用雙鏈rna抑制鑑定基因功能的製作方法

2023-05-22 06:53:06

專利名稱：用雙鏈rna抑制鑑定基因功能的製作方法
技術領域：
本發明為分案申請，原申請的申請號為200510052742.X，申請日為1999年7月2日，發明名稱為「用雙鏈RNA抑制鑑定基因功能」。
本發明涉及採用雙鏈RNA抑制(dsRNAi)來特徵鑑定或鑑定基因的功能，涉及鑑定負責在細胞中誘導特定表型的DNA的方法以及將功能確定到已知基因序列的方法。
最近，在Nature第391卷，第806-811頁(1998年2月)中已經描述了將雙鏈RNA引入到細胞中，導致有效且特異性地幹擾細胞中內源基因的表達，並且這種幹擾比在反義技術中提出的單獨提供任一RNA鏈要有效得多。也發現當將所述RNA引入到線蟲Caenorhabditis elegans(C.celegans)蠕蟲基因組或體腔中時，在這種蠕蟲中存在該基因活性的這種特異性降低。
本發明人已經利用了這種技術，並應用其進一步設計新的發明方法，以將功能確定至已經在各種計劃諸如人類基因組計劃中測序、並且還給予了一種特定功能的基因或DNA片段上，並且將其用於鑑定負責賦予特定表型的DNA。
因此，按照本發明的第一個方面，提供一種鑑定負責在細胞中賦予表型的DNA的方法，所述方法包括a)以相應於啟動子的方向，構建所述細胞DNA的cNDA文庫或基因組文庫，使得在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時能夠促進從所述cDNA或DNA轉錄出雙鏈(ds)RNA，b)將所述文庫引入到包含所述轉錄因子的一種或多種所述細胞中，且c)鑑定並分離包含所述文庫的所需表型的所述細胞，並鑑定所述文庫中負責賦予所述表型的DNA或cDNA片段。
在本發明的一個優選實施方案中，在步驟b)之前，可以將所述文庫組成為如在所提供的實施例中更詳細描述的等級庫，以致包括例如基因家族。
按照本發明的再一方面，也提供一種將功能確定到已知DNA序列的方法，所述方法包括a)鑑定細胞中所述DNA的同源物，b)從所述細胞中分離出相關的DNA同源物或其片段，c)以相應於合適的轉錄因子結合於啟動子時能夠促進dsRNA轉錄的啟動子的方向，將所述同源物或片段克隆到合適的載體中，d)將所述載體引入到得自步驟a)的包含所述轉錄因子的所述細胞中，以及e)鑑定與野生型相比所述細胞的表型。
在本發明的每一方面，均可以以相應於具有以上所定義特性的單個啟動子的有義和反義方向提供所述核苷酸序列或DNA序列，或者可選擇地，可以在兩個相同啟動子之間提供所述核苷酸序列或DNA序列。在這兩個實施方案中，在啟動子結合其合適的轉錄因子後，由所述啟動子啟動的轉錄提供dsRNA。
按照本發明的細胞可以得自一種生物或包含於一種生物中。在所述細胞包含於一種生物中的場合下，可以改變所述生物以表達合適的轉錄因子。所述生物可以為植物、動物、真菌或酵母中的任何一種，但最好可以是線蟲蠕蟲C.elegans，它可以是C.elegans野生型、nuc-1或pha-ts突變體中的任何一種或所述突變的組合。在一個替代實施方案中，可以便利地將所述DNA或cDNA文庫或所述DNA同源物或其片段轉染或轉化到可以飼餵給所述生物的微生物中，諸如細菌或酵母細胞，所述生物最好是線蟲蠕蟲C.elegans。在本發明的該實施方案中，可以將所述微生物改變以表達所述合適的轉錄因子。所述微生物最好是大腸桿菌。
