一種磁性螢光複合納米粒子及其製備方法與應用的製作方法
2023-05-22 00:48:26 1
專利名稱：一種磁性螢光複合納米粒子及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於納米材料、生物醫學技術領域，特別涉及一種磁性螢光複合
納米粒子Fe304/CdTe/Si02及其製備方法與應用。
背景技術：
在分子影像學中，以超順磁性氧化鐵為核心的納米顆粒已經成為磁共振分 子影像學研究的主要技術手段之一。磁共振成像(MRI)具有無損害、空間分 辨率高、可多維立體觀察的優點。近年來發展迅速的幹細胞研究中也廣泛通過 各種轉染試劑(如聚賴氨酸(PLL)、硫酸魚精蛋白、陽離子脂質體等)或配 體-受體、抗原-抗體反應介導氧化鐵納米粒子標記幹細胞，達到體外或活體成 像的目的。多項研究證明，氧化鐵納米顆粒能夠成功標記幹細胞，在實驗動物 的肝臟、腦、心肌、腎臟等不同部位可較長時間(最長可長達8周)活體監測 幹細胞的存活、定居、遷移甚至分化，而且1.5T磁共振掃描儀可達到對氧化 鐵納米粒於標記的BMSCs進行活體示蹤的目的。但是， 一般認為磁共振成像 敏感性相對較低，尤其是臨床應用的磁共振掃描儀，只能達到組織和細胞群層 面，在活體內還不能達到對低數量級細胞群、單個細胞或者分子成像的目的， 這一不足使磁共振成像在活休內細胞和分子影像學研究的應用有所受限。為了 解決這一不足，方法之一就是開發多功能的納米粒子，同時應用於磁共振成像 和其他成像技術，將空間解析度高的磁共振成像與其他敏感性高的成像技術的 優點結合。
活體可見光成像，包括生物發光和螢光成像技術，是一種新興的活體內光 學成像技術，其優點之一就是敏感度高，在活體內的研究也證實活體可見光成 像可以檢測最低至102個數量級的被標記細胞，可以與磁共振成像相結合，彌 補其敏感性相對較低的不足。近年來常用的螢光納米材料——量子點(QDs)， 是一種由II VI族或m V族元素組成的納米晶粒，直徑2 10nm，激發後能 自發螢光，可用於小動物活體可見光成像，追蹤標記的目的細胞，與傳統的有 機螢光染料相比，具有螢光強度高、光化學穩定性高、抗光漂白作用強、可反
5復多次激發觀察的優點，其螢光強度至少是有機螢光染料的20倍，穩定性則
強100倍以上。與生物發光相比，QDs也具有不需要底物、不存在基因脫落 的可能、發光強度高，可用於反覆多次長期觀察等優勢。QDs成像的的敏感 度極高且穩定，可以單分子成像，Dahan.M等就通過QDs觀察到了活神經細
胞細胞膜上單個甘氨酸受體的橫向動力學。
磁性粒子具有磁靶向、磁分離、磁共振顯影等多種功能，量子點具有優
秀的螢光性能，因而磁性粒螢光納米複合材料在生物標記、生物分離、疾病的 檢測與治療等諸多領域具有非常廣闊的應用前景。公開號為CN1831079、名 稱為"螢光磁性多功能納米材料的製備方法"的專利申請公開了一種磁性納米 粒子與螢光量子點直接通過靜電作用複合的方法。公開號為CN1559656、名 稱為"磁性微粒與量子點的核-売式納米複合粒子的製備方法"專利申請公開了 一種磁性粒子通過分子偶聯與量子點形成核殼粒子的方法。這兩種方法由於量 子點表面沒有包覆層，其毒性使得這些粒子難以在活體內應用。公告號為 CN1539913、名稱為"螢光磁性多功能納米材料及其製備方法"的國家發明專利 公開了一種將螢光量子點與磁性納米粒子共同包覆入高分子微球的方法，但由 於這些高分子表面繼續改性困難，限制了微球與生物分子的連接而使其應用受 限。公開號為CN1698582、名稱為"表面包矽的近紅外螢光磁性納米粒子及其 製備方法和應用"的專利申請公開了一種表面包矽的近紅外螢光磁性納米複合 粒子的製備方法，用丁腫瘤靶向熱療。但此方法中水相合成的磁性粒子易團聚， 與量子點同時包埋於二氧化矽時，複合粒子的粒徑不易控制，而且其包被的近 紅外螢光量子點也主要局限於熱療應用。
發明內容
為了克服上述現有技術的缺點與不足之處，本發明的首要目的在於提供一 種能獲得粒徑較小、分散性好、飽和磁化強度高、易於與生物分子結合的磁性 螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02。
所述的磁性螢光複合納米粒子Fe3(VCdTe/Si02，由磁性粒子Fe304， CdTe 螢光量子點和Si02包覆層組成，以所述磁性粒子Fe304為球核心，中間層為 所述CdTe螢光量子點，所述CdTe螢光量子點分布在所述磁性粒子Fe304表 面，最外層為所述Si02包覆層，Si02包覆層包覆由所述磁性粒子Fe304和所 述CdTe螢光量子點形成的球體。本發明的另 一 目的還在於提供上述磁性螢光複合納米粒子
