楊梅苷防治骨質疏鬆的應用的製作方法
2023-05-21 18:25:56 1
楊梅苷防治骨質疏鬆的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了楊梅苷防治骨質疏鬆的應用，楊梅苷對人骨髓間充質幹細胞無毒性作用，不影響細胞增殖；對H2O2造成的人骨髓間充質幹細胞的凋亡具有保護作用；並且在其分化過程中改善H2O2誘導的氧化應激狀態；對H2O2造成的人骨髓間充質幹細胞成骨分化抑制具有保護作用；對H2O2造成的人骨髓間充質幹細胞成脂分化增強具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表達，從而通過改善人骨髓間充質幹細胞凋亡和分化抑制及間接抑制破骨細胞活化來對骨質疏鬆起保護作用。在去勢小鼠骨松模型中，楊梅苷可以改善血清中的氧化應激狀態，改善股骨遠端和第四腰椎的松質骨骨微結構，表明楊梅苷能夠通過抑制氧化應激而改善骨微結構，發揮防治骨質疏鬆的作用。
【專利說明】楊梅苷防治骨質疏鬆的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於骨質疏鬆的防治【技術領域】，涉及楊梅苷防治骨質疏鬆的應用。
【背景技術】
[0002]骨質疏鬆症(osteoporosis，0P)是由多種病因導致的骨組織骨量丟失、骨微結構惡化和生物力學性能減退的全身性、退行性、代謝性骨骼疾病，導致骨脆性增加，容易發生骨折，嚴重威脅著中老年人的身心健康。
[0003]氧化應激(oxidative stress)是機體內高活性物質如ROS(Reactive oxygenspecies)產生過多，超出了機體的清除能力，導致氧化和抗氧化失衡的一種狀態。生理範圍內的ROS在調節人體正常的功能如細胞凋亡、基因表達、信號轉導等方面起著重要的作用。然而，高濃度的ROS可以導致核酸、蛋白質、脂質產生氧化反應，損害細胞的結構和功能，弓丨起疾病的發生。
[0004]近年來，研究發現氧化應激在骨質疏鬆發生發展中起重要作用。過量氧自由基(ROS)的產生可以抑制骨髓基質幹細胞(MSCs)成骨分化，造成MSCs和成骨細胞(OB)凋亡，促進破骨細胞(OC)活化和功能增強，導致骨吸收和骨形成失衡，引起骨微結構改變和骨量降低。
[0005]楊梅 苷(myricitrin)是一種植物黃酮苷,在楊梅的枝幹、皮中含量豐富,在其他多種水果和植物中也含有此成分。鑑於其來源豐富，楊梅苷比較容易被提取和純化。由於楊梅苷的良好活性，它被作為功能性食品、化妝品和藥品的重要補充。大量文獻表明，楊梅苷具有抗炎、神經保護和抗氧化等性能。
【發明內容】
[0006]本發明目的在於提供楊梅苷防治骨質疏鬆的應用。
[0007]為達到上述目的，本發明採用了以下技術方案:
[0008]楊梅苷在製備用於防治骨質疏鬆的藥物中的應用。
[0009]含楊梅苷的植物提取物在製備用於防治骨質疏鬆的藥物中的應用。
[0010]楊梅苷在製備用於改善人骨髓間充質幹細胞氧化應激狀態的藥物中的應用。
[0011]楊梅苷在製備用於抗人骨髓間充質幹細胞凋亡的藥物中的應用。
[0012]楊梅苷在製備用於抗人骨髓間充質幹細胞成骨分化抑制的藥物中的應用。
[0013]楊梅苷在製備用於提高人骨髓間充質幹細胞中ALP活性的藥物中的應用。
[0014]楊梅苷在製備用於提高人骨髓間充質幹細胞中促成骨分化基因Alp、Collal及Ocn表達水平的藥物中的應用。
[0015]楊梅苷在製備用於提高人骨髓間充質幹細胞中抑制RANKL和IL-6水平的藥物中的應用。
[0016]楊梅苷的給藥量至少為5mg/kg。