在本發明的每個方面，可以在包含編碼所述轉錄因子的核苷酸序列的合適的DNA載體中，構建所述DNA文庫、DNA同源物或DNA片段。或者，可以由另一載體編碼所述轉錄因子。在再一替代方法中，所述細胞或生物可以表達所述轉錄因子，或者可以將其改變以表達所述轉錄因子。最好是，用於按照本發明的方法中的任一所述載體包含一種選擇標記，可以例如為編碼sup-35或其片段的核苷酸序列。可以將所述核苷酸序列相應於啟動子定向，以致轉錄因子結合至所述啟動子而啟動從所述DNA轉錄出雙鏈RNA。

圖10圖解了使得在C.elegans中能夠產生雙鏈RNA的載體和DNA序列的方向。因此，在一個實施方案中，所述DNA位於載體上的兩個啟動子之間，當合適的轉錄因子結合於所述啟動子時，所述載體能夠表達dsRNA。或者，所述載體包含兩個拷貝的所述DNA序列，所述兩個拷貝以相應於所述啟動子的有義和反義方向組織，而且當所述標記包含於pha-1突變C.elegans中時，所述標記為可選擇的。所述啟動子最好是T7、T3或SP6啟動子中的任一種，所述轉錄因子包括所述合適的聚合酶。
所述選擇標記最好包含能夠在所述細胞中抑制或防止基因表達的核苷酸序列，而且所述基因負責賦予已知的表型。該核苷酸序列可以是賦予所述表型的所述基因的一部分，或與所述基因相同，而所述核苷酸序列本身的定向與在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時能夠啟動雙鏈RNA轉錄的合適啟動子的定向相應。或者，所述核苷酸序列可以是賦予所述表型的所述基因序列的一部分，或與所述基因序列相同，而所述核苷酸序列是這樣的序列，以致允許所述合適的載體或另一載體通過同源重組整合到所述細胞的基因組中，並且在所述整合後，所述核苷酸序列能夠抑制賦予所述表型的所述基因序列的表達。在該實施方案中，所述核苷酸序列包含足以防止所述核苷酸序列在其整合到所述基因組中之後進行翻譯的終止密碼子。
有利地是，在所述方法中，可以將化合物加到所述細胞上或生物中，以便篩選所需表型，諸如當與野生型相比時，具有對該化合物的抗性或敏感性。所述啟動子最好是誘導型的。在某些實施方案中，所述轉錄因子可以得自噬菌體，諸如為由噬菌體啟動子驅動的T7聚合酶。然而，當利用C.elegan時，可以使用蠕蟲特異性或組織特異性啟動子，例如Let858、SERCA、UL6、myo-2或myo-3。所述大腸桿菌菌株最好是RNA酶III陰性菌株，甚至更優選為RNA酶陰性菌株。
本發明的再一方面提供一種產生包含一種外源轉錄因子和一種轉基因的非人類轉基因生物的方法，其中所述轉基因包含一個有效連接至DNA片段的啟動子，當所述轉錄因子結合於所述啟動子時表達所述DNA片段；所述方法包括a)提供包含第一構成物的第一轉基因生物和包含第二構成物的第二轉基因生物，所述第一構成物摻入了編碼外源轉錄因子的DNA，而所述第二構成物包括至少一個有效連接至所需DNA序列的啟動子，在所述第一轉基因生物的轉錄因子結合於所述啟動子時，表達所述所需DNA序列，b)將所述第一轉基因生物與所述第二轉基因生物雜交，並選擇表達所述所需DNA序列的後代。在一個實施方案中，通過將所述第一和第二構成物轉化到相應的微生物中，隨後用所述微生物飼餵所述相應的生物，產生所述第一和第二轉基因生物。最好是，所述第二構成物包含所述所需DNA序列，所述所需DNA序列相應於所述啟動子的方向，使得當所述轉錄因子結合於所述啟動子時，能夠啟動從所述DNA轉錄出dsRNA。在該實施方案中，所述第二構成物包含兩個鄰接所述所需DNA序列的啟動子，所述啟動子在所述轉錄因子與其結合時，可以啟動從所述DNA序列轉錄出dsRNA。或者，以相應於所述啟動子的有義和反義的方向提供所述DNA序列，使得可以在所述轉錄因子結合於所述啟動子時產生dsRNA。在這些實施方案中的每一個中，可能最好為所述第一構成物和/或第二構成物提供一個有效連接至啟動子的報導基因，所述啟動子在所述轉錄因子與其結合時能夠啟動所述報導基因的轉錄。最好是，所述報導基因編碼螢光素酶、綠螢光蛋白、β半乳糖苷酶或β-內醯胺酶中的任一個。
