一種夾心式單面孵育方法及其免疫印跡方法

2023-05-21 23:28:21

專利名稱：一種夾心式單面孵育方法及其免疫印跡方法
技術領域：
本發明屬於生物化學與分子生物學領域，是蛋白檢測方法和技術的運用，特別涉 及免疫印跡中一種節約型、夾心式的單面孵育抗體或檢測試劑的方法及應用該孵育方法的 免疫印跡方法。
背景技術：
免疫印跡法(Western blotting)是一種將高解析度凝膠電泳和免疫化學分析技 術相結合的雜交技術，該技術主要用於檢測特定的組織或細胞提取物中特定蛋白。其基本 原理為利用SDS-PAGE電泳分離蛋白質混合物，隨後將凝膠上分散開的蛋白質轉移到固相 載體(如聚乙二烯二氟化物膜，又稱PVDF膜；硝酸纖維素膜)上，非共價鍵形式吸附蛋白質 的固相載體能夠保持電泳分離的多肽類型和蛋白質的生物學活性不變。隨後，以固相載體 上的蛋白質或多肽作為抗原，與特異性的初級抗體發生免疫反應，再與酶或同位素標記的 次級抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性蛋白的表達。運用此項技術，可以檢測一種蛋白的大致的分子量和不同樣本中某種蛋白的相對 含量(Renart et al. , 1979 ；Towbin et al.，1979)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度 高、特異性強等優點，是檢測蛋白質特性、表達與分布的一種最常用的方法；該方法被廣泛 應用於分子生物學，生物化學，免疫遺傳學等生物學領域。在標準的免疫印跡實驗中，抗體 能夠特異性地與成百上千種的蛋白混合物中的一種蛋白即靶蛋白結合達到特異識別抗原 的目的。因此，抗體特異性的強弱和其質量的高低是免疫印跡實驗成功與否的決定性因素。 目前，很多的抗體已經商品化生產，易於獲得；但是商品化的抗體價格相對昂貴，其購買費 用不菲。基於此，任何節約抗體的使用但不影響免疫印跡的實驗結果的方法對於解決抗體 的費用問題都是非常有用的。目前，已有研究者利用熱密封袋或者密封的塑膠袋，在袋子中將膜與抗體進行孵 育，或者直接將抗體添加到轉移有蛋白印跡的膜的那一側等方法來降低免疫印跡實驗中對 抗體等試劑的消耗。然而，第一種節約試劑的方法需要特殊的密封袋，而且在放置膜的時 候，需要格外小心以防止膜的摺疊。而添加抗體至膜的一側的孵育方法中，抗體極易從膜上 流出，從而使得轉移有蛋白印跡點的膜乾燥，影響免疫印跡的實驗結果。Canzler等研發了 只需100 μ 1或更少量的稀釋後的抗血清的微小印跡方法(Canzler et al.，2009a ；CanzIer et al., 2009b) 0該方法對使用有限的樣品利用不同的抗體同時檢測不同的蛋白表達時非 常有用，但是操作過程更為複雜，對於常規的免疫印跡檢測而言，該方法既不經濟也不簡 便。雖然不同實驗中未與抗原結合的剩餘抗體可以反覆利用，但是重複使用的抗體中有效 抗體的數量和質量卻很難度量和控制，在實驗中應用這些抗體降低了對免疫印跡的結果的 預測和控制。參考文獻Canzler, U. , Bartsch, H. , Grossmann, K. , Lehmann, W. , Conrad, K. , Kurien, B. Τ. , Dorri, Y. , Scofield, R. H. , Bachmann, Μ. , 2009a. A miniaturized blotting system
3for simultaneous detecting of different autoantibodies. Methods Mol. Biol. 536, 129-137.Canzler, U. , Bartsch, H. , Ulitzsch, S. , Kurien, B. Τ. , Dorri, Y. , Scofield, R. H., Grossmann, K. , Lehmann, W. , Pilarsky, C. , Denz, A. , Grutzmann, R. , Conrad, K. , Schmitz, Μ. , Rieber, E. P. , Distler, W. , Bachmann, M. P. , 2009b. Detection of autoantibodies to tumour-associated antigens in sera of patients with systemic autoimmunity using a novel protein microblot array. Scand. J. Immunol. 69,563-569.Renart, J. ,Rei ser, J. , Stark, GR. , 1979. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethy 1-paper and detection with antisera -.a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad.Sci.U.S.A.76, 3116-3120.Towbin, H. , Staehelin, Τ. , Gordon, J. ,1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets :procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76,4350-4354.

