一種葉下珠多糖組份的提取分離方法

2023-05-21 12:31:26 1

專利名稱：一種葉下珠多糖組份的提取分離方法
技術領域：
本發明一種涉及葉下珠多糖組份TOIP II的提取分離方法。
背景技術：
珠^Phyllanthus urinaria L ),又名珍珠草、夜合草、陰陽草,屬於大戟科(Euphorbi aceae)葉下珠屬植物葉下珠的乾燥全草，在民間廣泛用於利水解毒、平肝清熱。1988年，印度學者Thyagarajan等人首次通過實驗證明苦味葉下珠可以使59%患者的B肝表面抗原(HBsAg)轉陰，這一實驗結果引起了國內外學者對葉下珠的關注。大量研究表明]葉下珠具有抗B肝病毒、保肝降酶、抗肝纖維化、防止肝損傷和抗癌變的效果，且毒副作用低，是一種值得深入開發的治療B型肝炎的天然藥材。葉下珠中含有多種化學成分，文獻已經報導過的有木脂素、萜類、黃酮、糅質、生物鹼等，包括正十八烷、去氫訶子次酸、阿魏酸、沒食子酸、短葉蘇木酚酸、丁二酸、甲氧基糅花酸、山茶素、老鶴草素、短葉蘇木酸甲脂、短葉蘇術酚酸乙脂、柯裡拉京、去氫訶子次酸三甲月旨、多糖等等。

多糖類化合物具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗消化性潰瘍、抗凝血、降血糖、降血脂、抗輻射、抗血栓、抗水腫、抗毒物損傷等多種生物活性。乙型病毒性肝炎(HBV)是全球性的公共衛生問題，根據全球衛生組織(WHO)數據，全世界有3. 5 4. O億B肝病毒感染者，其中每年有近100萬患者死於HBV感染引起的肝功能衰竭、肝硬化和肝癌。目前應用於B型肝炎治療的藥物主要是幹擾素和核苷類似物，然而這些藥物只能獲得某種程度上的治療效果。在尋找B肝治療藥物的過程中，中藥多糖成分越來越受到人們的重視。葉下珠具有抗B肝病毒，保肝，抗腫瘤等功效已得到普遍證實，並且相關學者也對其中的幾種化學成分，如沒食子酸、黃酮類及葉下珠素等做了結構和生物活性的研究，但對其中的多糖研究卻很少。開展對葉下珠中多糖成分的提取分離，結構鑑定及生物活性的檢測，有利於進一步確定葉下珠用於治療B型肝炎的藥效物質基礎，更好地開發葉下珠這一藥用植物資源，為尋找B肝治療新藥打下理論基礎。

發明內容
本發明的目的是提供一種葉下珠多糖組份I3UIP II的提取分離方法。本發明所述的葉下珠多糖組份TOIP II的提取分離方法，包括如下步驟
O葉下珠全草用蒸餾水洗淨，乾燥後粉碎，用石油醚脫脂，乙醇脫小分子糖後，藥渣用水浸提，浸提液離心分離，取清液濃縮後加入乙醇醇沉，醇沉物即為粗總多糖；粗總多糖經2)除蛋白，3)醇沉、洗滌和4)透析、乾燥即得葉下珠精總多糖；5)多糖各組分分離純化葉下珠精總多糖過離子交換柱，用NaCl溶液梯度洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，繪製洗脫曲線，洗脫曲線上依次出現四個峰，分別代表四個多糖組分，按照出峰的順序分別記為PULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV，收集第2主峰組分，濃縮，重蒸水透析，冷凍乾燥得葉下珠多糖PULP II純組分。步驟I)粉碎的葉下珠全草粉末，用石油醚在70 90°C下回流提取2 4次，每次I 3小時，棄去回流液，藥渣繼續用50 100%乙醇在80 95°C下回流提取2 4次，每次I 3小時，棄去回流液，得到的藥渣再用60 95 °C水浸提3次，每次I 3小時，合併3次浸提液進行離心分離，離心速度2000 6000r/min，取清液濃縮至原體積1/4，加入4倍體積的90 100%乙醇，靜置24h，離心，取醇沉物即為粗多糖。