本發明也包括在酵母雙雜種載體實驗中所鑑定的克隆的驗證方法，所述實驗是本領域技術人員眾所周知的，並且所述實驗由Chien等(1991)首先提出，用於探測蛋白-蛋白相互作用。按照本發明的方法包括提供一種構成物，所述構成物包含在雙雜種載體實驗中所鑑定的蛋白的編碼DNA，所述構成物使得以相應於一個或多個啟動子的方向提供所述DNA，所述啟動子在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時，能夠促進從所述DNA轉錄出雙鏈RNA；用所述構成物轉化諸如細菌細胞的細胞，或者轉化包含所述轉錄因子的生物；並且與野生型相比，鑑定在所述細胞或生物中的表型變化，所述生物可以是C.elegan或諸如此類的生物。最好是，所述轉錄因子在所述細胞或生物中為可誘導的。如上所述，可以再一次將所述DNA序列定位於兩種啟動子之間，或以相對於單一啟動子的有義和反義兩個方向定位。最好是，所述啟動子為噬菌體聚合酶啟動子，而所述轉錄因子為RNA聚合酶，最好是T7聚合酶。本發明的範圍也包括用於轉化所述細胞或生物的載體以及所述細胞或生物本身。
在本發明的再一方面，提供減輕植物害蟲侵染的方法，所述方法包括a)從所述害蟲中鑑定出或者對於其生存、生長、增殖或者對於其生殖重要的DNA序列，b)在合適的載體中，以相對於一個或多個啟動子的方向克隆得自步驟a)的所述序列或其片段，所述啟動子在合適的轉錄因子與其結合時能夠從所述序列轉錄出RNA或dsRNA，並且c)將所述載體引入到所述植物中。
因此，有利的是，按照本發明的方法提供一種特別具有選擇性的機制，用於減輕害蟲侵染，而且在某些情況下用於減輕植物寄生蟲侵染，使得當所述害蟲在所述植物上攝食時，它將攝入植物中所表達的dsRNA，因此抑制對於害蟲生長、生存、增殖或生殖重要的DNA在害蟲中的表達。在一個優選實施方案中，所述害蟲可以為小墊刃線蟲屬物種(Tylenchulus ssp.)、穿孔線蟲屬物種(Radopholus ssp.)、細杆滑刃線蟲屬物種(Rhadinaphelenchus ssp.)、異皮線蟲屬物種(Heteroderassp.)、小盤旋線蟲屬物種(Rotylenchulus，ssp.)、短體線蟲屬物種(Pratylenchus ssp.)、刺線蟲屬物種(Belonolaimus ssp.)、Canjanus ssp.、根結線蟲屬物種(Meloidogyne ssp.)、球異皮線蟲屬物種(Globoderassp.)、科布線蟲屬物種(Nacobbus ssp.)、莖線蟲屬物種(Ditylenchusssp.)、滑刃線蟲屬物種(Aphelenchoides ssp.)、潛根線蟲屬物種(Hirschmenniella ssp.)、鰻線蟲屬物種(Anguina ssp.)、紐帶線蟲屬物種(Hoplolaimus ssp.)、螺旋線蟲屬物種(Heliotylenchus ssp.)、小環線蟲屬物種(Criconemella ssp.)、劍線蟲屬物種(Xiphinema ssp.)、長針線蟲屬物種(Longidorus ssp.)、毛刺線蟲屬物種(Trichodorus ssp.)、副毛刺線蟲屬物種(Paratriehodorus ssp.)、真滑刃線蟲屬物種(Aphelenchs ssp.)中的任何一種。可以將按照本發明該方面的DNA序列或其片段克隆在兩個組織特異性啟動子之間，諸如在兩個根特異性啟動子之間。