[0017]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:[0018]楊梅苷對人骨髓間充質幹細胞(hBMSC)無毒性作用、對hBMSC的凋亡具有保護作用；並且可以改善氧化應激狀態；對hBMSC成骨分化抑制具有保護作用JihBMSC成脂分化增強具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表達。在去勢小鼠模型中，楊梅苷可以改善血清中的氧化應激狀態，改善股骨遠端和腰椎的松質骨骨微結構。
[0019]人骨髓間充質幹細胞是研究早期成骨前體細胞生長、分化的較常用的細胞模型，楊梅苷對hBMSC具有保護作用，促進骨形成，並通過抑制骨吸收因子來抑制破骨細胞的活化，降低骨吸收，最終起到防治骨質疏鬆的作用。卵巢切除小鼠模型為常用的絕經後骨松模型，通過連續腹腔注射給與不同劑量楊梅苷，明顯改善了血清氧化應激狀態，對松質骨骨微結構有保護作用，表明其能夠發揮預防及治療絕經後骨質疏鬆的作用。
[0020]楊梅苷為純天然物質，用藥較安全，毒副作用小。
[0021]因此，楊梅苷可應用於骨質疏鬆的防治，尤其應用在製備防治骨質疏鬆的藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1-1為不同濃度楊梅苷對細胞增殖作用的影響。
[0023]圖1-2為楊梅苷對H2O2造成細胞凋亡的保護作用。
[0024]圖2為楊梅苷可以改善細胞氧化應激ROS水平的檢測結果。
[0025]圖3-1為楊梅苷在H2O2作用後，對細胞鹼性磷酸酶(ALP)活性的作用。
[0026]圖3-2為楊梅苷在H2O2作用後，對細胞基質鈣鹽沉積的作用。
[0027]圖3-3A、圖3-3B、圖3-3C為楊梅苷在H2O2作用後，對3種(Alp、Collal及Ocn)成骨分化基因表達水平的影響。
[0028]圖4-1為在H2O2作用後，楊梅苷對細胞脂質生成的作用。
[0029]圖4-2為在H2O2作用後，楊梅苷對成脂分化基因PPAR Y 2表達水平的影響。
[0030]圖5A、圖5B為楊梅苷在H2O2作用後，對2種骨吸收因子IL-6和RANKL表達的影響。
[0031]圖6-1A和圖6-1B為楊梅苷可以改善小鼠血清中氧化應激指標MDA和GSH水平的檢測結果。
[0032]圖6-2為楊梅苷可以改善OVX小鼠股骨遠端松質骨骨微結構的Micro-CT結果。
[0033]圖6-3為楊梅苷可以改善OVX小鼠股骨遠端松質骨骨微結構的VG染色結果。
【具體實施方式】
[0034]下面結合附圖和實施例對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0035]hBMSC為人骨髓間充質幹細胞，具有多向分化潛能，比如分化為成骨細胞、成脂細胞、成纖維細胞等，是研究骨髓間充質幹細胞生長、分化的較常用的細胞模型，過氧化氫(H2O2)處理也是較常用的體外氧化應激模型，出於觀察楊梅苷對人骨髓間充質幹細胞凋亡和分化的影響，及其抗氧化損傷的作用，所以選擇hBMSC作為細胞模型，H2O2處理為體外氧化應激模型。卵巢切除(去勢)小鼠模型作為動物模型，是常用的模擬婦女絕經後骨松的模型。
[0036]1、楊梅苷對氧化應激導致hBMSC凋亡的保護作用[0037]1.1單純楊梅苷對細胞的毒性作用
[0038]將hBMSC細胞以2X IO3個/mL接種到96孔板上，待細胞長滿後，棄掉培養基(成分:α-ΜΕΜ培養液+20%胎牛血清(FBS)+1%雙抗(青鏈黴素))，加含不同濃度O、0.1、1、10 μ M楊梅苷的無血清培養基至孔板中，培養24h和72h，觀察楊梅苷對細胞增殖作用的影響。在觀察點，利用MTT法對細胞活性進行檢測。
[0039]結果如圖1-1所示，橫坐標為不同濃度的楊梅苷作用時間，該圖的縱坐標為細胞活力值，以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。由圖可見，不同濃度的楊梅苷在觀察時間內，對細胞的增殖並無明顯影響。
[0040]1.2楊梅苷對氧化應激導致hBMSC凋亡的保護作用
