轉鐵蛋白－聚乙二醇－藥物分子複合物及其用途的製作方法
2023-05-21 18:34:06
專利名稱：轉鐵蛋白－聚乙二醇－藥物分子複合物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬化學製藥領域，具體涉及轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物及其在腫瘤靶向治療中的應用。
背景技術：
蛋白質多肽類抗腫瘤藥物是一類應用細胞生物學和分子生物學手段對機體免疫系統或腫瘤的生長進行調節，從而抑制腫瘤生長的藥物，其特別對化療及放療後血細胞群的恢復能起到很好作用。目前此類藥物在臨床腫瘤治療中受到重視，但其應用還存在一些問題，例如體內不夠穩定，半衰期很短；因缺乏選擇性，導致相對平均的組織分布，在發揮治療作用的同時，對正常組織和細胞毒副作用大；常產生一定的抗原性，導致免疫反應的發生等。因此，嚴重影響這些藥物的抗腫瘤治療價值。
轉鐵蛋白(Transferrin，Tf)是一種非血紅素結合鐵的β-球蛋白，廣泛分布於脊椎動物的體液及細胞中。包括血清轉鐵蛋白、卵轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、黑色素轉鐵蛋白等，均為具有兩個Fe3+結合位點的單肽鏈糖蛋白，其中以血清轉鐵蛋白含量最多，且分布廣泛，能提供機體大多數組織器官所需的鐵。轉鐵蛋白的蛋白質部分由相對分子量為70kDa～80kDa的單一多肽鏈構成，含糖約6％[龍華等生物工程進展，2001，21(2)32-39.]。Tf具有熱穩定性，在60℃加熱時幾乎無變性現象。Tf主要在肝臟合成，其主要作用是運載細胞外的鐵，通過細胞膜受體介導的內吞作用，將鐵轉入細胞。
研究表明多數腫瘤細胞表面轉鐵蛋白受體(TfR)數目或活性高於正常細胞[Vyas SP and Sihorkar VAdv Drug Deliv Rev，2000，43(2-3)101-164]。如TfR表達的改變與乳腺癌、膀胱癌、肺癌、皮膚癌等均有密切關係。惡性腫瘤表面TfR的超量表達提供了人體內源性蛋白——轉鐵蛋白作為腫瘤導向基團的可能性。近年來，以轉鐵蛋白受體介導靶向腫瘤細胞的研究有所發展。通過Tf-藥物結合物可獲得更加理想的組織分布，更長的藥物血漿半衰期和控制藥物從結合物中的釋放，在動物模型和人體上研究顯示通過Tf攝取途徑治療癌症的有效性[Li et alTrends Pharmacol Sci，2002，23(5)206-209]。
有研究顯示，作為TfR配體的Tf與小分子抗癌藥物阿黴素直接通過小分子間接連接而成的複合物，可選擇性地殺死白血病細胞而對正常血細胞無毒性，對KB細胞毒實驗中發現其IC50明顯低於阿黴素，並且可避免阿黴素引起的心血管毒性和抗藥性[Yeh et alClin Immunol Immunopathol.1984，321-11；Fritzer et alBiochemical Pharmacology，1996，51489-493；Singh et alAnticancer Res，1998，18(3A)1423-1427]。將馬來醯亞胺基團引入小分子抗癌藥物正定黴素後直接與巰基化的Tf結合形成的Tf-正定黴素複合物，體外黑色素瘤細胞實驗表明該複合物比原藥具有更高的抗腫瘤活性[Kratz et alBioorganic Medicinal ChemistryLetters.1997，7(5)617-622.]。
將Tf連接在脂質體表面製得的Tf-脂質體或Tf-PEG-脂質體，細胞培養和動物實驗表明可攜帶藥物至TfR豐富的細胞，通過受體介導的細胞內吞作用進入腫瘤細胞；其體內滯留時間延長，網狀內皮系統的攝取降低，腫瘤部位的累積量有所增加[Singh et alCurr Pharm Des，1999，5(6)443-451；Maruyama et alAdvDrug Deliv Rev，1999，4089-102；Voinea et alVascular Pharmacology，2002，39(1～2)13-20；Ishida et al.Pharmaceutical Research，2001，18(7)1042-1048；Maruyama et alJ Control Release，2004，98195-207]，但由於脂質體不夠穩定，極易從脂質體中滲漏出的藥物，失去了其靶向到腫瘤細胞的作用。
聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一類由乙二醇單體聚合而成的線性或分支的高分子材料，分子組成為HOCH2CH2(OCH2CH2O)nCH2CH2OH。PEG分子具有良好的水溶性和生物相容性，為一種被廣泛使用的生物修飾材料。目前大部分研究主要集中在PEG與蛋白質的化學複合方面，如幹擾素、超氧化物岐化酶、粒細胞集落刺激因子、牛血紅蛋白、水蛭素、腫瘤壞死因子、胰島素、白介素-2等[Hinds K.D.et alAdvanced Drug Delivery Reviews，2002，54505-530；Kodera Y.et alProg.Podlym.Sci.，1998，231233-1271；Veronese F.MBiomaterials，2001，22405-417]。PEG與生物大分子類藥物的結合，可增加藥物的穩定性；減弱或消除免疫原性；延長藥物體內半衰期；雖然，抗腫瘤藥物經PEG修飾後，可通過被動靶向作用來增加藥物在腫瘤組織的攝取量，但由於其對腫瘤細胞無特異性識別作用，使其在腫瘤組織和正常組織中的分布無明顯差別，靶向腫瘤作用不顯著。
綜上所述，腫瘤細胞表面TfR是一條可通過Tf將包括納米粒、脂質體、基因和抗腫瘤藥物等物質導入腫瘤細胞內的有效途徑；PEG是一類具有廣闊應用前景的高分子化合物，其在生物醫學領域主要用作蛋白質、多肽、核酸、多糖等生物大分子的首選化學修飾劑。因此Tf的主動靶向性與PEG作為藥物載體的優良性能結合，可能成為新的具有腫瘤靶向作用的治療藥物載體。
發明內容
本發明的目的在於，提供一種轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物。本發明的進一步目的在於提供上述藥物分子複合物在腫瘤靶向治療中的用途。
本發明以Tf為靶向頭基，PEG為間隙基團與抗腫瘤藥物結合製成藥物分子複合物。