本發明的再一方面涉及用於本發明每個方法中用於構建所述文庫的載體，所述載體包含兩個相同的啟動子，所述啟動子的定向使得在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時，所述啟動子能夠啟動從位於所述啟動子之間的DNA序列轉錄出dsRNA。所述DNA序列可以例如包括一個多克隆位點。最好是，所述表達載體包含一段編碼選擇標記的核苷酸序列。在一個實施方案中，編碼所述選擇標記的所述核苷酸序列位於兩個相同的啟動子之間，所述啟動子的定向使得在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時，所述啟動子能夠啟動從位於所述啟動子之間的DNA轉錄出雙鏈RNA。為了引入到具有pha-1突變的C.elegans中，所述選擇標記最好包含一段編碼sup-35的核苷酸序列。
最好是，所述轉錄因子或者包括一個結合於其相應啟動子的噬菌體聚合酶，或者包括一個C.elegans特異性啟動子，甚至更優選T7聚合酶。最好是，所述載體包含一個在所述相同的啟動子之間的多克隆位點。
在本發明的再一方面，提供一種表達載體，用於表這供按照本發明方法使用的合適的轉錄因子，所述載體包含一段有效連接至合適的表達控制序列的、編碼所述轉錄因子的核苷酸序列。所述表達控制序列最好包括啟動子，所述啟動子為誘導型啟動子、組成型啟動子、普遍性啟動子或組織特異性啟動子或它們的組合。最好是所述轉錄因子包括噬菌體聚合酶，最好為T7、T3或SP6的RNA聚合酶。
本發明的再一方面提供一個選擇系統，用於鑑定用按照本發明的載體對細胞或生物的轉化，所述系統包括一個按照本發明的載體，其中所述選擇標記包括一段在所述細胞或生物中能夠抑制或防止負責賦予已知表型的基因表達的核苷酸序列。所述核苷酸序列最好對應於賦予所述已知表型的所述基因的一部分，或與所述基因相同，而且所述核苷酸序列本身位於兩個相同啟動子之間，所述啟動子在合適的轉錄因子與其結合時，能夠啟動雙鏈RNA的轉錄。或者，所述核苷酸序列包含的一段核苷酸序列是賦予所述細胞或生物已知表型的所述基因序列的一部分，或與所述基因相同，並且使得在所述載體通過同源重組而整合到所述細胞或生物的染色體中之後，所述序列抑制賦予所述已知表型的所述基因序列的表達。最好是，按照該實施方案，所述核苷酸序列包含足以防止所述核苷酸序列在整合到所述染色體之後進行翻譯的終止密碼子。所述已知基因序列最好包含可選擇的sup-35基因或其片段，可通過鑑定將其引入到pha-1 et123ts突變型C.elegans蠕蟲中之後於高於25℃的溫度下生長的後代，可選擇出該基因或片段。
在本發明的再一方面，提供所述已知基因的序列，所述序列包括通過鑑定將所述載體引入到pha-1 et123ts突變型C.elegans蠕蟲中之後後代在高於25℃的溫度下生長可選擇出的sup-35基因或其片段。又一個方面包括將功能確定至多細胞生物的DNA序列的方法，所述方法包括a)在能夠從所述啟動子啟動子轉錄的多細胞生物中，提供i)構成物，所述構成物包含在所述多細胞生物中能夠促進轉錄的兩個啟動子之間克隆的所述DNA片段；b)與野生型相比，鑑定所述多細胞生物的表型。