[0041]分組情況:空白對照組；單純H2O2處理組；0.1 μ M Myricitrin+H202 ；1 μ MMyricitrin+H202 ；10 μ M Myricitrin+H202。
[0042]將hBMSC細胞以2X103個/mL接種到96孔板上，待細胞長滿後，棄掉培養基，加含不同濃度O、0.1、1、10 μ M楊梅苷的無血清培養基至孔板中，培養24h，加入H2O2 (300 μ Μ)，再培養24h，利用MTT法進行細胞活性檢測。
[0043]結果如圖1-2所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為細胞活力值，以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。由圖可見，單純H2O2作用後，細胞活性降低 ，經不同濃度楊梅苷作用後細胞活性增加，同單純H2O2作用組相比，具有統計學差異。圖中的#號表示:同對照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01 ;圖中的*號表示:同單純H2O2作用組相比，*P < 0.05，林P < 0.01。這表明用楊梅苷處理後能夠保護H2O2誘導的hBMSC的凋亡。
[0044]綜上所述，經楊梅苷對hBMSC細胞作用，不同濃度楊梅苷對細胞進行預處理，然後施加H2O2幹預，通過MTT檢測細胞活性，結果表明單純H2O2作用可以導致細胞活性降低，造成細胞凋亡，而0.1、1、10 μ M楊梅苷預處理，對這種損傷具有保護作用。因此，楊梅苷對H2O2誘導的氧化應激導致的細胞凋亡具有保護作用。
[0045]2、楊梅苷抗氧化作用檢測
[0046]hBMSC細胞鋪滿後，在楊梅苷和/或H2O2作用下，處理方法同上(1.2中)，進行氧化應激相關檢測。
[0047]根據ROS檢測試劑盒，利用螢光探針DCFH-DA對細胞內的活性氧進行檢測。細胞爬片，0.1、1、10 μ M楊梅苷預處理24h，300 μ M H2O2作用24h，然後進行原位裝載探針，加入
10μ M DCFH-DA,孵育20min，用PBS洗3次，去除未結合的探針，利用螢光酶標儀進行檢測。
[0048]結果如圖2所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為ROS生成，以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。由圖可見，單純H2O2處理後，細胞內的ROS水平升高很明顯，而0.1、1、10 μ M楊梅苷預處理後，細胞內的ROS水平降低。因此，楊梅苷可以改善hBMSC氧化應激ROS水平。
[0049]3、楊梅苷對氧化應激造成hBMSC成骨分化抑制的保護作用
[0050]楊梅苷對氧化應激造成hBMSC成骨分化抑制的保護作用:實驗分組同上(1.2中)，將細胞鋪於6孔板上，鋪滿後，加入地塞米松0.1uM, IOmM甘油磷酸鈉以及50ug/mL抗壞血酸進行成骨誘導培養。14天後，給予0.1、1、10 μ M楊梅苷預處理24h，然後加入300 μ MH2O2 處理 24h。[0051]3.1根據鹼性磷酸酶定量試劑盒(上海傑美)進行ALP定量，收集細胞，裂解後，提取蛋白。測定蛋白濃度，然後根據試劑盒的說明，進行ALP定量檢測。
[0052]結果如圖3-1所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為ALP活力，以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。單純H2O2作用後，細胞ALP活性表達同空白對照組相比顯著下降，楊梅苷作用後，ALP活性表達升高，同單純H2O2作用組相比具有統計學差異。ALP為成骨及其前體細胞分化中期的關鍵表達蛋白，為檢測成骨及其前體細胞分化的特異性指標，氧化應激導致ALP活性降低，對成骨及其前體細胞分化為抑制作用，但經楊梅苷作用後，ALP表達增加，改善了氧化應激對hBMSC成骨分化的抑制作用。