步驟2)所述除蛋白採用Sevag法脫蛋白將步驟I)得到的醇沉物用蒸餾水復溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液，粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液體積為I 6 :1 3，所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿正丁醇體積比=1 4:1 4，攪拌，充分靜置分層，棄去沉澱，重複I 10次後直至界面無白色沉澱。步驟3)所述醇沉、洗滌在除蛋白後的多糖溶液中加入3 6倍體積的75 100%乙醇，靜置12 36h，離心，沉澱依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重複2 5次。步驟4)所述透析、乾燥取醇沉、洗滌後的多糖加入蒸餾水，充分復溶後用蒸餾水透析，透析在磁力攪拌下進行，樣品液與蒸餾水體積比為1:10 30，4 8h換一次水，透析12 120h，透析完畢後將糖溶液放入冷凍乾燥機中乾燥得葉下珠精總多糖，多糖含量在95%以上。步驟5)的離子交換柱採用DEAE-52陰離子交換樹脂。步驟5)所述NaCl溶液的濃度梯度範圍為O 3mol/L。優選地，所述NaCl溶液的濃度梯度分別為 0、0· 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L。
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步驟5)依次用不同濃度NaCl梯度洗脫，每種濃度NaCl溶液洗脫8小時，流速4mL/min，用管收集洗脫液，每IOmin收集一管，繪製洗脫曲線。所述洗脫曲線以收集的管序為橫坐標，溶液的光吸收度為縱坐標繪製而成。本發明所述的葉下珠多糖TOIP II，為土黃色粉末，易吸潮，是一類不含有N、S元素酸性多糖，相對平均分子量為579962. 6 ；PULP II單糖組成及其比例為鼠李糖(Rha):阿拉伯糖(Ara):甘露糖(Man):葡萄糖(Glc)為 O. 11:0. 36:0. 08:0. 45 ;主鏈由 Rha>Ara 和 Glc組成。各單糖通過呋喃糖苷鍵連接，糖苷鍵以I — 6連接為主，同時還存在I — 4和I — 3連接方式。本發明所述的葉下珠多糖TOIP II，具有一定的抗氧化、抗B肝病毒活性。本發明的優點是通過對葉下珠粗多糖的分離純化，得到了純淨單一的葉下珠多糖成分。通過對多糖的純組分PULP II的結構分析及體外抗氧化、抗病毒活性實驗的研究，確證了葉下珠多糖是葉下珠治療B肝的有效成分，這為研究葉下珠多糖的抗B肝病毒作用機制提供了理論基礎；今後可在此基礎上，結合多糖的構效關係，進一步為開發以葉下珠多糖為原材料的抗B肝病毒藥物奠定基礎。


圖1為葡萄糖標準曲線。圖2為多糖梯度洗脫曲線。圖3為H印G2. 2. 2. 15細胞分泌HBsAg、HBeAg的規律。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明進行詳細說明
實施例1葉下珠多糖的提取
I材料與方法1.1材料(略)
1.2實驗方法
1.2.1葉下珠預處理
葉下珠全草蒸餾水洗滌去土，50°C低溫乾燥後，粉碎，密封備用。其粉末為黃綠色。1. 2. 2葉下珠多糖的提取方法
石油醚80 1回流脫脂一95%乙醇80 1回流脫小分子糖一90 °C水回流提取3次，合併3次濾液4000r/min離心，濃縮至1/4體積一加入4倍體積的95%乙醇，靜置24h，離心，蒸懼水復溶一sevag法除蛋白(氯仿正丁醇=4:1,多糖溶液混合液=3:1),磁力攪拌30min,充分靜置分層，重複7 8次操作即可除去游離蛋白質一除蛋白後的多糖溶液加入4倍體積的95%乙醇沉澱24h —依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重複三次一透析72h —冷凍乾燥得葉下珠總多糖(PULP )。1. 2. 3葉下珠總多糖含量的測定1.2. 3.1葡萄糖標準液和樣品供試液的製備