參考附圖，通過以下僅為示例性的實施例，可以更清楚地理解本發明，在附圖中圖1是按照本發明的質粒PGN1的核苷酸序列。
圖2是按照本發明的質粒PGN100的核苷酸序列。
圖3是按照本發明的方法中使用的質粒和轉化方案的示意圖。
圖4是按照本發明使用的表達載體的說明。
圖5是用於轉化C.elegans的T7 RNA聚合酶表達載體的示意圖。
圖6是質粒PGN1的圖解。
圖7是用於dsRBA抑制、編碼sup-35dsRNA的增強載體的圖示說明。
圖8是用於整合到C.elegans基因組中的載體的說明。
圖9是相對於從所述DNA序列啟動dsRNA表達的合適啟動子的DNA序列位置的說明。
圖10是質粒pGN108的說明。
圖11是質粒pGN105的說明。
圖12是質粒pGN400的說明。
圖13是質粒pGN401的說明。
圖14是質粒pGN110的說明。
圖15是具有正向和反向T7/T3/SP6啟動子的質粒pAS2的說明。
圖16是具有正向和反向T7/T3/SP6啟動子的質粒pGAD424的說明。
圖17是質粒pAS2-cyh2-HA+both T7-final的說明。
圖18為質粒pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7的說明。
圖19(a)為質粒pGN205的說明，而(b)為質粒pGN207的說明。
實施例A有序等級匯集的cDNA文庫的構建及其應用隨機有序和匯集的文庫所述載體為一種大腸桿菌載體，帶有兩個T7啟動子，在所述兩個啟動子之間有一個多克隆位點(MCS)。所述兩個啟動子彼此相對地定向並朝向所述MCS定向。在存在在大腸桿菌、C.elegans或任何其它生物中表達的T7 RNA聚合酶的情況下，將從所述兩個T7啟動子開始，產生RNA。由於這些啟動子以相反的方向定向，因此將從插入(或克隆)到位於所述兩個啟動子之間的MCS中的DNA，產生兩條RNA鏈，當T7 RNA聚合酶與啟動子結合時，導致產生雙鏈RNA(dsRNA)。
採用標準分子生物學技術，在所述MCS中構建了一個C.eleganscDNA文庫。將所述文庫轉化到大腸桿菌中，讓所產生的大腸桿菌在在培養基中生長並貯存在96孔多孔板中。在該階段，可以分離質粒DNA並將其對應於大腸桿菌菌落的96多孔板貯存在96孔多孔板中。記錄了大約100,000個菌落。以這種方式，該文庫將含有約5倍於總的表達的C.elegans cDNA變異的cDNA變異，這為低表達序列出現在該文庫中提供了機會。這將產生約1041塊96孔板。必要時將所述板進行等級匯集。目前，將所述克隆的匯集範圍安排在10-100個。如果按每8個或每12個進行等級匯集(因為96孔板具有8排12列，則這些數字更為方便)，則這產生大約87塊多孔板，大約8352個孔。如果按96孔即整個板進行等級匯集，則這產生約11塊板，大約1041個孔。在等級匯集的任一階段，均可以分離質粒DNA，當使用較少的板時，工作量可能較少，但將導致複雜度的降低，儘管在按12列匯集的條件下不應該是這種情況。也可以用所述原始DNA進行所述DNA的匯集。
以下實驗描述了應該如何對所述DNA文庫以及對大腸桿菌文庫進行等級匯集。