發明內容
本發明旨在解決常規的免疫印跡實驗中利用浸泡式孵育方法檢測目的蛋白表達 的時候所用抗體和檢測試劑較多，實驗成本較高等問題。本發明所公布的夾心式單面孵育 的方法在節省抗體和檢測試劑的同時並不影響免疫印跡實驗的結果，驗證其可以作為一種 新的孵育方法應用於免疫印跡實驗。本發明是通過以下技術方案來實現一種免疫印跡分析中夾心式單面孵育方法，利用石蠟膜-抗體或檢測試劑-固相 載體膜組成三明治式的夾心孵育，將所述固相載體膜上轉移有蛋白質印跡的一面朝向所述 抗體或所述檢測試劑進行單面孵育，以此代替常規的浸泡式孵育。所述的夾心式單面孵育方法，所述固相載體為PVDF膜和纖維素膜之一。所述的夾心式單面孵育方法，所述抗體為初級抗體或次級抗體。一種應用上述任一所述單面孵育方法的免疫印跡分析方法，利用石蠟膜_抗體或 檢測試劑_固相載體膜組成三明治式的夾心孵育，將所述固相載體膜上轉移有蛋白質印跡 的一面朝向所述抗體或所述檢測試劑進行單面孵育，以此代替常規的浸泡式孵育。所述的免疫印跡分析方法，所述固相載體為PVDF膜和纖維素膜之一。所述的免疫印跡分析方法，其特徵在於，所述抗體為初級抗體或次級抗體。本發明公布了一種節約型、夾心式單面孵育抗體和檢測試劑的免疫印跡的方法， 此方法能節省80 %的抗體的使用。這種單面孵育的新方法的操作步驟與常規的孵育方法的 比較見圖1。本發明從檢測內源性和外源性的不同表達水平的蛋白的表達，以及新的孵育方法 和傳統的孵育方法的檢測結果的比較等，驗證了新的孵育方法的可靠性；結果表明該方法 能夠作為一種有效的節約抗體和檢測試劑的免疫印跡方法。


圖1為採用夾心式、單面孵育法(抗體和檢測試劑)和浸泡式孵育法(抗體和檢 測試劑)的免疫印跡方法的操作步驟比較；圖2為準備石蠟膜；圖3為滴加稀釋後的抗體形成微陣列；圖4為Iml稀釋抗體在石蠟膜上形成的微陣列與在容器中形成的大液體的比較；圖5為PVDF膜的最左端與抗體液滴呈線性接觸；圖6為PVDF膜、抗體、石蠟膜形成夾心，實現單面孵育；圖7為免疫印跡檢測HEK-293細胞內源性β -肌動蛋白的表達；左圖為採用夾心 式單面孵育抗體和檢測試劑的方法的免疫印跡實驗結果，右圖為採用浸泡式孵育抗體和檢 測試劑的方法的免疫印跡實驗結果。所用初級抗體為抗-β-肌動蛋白的鼠單克隆抗體(貨 號 sc-47778，Santa Cruz 生物公司)；圖8為免疫印跡檢測外源性融合蛋白的原核誘導表達；利用夾心式單面孵育抗體 和檢測試劑的方法，免疫印跡檢測外源性融合蛋白在Ε. coli細胞的誘導表達；「_」和「 + 」分 別表示未誘導和IPTG誘導後的融合蛋白的表達。所用的初級抗體為抗His標籤抗體(貨 號 Sc-803，Santa Cruz 生物公司)；圖9為免疫印跡檢測原核表達的融合蛋白對IMR90細胞的跨膜轉導；利用夾心 式單面孵育抗體和檢測試劑的方法，免疫印跡檢測圖8所得的融合蛋白經純化後在TAT跨 膜結構域的幫助下穿透IMR90細胞膜，在IMR90細胞內的聚積情況。所用的特異性抗體 購自Santa Cruz生物公司，分別是抗-c-Myc抗體(貨號Sc_40)、抗_0ct3/4抗體(貨號 Sc-5279)和抗-Sox2 抗體(貨號 Sc-20088)。