精密稱取葡萄糖標準品(在105°C下乾燥到重量不再發生變化)10mg，用蒸餾水溶解後，置於IOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，製成O. lmg/mL的葡萄糖標準液，備用。

精密稱取乾燥至恆重的葉下珠多糖10mg，用蒸餾水溶解後，置於IOOmL容量瓶中加蒸懼水定容至刻度，搖勻，製成O. lmg/mL的樣品供試液備用。1. 2. 3. 2吸收波長的確定
取葡萄糖標準液和樣品溶液各I mL,分別加入ImL 5%苯酹溶液(取5g重蒸苯酹於IOOmL棕色容量瓶中加蒸餾水定容)，搖勻後，懸空垂直加入5mL濃硫酸，置沸水浴中加熱15min，然後置冷水浴中冷卻，在400 600 nm範圍內全波長掃描，確定吸收波長。L 2. 3. 3葡萄糖標準曲線製作
精密吸取葡萄糖標準液O. 2,0. 4,0. 6,0. 8、ImL於IOmL具塞刻度試管中，依次添加水使終體積為ImL,空白對照為ImL水,然後加入ImL 5%苯酹溶液搖勻,迅速加入5mL濃硫酸(懸空垂直加入)，置沸水浴中加熱15min,然後置冷水浴中冷卻，於490nm處測定吸光度。以吸光度為Y軸，葡萄糖質量為X軸，繪製標準曲線，並計算回歸方程。1. 2. 3. 4糖含量的計算
精密吸取供試液lmL，按「1. 2. 3. 3」同法操作，於490nm處測定吸光度。按照公式計算糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%
C :由標準曲線查得的葡萄糖微克數 C0 :樣品溶液的濃度(O.1 mg/mL)
V :測定時用的樣品溶液體積(1. OmL)1.2. 3. 5多糖的提取率
多糖的提取率=多糖的質量/原材料的質量X 100 %2.結果與分析
2..1測定波長的確定
樣品溶液和葡萄糖標準液的最大吸收峰波長都在490 nm左右處，所以選取490 nm作為多糖含量的測定波長。2. 2葡萄糖標準曲線
以吸光度為Y軸，葡萄糖微克數為X軸，繪製標準曲線，如圖1，可以看出在20 100 g範圍內，葡萄糖量與吸光度有良好的線性關係。2. 3糖含量
測得樣品液的吸光度A為O. 388，根據回歸方程計算其相應葡萄糖的微克數為28. 27 g。根據公式得糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%=28. 27/(0. 1X1) X 100%=28. 27%
2.4多糖的提取率
多糖的提取率==1. 5/100X 100 %=1. 5%
3結論
本實驗通過石油醚脫脂，再以95%的乙醇脫去低聚糖等小分子物質，然後以水提醇沉法從葉下珠中分離出多糖，並採用sevag法脫蛋白，苯酚一硫酸法測定其含量，其最大吸收波長為490nm，多糖提取率為1. 5%，糖含量為28. 27%。實施例2葉下珠多糖的分離純化 I材料與方法1.1材料(略)
1.2.實驗方法1. 2.1 DEAE-52 柱分離1.2.1.1 DEAE-52填料預處理
DEAE-52纖維素填料用蒸餾水浸泡48h，期間4 5h換一次水，並用傾瀉法除去懸浮雜質，然後進行鹼-酸-鹼處理。先用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min後蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min後蒸餾水洗至中性，最後用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min後蒸餾水洗至中性，得到0H_型纖維素。溼法裝柱(柱尺寸為500 X 50mm)，蒸餾水平衡48h，裝柱過程中避免氣泡及斷層現象。1. 2.1. 2過DEAE-52層析柱分離純化