用於RNAi技術的、含有C.elegans基因組中每個基因的有序文庫及其應用由於基因組測序計劃即將進入尾聲，因而可以將這種信息用於T7RNA抑制技術的應用中。採用PCR技術，可以克隆C.elegans基因組的每個基因。優選克隆最小長度為500bp的外顯子。如果外顯子太小，則用PCR分離較小的片段，或甚至用PCR技術分離多個內含子的部分和相鄰的外顯子，使得至少克隆足夠部分的所述基因的翻譯區。為此，需要進行至少17000個PCR反應。將這種PCR產物的收集物克隆在所述T7載體(兩個T7啟動子彼此相對地定向，在其之間具有一個多克隆位點)中。獨立地克隆每種PCR產物，或可以用全部PCR產物產生類似於所述cDNA文庫的隨機文庫。如果單獨克隆每種PCR產物，則可以以不同方式匯集所產生的細菌和質粒DNA。首先，可以如在隨機文庫中所述，將這種分別在T7 RNAi載體中克隆的PCR產物的收集物隨機地匯集。也可以以更合理的方式進行這種匯集。例如，可以採用生物信息工具(載於silico biology)分析C.elegans基因組的基因。該基因組的不同基因將屬於一個基因家族，或在該基因組中具有同源物。匯集該基因家族的這些成員，或將為同源物的成員匯集。以這種方式，將約17000個克隆的總數降至更合用的量。在按照本發明的方法中可以用該文庫篩選表型。所產生的表型給出了對C.elegans基因組的所述基因或基因家族或基因同源物的功能描述。由於該文庫由該基因組中每個基因的一部分構成，因此該方法使得能夠用功能-表型術語描述整個基因組。為此，需要將雙鏈RNA(dsRNA)引入到所述蠕蟲中。可以以所述的幾種方式，完成這種單獨的克隆、或者隨機匯集或合理匯集的匯集克隆的引入。
用於表達雙鏈RNAi的載體的實例可以使用含有T7啟動子的任何載體，且所述載體含有一個多克隆位點(有許多市售的載體)。設計具有合適末端的含有T7啟動子的引物和具有合適末端的反向互補鏈的引物。可以將這些引物雜交，並且如果很好地設計，可以將其克隆在選擇的載體中。作為T7啟動子的最小序列為TAATACGACTCACTATAGGGCGA。儘管可以使用任何載體構建一個T7表達載體，但以下是用載體pGEM-3zf(-)如何完成這一過程的實例。
-用HindIII和SalI消化載體pGEM-3zf(+)(PROMEGA)。
-將引物oGN1和oGN2以1μg/30μl的終濃度混合在一起，將其煮沸並緩慢冷卻至室溫。
-採用標準連接程序將所述引物連接到該載體中。所產生的載體為pGN1(示於圖1)，它含有彼此相對地定向的兩個T7啟動子，兩個啟動子之間含有一個多克隆位點。
oGN1和oGN2的序列為-oGN1AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT-oGN2TCG AAA GCT TCT CGC ATA ATA GTG AGT CGT ATT AC文庫構建實施例從對RNAi敏感的每種生物中分離RNA。一般接著將分離的RNA拷貝為雙鏈cDNA，隨後在合適的載體中製備用於克隆。存在幾種方法，分子生物學試劑盒可以購自不同公司，包括promega，clontech，boehringer Mannheim、BRL等，所述試劑盒使得能夠-分離RNA，-最終可以分離polyA RNA(可利用幾種技術和試劑盒)-用AMV逆轉錄酶、隨機六聚引物和/或寡聚(dT)引物合成第一條鏈-用RNA酶H、DNA聚合酶I合成第二條鏈，-用T4 DNA聚合酶填平末端-用T4 DNA連接酶加入一個連接物-最後用T4多核苷酸激酶處理-將所述cDNA克隆到所述載體中。
所產生的連接混合物可以被認為是cDNA文庫。連接翻譯物含有連接到目的載體中的所有該步驟的cDNA。為了安排文庫，需要將該連接反應物轉化到大腸桿菌菌株中。