本發明所製成的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，一方面具有PEG化藥物的優點，即可提高藥物的穩定性，延長藥物的血漿半衰期，通過被動靶向作用增加藥物在腫瘤組織中的攝取量；另一方面利用轉鐵蛋白的主動靶向腫瘤細胞的作用，即可循細胞膜上TfR途徑選擇性地蓄積於過度表達TfR的腫瘤細胞內，釋放藥物後，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤組織生長，同時又不損傷正常組織。實驗結果表明Tf-PEG-藥物分子複合物具有競爭TfR的特徵和腫瘤組織靶向性，其進入血液循環系統後，與過度表達TfR的腫瘤細胞結合，所攜帶藥物主動靶向腫瘤組織，與原藥和PEG化藥物相比，在腫瘤組織中的分布顯著提高，抗腫瘤作用顯著增強，毒副作用顯著降低。
本發明所涉及的Tf-PEG-藥物分子複合物包括不同分子量的PEG衍生物，結構為G-PEG-G』，其中聚乙二醇末端一個羥基被氨基、巰基、醛基、磺酸基或羧基取代，或被N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)衍生化，再與抗腫瘤藥物共價結合。另一端羥基被馬來酸亞胺基(MAL)、氨基(t-Boc-NH)或乙烯磺酸基(VS)等功能性基團(G)取代後再與Tf共價結合而成的分子複合物。
上述抗腫瘤藥物是具有可與PEG衍生物一端氨基、巰基、醛基、磺酸基或羧基共價結合的帶有羧基、氨基或巰基的抗腫瘤藥物或帶有羧基、氨基或巰基的蛋白質多肽類抗腫瘤藥物。所述的帶有羧基、氨基或巰基的蛋白質多肽類抗腫瘤藥物選自腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核糖核酸酶(RNase)、幹擾素類(IFN)或白介素類(IL)。
本發明採用如下技術方案實現本發明和達到上述發明目的。
1、製備Tf-PEG-藥物分子複合物本發明合成的Tf-PEG-藥物分子複合物，其通式如下X-PEG-Y其中，X為轉鐵蛋白或其它可循細胞膜上轉鐵蛋白受體途徑進入細胞的物質；PEG為具有-(OCH2CH2O)n-重複結構的聚乙二醇及其衍生物；Y為抗腫瘤藥物。
所述的轉鐵蛋白或其它可循細胞膜上轉鐵蛋白受體途徑進入細胞的物質，其對動物或人體細胞無毒副作用，它們包括轉鐵蛋白家族(血清轉鐵蛋白、卵轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、黑色素轉鐵蛋白等)以及抗轉鐵蛋白受體抗體(抗血清、體外雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體、基因工程抗體)。
上述聚乙二醇及其衍生物，平均分子量為3000～20,000，其特徵在於所述的聚乙二醇末端一個羥基被氨基、巰基、醛基、磺酸基或羧基取代，或被N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)衍生化，再與抗腫瘤藥物共價結合，另一端羥基被馬來酸亞胺基(MAL)、氨基(t-Boc-NH)或乙烯磺酸基(VS)等功能性基團取代後再與轉鐵蛋白共價結合。
所述的抗腫瘤藥物是具有可與PEG衍生物一端氨基、巰基、醛基、羧基或磺酸基共價結合的帶有羧基、氨基或巰基的蛋白質多肽類抗腫瘤藥物。
(1)製備聚乙二醇-藥物化合物取G-PEG-G』與藥物，投料比為5∶1～60∶1，加入pH7～9的磷酸鹽、HEPES或Tris-HCl等緩衝液溶解，反應溫度4～25℃，緩慢攪拌15～120分鐘，加入3-10倍PEG摩爾量的6-氨基正己酸結束反應，即得G-PEG-藥物化合物。
所得G-PEG-藥物化合物經凝膠過濾色譜、離子交換色譜、反相高效液相色譜或疏水作用色譜等分離技術得純化的G-PEG-藥物化合物。
所述G為MAL-、t-Boc-NH-或VS-等功能性基團。
所述G』為PEG一端羥基被氨基、巰基、醛基、磺酸基或羧基取代，或被N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)衍生化。
所述藥物為腫瘤壞死因子-α、核糖核酸酶、幹擾素或白介素的其中一種。
(2)製備Tf衍生物①取無鐵人血清轉鐵蛋白，加巰基化反應緩衝液溶解，加入1～10倍摩爾量的巰基化試劑，室溫，氬氣下，反應1～3h。反應產物經凝膠脫鹽柱或透析袋，去除小分子未反應的巰基化試劑，超濾管離心濃縮，即得Tf-SH溶液。
所述巰基化反應緩衝液為pH8～9，15～30mM的HEPES和/或含1mM的EDTA的緩衝液，通入氬氣脫氣，密閉保存。
所述巰基化試劑為2-亞氨基四氫噻吩鹽酸鹽、N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯、甲基-4-巰基丁醯亞胺、S-乙醯疏基琥珀酸酐等其中之一。
②取無鐵人血清轉鐵蛋白與高碘酸鈉，摩爾比為1∶5，加pH4～6的醋酸鈉緩衝液溶解，冰浴、暗處反應60～120min，過凝膠過濾色譜柱(Sephadex G25PD10)純化，即得Tf-CHO。
上述所製備的Tf衍生物，對Tf的生物學功能影響極小，不幹擾Tf與細胞膜上的TfR特異結合活性。
(3)製備Tf-PEG-藥物分子複合物①取純化G-PEG-藥物化合物與Tf-SH，按PEG/-SH的摩爾比為1∶1～1∶3，在pH6.5～7.5的HEPES緩衝液中，氬氣下，4～25℃反應24～48小時，即得Tf-PEG-藥物分子複合物。
所述G為MAL-或VS-基團②取純化G-PEG-藥物化合物，加適量三氟乙酸，反應10～60分鐘，超濾2～3次後，得NH2-PEG-藥物化合物，加Tf-CHO，按PEG/-CHO的摩爾比為1∶1～1∶3，在pH5～10反應緩衝液中，4～25℃下，反應1～10小時後，最後加入10～30倍摩爾量的氰基硼氫化鈉，繼續反應24～36小時，即得Tf-PEG-藥物分子複合物。
上述G為t-Boc-NH-基團。
上述所製得Tf-PEG-藥物分子複合物經凝膠過濾色譜分離得純化的Tf-PEG-藥物分子複合物。
所得Tf-PEG-藥物分子複合物，加入200mM，pH7.5～8.0的檸檬酸-碳酸氫鈉緩衝液，超濾濃縮1～2次，按Tf與Fe3+的摩爾比為1∶5的比例，加入Fe3+試劑，反應30～60分鐘，使分子複合物中的每摩爾Tf與2摩爾的三價鐵離子結合。
上述Fe3+試劑為FeCl3溶於200mM，pH7.5～8.0的檸檬酸-碳酸氫鈉緩衝液中，使Fe3+濃度為10mM。
本發明Tf-PEG-藥物分子複合物可採用藥劑學上允許的賦形劑、pH調節劑、滲透壓調節劑等輔料配伍，按照藥學領域的常規或用特定的生產方法製備成相應藥物組合製劑。
所述藥物組合製劑包括腫瘤內和靜脈注射的Tf-PEG-藥物分子複合物的水針劑和凍乾粉針劑。