具體實施例方式本發明首先利用夾心式單面孵育和常規的浸泡式孵育兩種方法檢測了人胚腎293 細胞(HEK-293)的內源性肌動蛋白的表達；在此結果之上，進一步檢測了這種新的孵育 方式是否可以用於檢測轉染細胞或轉化細胞中外源性蛋白的表達。下面結合實例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I、蛋白樣品的獲得(1)收集細胞胰酶細胞消化液(含0. 05% Trypsin和0. 02% EDTA的PBS緩衝 液)消化收集293細胞，通過常溫1500rpm離心5min去除培養液並收集細胞團；(2)裂解細胞添加有蛋白酶抑制劑的一定量的RIPA緩衝液(150mM的氯化鈉， 1% triton X-100，1 %去氧膽酸鈉，0. 1 % 的 SDS，50mM 的 Tris-HCl，pH值 7. 5，2mM EDTA)重 懸細胞團，於冰上孵育30min以裂解細胞；(3)收集裂解液細胞裂解液經4°C 14，OOOrpm離心5min，將裂解液上清轉移至潔 淨的1. 5ml離心管；(4)測定蛋白含量=Bio-Rad蛋白分析儀測量上清液中總蛋白的含量；11、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(1)煮樣含40yg總蛋白的細胞裂解液與等體積的含有5.0%的β-巰基乙 醇的Laemmli上樣緩衝液(貨號161-0737，Bio-Rad生物公司)混勻後，95°C加熱5min，
540C 14，OOOrpm離心5min，收集上清液；(2)上樣取40yg蛋白樣品和10μ 1 BenchMark 預染蛋白分子量標準(貨 號10748-010，Invitrogen生物公司)上樣至15-孔4-20. O % Tris-HCl預製膠(貨號 161-1123，Bio-Rad 生物公司)；(3)蛋白電泳利用 PowerPac Universal 電泳儀(貨號 IM-5O7O, Bio-Rad 生物 公司)，在IOOV的電壓下電泳30min，然後再調整為120V的電壓下電泳90min ；III、轉膜(半乾式轉移)(1)準備聚乙二烯二氟化物膜(PVDF膜)剪裁適量大小的PVDF膜，於甲醇中浸泡 15min，去離子水漂洗2次，隨後將膜平衡於Ix轉移緩衝液(25mMTris，192mM甘氨酸，10% 甲醇)中直至使用；(2)轉膜聚丙烯醯胺凝膠電泳結束後，按從上至下順序為「濾紙-凝膠-PVDF 膜-濾紙」放置PVDF膜和凝膠，形成「三明治夾心」模式。最後，利用Trans-Blot SD半乾 轉膜儀(貨號170-3940，Bio-Rad生物公司)，在20v的電壓下轉膜Ih ；IV、酶聯免疫定位(1)封閉蛋白轉膜完成後，標記轉移有蛋白印跡的PVDF膜的那一側，將PVDF膜 浸泡在30ml的含有5. 0%脫脂奶粉的TBST緩衝液組成的封閉液中(TBST緩衝液為含有 0. 1% Tween-20的TBS緩衝液)，於4°C過夜孵育或者室溫孵育60min ；(2)與初級抗體孵育利用含有的脫脂奶粉的封閉液稀釋抗-β-肌動蛋白的 鼠單克隆抗體(貨號sc-47778，Santa Cruz生物公司)至終濃度為0. 1 μ g/ml。封閉後的 PVDF膜經IxTBST緩衝液漂洗3次，每次5min後，分別用如下兩種方法與初級抗體孵育。