該大腸桿菌文庫或DNA文庫的應用產生T7 RNA的菌株-一種標準的菌株為BL21(DE3)F-ompT[lon]hsds(r-m-)；和大腸桿菌B菌株)λ(DE3)。最後可使用BL21(DE3)的變異體，儘管使用BL21(DE3)pLysS。
-需要構建可以利用的、產生T7 RNA聚合酶的任何其它大腸桿菌菌株。可以用市售的噬菌體容易地產生這種菌株，在這種情況下，使用λCE6載體(由Promega提供)。可以用該噬菌體轉染幾乎每種大腸桿菌，並將產生T7 RNA聚合酶。
-RNA酶III突變大腸桿菌原則上可利用各種菌株，我們選擇在第一個實驗中使用菌株AB301-105rna-19，suc-11，bio-3，gdhA2，his95，rnc-105，relA1，spoT1，metB1。(kinder等，1973 Mol.Gen.Genet 12653)，但其它菌株可能更適合。用λDE6感染該菌株，由此構建生產T7的變異體。
可以在細菌庫(bacteria pool)上培養野生型C.elegans蠕蟲。所述細菌正在表達T7 RNA聚合酶。這在C.elegans腸中產生大量的dsRNA，dsRNA將在這種生物中擴散，並導致抑制表達。現在可以用該文庫篩選幾種表型。這種技術的優點是與已知的C.elegans技術相比，它探測某些途徑中的相關基因要快得多。此外，如果發現一種感興趣的表型，則可以容易地克隆負責的基因。
採用等級匯集，人們可以容易地在第二次篩選中發現該庫的相關克隆。然後可以對該克隆的插入DNA進行測序。該實驗以一個步驟產生遺傳和生化的數據。
可以將野生型C.elegans株系與化合物混合，以根據表型、藥物抗性和或藥物敏感性進行篩選。所述C.elegans株系可以是突變型株系，根據增強的表型、減弱的表型或新表型篩選。所述C.elegans株系可以是一種突變株系，並且可以將所述文庫的篩選與化合物相結合。因此，人們可以篩選藥物抗性、藥物敏感性、增強的表型、減弱的表型或新表型。所述大腸桿菌菌株可以是表達T7 RNA聚合酶的任何菌株，例如像BL21(DE3)，但通過採用RNA酶III陰性的特殊大腸桿菌菌株，可以增強雙鏈RNA的形成。最後，可以使用非RNA酶III的RNA酶缺失的大腸桿菌，或可以使用一種或多種RNA酶缺失的大腸桿菌。T7 RNA聚合酶在大多數已知的大腸桿菌菌株和可用來產生生產T7 RNA聚合酶的大腸桿菌菌株的構成物中的表達，一般包括一個誘導型啟動子。以這種方式，調節T7 RNA聚合酶的產生，並由此產生所述dsRNA。最好是，可以用這一特徵來「脈衝式」飼餵特定生長階段的C.elegans蠕蟲。讓所述蠕蟲生長在非誘導的大腸桿菌菌株上。當所述蠕蟲長到目的階段時，在所述細菌中誘導產生T7 RNA。這使得可以在所述動物生活周期中的任何點研究任一基因的功能。篩選文庫中推定的目的人類基因的同源物並將功能確定至這些基因已經在各種計劃(為基因組計劃、差異表達排列、雜交研究等)中分離出數百個基因。所描述的cDNA文庫可以提供一種以快速有效的方式驗證功能和或將功能確定至這些基因的方法。首先，需要通過生物信息工具(載於silico biology)鑑定出該蠕蟲的一種或多種同源物或所述基因。研製出PCR引物，並用PCR技術分離所述cDNA片段。可以在等級庫上進行PCR。將含帶有合適cDNA的細菌的陽性庫或陽性孔的所述細菌飼餵C.elegans並記錄表型。
可以在從C.elegans中分離的cDNA上進行PCR。可將產生的DNA克隆到T7載體中，並轉化到所述生產dsRNA的大腸桿菌中，然後用該大腸桿菌飼餵C.elegans蠕蟲。需要根據哪種方式更快和更可靠而作出選擇。