Fe304/CdTe/Si02的製備方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現 一種磁性螢光複合納米粒子 Fe304/CdTe/Si02的製備方法，包括如下工藝歩驟和工藝條件
(1) 油相高溫法製備疏水性Fe304納米粒子在惰性氣體保護下，混勻 0.5mmol乙醯丙酮鐵、2.5mmol 1,2-十六烷二醇、1.5mmol油酸、1.5mmol油胺 和5ml節醚組成的混合物，20(TC下保溫2小時後繼續加熱至300°C，回流1 小時，冷卻至室溫，產物用無水乙醇沉澱，10000 12000rpm7min離心分離5 8分鐘，將沉澱物溶於含有0.013 ml油酸和0.013 ml油胺的10 15 ml正己烷 中，6000 8000rpm/min離心分離8 10分鐘，沉澱物分散在2 3 ml正己烷 中，製得一級疏水性Fe304納米粒子；根據所需疏水性Fe304納米粒子的尺寸， 以一級疏水性Fe304納米粒子為晶種進行生長，製備得各種粒徑的疏水性Fe304 納米粒子，具體歩驟如下A、在含20mg —級疏水性Fe304納米粒子的1 2 ml正己烷中，加入0.5mmo1乙醯丙酮鐵、2.5mmo1 1,2-十六烷二醇、0.5mmo1 油酸、0.5mmo1油胺和5ml卡醚組成的混合物，在惰性氣體保護下攪拌均勻， 加熱至10(TC保持0.5小時，然後在200。C下保溫1小時，再加熱至300。C回 流0.5小時，冷卻至室溫；B、產物用無水乙醇沉澱，10000 12000rpm/min 離心分離5 8分鐘，將沉澱物溶於含有0.013 ml油酸和0.013 ml油胺的10 15ml正己烷中，6000 8000rpm/min離心分離5 8分鐘，沉澱物分散在l 2ml正己烷中，製得二級疏水性Fe304納米粒子；C、再以二級疏水性Fe304 納米粒子為晶種，循環重複B歩驟，直至獲得所需尺寸的疏水性Fe304納米粒 子。
(2) 親水性Fe304納米粒子的製備用無水乙醇沉澱步驟(1)製得的所 需尺寸的疏水性Fe304納米粒子，得到疏水性Fe304納米粒子沉澱物，然後將 20 30mg沉澱物分散於3 5ml於氯仿中，加入15 25pl三乙胺，製得溶液 A。另取15 25 mg 2，3-二巰基丁二酸(DMSA)溶於3 5 ml 二甲亞碸(DMSO) 中，製得溶液B。將溶液A和溶液B混合均勻，60 70。C下振蕩24 36小時， 10000 12000rpm/min下離心分離，得到沉澱，無水乙醇洗滌，重複離心、洗 滌3 4次。接著，將沉澱重新分散於30 50ml無水乙醇溶液中，加入15 25^1三乙胺，製得溶液C。另取15 25 mg 2,3 — 二巰基丁二酸溶於3 5 ml 二甲亞碸中，製得溶液D。將溶液C和溶液D混合均勻，60 7(TC下振蕩12
724小時，產物在10000 12000 rpm/min下離心分離，用無水乙醇洗滌，重複 離心、洗滌3 4次。接著，將沉澱分散於5 6 ml超純水中，製得親水性Fe304 納米粒子。
(3) CdTe螢光量子點的製備:100mlCdCl2溶液(1.25><10—3mol/L)中加 入26.14 pi巰基丙酸，用0. lmol/L NaOH溶液調pH至9.1 ，劇烈攪拌下通N2脫 氧20 30分鐘，加入10 pl NaHTe溶液，使反應物摩爾比為Cd2+:HTe':巰基 丙酸=1:0.5:2.4。 IO(TC加熱回流10分鐘 5小時，得到不同螢光顏色的CdTe 螢光量子點的水分散液；所述NaHTe溶液通過以下方法製備127.5mgTe粉 和80mgNaBH4，所述NaBH4: Te粉摩爾比為2:1，加入lml H20，於室溫下 反應2 3 min，即可獲得NaHTe溶液。
(4) Fe304/CdTe納米粒子的製備在含0.4 mg親水性Fe304納米粒子的 100pl水分散液中，加入2 3mlCdCl2溶液(0.1 mol/L， pH6.0)，超聲20 30 分鐘後，加入l 2ml步驟(3)製得的CdTe螢光量子點的水分散液，室溫振 蕩6 8小時。磁分離，依次用超純水和無水乙醇洗滌2 3次。