稱取640mg葉下珠總多糖溶於80mL重蒸水中(8 mg/mL),過O. 45 μ m濾膜後上樣。依次用 0、0· 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl 梯度洗脫，每 IOmin 收集一管，流速 4mL/min ;苯酚-硫酸法跟蹤檢測，收集各主峰組分，濃縮，重蒸水透析48h，冷凍乾燥得葉下珠多糖各組分。1. 2. 2.純度鑑定1.2. 2.1 SephadexG-200葡聚糖凝膠過濾法
SephadexG-200的預處理S印hadexG-200填料加適量蒸餾水浸泡24h，期間4 5h換一次水，並用傾瀉法除去懸浮雜質，然後超聲脫氣直到凝膠液中沒有氣泡出現為止。溼法裝柱(柱尺寸為500 X 25mm)，用0.05 mol/L的NaCl溶液平衡48 h後備用。SephadexG-200柱層析將上面收集的各組分配製成25mg/mL的樣品液,上樣2mL,用O. 05 mol/L的NaCl洗脫。自動部分收集器收集,每管5 mL,每30 min收集一管,苯酹-硫酸法跟蹤檢測。1. 2. 2 2 HPLC高效液相色譜法
將純化後的各組分多糖配製成lmg/mL的樣品液,過O. 45 μ m的濾膜後進樣。色譜條件色譜柱PolyS印-SEC4000 Part No:00H-3144-K0 ColumnSize:300X7. 8mm ;
檢測器示差檢測器；柱溫30°C;流動相雙蒸水；流速0. 8 mL/min ;進樣量20 μ L。2結果與分析·
2.1 DEAE-52柱層析分離結果
經過脫蛋白，透析處理後的葉下珠精多糖(PULP)，過DEAE - 52離子交換柱，依次用O、O. U0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl溶液梯度洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，得如圖2所示中洗脫曲線。由圖2可以看出，TOLP經DEAE-52柱層析分離後，能夠明顯分離出四個峰形對稱的洗脫峰，分別代表四個組分，記為I3ULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV。收集含量較大的組分PULP II做進一步分析。2. 2 SephadexG-200 柱和 HPLC 純度鑑定 2. 2.1 SephadexG-200 柱結果
取葉下珠多糖組分I3ULP II過S印hadexG-200凝膠柱，NaCl洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，用吸光度值與洗脫管數作洗脫曲線，PULP II在Sephadex G-200柱上的洗脫曲線是對稱的單一峰，說明TOLP II組分是分子量相對均一的多糖組分。2. 2. 2 HPLC法純度鑑定
利用HPLC法檢測葉下珠多糖組分TOLP II的純度時，結果顯示，經DEAE-52纖維素柱分離純化後的多糖組分PULP II，在高效液相圖譜上峰型比較對稱，且經過面積歸一法計算其純度達到95%以上，與S印hadex G-200凝膠色譜圖結果相吻合，說明純度比較高，可以用來做結構鑑定。3 結論
水提醇沉脫蛋白後的葉下珠多糖經過DEAE-52纖維素柱分離純化後得到四個組分，分別記為 I3ULP I ,PULP I1、TOLPIII和 I3ULPIV。收集含量較大的組分I3ULP II，用 S印hadexG-200凝膠柱層析法和高效液相色譜法(HPLC)兩種方法進行純度鑑定，證明其組分相對均一，可以進一步做結構分析。實施例3 PULP II的理化性質及結構分析1、理化性質
PULP II為土黃色粉末，易吸溼。易溶於水，不溶於乙醇、丙酮等有機溶劑。Molish反應、苯酚-硫酸反應、硫酸-咔唑反應陽性，茚三酮反應、碘-碘化鉀反應、斐林反應、三氯化鐵反應和硫酸基反應為陰性。由理化性質，糖醛酸含量測定，元素分析、紅外和紫外，HPLC綜合分析表明PULP II中是一類不含有N、S元素酸性多糖，相對平均分子量為579962. 6。2、PULP II的紅外吸收圖譜
