確性檢測取4份已知的不同PSA濃度的血清樣品(P)分別加入一定量的PSA標準品(A)，充分混勻，測定各份樣品PSA的濃度，每個濃度測定4次獲得平均測定值(M)，根據回收率%=(M—P)/Ax100%，計算結果。如表1所示，回收率為96.3%107.8%。依上述的核酸條碼標識建立和檢測步驟作重複性檢測取常規檢測PSA血清標本低、中、高值各3份，分別為4.0jjg/L、10jjg/L、100|jg/L的樣品進行多點多次測定,計算重複測定值的平均值和標準差,觀察批內變異，結果之間的變異係數。如表2所示，平均批內變異係數(C/%)為6.24%，重複性良好。本發明還公開了一種該抗原檢測方法在臨床上的應用如圖13所示，依上述抗原檢測方法的步驟分別檢測45例前列腺癌患者，45例前列腺良性增生患者，15例其它腫瘤患者，30例正常人群血清標本，重複三次試驗，以核酸條碼標識法檢測本底值與標準條帶對照，以PSA〉4ng/ml為陽性檢測標準，PSA^4ng/ml為陰性標準。確定核酸條碼標識法的臨床檢測血清特異性和靈敏度等指標。如表3所示，靈敏度和特異性分別為92%和68%。假陽性率及假陰性率則是，分別為32%和8%。通過核酸條碼標識法與ELISA和RIA對比驗證該方法的準確性步驟如下如圖14，採用上述抗原檢測方法檢測45例前列腺癌患者，45例前列腺良性增生患者，15例其它腫瘤患者，30例正常人群血清標本，用核酸條碼法標識法檢測，並用PSA-ELISA試劑盒(購於瑞典CanAgDiagnostics.ABGothenburgSweden)和PSA放射免疫試劑盒(法國CISBIO，lnc.)進行對比驗證，嚴格按試劑盒說明書操作，檢測結果做配對卡方檢驗、相關性分析及吻合度測量係數檢測，如表4所示為三種方法的檢測結果。如表5和表6所示，三法的檢測結果差異無顯著性意義(P>0.05)。相關性比較顯示相關係數r分別為0.950和0.967，相關性良好，且K係數為0.9180.960，吻合度強，說明了臨床結果與公司進口試劑盒基本一致。表1.核酸條碼法回收實驗結果tableseeoriginaldocumentpage25表2.核酸:條碼標識法批內重複性檢測結果tableseeoriginaldocumentpage25表3.核酸條碼法臨床血清標本試驗結果例數核酸條碼法真陽性真陰性前列腺癌患者45檢測陽性420檢測陰性30前列腺增生患者45檢測陽性207檢測陰性216其它腫瘤患者15檢測陽性07檢測陰性08正常人對照組30檢測陽性08誦性022(1)靈敏度(真陽性率)=(42+20)/(42+3+20+2)"00%=92,5%(2)特異度(真陰性率)=(16+8+22)/(7+16+7+8+22+8)"00%=68%(3)假陽性率=(7+7+8)/(7+16+15+30)x100%=32%(4)假陰性率=3/(15+22)"00%-8%表4.三種方法PSA檢測結果組別例數核酸條碼法酶聯免疫測定法放射性免疫測定法—+—+—前列腺癌組45423369423前列腺增生45271816291827其他腫瘤組157851069正常對照組30822921921合計135845166697560表5.核酸條碼標識法和ELISA吻合性比較核酸條碼法ELISA合計+—+582684一84351合計6669135P>0.05,K係數-0.918表6.核酸條碼標識法和RIA吻合性比較核酸條碼法RIA合計+—+562484一193651合計7560135P>0.05，K係數-0.960本發明可用其他的不違背本發明的精神或主要特徵的具體形式來概述。因此，無論從哪一點來看，本發明的上述實施方案都只能認為是對本發明的說明而不能限制本發明，權利要求書指出了本發明的範圍，因此，在與本發明權利要求書相當的含義和範圍內的各種改動或修改，都應認為是包括在本發明的範圍之內。權利要求1.一種抗原檢測方法，該方法將抗原信號的檢測轉化為對核酸條碼標識的檢測，其特徵在於，該方法的操作步驟如下(1)用待測抗原的抗體I標記經過修飾的納米磁性微球製備免疫磁性微球；用待測抗原的抗體II和核酸條碼片段同時標記納米金溶膠製備雙標記納米金探針；(2)使免疫磁性微球和納米金探針與待測抗原充分結合，除去結合聚集物，留下上清液待檢；(3)對上清液中的核酸條碼標識進行檢測。2.根據權利要求1所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述納米磁性微球為Fe304/海藻酸納包裹的磁性微球，磁性顆粒大小為是0.3|jmlMm。3.根據權利要求1所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述免疫磁性微球中每毫克磁性微球含70|jg-150Mg抗體。4.根據權利要求1所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述納米金是通過檸檬酸三鈉還原四氯金酸製備而成，納米金平均粒徑約為10nm50nm。5.根據權利要求1所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述標記抗體I包括單克隆抗體和多克隆抗體，標記抗體n包括單克隆抗體和多克隆抗體。6.