(5) 磁性螢光複合粒子Fe304/CdTe/Si02的製備在歩驟(4)所述的Fe304/ CdTe納米粒子中加入3 4 ml無水乙醇和500 600 ]il 3-巰丙基三甲氧基矽 垸，振蕩5 6小時，10000 12000rpm/min分離，用無水乙醇洗滌、離心， 重複3 4次。沉澱物與無水醇和超純水混合，加入正矽酸乙酯或矽烷偶聯劑， 振蕩6 7小時，無水乙醇洗滌3 4次，得到磁性螢光複合粒子 Fe304/CdTe/Si02。
所述步驟(1)中的惰性氣體優選為氮氣。
所述步驟(1)中的疏水性Fe3O4納米粒子直徑為6nm 10nm之間。 所述步驟(2)中的親水性Fe304納米粒子直徑為6nm 10nm之間。 所述步驟(3)中的CdTe螢光量子點發射光譜在521 647 nm之間，呈
現綠、黃、橙或紅顏色的螢光。
所述步驟(5)中的無水醇為無水甲醇或無水乙醇；所述矽烷偶聯劑為3-
氨丙基三乙氧基矽垸或3-巰丙基三甲氧基矽垸。
所述步驟(5)中的磁性螢光複合納米粒子Fe3(VCdTe/Si02直徑為30
50nm，其分散性好、呈現超順磁性。
根據上述製備方法製備的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02應用於
骨髓間充質幹細胞的標記和成像。
8本發明的原理為首先採用油相高溫法製備單分散、具有磁性的疏水性氧化 鐵納米粒子，並對疏水性氧化鐵納米粒子表面進行改性使其成為親水性氧化鐵 納米粒子，分散於水相，再製備表面帶羧基的螢光量子點，通過共凝聚使螢光 量子點沉澱在磁性粒子表面，然後利用配體交換在螢光量子點表面修飾矽烷偶 聯劑，最後通過矽烷或矽酸酯水解形成最外層的二氧化矽包覆層。
本發明與現有技術相比，具有如下優點
1、 本發明採用油相高溫法製備Fe304磁核，單分散性好，粒子間無團聚，
可嚴格控制單個磁性粒子與螢光量子點結合，從而控制最終複合粒子具有較小 的粒徑，避免複合粒子由於粒徑過大在活體內應用時被巨噬細胞清除。
2、 本發明通過用共凝聚方法將表面帶羧基的螢光量子點沉澱在氧化鐵納 米粒子表面，操作簡單易行，反應快速，而且CdTe螢光量子點分布在氧化鐵 納米粒子表面，可有效減少CdTe螢光量子點的用量，增加磁性螢光複合納米 粒子的安全性。
3、 本發明中的Si02包覆層，既可通過正矽酸乙酯水解得到表面帶羥基的 矽層，又可通過氨基矽烷或巰基矽烷直接水解得到表面帶氨基或巰基的矽層， 便於進一步連接生物分子，製成具有特異性的分子探針。
4、 本發明製備得到的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02，分散性好， 具有超順磁性，螢光明顯。磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02能夠成功 的對大鼠BMSCs —步進行雙重標記，即標記後的大鼠骨髓間充質幹細胞具有 磁性和螢光，標記後螢光強度強而持久，細胞磁共振信號明顯減低。
圖1是實施例1所製得的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的透射 電鏡圖。
圖2是實施例1所製得的CdTe螢光量子點、Fe304/CdTe納米粒子和磁性 螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的螢光光譜圖。
圖3是實施例1所製得的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02磁化曲線圖。
圖4是實施例1所製得的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02雙標記 大鼠骨髓間充質幹細胞與對照組細胞的磁共振掃描圖。
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具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一歩詳細的描述，但本發明的實施方 式不限於此。 實施例1