紅外圖譜表明，PULP II 在 3100 3500 cm_1,2800 2900 cnT1，1400 1530 cnT1，1000 1100 cnT1處有明顯的多糖的特徵吸收峰。且PULP II在1010 1100 cnT1有兩個強吸收峰，說明有呋喃型糖苷鍵存在。
由單糖組成和部分酸水解結果分析，PULP II單糖組成及其比例為Rha:Ara: ManiGlc 為 0. 11:0. 36:0. 08:0. 45 ;主鏈主要由 Rha, Ara 和 Glc 組成。綜合高碘酸氧化和Smith降解結果分析，PULP II糖苷鍵以I — 6連接為主，同時還存在I — 4和I — 3連接方式。實施例4葉下珠多糖I3UIP II的體外抗氧化活性初歩研究 I材料與方法1.1材料與試劑(略)
1.2實驗方法1. 2.1多糖還原カ的測定
實驗參考Oyaizu方法，略做稍微改動。取I mL不同濃度(l、2、3、4、5mg/mL)的多糖溶液於具塞試管中，然後分別加入2. 5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸緩衝溶液及1%鐵氰化鉀溶液，50で水浴反應20 min後冰浴迅速冷卻，加入2. 5 mL 10%的三氯こ酸溶液，搖勻，離心(3000 r/min, 10 min)。取上清液 2. 5 mL，_2.5 mL 雙蒸水和 0. 5 mL 0.1% FeCl3,搖勻，反應10 min後，測定700 nm處的吸光度。1.2..2多糖體外羥基自由基( 0H)清除率的測定
在Fenton反應體系中，H2O2與Fe2 +混合產生 0H。由於 OH反應活性強，存活時間很短，加入水楊酸，就能有效地捕捉到.0H，並生成在510 nm處有強吸收的有色物質。同時，若在此體系中加入與水楊酸有競爭作用的能夠清除.OH的物質，則有色物質的生成量變少，吸光度變低，吸光度越低，證明該物質清除.OH的能力越強。在具塞試管中 分別加入2 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L的水楊酸こ醇溶液，不同濃度(l、2、3、4、5mg/mL)的多糖溶液，最後加入2 mL 8. 8mmol/L的H2O2溶液啟動反應，室溫下反應30 min，測定510 nm處的吸光度，以蒸餾水代替多糖溶液做空白對照。自由基清除率計算公式P= (A0-Ai) /A0X 100%
A0 :空白吸光度，A1:樣品吸光度
1.2. 3抗脂質過氧化能力
吸取 0.4 mL 卵黃懸液[V (卵黃):V (PBS) =1:25], I mL 不同濃度(l、2、3、4、5mg/mL)的多糖溶液，0.4 mL 25 mmol/L的FeSO4，於具塞試管中，加入0.1 mol/LpH7. 45的PBS溶液至總體積為4. 0 mL，37°C水浴恆溫振蕩15 min。取出後加入1. 0 mL 20%的TCA，靜置10min後，離心(3500 r/min, 10 min)。吸取4. 0 mL上清液,加入2.0 mL 0.8%的硫代巴比妥酸，加塞，沸水浴15 min，冷卻後，以PBS做參比，測定532 nm處的吸光值。樣品對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率表示樣品的抗氧化活性的能力，即
抑制率 I= (A0-A)/A0X 100%
Atl-對照管的吸光度；A-樣品的吸光度 2結果與分析
2.1 PULP II的還原カ
實驗結果表明各濃度下的PULP II多糖溶液都具有一定的還原能力，並且在I 5mg/mL的濃度範圍內，其還原カ隨濃度的增高而增強。2. 2 PULP II體外羥基自由基清除率實驗結果表明各濃度下的PULP II多糖溶液對體外羥基自由基都有一定的清除能力，並且在I 5mg/mL的濃度範圍內，其清除率隨濃度的增高而增強。5mg/mL吋，PULP II的清除率為35. 5%。2.3 PULP II抗脂質過氧化能力