2、Tf-PEG-藥物分子複合物與細胞表面轉鐵蛋白受體結合特異性和親和能力檢測採用放射性配體結合分析法，測定競爭抑制125I-Tf與腫瘤細胞膜表面轉鐵蛋白受體結合程度，了解Tf-PEG-藥物分子複合物對腫瘤細胞膜表面轉鐵蛋白受體的特異性親和能力。
3、Tf-PEG-藥物分子複合物在正常和模型動物體內的行為採用放射性同位素示蹤法，檢測不同時相內Tf-PEG-藥物分子複合物在正常大鼠及荷瘤小鼠的正常組織和腫瘤組織中的分布，了解其被動物正常組織和腫瘤組織攝取情況以及藥物動力學參數和對腫瘤組織的靶向性。
4、Tf-PEG-藥物分子複合物在模型動物體內藥效學檢測採用S-180荷瘤小鼠，分別尾靜脈注射Tf-PEG-藥物分子複合物、生理鹽水、原藥和PEG化藥物後，不同時間下測量腫瘤體積大小，計算腫瘤抑制率，與原藥和PEG化藥物比較，評價Tf-PEG-藥物分子複合物的抗腫瘤效果。
本發明所涉及的實驗方法屬本領域已知方法，實驗所採用的試劑為市購。
經上述實驗結果證實，本發明既具有PEG化藥物的優點，又具有Tf的主動靶向腫瘤細胞的特點Tf-PEG-藥物分子複合物可循細胞膜上轉鐵蛋白受體途徑選擇性地蓄積於過度表達轉鐵蛋白受體的腫瘤細胞；與藥物和PEG-藥物化合物相比，Tf-PEG-藥物分子複合物血漿清除速度顯著延長，腫瘤組織的攝取量顯著提高；在腫瘤組織的分布量顯著大於其它正常組織；抗腫瘤效果顯著增強。此分子複合物具有主動靶向和被動靶向腫瘤細胞的雙重功能，可產生高效、安全的抗腫瘤療效。
圖1顯示A、125I-Tf(Fe)2和125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α與B、K562細胞特異性結合曲線和Scatchard圖。
圖2顯示與Tf和PEG-TNF-α對比，Tf-PEG-TNF-α分子複合物競爭抑制125I-Tf與K562細胞結合的競爭曲線。
圖3顯示尾靜脈注射後，TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α分子複合物在正常大鼠體內藥動學曲線。
圖4顯示尾靜脈注射2h後，TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α分子複合物在S-180荷瘤小鼠中的組織分布圖。
圖5顯示尾靜脈注射後，TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α分子複合物抑制S-180荷瘤小鼠腫瘤生長曲線。
具體實施例方式
以下藉助非限制性實施例進一步描述本發明。
實施例1 製備Tf-PEG-腫瘤壞死因子-α分子複合物(I)取20nmol腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和100nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.0)中，4℃下，反應1小時，加入5倍PEG摩爾量的6-氨基正己酸結束反應。一次上樣0.5mL於陽離子交換柱(POROS 20HS，直徑4.6mm，柱床體積1.66mL)，BioCAD工作站，紫外檢測器(波長280nm)進行分離純化，收集MAL-PEG-TNF-α組分。分別測定MAL-PEG-TNF-α組分中TNF-α和PEG的含量，得TNF-α和PEG的摩爾比為1∶1.9，收率(與參加反應的TNF-α量對照)為18.90％。
取0.5μmol Tf於1mL的30mM HEPES緩衝液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巰基化試劑2-亞氨基四氫噻吩鹽酸鹽，室溫，氬氣下，反應3h。反應產物過凝膠脫鹽柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反應巰基化試劑，超濾離心濃縮後，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩爾比為1∶3.03±0.12取Tf-SH和Mal-PEG-TNF-α，按PEG/-SH摩爾比為1∶1.2，在20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氬氣下反應24小時，即得Tf-PEG-TNF-α。凝膠過濾色譜法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200HR)，分離純化。收集Tf-PEG-TNF-α組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-TNF-α。分別測定Tf(Fe)2-PEG-TNF-α組分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/TNF-α為0.8/1.9/1，收率為38.6％。
實施例2 製備Tf-PEG-腫瘤壞死因子-α分子複合物(II)取20nmol TNF-α和400nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.0)中，4℃下，反應1小時，加入5倍PEG摩爾量的6-氨基正己酸結束反應。一次上樣0.5mL於陽離子交換柱(POROS 20HS，直徑4.6mm，柱床體積1.66mL)，BioCAD工作站，紫外檢測器(波長280nm)進行分離純化，收集MAL-PEG-TNF-α組分。分別測定MAL-PEG-TNF-α組分中TNF-α和PEG的含量，得TNF-α和PEG的摩爾比為1∶2.6，收率(與參加反應的TNF-α量對照)為50.44％。
取0.5μmol Tf於1mL的30mM HEPES緩衝液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巰基化試劑2-亞氨基四氫噻吩鹽酸鹽，室溫，氬氣下，反應3h。反應產物過凝膠脫鹽柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反應巰基化試劑，超濾離心濃縮後，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩爾比為1∶3.03±0.12取Tf-SH和Mal-PEG-TNF-α，按PEG/-SH摩爾比為1∶1.2，在20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氬氣下反應24小時，即得Tf-PEG-TNF-α。凝膠過濾色譜法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200HR)，分離純化。收集Tf-PEG-TNF-α組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-TNF-α。分別測定Tf(Fe)2-PEG-TNF-α組分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/TNF-α為0.9/2.6/1，收率為40.1％。