(1)疏水性Fe304納米粒子的製備在氮氣保護下，快速混勻0.5mmo1 乙醯丙酮鐵、2.5mmo1 1,2-十六烷二醇、1.5 mmol油酸、1.5 mmol油胺和5 ml 苄醚組成的混合物，200 。C下保溫2小時後繼續加熱至30(TC，回流1小時， 冷卻至室溫，產物用無水乙醇沉澱，10000rpm/min離心分離5分鐘，將沉澱 物溶於含有0.013 ml油酸和0.013 ml油胺的10ml正己垸中，6 OOOrpm/min離 心分離10分鐘，將沉澱物分散在2ml正己烷中，製得6nm的一級疏水性Fe304 納米粒子；接著，按以下歩驟製備得到lOnm的疏水性Fe304納米粒於A、 含20 mg 6nm —級疏水性Fe304納米粒子的2 ml正己垸中，加入0.5 mmol乙 醯丙酮鐵、2.5 mmoll,2-十六垸二醇、0.5mmol油酸、0.5mmol油胺和5ml苄 醚組成的混合物，在氮氣保護下攪拌均勻，加熱至10(TC保溫0.5小時，然後 在200。C保溫1小時，再加熱至300。C回流0.5h，冷卻至室溫；B、產物用無 水乙醇沉澱，10000rpm/min離心分離5分鐘，將沉澱物溶於含有0.013 ml油 酸和0.013 ml油胺的10 ml正己烷中，6 OOOrpm/min離心分離10分鐘，將沉 澱物分散在2ml正己垸巾，製得8nm的二級疏水性Fe304粒子；C、以20 mg 8nm的二級疏水性Fe304粒子為晶種，按由6nm的一級疏水性Fe304納米粒子 製備8nm的二級疏水性Fe304粒子的反應條件，製備10nm的疏水性Fe304納 米粒子。
(2)親水性Fe304納米粒子的製備:用無水乙醇沉澱10nm的疏水性？6304 納米粒子。將30mg疏水性Fe304納米粒子沉澱物分散於3 ml氯仿，加入15^1 三乙胺，得到溶液A，另取15mg DMSA溶於3ml DMSO中，得到溶液B， 將溶液A和溶液B混合均勻，60"C下振蕩24小時，接著，12 OOOrpm/min下 離心分離10分鐘，無水乙醇洗滌，重複離心、洗滌步驟4次。接著，將沉澱 物重新分散於30ml無水乙醇中，加入15nl三乙胺，得到溶液C，另取15mg DMSA溶於3mlDMSO，得到溶液D，將溶液C和溶液D混合均勻，6(TC下 振蕩12小時，接著在12000rpm/min下離心分離10分鐘，用無水乙醇洗滌後 分散於5 ml超純水中，得到4 mg/ml的親水性Fe304納米粒子的水分散液。
(3) CdTe螢光量子點的製備100mlCdCl2溶液(1.25x1 (T3mol/L)中
10加入26.14 pi巰基丙酸，用0.1 mol/L NaOH調pH至9.1，在劇烈攪拌條件下 通氮氣20分鐘進行脫氧，加入10(HilNaHTe上清液，100。C加熱回流4小時， 得到發射峰為630 nm的CdTe螢光量子點水分散液；上述NaHTe上清液的制 備為127.5mgTe粉和80mgNaBH4加入lmlH20，於室溫下反應，生成NaHTe 上清液。
(4) Fe304/CdTe納米粒子的製備取lOO(il 10 nm親水性Fe304納米粒 子的水分散液，依次加入500iil超純水和2mlCdCl2溶液(0.1mol/L， pH6.0)， 超聲30min後，加入lml步驟(3)的CdTe螢光量子點水分散液，室溫振蕩 6小時。磁分離，超純水洗滌2次，無水乙醇洗滌三次，得到Fe304/CdTe納米 粒子沉澱物。
(5)磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的製備在Fe304/ CdTe 納米粒子沉澱物中加入3ml無水乙醇和5(^1 3-巰丙基三甲氧基矽烷，振蕩5 小時，12 000rpm/min離心分離，得到Fe3(VCdTe納米粒子沉澱物，乙醇洗滌， 重複離心、洗滌步驟3次。在Fe304/ CdTe納米粒子沉澱物中加入2.1 ml無水 乙醇，O.lml超純水，10pl正矽酸乙酯，振蕩7小時，無水乙醇洗滌，得到 表面帶羥基的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02粒子。
圖1為本實施例製得的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的透射電 鏡圖，可看出粒子的直徑約為50nm，分散性好，無團聚。圖2為本實施例制 得的CdTe螢光量子點與Fe304/CdTe納米粒子以及磁性螢光複合納米粒子 Fe304/CdTe/Si02的螢光光譜。可以看出，各粒子都有明顯的螢光發射峰，與 CdTe相比，Fe304/CdTe納米粒子和磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02 的螢光峰發生了紅移，從630nm紅移到705 nm左右，這是由於複合後CdTe 螢光量子點周圍的微環境發生變化以及量子點的聚集引起的。圖3為本實施例 製得的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的磁性曲線圖，從圖中可以看 出所製得的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02具有超順磁性。