[0053]3.2鈣化結節染色:用PBS衝洗培養細胞，多聚甲醛固定後，I %茜素紅染色30分鐘，用水衝洗5次，倒置顯微鏡下觀察鈣結節沉積。
[0054]分組情況:①空白對照組；②單純H2O2處理組；③0.1 μ M Myricitrin+H202 ；④ I μ M Myricitrin+H202 ；(5) 10 μ M Myricitrin+H202O
[0055]結果如圖3-2所示，單純H2O2作用後鈣化結節形成較少，但是楊梅苷預處理後，結節面積有增加。鈣結節形成為成骨及其前體細胞分化的礦化階段，氧化應激可以抑制成骨及其前體細胞分化，而楊梅苷可以通過改善氧化應激來改善hBMSC成骨分化。
[0056]3.3成骨基因的RT-PCR檢測:實驗分組同上(1.2中)，將細胞鋪於6孔板上，鋪滿後，加入0.1uM地塞米松，IOmM甘油磷酸鈉以及50ug/mL抗壞血酸進行成骨誘導培養。14天後，給予0.1、1、10 μ M楊梅苷預處理24h，然後加入300 μ M H2O2處理24h。用Trizol裂解細胞，提取細胞內的mRNA，根據實時定量RT-PCR的程序，對目的基因Alp、Collal及Ocn進行定量檢測。
[0057]結果如圖3-3A、圖3-3B、圖3-3C所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為mRNA的相對表達水平，以各組相對於空白對照組的百分率來表述。由圖可見，H2O2作用後，細胞成骨分化基因Alp、Collal及Ocn表達水平下降，楊梅苷作用後，可以顯著促進成骨基因表達。Alp、Collal及Ocn基因分別為成骨及其前體細胞分化中期和後期的關鍵基因，決定著細胞的分化水平。H2O2抑制成骨及其前體細胞成骨分化基因的表達，而楊梅苷作用後，成骨分化基因表達有上調，說明楊梅苷可以改善H2O2導致的hBMSC成骨分化抑制。
[0058]4、楊梅苷對氧化應激造成的hBMSC成脂增強的抑制作用
[0059]4.1油紅O檢測脂質的生成:成脂誘導14天後，細胞經楊梅苷和/或H2O2處理2天，用PBS衝洗細胞，3.7%甲醛固定20分鐘，再用油紅O液體染色I小時。
[0060]分組情況:①空白對照組；②單純H2O2處理組；③0.1 μ M Myricitrin+H202 ；④ I μ M Myricitrin+H202 ；(5) 10 μ M Myricitrin+H202O
[0061]結果如圖4-1所示，單純H2O2作用後脂滴形成較多，但是楊梅苷預處理後，脂滴生成明顯減少。脂質生成為骨髓間充質幹細胞向成脂分化的標誌，氧化應激可以促進成脂分化，而楊梅苷可以通過改善氧化應激來抑制hBMSC成脂分化。
[0062]4.2成脂基因的RT-PCR檢測:實驗分組同上(1.2中)，將細胞鋪於6孔板上，鋪滿後，再成脂誘導14天，之後給予0.1、1、10 μ M楊梅苷預處理24h，然後加入300 μ M H2O2處理24h。用Trizol裂解細胞，提取細胞內的mRNA，根據實時定量RT-PCR的程序，對目的基因PPAR Y 2進行定量檢測。
[0063] 結果如圖4-2所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為mRNA的相對表達水平，以各組相對於空白對照組的百分率來表述。由圖可見，H2O2作用後，細胞成脂分化基因PPAR Y 2表達水平升高，楊梅苷作用後，可以顯著抑制成脂基因的表達。PPAR Y 2為成脂及其前體細胞分化的關鍵基因，一定程度上決定著細胞的分化水平。H2O2促進成脂分化基因的表達，而楊梅苷作用後，成脂分化基因表達下調，說明楊梅苷可以抑制H2O2導致的hBMSC成脂分化。5、楊梅苷對骨吸收因子的表達影響