實施例3 製備Tf-PEG-腫瘤壞死因子-α分子複合物(III)取20nmol TNF-α和800nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.0)中，4℃下，反應1小時，加入5倍PEG摩爾量的6-氨基正己酸結束反應。一次上樣0.5mL於陽離子交換柱(POROS 20HS，直徑4.6mm，柱床體積1.66mL)，BioCAD工作站，紫外檢測器(波長280nm)進行分離純化，收集MAL-PEG-TNF-α組分。分別測定MAL-PEG-TNF-α組分中TNF-α和PEG的含量，得TNF-α和PEG的摩爾比為1∶3.7，收率(與參加反應的TNF-α量對照)為60.81％。
取0.5μmol Tf於1mL的30mM HEPES緩衝液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巰基化試劑2-亞氨基四氫噻吩鹽酸鹽，室溫，氬氣下，反應3h。反應產物過凝膠脫鹽柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反應巰基化試劑，超濾離心濃縮後，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩爾比為1∶3.03±0.12取Tf-SH和Mal-PEG-TNF-α，按PEG/-SH摩爾比為1∶1.2，在20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氬氣下反應24小時，即得Tf-PEG-TNF-α。凝膠過濾色譜法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200 HR)，分離純化。收集Tf-PEG-TNF-α組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-TNF-α。分別測定Tf(Fe)2-PEG-TNF-α組分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/TNF-α為0.9/3.7/1，收率為42.3％。
實施例4 製備Tf-PEG-腫瘤壞死因子-α分子複合物(IV)取20nmol TNF-α和1200nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.0)中，4℃下，反應1小時，加入5倍PEG摩爾量的6-氨基正己酸結束反應。一次上樣0.5mL於陽離子交換柱(POROS 20HS，直徑4.6mm，柱床體積1.66mL)，BioCAD工作站，紫外檢測器(波長280nm)進行分離純化，收集MAL-PEG-TNF-α組分。分別測定MAL-PEG-TNF-α組分中TNF-α和PEG的含量，得TNF-α和PEG的摩爾比為1∶4.8，收率(與參加反應的TNF-α量對照)為85.70％。
取0.5μmol Tf於1mL的30mM HEPES緩衝液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巰基化試劑2-亞氨基四氫噻吩鹽酸鹽，室溫，氬氣下，反應3h。反應產物過凝膠脫鹽柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反應巰基化試劑，超濾離心濃縮後，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩爾比為1∶3.03±0.12
取Tf-SH和Mal-PEG-TNF-α，按PEG/-SH摩爾比為1∶1.2，在20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氬氣下反應24小時，即得Tf-PEG-TNF-α。凝膠過濾色譜法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200HR)，分離純化。收集Tf-PEG-TNF-α組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-TNF-α。分別測定Tf(Fe)2-PEG-TNF-α組分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/TNF-α為1.1/4.8/1，收率為52.7％。
實施例5 製備Tf-PEG-幹擾素-γ分子複合物(I)取0.3nmol幹擾素-γ(IFN-γ)和1.5nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量5000)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.5)中，4℃下，反應1小時，加入5倍PEG摩爾量的6-氨基正己酸結束反應。將反應混合物上樣於凝膠過濾色譜柱(HiPrep 16/60，Sephacryl S-200HR，柱床體積120mL)，以流速為0.3mL/min，20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)進行洗脫，自動部分收集器以1.5mL/管收集，測定每管280nm處的吸收值，以洗脫體積對吸收值繪製洗脫曲線，按照分子量標準曲線求得MAL-PEG-IFN-γ組分峰濃度處分子量，從而計算得每個IFN-γ分子連接了2.1個PEG分子。收集MAL-PEG-IFN-γ組分，超濾濃縮後，計算收率(與參加反應的IFN-γ量對照)為9.60％。
取0.5μmol Tf於1mL的30mM HEPES緩衝液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巰基化試劑2-亞氨基四氫噻吩鹽酸鹽，室溫，氬氣下，反應3h。反應產物過凝膠脫鹽柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反應巰基化試劑，超濾離心濃縮後，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩爾比為1∶3.03±0.12。