實施例2
(1) 疏水性Fe304納米粒子的製備: 備6nm疏水性Fe304粒子。
(2) 親水性Fe304納米粒子的製備: 備6 nm親水性Fe304粒子。
按實施例1步驟(1)相同的方法制 按實施例1步驟(2)相同的方法制(3) CdTe螢光量子點的製備按實施例1步驟(3)相同方法製備，區 別在於回流時間為10分鐘，得到螢光發射峰為521 nm的CdTe螢光量子點水 分散液。
(4) Fe304/CdTe納米粒子的製備取6 nm親水性Fe304納米粒子和炎光 發射波長為521 nm的量子點，按實施例1步驟(4)相同的方法製備Fe304/CdTe 納米粒子。
(5)磁性螢光複合納米粒子Fe3(VCdTe/Si02的製備按實施例1步驟 (5)相同方法製備，得到直徑為45nm、表面帶羥基的磁性螢光複合納米粒 子Fe3CVCdTe/Si02。
實施例3
(1) 疏水性Fe304納米粒子的製備按實施例1步驟(1)相同的方法制 備8 nm疏水性Fe304粒子。
(2) 親水性Fe304納米粒子的製備按實施例1步驟(2)相同的方法制 備8nm親水性Fe304粒子。
(3) CdTe螢光量子點的製備按實施例1歩驟(3)相同方法製備，區 別在於回流時間為1小時，得到螢光發射峰為560 nm的CdTe螢光量子點水 分散液。
(4) Fe304/CdTe納米粒子的製備取8 nm親水性Fe304納米粒子和螢光 發射波長為560 nm的CdTe螢光量子點，按實施例1步驟(4)相同的方法制 備Fe304/CdTe納米粒子。
(5)磁性螢光複合納米粒子Fe3(VCdTe/Si02的製備Fe3(VCdTe納米 粒子中加入加入3ml乙醇，50^13-巰丙基三甲氧基矽烷，振蕩5小時，12 000rpm/min離心分離，乙醇洗滌，重複離心、洗滌步驟3次。沉澱物加入2.1ml 甲醇，O.lml水，再加入10^il3-巰丙基三甲氧基矽垸，7.5^1四甲基氫氧化胺， 振蕩2小時，然後加熱到6(TC保持5分鐘，冷卻到室溫，甲醇洗滌，得到直 徑為30nm、表面帶巰基的磁性螢光複合納米粒子Fe3(VCdTe/Si02。
實施例4
(1)疏水性Fe304納米粒子的製備按實施例1歩驟(1)相同的方法制 備10nm疏水性Fe304粒子。(2) 親水性Fe304納米粒子的製備按實施例1步驟(2)相同的方法制 備10nm親水性Fe304粒子。
(3) CdTe螢光量子點的製備按實施例1歩驟(3)相同方法製備，區 別在丁回流時間為3小時，得到螢光發射峰為608 nm的CdTe螢光量子點。
(4) Fe304/CdTe納米粒子的製備取8 nm親水性Fe304納米粒子和螢光 發射波長為608 nm的CdTe螢光量子點，按實施例1步驟(4)相同的方法制 備Fe304/CdTe納米粒子。
(5)磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的製備按實施例3歩驟 (5)相同方法製備，區別在於以1(V13-氨丙基三乙氧基矽垸取代了實施例3 步驟(5)的1(V13-巰丙基三甲氧基矽烷，得到直徑為34nm、表面帶巰基的 磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02。
實施例5
(1) 疏水性Fe304納米粒子的製備按實施例1歩驟(1)相同的方法制 備8 nm疏水性Fe304粒子。
(2) 親水性Fe304納米粒子的製備按實施例1步驟(2)相同的方法制 備8nm親水性Fe304粒子。
(3) CdTe螢光量子點的製備按實施例1歩驟(3)相同方法製備，區 別在於(Hj流時間為5小時，得到螢光發射峰為647 mn的CdTe螢光量子點。
(4) Fe304/CdTe納米粒子的製備取8 nm親水性Fe304納米粒子和螢光 發射波長為647 nm的CdTe螢光量子點，按實施例1步驟(4)相同的方法制 備Fe304/CdTe納米粒子。
(5) 磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的製備按實施例3步驟(5) 相同方法製備，得到直徑為40nm、表面帶巰基的磁性螢光複合納米粒子 Fe304/CdTe/Si02。
實施例6