實驗結果表明各濃度下的PULP II多糖溶液對LPO均具有一定的抑制作用，並且在I 5mg/mL的濃度範圍內存在量效關係，其抑制率隨濃度的增高而增強。5mg/mL吋，PULP II的抑制率為10. 7%。3 結論
葉下珠多糖PULP II具有一定的還原力、清除體外羥基自由基能力和抗脂質過氧化能力，並且隨著多 糖濃度的增大而增強。在5mg/mL時，PULP II的還原カ為0. 538，對體外羥基自由的清除率達到35. 5%，對LPO的抑制率分別為10. 7%。這說明葉下珠多糖具有一定的抗氧化活性並且其抗氧化活性主要表現在清除體外羥基自由基上。
實施例5葉下珠多糖I3UIP II體外抗こ肝病毒研究本試驗採用目前應用最廣泛的體外抗こ肝病毒藥物篩選模型H印G2. 2. 2. 15細胞模型，從、葉下珠提取分離得到PUIP II與H印G2. 2. 2. 15細胞作用，取其細胞上清液，分別測定其こ肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的滴度變化，來判斷該藥物是否有效，並採用MTT法測定各部分的細胞毒性。綜合這ニ個指標，對葉下珠多糖PUIP II進行體外抗こ肝藥效學試驗，並選用臨床上已證實的具有抗こ肝病毒作用的阿昔洛韋(ACV)作為陽性對照藥物，以評價各部位抗こ肝病毒的效果，以此篩選有效部位或有效成分。I材料與方法1.1材料與試劑(略)1.2實驗方法1.2.1細胞的復甦
基本步驟調配37°C -40°C的溫水；從液氮罐中取出H印G2. 2. 2. 15細胞凍存管，立即投入37°C -40°C的溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解，融解過程在l_2min內完成；將細胞凍存懸液移入離心管，加入約5mL培養液，輕輕吹勻；將細胞懸液800r-1000r/min離心5min,棄上清液；給細胞沉澱加入完全培養液，輕輕吹吸打勻，將細胞懸液移入培養瓶，加足培養液進行培養，置於37°C，5%C02細胞培養箱培養。1. 2. 2細胞的傳代培養
H印G2. 2. 2. 15細胞置於5%C02，37°C培養。培養基為DMEM，添加10%的胎牛血清，3%L-穀氨醯胺1%，G418 200ug/mL，青黴素100u/mL，鏈黴素100u/mL。2. 2. 15細胞長滿培養瓶後，先用EDTA消化10-30秒，再用0. 25%胰酶37°C消化3_10min，加培養液吹打，I 3或1:4傳代，8天長滿，採用細胞記數板記數，配製成IO5個/mL接種細胞培養板，96孔板每孔
0.1mL ；24孔板每孔lmL，5%C02，37°C培養24小時進行實驗。1. 2. 3細胞計數方法
一般用血細胞計數板，按白細胞計數法進行計數。取待稀釋的細胞懸液ImL加生理鹽水做5倍稀釋，用IOX 10的倍數進行計數，中央為紅細胞計數用，四角大格為白細胞計數用，計數時僅統計完整的細胞，若聚成ー團的細胞按ー個細胞進行計數，在一個方格中，如果有細胞位於線上，一般計上線不計下線，計左線不計右線，計數誤差不超過±5%，計數後需計算每mL懸液中的細胞數，由於計數板中的姆一方格的面積為0.1cm2,高為0. Olcm,體積為0. 0001cm3。姆mL細胞數按式I計算
每 mL 細胞數=(n/4) X10000X5(I)
式中n為四大格細胞總數1.2. 4 MTT比色法測細胞存活率
H印G2. 2. 2. 15細胞培養於96孔培養板，每孔80 U I培養液；加入20 u IMTT,繼續培養
3-4h ;吸去100 ill培養液，加入等量0.04-0. lmol/L鹽酸異丙醇溶液，室溫下約IOmin (或將平板置於微型震蕩器震蕩)，使結晶物溶解；在酶標儀上測定光吸收，測定波長為570nm。1.2.5 MTT法測藥物毒性