取Tf-SH和Mal-PEG-IFN-γ，按PEG/-SH摩爾比為1∶1.1，在20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氬氣下反應24小時，即得Tf-PEG-IFN-γ。凝膠過濾色譜法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200 HR)，分離純化。收集Tf-PEG-IFN-γ組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ。分別測定Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ組分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/IFN-γ為0.7/2.1/1，收率為39.5％。
實施例6 製備Tf-PEG-幹擾素-γ分子複合物(II)取0.3nmol IFN-γ和3nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量5000)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.5)中，4℃下，反應1小時，加入5倍PEG摩爾量的6-氨基正己酸結束反應。將反應混合物上樣於凝膠過濾色譜柱(HiPrep16/60，Sephacryl S-200HR，柱床體積120mL)，以流速為0.3mL/min，20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)進行洗脫，自動部分收集器以1.5mL/管收集，測定每管280nm處的吸收值，以洗脫體積對吸收值繪製洗脫曲線，按照分子量標準曲線求得MAL-PEG-IFN-γ組分峰濃度處分子量，從而計算得每個IFN-γ分子連接了4.1個PEG分子。收集MAL-PEG-IFN-γ組分，超濾濃縮後，計算收率(與參加反應的IFN-γ量對照)為21.2％。
取0.5μmol Tf於1mL的30mM HEPES緩衝液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巰基化試劑2-亞氨基四氫噻吩鹽酸鹽，室溫，氬氣下，反應3h。反應產物過凝膠脫鹽柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反應巰基化試劑，超濾離心濃縮後，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩爾比為1∶3.03±0.12。
取Tf-SH和Mal-PEG-IFN-γ，按PEG/-SH摩爾比為1∶1.1，在20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氬氣下反應24小時，即得Tf-PEG-IFN-γ。凝膠過濾色譜法(HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR)，分離純化。收集Tf-PEG-IFN-γ組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ。分別測定Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ組分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/IFN-γ為1.0/4.1/1，收率為42.6％。
實施例7 製備Tf-PEG-幹擾素-γ分子複合物(III)取0.3nmol IFN-γ和6nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量5000)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.5)中，4℃下，反應1小時，加入5倍PEG摩爾量的6-氨基正己酸結束反應。將反應混合物上樣於凝膠過濾色譜柱(HiPrep16/60，Sephacryl S-200HR，柱床體積120mL)，以流速為0.3mL/min，20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)進行洗脫，自動部分收集器以1.5mL/管收集，測定每管280nm處的吸收值，以洗脫體積對吸收值繪製洗脫曲線，按照分子量標準曲線求得MAL-PEG-IFN-γ組分峰濃度處分子量，從而計算得每個IFN-γ分子連接了6.8個PEG分子。收集MAL-PEG-IFN-γ組分，超濾濃縮後，計算收率(與參加反應的IFN-γ量對照)為32.6％。
取0.5μmol Tf於1mL的30mM HEPES緩衝液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巰基化試劑2-亞氨基四氫噻吩鹽酸鹽，室溫，氬氣下，反應3h。反應產物過凝膠脫鹽柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反應巰基化試劑，超濾離心濃縮後，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩爾比為1∶3.03±0.12。
取Tf-SH和Mal-PEG-IFN-γ，按PEG/-SH摩爾比為1∶1.1，在20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氬氣下反應24小時，即得Tf-PEG-IFN-γ。凝膠過濾色譜法(HiPrep 16/60 Sephacryl S-200HR)，分離純化。收集Tf-PEG-IFN-γ組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ。分別測定Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ組分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/IFN-γ為1.2/6.8/1，收率為49.3％。