(1)大鼠骨髓間充質幹細胞(BMSCs)的提取、培養無菌條件下取大 鼠股骨和脛骨，完全培養基衝洗出骨髓，採用密度為1.077 kg/L的Percoll液 密度梯度離心(2000 rpm/min， 20 min，取中間層)分離骨髓液，獲得單個核 細胞，加入含10。/。FBS的低糖DMEM培養液，調節細胞濃度至2x105個/ml，接種於25cm2培養瓶內，5%C02、 37"C培養箱中培養，3天首次換液，以後 每3天換液及傳代1次，培養過程中倒置相差顯微鏡動態觀察細胞。取第三代 貼壁細胞，採用流式細胞儀檢測細胞的表面標誌CD29、 CD44、CD45、CDllb， 鑑定BMSCs。
(2) BMSCs表達增強型綠色螢光蛋白(EGFP): 將已鑑定的BMSCs 傳代48h後，去除原培養液，以無血清DMEM培養基洗1次，加入EGFP慢 病毒上清，病毒滴度(MOI) =20，並加入8mg/Lpolybrene。感染96小時後， 細胞出現螢光，使用含10%FBS的DMEM培養基換液，正常培養，動態觀察 螢光強度，挑選螢光強度高且穩定的單克隆繼續培養以提高感染效率，得到熒 光強度高且穩定的單克隆EGFP-BMSCs。
(3) 磁性螢光複合納米粒子Fe3CVCdTe/Si02雙標記EGFP-BMSCs: 取 實施例1製備的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02、 DMEM培養基和聚 賴氨酸(PLL)混合，室溫下振蕩l小時，製成Fe304/CdTe/Si02-PLL複合物。 將傳代第7代的EGFP-BMSCs接種丁細胞培養板；將Fe304/CdTe/SiOrPLL加 入DMEM培養基中使鐵的終濃度為25pg/ml，標記EGFP-BMSCs，在37°C 、 5%C02培養箱內孵育24h。除去培養液後，PBS充分衝洗去除細胞外鐵，置 於倒置相差顯微鏡下觀察。設不加Fe3(VCdTe/Si02-PLL複合物，DMEM培養 基正常培養的EGFP-BMSCs作為對照組，同樣進行以下的實驗。
(4) 細胞磁共振成像(MRI):將1%瓊脂糖溶液煮沸，1.5ml/孔注入裝 有特殊印模的24孔培養板中凝固成型，製造出一系列同規格的圓錐形空洞。 收集以鐵濃度25嗎/ml雙標記的生長良好的EGFP-BMSCs (細胞數^5xi(^個 /ml)， PBS充分衝洗，0.25%胰酶消化並離心(1500 rpm/min， 3min)，重懸 後計數，取少量用分光光度計測量鐵含量，其餘按3xl06、 lx106、 5xl05、 lx105、 5xl04、 lx104、 5xl03、 lxl3數量取BMSCs的細胞懸液分別加至8個EP管， 離心(1500rpm， 3min)後將細胞重懸於3(^1 1%溫熱瓊脂糖溶液中，植入圓 錐形空洞，凝固後，注入0.5ml 1%溫瓊脂糖溶液封閉空洞，以消除磁敏感偽 影。MR掃描採用頭線圈，視野(FOV) 16cmxl6 cm，層厚2 mm，矩陣320x224。 成像序列包括(1)自旋迴波(SE) T、WI:重複時間(TR) 400 ms，回波 時間(TE) Minfbll，激勵次數2.0; (2)快速自旋冋波(FSE) T2WI:重複 時間(TR) 2500 ms，回波時間(TE) 85ms，回波鏈12，激勵次數8.0;
(3)梯度回波序列(GRE) T2*WI:重複時間(TR) 450 ms，回波時間(TE)
1415ms，翻轉角20°，激勵次數6.0。
螢光顯微鏡下觀察磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02雙標記 EGFP-BMSCs,激發波長450-490 nm時，可見雙標記EGFP-BMSCs的綠色熒 光和胞漿內Fe3(VCdTe/Si02納米顆粒的紅色螢光，而未標記的EGFP-BMSCs 的對照組僅見細胞的綠色螢光。圖4為磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02 標記細胞與對照組未標記細胞的磁共振掃描結果。對磁性螢光複合納米粒子 Fe3(VCdTe/Si02標記的8個不同數量級的EGFP-BMSCs進行磁共振掃描(圖 5中Bl、 B2、 B3、 B4、 Dl、 D2、 D3、 D4所示，分另樹應3xl06、 lx106、 5xl05、 lxl05、 5xl04、 lxl04、 5xl03、 lxl3個標記後的EGFP-BMSCs細胞)，相對於 相同數量級無標記的EGFP-BMSCs (圖中Al、 A2、 A3、 A4、 Cl、 C2、 C3、 C4所示，分別對應3xl06、 lx106、 5xl05、 lx105、 5xl04、 1><104數量級細胞丁2\￥1、 T/WI信號明顯低於未標記的細胞，以3xl06 最為明顯。