[0064]楊梅苷對氧化應激刺激骨吸收因子增加的抑制作用:分組同上(1.2中)，將細胞鋪於6孔板上，鋪滿後，進行成骨誘導培養，14天後，給予楊梅苷處理，然後加入H2O2,裂解細胞，提取蛋白，測定蛋白濃度，根據酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)檢測IL-6和RANKL的表達情況。
[0065]結果如圖5A、圖5B所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為骨吸收因子的相對表達量，以各組相對於空白對照組的百分率來表述。H2O2作用後，細胞表達的IL-6和RANKL水平增加，楊梅苷預處理可以抑制骨吸收因子的表達。IL-6和RANKL為成骨及其前體細胞分泌的細胞因子，可以活化破骨細胞，進而引起骨吸收增強，導致骨量降低。因此，楊梅苷可以通過抑制IL-6和RANKL的表達，來抑制破骨細胞的活化，進而減少骨量的丟失。
[0066]綜合以上表明:楊梅苷對人骨髓間充質幹細胞無毒性作用，不影響細胞增殖；對H2O2造成的人骨髓間充質幹細胞的凋亡具有保護作用；並且在其分化過程中改善H2O2誘導的氧化應激狀態；對11202造成的人骨髓間充質幹細胞成骨分化抑制具有保護作用；對!1202造成的人骨髓間充質幹細胞成脂分化增強具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表達，從而通過改善人骨髓間充質幹細胞凋亡和分化抑制間接抑制破骨細胞活化來對骨質疏鬆起保護作用。
[0067]6.動物骨松模型的建立
[0068]40隻8周大BALB/c雌性小鼠，體重為20_22g。本實驗中4組小鼠的初始體重無統計學差異。在切除卵巢前，先將它們置於實驗室條件下I周(即通氣良好的20°C恆溫環境中，每12小時光照與黑暗交替，水糧足量，自由取用)。適應I周后，用戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)進行麻醉，小鼠被切除卵巢(去勢，η = 30)或者假手術(η = 10)。卵巢切除是通過背側入路切除雙側卵巢。假手術意味著手術找到雙側卵巢，但不切除，直接縫合關閉切口。小鼠被隨機分為4組:不處理組(假手術對照組，Sham);不處理組(單純卵巢切除組，0VX);低劑量楊梅苷給藥組(卵巢切除後每日通過腹腔注射給予5mg/kg體重的楊梅苷溶液，0VX+Myricitrin(5));高劑量楊梅苷給藥組(卵巢切除後每日通過腹腔注射給予25mg/kg體重的楊梅苷溶液，OVX+Myricitrin(25))。楊梅苷溶解於去離子水中，通過腹腔注射對不處理組小鼠注射同體積去離子水。手術後I周開始給藥，連續給藥12周時間。給藥完成後，麻醉下通過心臟採血獲得血液標本，並進行離心。提取每隻小鼠的左側股骨和第四腰椎，清除粘連的肌肉組織，妥善固定。
[0069]6.1使用脂質過氧化物MDA檢測試劑盒檢測各組血液樣本。在脂質過氧化過程中硫代巴比妥酸與MDA結合生成顯色複合物，其最大吸收峰在532nm，利用酶標儀在此處讀數。同樣，使用GSH檢測試劑盒檢測各組血液樣本。GSH的檢測是根據GSH與二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應形成一個產物，此產物通過酶標儀在412nm處進行讀數檢測。
[0070] 結果如圖6-1A和圖6-1B所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為MDA活力和GSH活力，以各組的OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。由圖可見，單純H2O2處理後，血清中的MDA水平明顯升高，GSH水平明顯降低；而高、低劑量的楊梅苷給藥組血清中的MDA水平降低，GSH水平升高。因此,楊梅苷可以改善血清中氧化應激狀態。