實施例8 製備Tf-PEG-幹擾素-γ分子複合物(III)取0.3nmol IFN-γ和9nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量5000)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.5)中，4℃下，反應1小時，加入5倍PEG摩爾量的6-氨基正己酸結束反應。將反應混合物上樣於凝膠過濾色譜柱(HiPrep16/60，Sephacryl S-200HR，柱床體積120mL)，以流速為0.3mL/min，20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)進行洗脫，自動部分收集器以1.5mL/管收集，測定每管280nm處的吸收值，以洗脫體積對吸收值繪製洗脫曲線，按照分子量標準曲線求得MAL-PEG-IFN-γ組分峰濃度處分子量，從而計算得每個IFN-γ分子連接了7.9個PEG分子。收集MAL-PEG-IFN-γ組分，超濾濃縮後，計算收率(與參加反應的IFN-γ量對照)為51.6％。
取0.5μmol Tf於1mL的30mM HEPES緩衝液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巰基化試劑2-亞氨基四氫噻吩鹽酸鹽，室溫，氬氣下，反應3h。反應產物過凝膠脫鹽柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反應巰基化試劑，超濾離心濃縮後，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩爾比為1∶3.03±0.12。
取Tf-SH和Mal-PEG-IFN-γ，按PEG/-SH摩爾比為1∶1.1，在20mM的HEPES緩衝液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氬氣下反應24小時，即得Tf-PEG-IFN-γ。凝膠過濾色譜法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200HR)，分離純化。收集Tf-PEG-IFN-γ組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ。分別測定Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ組分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/IFN-γ為1.5/7.9/1，收率為55.8％。
實施例9 製備TF-PEG-核糖核酸酶分子複合物(I)取0.3nmol核糖核酸酶(RNase)和1.5nmol t-BOC-NH-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.5)中，室溫下，反應0.5小時，加15μL三氟乙酸，反應30分鐘，超濾2次後，得NH2-PEG-RNase。將反應混合物上樣於凝膠過濾色譜柱(HiPrep 16/60，Sephacryl S-200HR，柱床體積120mL)，以流速為0.3mL/min，10mM的HEPES緩衝液(pH7.3，含0.15M的NaCl)進行洗脫，自動部分收集器以1.5mL/管收集，測定每管280nm處的吸收值，以洗脫體積對吸收值繪製洗脫曲線，按照分子量標準曲線求得NH2-PEG-RNase組分峰濃度處分子量，從而計算得每個RNase分子連接了2.2個PEG分子。收集NH2-PEG-RNase組分，超濾濃縮後，計算收率(與參加反應的RNase量對照)為10.7％。
取無鐵人血清轉鐵蛋白與高碘酸鈉，摩爾比為1∶5，加pH5的醋酸鈉緩衝液1mL溶解，冰浴、暗處反應90分鐘，反應產物過凝膠過濾色譜柱(Sephadex G25PD10)，以10mM的HEPES緩衝液(pH7.3，含0.15M的NaCl)進行洗脫，即得Tf糖鏈上的羥基被氧化成醛基的純化的Tf-CHO。
氧化的Tf，按PEG/-CHO的摩爾比為1∶1，立即加到純化的NH2-PEG-RNase溶液中，在pH7.3的HEPES緩衝液中，室溫下，反應2小時，加入20倍摩爾量的氰基硼氫化鈉，繼續反應24小時，即得Tf-PEG-RNase。凝膠過濾色譜法(HiPrep16/60Sephacryl S-200HR)，分離純化。收集Tf-PEG-RNase組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-RNase。分別測定Tf(Fe)2-PEG-RNase組分中PEG和Tf含量超濾濃縮，得Tf/PEG/RNase為0.9/2.2/1，收率為41.8％。
實施例10 製備TF-PEG-核糖核酸酶分子複合物(II)取0.3μnmol RNase和6μnmol t-BOC-NH-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES緩衝液(15mM，pH8.5)中，室溫下，反應0.5小時，加60μL三氟乙酸，反應30分鐘，超濾2次後，得NH2-PEG-RNase。將反應混合物上樣於凝膠過濾色譜柱(HiPrep 16/60，Sephacryl S-200HR，柱床體積120mL)，以流速為0.3mL/min，10mM的HEPES緩衝液(pH7.3，含0.15M的NaCl)進行洗脫，自動部分收集器以1.5mL/管收集，測定每管280nm處的吸收值，以洗脫體積對吸收值繪製洗脫曲線，按照分子量標準曲線求得NH2-PEG-RNase組分峰濃度處分子量，從而計算得每個RNase分子連接了6.1個PEG分子。收集NH2-PEG-RNase組分，超濾濃縮後，計算收率(與參加反應的RNase量對照)為30.2％。
取無鐵人血清轉鐵蛋白與高碘酸鈉，摩爾比為1∶5，加pH5的醋酸鈉緩衝液1mL溶解，冰浴、暗處反應90分鐘，反應產物過凝膠過濾色譜柱(Sephadex G25PD10)，以10mM的HEPES緩衝液(pH7.3，含0.15M的NaCl)進行洗脫，即得Tf糖鏈上的羥基被氧化成醛基的純化的Tf-CHO。
氧化的Tf，按PEG/-CHO的摩爾比為1∶1，立即加到純化的NH2-PEG-RNase溶液中，在pH7.3的HEPES緩衝液中，室溫下，反應2小時，加入20倍摩爾量的氰基硼氫化鈉，繼續反應24小時，即得Tf-PEG-RNase。凝膠過濾色譜法(HiPrep16/60Sephacryl S-200HR)，分離純化。收集Tf-PEG-RNase組分，與Fe3+結合後，得橙紅色的每摩爾Tf結合2摩爾的三價鐵離子的Tf(Fe)2-PEG-RNase。分別測定Tf(Fe)2-PEG-RNase組分中PEG和Tf含量得Tf/PEG/RNase為1.4/6.1/1，收率為54.1％。