隨著細胞數量級減小，兩組之間的信號差異逐漸減小，數量級小於 "104則與對照組信號差異不明顯，不能被觀察到。所有序列中T/WI信號差 異較T2WI明顯。以上結果表明，Fe3CVCdTe/Si02納米粒子能夠成功地對大鼠 BMSCs —步進行雙重標記，標記後的磁共振和螢光信號明顯。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實 施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
1權利要求
1、一種磁性螢光複合納米粒子Fe3O4/CdTe/SiO2，其特徵在於所述磁性螢光複合納米粒子Fe3O4/CdTe/SiO2由磁性粒子Fe3O4，CdTe螢光量子點和SiO2包覆層組成，以所述磁性粒子Fe3O4為球核心，中間層為所述CdTe螢光量子點，所述CdTe螢光量子點分布在所述磁性粒子Fe3O4表面，最外層為所述SiO2包覆層，SiO2包覆層包覆由所述磁性粒子Fe3O4和所述CdTe螢光量子點形成的球體。
2、 根據權利要求1所述的磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02，其特徵 在於所述磁性螢光複合納米粒子直徑為30 50nm。
3、 一種權利要求1所述磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的製備方法， 包括如下工藝歩驟和工藝條件(1) 油相高溫法製備疏水性Fe304納米粒子在惰性氣體保護下，混勻 0.5mmo1乙醯丙酮鐵、2.5mmo1 1,2-十六烷二醇、1.5mmo1油酸、1.5mmo1油胺 和5ml苄醚組成的混合物，20(TC下保溫2小時後繼續加熱至30(TC，回流1小 時，冷卻至室溫，產物用無水乙醇沉澱，10000 12000rpm/min離心分離5 8分 鍾，將沉澱物溶於含有0.013 ml油酸和0.013 ml油胺的10 15 ml正己烷中， 6000 8000rpm/min離心分離8 10分鐘，沉澱物分散在2 3 ml正己烷中， 製得一級疏水性Fe304納米粒子；根據所需疏水件Fe304納米粒子的尺寸，以一 級疏水性Fe304納米粒子為晶種進行生長，製備得各種粒徑的疏水性Fe304納米 粒子，具體步驟如下A、在含20mg —級疏水性Fe304納米粒子的1 2ml正 己烷中，加入0.5mmo1乙醯丙酮鐵、2.5mmo1 1,2-十六烷二醇、0.5mmo1油酸、 0.5mmo1油胺和5ml節醚組成的混合物，在惰性氣體保護下攪拌均勻，加熱至 IO(TC保持0.5小時，然後在20(TC下保溫1小時，再加熱至30(TC回流0.5小時， 冷卻至室溫；B、產物用無水乙醇沉澱，10000 12000rpm/min離心分離5 8分 鍾，將沉澱物溶於含有0.013 ml油酸和0.013 ml油胺的10 15 ml正己垸中， 6000 8000rpm/min離心分離5 8分鐘，沉澱物分散在1 2 ml正己烷中，制 得二級疏水性Fe304納米粒子；C、再以二級疏水性Fe304納米粒子為晶種，循 環重複B步驟，直至獲得所需尺寸的疏水性Fe304納米粒子；(2) 親水性Fe304納米粒子的製備用無水乙醇沉澱步驟(1)製得的所需 尺寸的疏水性Fe304納米粒子，得到疏水性Fe304納米粒子沉澱物，然後將20 30mg沉澱物分散於3 5ml於氯仿中，加入15 25^1三乙胺，製得溶液A，另取15 25mg2,3-二巰基丁二酸溶於3 5ml二甲亞碸中，製得溶液B，將溶液 A和溶液B混合均勻，60 70。