①傳統的浸泡式孵育方法將初級抗體放在一個小的容器中，將PVDF膜浸泡於稀 釋的抗體液中。以85mmX60mm的PVDF膜為例，使用傳統的浸泡式孵育抗體方法，至少需要 5ml的稀釋後的抗體。②夾心式單面孵育抗體的方法a、裁減1. 5倍於PVDF膜大小的石蠟膜，並將潔淨的石蠟膜平鋪於一個潔淨的開放 容器中(如圖2所示)。b、利用20 μ 1的移液器，將Iml稀釋後的初級抗體以每滴10_15 μ 1的量，均勻地 滴加於石蠟膜上，最後形成每平方釐米2滴稀釋抗體的微陣列，如圖3、圖4所示。c、用平頭鑷子將PVDF膜的一邊固定，並使轉移有蛋白的PVDF膜的那一側面向抗 體微陣列。d、將PVDF膜的最左端與抗體液滴接觸(圖5)，隨後從左至右慢慢地、輕柔地(大 約10S)讓PVDF膜與石蠟膜上的抗體液滴充分接觸，並注意不要產生氣泡(如圖6左圖所 示)°e、PVDF膜與抗體夾心式單面孵育上後，蓋上容器的蓋子以防止抗體溶液的揮發， 將PVDF膜置於4°C過夜孵育。(3)與次級抗體孵育lx TBST緩衝液漂洗與抗體過夜孵育的PVDF膜，每次漂洗 5min;漂洗3次後再按此前的各自不同的孵育方法與1 2000稀釋後的辣根過氧化物酶標 記的山羊抗鼠的次級抗體(貨號1858413，PIERCE生物公司)室溫孵育lh。(4)目的蛋白檢測與抗原結合的抗體，可以通過增強的化學發光檢測得到(ECL)(貨號sc-2048，Santa Cruz生物公司)；同時與發光底物的孵育也再次使用兩種不同的孵
育方式。(5)成像最後，利用LAS-3000成像系統檢測目的蛋白。V、檢測效果分析如圖7所示利用單面孵育抗體(圖7左圖)和傳統的浸泡式孵育抗體(圖7右 圖)兩種方法的免疫印跡實驗結果比較。比較結果顯示，由單面孵育抗體的方法獲得的結 果與傳統的孵育方法獲得的結果一致。本實驗進一步檢測了這種新的孵育方式是否可以用於檢測轉染細胞或轉化細胞 中外源性蛋白的表達。首先，利用重組質粒轉化大腸桿菌E.coli，在ImM IPTG的誘導下表 達融合蛋白(his-TAT-c-Myc，his-TAT-0ct4和his-TAT-Sox2)。分別來自於未誘導和IPTG 誘導的轉化細胞的IOug的細胞裂解液上清經凝膠電泳、蛋白轉膜等同前的操作程序進行 免疫印跡分析，利用抗His標籤的抗體(貨號Sc-803，Santa Cruz生物公司)檢測目的蛋 白在E. coli中的誘導表達，結果如圖8所示。此外，不同濃度的純化後的融合蛋白被添加到培養於24孔的組織培養皿中人的 成纖維細胞IMR90的培養液中。融合蛋白與IMR90細胞孵育8h後，收集整孔的IMR90細 胞以檢測融合蛋白在IMR90細胞內的積聚情況。原理上，融合蛋白可以在TAT跨膜結構域 的幫助下穿越細胞膜進入到細胞內。同樣利用單面抗體孵育的免疫印跡方法和特異性的 抗體(抗-c-Myc抗體貨號Sc-40 ；抗_0ct3/4抗體貨號Sc_5279 ；抗-Sox2抗體貨號 Sc-20088 ；Santa Cruz生物公司)檢測IMR90細胞內融合蛋白的聚積情況。所有的初級抗 體均被稀釋至0. 1 μ g/ml (此抗體濃度是標準的免疫印跡的最佳濃度)。從圖9所示的免疫 印跡的結果可以看出，夾心式單面孵育抗體的方法可以用於檢測外源基因的表達。