實施例11 Tf-PEG-TNF-α分子複合物(IV)與細胞表面轉鐵蛋白受體結合特性的評價1.125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α與K562和KB細胞表面受體特異結合試驗K562和KB細胞用含10％(V/V)新生牛血清的RPMI1640培養液，在二氧化碳培養箱內(37℃、5％CO2、飽和溼度)連續培養。將處於對數生長期的細胞用含1％BSA的RPMI1640培養液洗滌1次，分別取約含7.5×105個K562或1×106個KB細胞懸液0.4mL於牛血清白蛋白飽和的反應測試管內，加入0.1mL不同濃度的125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α(以Tf摩爾量計)或不同濃度的125I-Tf(Fe)2，4℃下孵育120min後，4℃、4000rpm離心10min，棄去上清液，並用4℃生理緩衝液洗滌兩次，γ計數器測量沉澱放射性計數(cpm)，並進行衰變校正。各水平樣品均採用3復管，設有總結合管和非特異性結合管。以特異結合125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α或125I-Tf(Fe)2對加入125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α或125I-Tf(Fe)2總量作圖，得125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α或125I-Tf(Fe)2與上述細胞的結合飽和曲線。用Graphpad Prism 4.0軟體，按Scatchard模型求出125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α或125I-Tf(Fe)2與上述細胞結合的解離常數Kd和最大結合位點數n，Kd值越小，表明配體與細胞表面受體結合的親和力越高；n值越大，表明配體與受體結合的數量越多。結果表明，125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α能與富含TfR的K562和KB細胞特異結合，其Kd和n值接近於Tf，可以認為125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α與TfR結合具有特異性和親和性特徵。表1是125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α和125I-Tf(Fe)2與腫瘤細胞表面轉鐵蛋白受體特異結合參數表1
2.125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α對K562轉鐵蛋白受體的競爭結合試驗取對數生長期的K562細胞懸液0.4mL(約7.5×105個細胞)於反應測試管中，加入0.1mL的125I-Tf(Fe)2(反應體系中終濃度3.1nmol/L)和0.05mL不同濃度非標記競爭劑(Tf(Fe)2-PEG-TNF-α、MAL-PEG-TNF-α或Tf(Fe)2)，補足體積至1mL，在4℃條件下孵育120min後，按結合動力學試驗中描述的方法測量各個水平沉澱物放射性計數。以特異結合佔最大結合百分數(B/B0)對不同競爭劑濃度作圖，得Tf(Fe)2-PEG-TNF-α、MAL-PEG-TNF-α或Tf(Fe)2競爭抑制K562細胞與125I-Tf結合的曲線。結果表明Tf(Fe)2-PEG-TNF-α和Tf(Fe)2競爭抑制125I-Tf(Fe)2與腫瘤細胞表面轉鐵蛋白受體結合的特徵相似，兩者抑制腫瘤細胞結合125I-Tf(Fe)250％時的濃度分別為5.4和3.1nM；而隨著MAL-PEG-TNF-α濃度增大並不能降低Tf特異結合佔最大結合百分數(B/B0)，說明MAL-PEG-TNF-α不能與Tf競爭K562細胞表面的TfR，即MAL-PEG-TNF-α對腫瘤細胞無特異親和能力。三種競爭劑與125I-Tf(Fe)2競爭TfR結合的抑制曲線見附圖2。
實施例12 Tf-PEG-TNF-α分子複合物(IV)的動物體內行為試驗1.Tf-PEG-TNF-α在正常大鼠體內藥動學行為取於溫度25±2℃，相對溼度75±5％和自然光條件下，飼養一周的SD雄性大鼠，隨機分成3組，每組5隻，於無菌條件下，用注射用生理鹽水分別配置125I標記的TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α(1μg/mL)注射液，大鼠尾靜脈注射2.5mL，劑量為2.5μg/200g體重或20μCi/200g體重。給藥後，分別於0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24和48小時，眼眶取血0.5mL，置肝素鈉抗凝的離心管中，4000rpm下，離心10分鐘。精密吸取血漿200μL，置反應測試管中，加入10％三氯醋酸1mL，旋渦1分鐘，6000rpm下，離心5分鐘，吸去上清夜，將剩下的沉澱進行cpm測定。用3P87軟體處理數據，計算藥動學參數。結果表明，Tf-PEG-TNF-α的血漿半衰期分別為TNF-α和PEG-TNF-α的3.7和1.3倍；平均滯留時間分別為TNF-α和PEG-TNF-α的4.7和1.3倍；AUC0→∞分別為TNF-α和PEG-TNF-α的7.5和1.6倍。表2是TNF-α，PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α在正常大鼠體內血漿藥動學參數。
表2
2.Tf-PEG-TNF-α在荷瘤小鼠體內組織分布取於溫度25±2℃，相對溼度75±5％和自然光條件下，飼養42±2日齡，體重18±1g的昆明種雌性小鼠，置超淨臺上，取生長良好的7-11天的S180瘤種，將瘤組織製成1～2×107/ml細胞懸液，小鼠右側腋部皮下接種0.2ml/只。7天後將小鼠隨機分組，每組5隻。將無菌條件下配製的125I標記的TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α生理鹽水注射液，尾靜脈注射0.4μg/只或5μCi/只，給藥後分別於第0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24和48小時，每種樣品在每個時間點各取一組小鼠，眼眶取血後，頸椎脫臼處死。取心、肝、脾、肺、腎和腫瘤等器官與組織，用濾紙將表面吸乾，稱重，測定各器官與組織的cpm數。結果表明，Tf-PEG-TNF-α在腫瘤組織中的半衰期分別是TNF-α和PEG-TNF-α的8.4和2.1倍；達峰濃度分別是TNF-α和PEG-TNF-α的3.5和1.8倍；Tf-PEG-TNF-α在腫瘤組織中的分布量分別為心、肝、脾、肺和腎的2.0、4.3、4.0、1.8、3.3倍，分別為TNF-α和PEG-TNF-α的9.7和2.3倍。表3是TNF-α，PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α在荷瘤小鼠腫瘤組織中的藥動學參數。