C下振蕩24 36小時，10000 12000 rpm/min 下離心分離，得到沉澱，無水乙醇洗滌，重複離心、洗滌3 4次；接著，將沉 澱重新分散於30 50ml無水乙醇溶液中，加入15 25pl三乙胺，製得溶液C， 另取15 25 mg2,3 —二巰基丁二酸溶於3 5 ml二甲亞碸中，製得溶液D，將 溶液C和溶液D混合均勻，60 70"C下振蕩12 24小時，產物在10000 12000 rpm/min下離心分離，用無水乙醇洗滌，重複離心、洗滌3 4次；接著，將沉 澱分散於5 6 ml超純水中，製得親水性Fe304納米粒子；(3) CdTe螢光量子點的製備100 ml 1.25xl(T3mol/L CdCl2溶液中加入26.14 (il巰基丙酸，用O.lmol/L NaOH溶液調pH至9.1 ，劇烈攪拌卜'通N2脫氧20 30分鐘，加入IO pl NaHTe溶液，使反應物摩爾比為Cd2+:HTe—:巰基丙酸= 1:0.5:2.4， IOO'C加熱回流10分鐘 5小時，得到不同螢光顏色的CdTe螢光量 子點的水分散液；所述NaHTe溶液通過以下方法製備127.5mgTe粉和80mg NaBH4，所述NaBH4:Te粉摩爾比為2:1，加入lmlH20，於室溫下反應2 3分 鍾，即可獲得NaHTe溶液；(4) Fe304/CdTe納米粒子的製備在含0.4 mg親水性Fe304納米粒子的 lOOiil水分散液中，加入2 3ml0.1 mol/L， pH6.0CdCl2溶液，超聲20 30分鐘 後，加入l 2ml步驟(3)製得的CdTe螢光量子點的水分散液，室溫振蕩6 8小時；磁分離，依次用超純水和無水乙醇洗滌2 3次；(5) 磁性螢光複合粒於Fe304/CdTe/Si02的製備在步驟(4)所述的Fe304/ CdTe納米粒子中加入3 4 ml無水乙醇和500 600 pl 3-巰丙基三甲氧基矽烷， 振蕩5 6小時，10000 12000rpm/min分離，用無水乙醇洗滌、離心，重複3 4次；沉澱物與無水醇和超純水混合，加入正矽酸乙酯或矽垸偶聯劑，振蕩6 7小時，無水乙醇洗滌3 4次，得到磁性螢光複合粒子Fe304/CdTe/Si02。
4、根據權利要求3所述磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的製備方法， 其特徵在於所述步驟(1)中的惰性氣體為氮氣。
5 、根據權利要求3所述磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的製備方法， 其特徵在於所述歩驟(1)中的疏水性氧化鐵納米粒子直徑為6 10nm之間。
6、 根據權利要求3所述磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的製備方法， 其特徵在於所述步驟(2)中的親水性氧化鐵納米粒子直徑為6 10nm之間。
7、 根據權利要求3所述磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的製備方法，其特徵在於所述歩驟(3)中的CdTe螢光量子點發射光譜在521 647nm之 間，呈現綠、黃、橙或紅顏色的螢光。
8、 根據權利要求3所述磁性螢光複合納米粒子Fe3CVCdTe/Si02的製備方法， 其特徵在於所述步驟(5)中的無水醇為無水甲醇或無水乙醇；所述步驟(5) 中的矽垸偶聯劑為3-氨丙基三乙氧基矽垸或3-巰丙基三甲氧基矽烷。
9、 根據權利要求3所述磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02的製備方法， 其特徵在於所述步驟(5)中的磁性螢光複合納米粒子Fe30VCdTe/Si02直徑為 30 50nm，其分散性好、呈現超順磁性。
10、 一種權利耍求1或2所述磁性螢光複合納米粒子Fe304/CdTe/Si02應用 於骨髓間充質千細胞的標記和成像。
全文摘要
本發明公開了一種磁性螢光複合納米粒子Fe3O4/CdTe/SiO2及其製備方法。所述磁性螢光複合納米粒子Fe3O4/CdTe/SiO2的製備方法首先採用化學油相高溫法製備疏水性單分散的Fe3O4納米粒子，並對疏水性Fe3O4納米粒子表面進行改性使其分散於水相，再製備表面帶羧基的CdTe螢光量子點，通過共沉聚使CdTe螢光量子點沉澱在磁性Fe3O4納米粒子表面，然後利用配體交換在CdTe螢光量子點表面修飾矽烷偶聯劑，最後通過矽烷或矽酸酯水解形成最外層的SiO2包覆層。所述磁性螢光複合納米粒子Fe3O4/CdTe/SiO2直徑為30～50nm，同時具有磁性和螢光雙功能，標記大鼠骨髓間充質幹細胞後，螢光強度強而持久，細胞磁共振信號明顯減低。該粒子在生物標記、生物分離等諸多領域有著廣泛的應用前景。
文檔編號C09K11/88GK101503623SQ20091003748
公開日2009年8月12日 申請日期2009年2月27日 優先權日2009年2月27日
發明者鴻 單, 張黎明, 聶立波, 顏榮華 申請人:中山大學