將H印G2. 2. 2. 15細胞按IO5個/mL接種於96孔培養板中，0.1 mL/孔，次日用培養液將待測藥物分別配成幾種不同的濃度，加入細胞孔，每孔濃度加3孔，0.1mL/孔，並設無藥細胞對照及陽性對照藥。加藥後培養4天，棄上清用MTT染色，每孔加lmg/mL的MTT無血清培養液0. lmL，孵育4小時，棄上清，加入0. 04mol/L鹽酸異丙醇0.1mL溶解後，用570nm波長比色測定OD值，實驗重複3次。1. 2. 6 測 HBsAg、HBeAg 分泌規律
將H印G2. 2. 2. 15細胞105/mL接種於24孔細胞培養板，每孔1. OmL,共10孔，第3、5、8、11、13天收集上清250 yl，培養液補足原量至第13天，培養上清於-20°C凍存，最後集中按試劑盒說明書，用ELISA法測定HBsAg、HBeAgo1. 2. 7藥物對HBV抑制試驗 將H印G2. 2. 2. 15細胞按105/mL接種於24孔板，每孔1. OmL,次日棄培養液，以待測藥物的H印G2. 2. 2. 15細胞的半數毒性濃度為起始濃度用培養液進行倍比稀釋，另設無藥對照及陽性對照藥，培養於37°C、5%C02培養箱中。每4天收取上清，並換加原濃度藥液繼續培養，將收集的上清_20°C凍存，於第12天收集完，集中用ELISA法測定HBsAg、HBeAg，實驗重複3次。1. 2. 8 ELISA 法測 HBsAg、HBeAg
(I)將試劑盒各組分從盒中取出，平衡至室溫(18-25°C )。(2)濃縮洗滌液配製前充分搖勻如有晶體應充分融解，濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水按1: 19稀釋後使用。(3)將微孔板條固定於支架，按序編號。(4)每孔加入待測標本50 iU，設陰、陽對照各2孔，每孔加入陰、陽對照各50 iU，
並設空白對照一孔；
(5)每孔加入酶標記抗體50Ul (除空白對照外)、充分混勻後封板，置於37°C環境中孵育 30min ；
(6)手工洗板；棄去孔內液體，洗滌液貯滿各孔，靜置5秒後甩幹，重複5次後拍幹；
(7)每孔加顯色劑A液、B液各50iU，充分混勻，封板，置37°C環境中孵育15min；
(8)每孔加入終止液50u 1，混勻；
(9)用酶標儀讀數，取波長450nm，先用空白空校零。然後讀取各孔OD值。(陰性對照OD值低於0. 05作為0. 05計算，高於0. 05按實際OD值計算。)1.3數據分析1.3.1 MTT法測藥物毒性後可得
權利要求
1.一種葉下珠多糖組份PUIP II的提取分離方法，包括如下步驟 1)葉下珠全草用蒸餾水洗淨，乾燥後粉碎，用石油醚脫脂，乙醇脫小分子糖後，藥渣用水浸提，浸提液離心分離，取清液濃縮後加入乙醇醇沉，醇沉物即為粗總多糖；粗總多糖經2)除蛋白，3)醇沉、洗滌和4)透析、乾燥即得葉下珠精總多糖；5)多糖各組分分離純化葉下珠精總多糖過離子交換柱，用NaCl溶液梯度洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，繪製洗脫曲線，洗脫曲線上依次出現四個峰，分別代表四個多糖組分，按照出峰的順序分別記為PULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV，收集第2主峰組分，濃縮，重蒸水透析，冷凍乾燥得葉下珠多糖PULP II純組分，即葉下珠多糖組份I3UIP II。
2.根據權利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特徵在於步驟1)粉碎的葉下珠全草粉末，用石油醚在70 90°C下回流提取2 4次，每次I 3小時，棄去回流液，藥渣繼續用50 100%乙醇在80 95°C下回流提取2 4次，每次I 3小時，棄去回流液，得到的藥渣再用60 95 °C水浸提3次，每次I 3小時，合併3次浸提液進行離心分離，離心速度2000 6000r/min，取清液濃縮至原體積1/4，加入4倍體積的90 100%乙醇，靜置24h，離心，取醇沉物即為粗多糖。