表3
實施例13 Tf-PEG-TNF-α分子複合物(IV)在模型動物體內抗腫瘤作用評價接種S-180腫瘤細胞24小時的昆明種雌性小鼠，隨機分組，每組10隻。分別尾靜脈注射TNF-α，PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α注射液，0.67μg/只，兩天一次，共8次。剩下2組小鼠，尾靜脈注射生理鹽水，0.3mL/只，兩天一次，共8次，作為陰性對照組。於接種後第7、9、11、13、15和17天測量瘤體積，計算第17天的腫瘤抑制率
結果表明，Tf-PEG-TNF-α的腫瘤抑制率分別為TNF-α和PEG-TNF-α的5.3和1.8倍。
權利要求
1.一種轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於其具有以下通式X-PEG-Y其中，X為轉鐵蛋白或其它可循細胞膜上轉鐵蛋白受體途徑進入細胞的物質；PEG為具有-(OCH2CH2O)n-重複結構的聚乙二醇及其衍生物；Y為抗腫瘤藥物。
2.按權利要求1所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的轉鐵蛋白或其它可循細胞膜上轉鐵蛋白受體途徑進入細胞的物質是轉鐵蛋白家族，包括血清轉鐵蛋白、卵轉鐵蛋白、乳鐵蛋白和黑色素轉鐵蛋白，或抗轉鐵蛋白受體抗體，包括抗血清、體外雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體和基因工程抗體。
3.按權利要求1所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的聚乙二醇是聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇的平均分子量為3000～20,000。
4.按權利要求1所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的抗腫瘤藥物是具有可與PEG衍生物一端氨基、巰基、醛基、磺酸基或羧基共價結合的帶有羧基、氨基、巰基的抗腫瘤藥物或帶有羧基、氨基或巰基的蛋白質多肽類抗腫瘤藥物。
5.按權利要求4所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的所述的帶有羧基、氨基或巰基的蛋白質多肽類抗腫瘤藥物選自腫瘤壞死因子-α、核糖核酸酶、幹擾素類或白介素類。
6.按權利要求1或3所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的聚乙二醇末端一個羥基被氨基、巰基、醛基、磺酸基或羧基取代，或被N-羥基琥珀醯亞胺酯衍生化後再與抗腫瘤藥物的羧基、氨基或巰基共價結合，另一端羥基被馬來酸亞胺基團、氨基或乙烯磺酸基功能性基團取代後再與轉鐵蛋白共價結合。
7.按權利要求1述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的轉鐵蛋白是具有可與PEG一端馬來酸亞胺基團、氨基或乙烯磺酸基共價結合的帶有巰基、醛基、氨基或羧基的轉鐵蛋白或轉鐵蛋白衍生物。
8.按權利要求3所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇的平均分子量為3000～10,000。
9.按權利要求3所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇的平均分子量為3400。
10.按權利要求3所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇的平均分子量為5000。
11.按權利要求3所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的聚乙二醇末端一個羥基被N-羥基琥珀醯亞胺酯取代後再與抗腫瘤藥物的氨基共價結合，另一端羥基被馬來酸亞胺基團取代後再與轉鐵蛋白衍生物共價結合。
12.按權利要求7所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的轉鐵蛋白衍生物是巰基化轉鐵蛋白。
13.按權利要求1或3所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的聚乙二醇末端一個羥基被N-羥基琥珀醯亞胺酯取代後再與抗腫瘤藥物的氨基共價結合，另一端羥基被氨基取代後再與轉鐵蛋白共價結合
14.按權利要求12所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物，其特徵在於所述的轉鐵蛋白衍生物是轉鐵蛋白糖鏈上的羥基被氧化成醛基的轉鐵蛋白。
15.權利要求1的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物在製備腫瘤靶向治療藥物中的用途。
16.一種用於腫瘤靶向治療的藥物組合，其特徵在於由權利要求1所述的轉鐵蛋白-聚乙二醇-藥物分子複合物和藥用輔料混合製成，其製劑為水針劑和/或凍乾粉針劑。
17.按權利要求16所述的用於腫瘤靶向治療的藥物組合，其特徵在於所述藥物輔料是藥劑學上允許的賦形劑、pH調節劑和滲透壓調節劑。
全文摘要
本發明屬化學製藥領域，具體涉及轉鐵蛋白－聚乙二醇－藥物分子複合物及其在腫瘤靶向治療中的應用。本發明採用轉鐵蛋白為主動靶向配體，與PEG化藥物共價結合成轉鐵蛋白－聚乙二醇－藥物分子複合物，具有主動靶向與被動靶向的雙重功能。體外實驗結果表明能與腫瘤細胞表面轉鐵蛋白受體特異性結合，競爭轉鐵蛋白受體；體內實驗結果表明，比原藥及PEG化藥物，血漿半衰期長，在腫瘤組織中的蓄積程度高，腫瘤抑瘤率顯著高。本發明可進一步製備抗腫瘤藥物產品，為臨床提供腫瘤靶向治療。
文檔編號C07K17/08GK1911447SQ20061002850
公開日2007年2月14日 申請日期2006年6月30日 優先權日2006年6月30日
發明者姜嫣嫣, 裴元英, 柳晨, 洪鳴凰, 朱賽傑, 孔淑儀 申請人:復旦大學