根據權利要求1所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述的核酸條碼片段為單鏈DNA或RNA分子，其長度為1050bp，其一端被硫醇修飾，另一端被生物素、螢光基團標記。7.根據權利要求6所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述的硫醇包含有巰基，所述的硫醇與核酸條碼片段通過巰基交聯，所述的核酸條碼片段靠近巰基的一端包含有烷氫和多個單一鹼基形成的基團。8.根據權利要求7所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述的硫醇包括3'-端硫醇和烷硫醇。9.根據權利要求1所述的抗原檢測方法，其特徵在於，步驟(2)的詳細步驟如下(1)免疫磁性微球與含目的抗原的物質混合，輕搖孵育，磁分離洗滌；(2)重新懸浮，加入納米金探針，輕搖孵育，磁分離洗滌，留聚集物；(3)加入還原劑還原出核酸條碼片段；(4)低溫超速離心，作用獲取核酸條碼片段。10.根據權利要求9所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述的待檢測的抗原為PSA抗原時，步驟(2)的更進一步詳細的步驟如下(1)將標準psa抗原稀釋至101000倍，取10ijI80ij1,510mg/ml的免疫磁性微球，加入稀釋的PSA標準抗原1ng500ng，超純水定容至1ml，37°C輕搖1h，磁場分離，0.01M，pH7.4PBS(含0.2%BSA)重複洗滌三次(2)依次加入核酸條碼法稀釋液和體積比為1:2~1:16的納米金探針，37°C，200500r/min輕搖1h3h，磁場分離，核酸條碼法洗漆液重複洗滌，最後定容至50[Jl(3)加入DTT至終濃度為0.01M，作用3h10h(4)12000r/min，0.5h1h，4'C條件下離心獲取上清液。11.根據權利要求9所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述的還原劑包括二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇(MCE)。12.根據權利要求11所述的抗原檢測方法，其特徵在於，DTT的加入終濃度小於或等於0.01M，室溫下搖勻310h。13.根據權利要求9所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述抗原和抗體結合方式為輕搖200500rpm，孵育溫度為37。C，作用時間為0.5h3h。14.根據權利要求9所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述核酸條碼片段採用12000rpm，《C低溫超速離心的方法提取，作用時間Q.5h1h。15.根據權利要求9所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述加入的納米金探針的量為免疫磁性微球的兩倍。16.根據權利要求9所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述的抗原和抗體結合的時間為1h。17.根據權利要求1所述的抗原檢測方法，其特徵在於，步驟(3)所述的核酸條碼標識的檢測方法包括酶放大檢測法、螢光定量法、核酸晶片檢測法。18.根據權利要求17所述的抗原檢測方法，其特徵在於，所述的步驟(3)採用酶放大檢測法包括生物素-鏈酶親和素系統放大檢測法，其步驟包括如下(1)尼龍膜點樣，8CTC烘烤24h;(2)按照試劑盒要求配置相應的洗滌液體，封閉液，平衡液等，洗滌液輕搖5min去液，加入封閉液，室溫輕搖30min，去液；(3)加入鹼性磷酸酶標記的鏈黴親合素的稀釋液體，37。C輕搖30min，去液；(4)洗滌液重複洗滌23次，每次室溫輕搖10min再去液體；(5)加入平衡液，室溫輕搖10min，去液體；(6)加入反應液顯色1015min，蒸餾水終止反應，觀察結果。19.如權利要求1-18任一所述的抗原檢測方法，應用於檢測微量PSA抗原，其特徵在於，在檢測時，以PSA〉4ng/ml為陽性檢測標準，PSA^4ng/ml為陰性標準。20.根據權利要求19所述的一種抗原檢測方法，其特徵在於，該方法應用於微量PSA抗原檢測時，PSA濃度範圍為100fg/ml1ijg/ml，採用標準血清檢測時，血清稀釋範圍為1:50。全文摘要本發明涉及一種抗原檢測方法及其應用，該方法將抗原信號的檢測轉化為對核酸條碼標識的檢測，其操作步驟為(1)用待測抗原的抗體I標記經過修飾的納米磁性微球製備免疫磁性微球；用待測抗原的抗體II和核酸條碼片段同時標記納米金溶膠製備雙標記納米金探針；(2)使免疫磁性微球和納米金探針與待測抗原充分結合，除去結合聚集物，留下上清液待檢；(3)對上清液中的核酸條碼標識進行檢測。該抗原檢測方法可以應用與臨床的PSA抗原的檢測。該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好，易於自動化，有廣泛的應用前景。文檔編號G01N33/543GK101566626SQ20081018694公開日2009年10月28日申請日期2008年12月6日優先權日2008年7月22日發明者孔小麗,李富榮,暉齊申請人:深圳市人民醫院