3.根據權利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特徵在於步驟2)所述除蛋白採用Sevag法脫蛋白將步驟I)得到的醇沉物用蒸餾水復溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液，粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液體積為I 6 :1 3，所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿正丁醇體積比=1 4:1 4，攪拌，充分靜置分層，棄去沉澱，重複I 10次後直至界面無白色沉澱。
4.根據權利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特徵在於步驟3)所述醇沉、洗滌在除蛋白後的多糖溶液中加入3 6倍體積的75 100%乙醇，靜置12 36h，離心，沉澱依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重複2 5次。
5.根據權利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特徵在於步驟4)所述透析、乾燥取醇沉、洗滌後的多糖加入蒸餾水，充分復溶後用蒸餾水透析，透析在磁力攪拌下進行，樣品液與蒸餾水體積比為1:10 30，4 8h換一次水，透析12 120h，透析完畢後將糖溶液放入冷凍乾燥機中乾燥得葉下珠精總多糖。
6.根據權利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特徵在於步驟5)的離子交換柱採用DEAE-52陰離子交換樹脂。
7.根據權利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特徵在於步驟5)所述NaCl溶液的濃度梯度範圍為0 3mol/L。
8.根據權利要求7所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特徵在於所述NaCl溶液的濃度梯度分別為0,0. 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L。
9.根據權利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特徵在於步驟5)依次用不同濃度NaCl梯度洗脫，每種濃度NaCl溶液洗脫8小時，流速4mL/min，用管收集洗脫液，每10min收集一管，繪製洗脫曲線。
10.根據權利要求9所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特徵在於所述洗脫曲線以收集的管序為橫坐標，溶液的光吸收度為縱坐標繪製而成。
全文摘要
本發明涉及一種葉下珠多糖組份PUIPⅡ的提取分離方法。包括如下步驟1)葉下珠全草用蒸餾水洗淨，乾燥後粉碎，用石油醚脫脂，乙醇脫小分子糖後，藥渣用水浸提，浸提液離心分離，取清液濃縮後加入乙醇醇沉，醇沉物即為粗總多糖；粗總多糖經2)除蛋白，3)醇沉、洗滌和4)透析、乾燥即得葉下珠精總多糖；5)多糖各組份分離純化，收集第2主峰組份，得葉下珠多糖PULPⅡ純組份。本發明通過對葉下珠粗多糖的分離純化，得到了純淨單一的葉下珠多糖成分。通過對多糖的純組份PULPⅡ的結構分析及體外抗氧化、抗病毒活性實驗的研究，確證了葉下珠多糖是葉下珠治療B肝的有效成分，這為研究葉下珠多糖的抗B肝病毒作用機制提供了理論基礎。
文檔編號A61P31/20GK103059157SQ20131000570
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月8日 優先權日2013年1月8日
發明者李清祿, 李宇翔, 李凌峰, 張麗麗, 謝勇平, 曹高娟, 黃志堅 申請人:福建農林大學