實驗數據顯示，夾心式單面孵育抗體的方法在節約抗體使用的同時並不影響免疫 印跡的結果，能夠給出與傳統的浸泡式孵育方法一樣的結果。本發明的抗體孵育方式也適用於免疫印跡中檢測試劑與PVDF膜上抗原的孵育， 即用石蠟膜-檢測試劑-PVDF膜組成三明治式的夾心，將PVDF膜轉移上有蛋白質印跡的一 側面向檢測試劑進行單面孵育。如圖1所示，本發明的單面孵育方法也可用於檢測試劑與 PVDF膜上抗原的孵育，圖中化學發光底物即為檢測試劑。本發明公布的夾心式單面孵育抗體方法的最主要優點是能節約免疫印跡實驗中 大約80%的初級抗體、次級抗體和化學發光試劑等的消耗。由於免疫印跡中利用發光氨底 物檢測靶抗原的強的靈敏性，在此試驗中僅利用了發光氨檢測方法，但是利用DAB或TMB的 比色法分析的免疫印跡試驗中，運用此孵育方法，同樣可以達到節約抗體和檢測試劑的效 果。由此，採用傳統的孵育方式做一次免疫印跡實驗所用的抗體(初級抗體和次級抗體) 和檢測試劑可以完成5次的採用新的單面孵育的免疫印跡實驗。本發明提供的新的孵育方 法對解決免疫印跡實驗中昂貴的抗體費用和檢測試劑費用問題提供了技術支持。
權利要求
一種夾心式單面孵育方法，其特徵在於，利用石蠟膜 抗體或檢測試劑 固相載體膜組成三明治式的夾心孵育，將所述固相載體膜上轉移有蛋白質印跡的一面朝向所述抗體或所述檢測試劑進行單面孵育，以此代替常規的浸泡式孵育。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述固相載體為PVDF膜和纖維素膜之一。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述抗體為初級抗體或次級抗體。
4.一種應用權利要求1至3任一所述單面孵育方法的免疫印跡方法，其特徵在於，利用 石蠟膜-抗體或檢測試劑-固相載體膜組成三明治式的夾心孵育，將所述固相載體膜上轉 移有蛋白質印跡的一面朝向所述抗體或所述檢測試劑進行單面孵育，以此代替常規的浸泡 式孵育。
5.根據權利要求4所述的免疫印跡方法，其特徵在於，所述固相載體為PVDF膜和纖維素膜之一。
6.根據權利要求4所述的免疫印跡方法，其特徵在於，所述抗體為初級抗體或次級抗體。
全文摘要
本發明公開了一種在免疫印跡實驗中節約型、夾心式單面孵育抗體和檢測試劑的方法，該方法包括以下內容1)用石蠟膜-抗體-聚乙二烯二氟化物膜(PVDF膜)組成三明治式的夾心，將PVDF膜上轉移有蛋白質印跡的一面朝向抗體進行單面孵育；2)用石蠟膜-檢測試劑-PVDF膜組成三明治式的夾心，將PVDF膜上轉移有蛋白質印跡的一面朝向檢測試劑進行單面孵育。單面孵育抗體的方法所得結果不受目標蛋白的表達水平的限制，在節省80％的抗體和檢測試劑的同時其檢測結果與傳統的免疫印跡方法所得結果一致。本發明提供的新的孵育方法對解決免疫印跡實驗中昂貴的抗體費用和檢測試劑費用問題提供了技術支持。
文檔編號G01N33/543GK101893637SQ20101022895
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月19日 優先權日2010年7月19日
發明者潘傳英, 藍賢勇, 陳宏 申請人:西北農林科技大學