[0071]6.2顯微CT檢測骨微結構:第四腰椎和股骨遠端的骨微結構通過探索軌跡SP預臨床標本顯微CT進行檢測。解析度為8mm,管電壓為50kV,管電流為0.1mA。通過一個桌面顯微CT處理軟體進行重建和3D定量分析。所有標本的掃描環境和分析方法相同。股骨掃描區域限定為遠端幹垢端，並且向近端的初級松質近末端區域延伸2.0mm0在排除了顱骨及尾終板區後，椎體的松質骨區域被包含在每一個顯微CT選區中。在這些待掃描的區域中，松質骨與皮質骨的分界為內皮質骨面。選定的感興趣區的3D參數用於數據分析，包括:骨礦物質密度、連接密度、結構模型指數、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分離度和相對骨體積分數。進行掃描分析的操作者對標本的處理過程單盲。
[0072]結果如圖6-2所示，相對於假手術組，卵巢切除導致了小鼠松質骨骨微結構的損害，表現為骨礦密度、連接密度、骨小梁數量、骨小梁厚度及骨體積分數的下降。同時，卵巢切除後結構模型指數和骨小梁分離度明顯提高。結果具有統計學差異。然而，高、低劑量楊梅苷給藥組明顯逆轉了卵巢切除引起的骨微結構參數的變化趨勢，起到保持第四腰椎及股骨遠端小梁骨骨量的作用，結果具有統計學差異。因此，楊梅苷能夠對絕經後骨質疏鬆發揮預防及治療作用。
[0073]6.3通過VG染色進行組織學檢測:小鼠的左側股骨取材完成後，用4%多聚甲醛固定48小時。所有標本用80%酒精脫水，並用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)進行包埋。用旋轉切片機切取240mm片厚的冠狀位薄片，然後將所有切片打磨成20mm片厚，用於進行VG染色。 [0074]結果如圖6-3所示，相對於假手術組，卵巢切除組骨小梁數量明顯下降，小梁間的距離明顯變寬。給予高、低劑量楊梅苷藥物處理後，上述骨小梁損害效果明顯得到改善，表現為骨小梁數量的增加及骨小梁間距的減小。
[0075]因此，楊梅苷可應用於骨質疏鬆的防治，尤其是應用在製備防治骨質疏鬆藥物的中。
【權利要求】
1.楊梅苷在製備用於防治骨質疏鬆的藥物中的應用。
2.含楊梅苷的植物提取物在製備用於防治骨質疏鬆的藥物中的應用。
3.楊梅苷在製備用於改善人骨髓間充質幹細胞氧化應激狀態的藥物中的應用。
4.楊梅苷在製備用於抗人骨髓間充質幹細胞凋亡的藥物中的應用。
5.楊梅苷在製備用於抗人骨髓間充質幹細胞成骨分化抑制的藥物中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，楊梅苷在製備用於提高人骨髓間充質幹細胞中ALP活性的藥物中的應用。
7.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，楊梅苷在製備用於提高人骨髓間充質幹細胞中促成骨分化基因Alp、Collal及Ocn表達水平的藥物中的應用。
8.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，楊梅苷在製備用於提高人骨髓間充質幹細胞中抑制RANKL和 IL-6水平的藥物中的應用。
9.如權利要求1~8中任意一項所述的應用，其特徵在於，楊梅苷的給藥量至少為5mg/kg。
【文檔編號】A61P19/10GK103989694SQ201410234693
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】劉建, 黃強, 高博, 楊柳, 羅卓荊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學