如果該基因屬於一個基因家族，則可能需要用細菌混合物飼餵所述蠕蟲。細菌混合物中的每種細菌均含有該基因家族成員的一部分。可以如上所述使用大腸桿菌菌株、生長條件及進行與化合物的混合。
如果使用其中以組織和結構方式克隆C.elegans的所有基因的該文庫的合理形式，則可以用silico biology容易地在該文庫中追蹤回該基因家族的C.elegans同源物，並最終追蹤回該基因家族的其它同源物、orthologues和成員。在該步驟中不涉及PCR，可以分離用於養所述蠕蟲的細菌和或DNA。
實施例所述系列實驗的既測試所述RNAi載體和也測試構建的各種大腸桿菌菌株。
1)試驗質粒的構建可以使用當被失效或用於RNAi實驗中時在蠕蟲中產生清楚表型的任何cDNA。已知unc-22是一個良好的候選者，但可能其它基因也是可以的。我們選擇可以用於較晚階段的一個敏感型系統。用在pha-1背景中的sup-35測試該系統。通過PCR分離sup-35的外顯子5，並將其克隆到T7啟動子載體pGN1中。產生的載體被命名為pGN2。pha-1(e2123)突變型蠕蟲不能在高於25℃的溫度下產生後代。這是由於胚胎發生中的發育問題而引起的。當在該株系中sup-35被失效或抑制時，後代可以在該溫度下生長。pha-1突變型蠕蟲和sup-35 RNAi的組合是一個驗證各種可選擇之物的良好系統。
2)用產生dsRNA的大腸桿菌菌株測試所述RNAi-將pGN2引入大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，並用IPTG誘導T7RNA聚合酶。在該細菌上接種C.elegans蠕蟲(pha-1(e2123))，讓其在25℃限制溫度下生長。因為該突變體在該溫度下是胚胎突變體，所以將觀察不到後代。如果大腸桿菌中存在的sup-35dsRNA有效抑制sup-35基因，則將觀察到後代。
-將pGN2引入大腸桿菌AB301-105(DE3)中，並用IPTG誘導T7RNA聚合酶。在該細菌上接種C.elegans蠕蟲(pha-1(e2123))，讓其在25℃限制溫度下生長。因為該突變體在該溫度下是胚胎突變體，所以觀察不到後代。如果大腸桿菌中存在的sup-35dsRNA有效抑制sup-35基因，則將觀察到後代。
3)改良蠕蟲株系以更好地攝入dsRNA在將pha-1 C.elegans接種到產生雙鏈sup-35 RNA的大腸桿菌菌株平板上之前，用EMS(甲磺酸乙酯)誘變該蠕蟲。然後將誘變蠕蟲的後代接種到所述細菌平板上。攝食該細菌的蠕蟲產生較大的後代，所述後代具有導致dsRNA攝入改善的突變，可以將其用於進一步的實驗。
所述產生dsRNA的載體穩定地整合到產生T7 RNA聚合酶的蠕蟲的基因組中構建具有以下特徵的大腸桿菌載體彼此相對的兩個T7啟動子，在所述兩個啟動子之間具有一個限制位點或一個多克隆位點。此外，該載體可以含有C.elegans sup-35基因組DNA，對該載體的工程改造方式使得其在不同的間隔含有幾個終止密碼子，以致從sup35基因組DNA片段不可能表達出全長蛋白，如圖8所示。在所述兩個T7啟動子之間的多克隆位點中可以克隆任何cDNA或cDNA片段。如果將該載體引入到表達T7 RNA聚合酶的C.elegans株系中，則在所述兩個T7啟動子之間克隆的cDNA或cDNA片段將轉錄，並從所克隆的片段產生dsRNA。
設計該載體以用於表達T7 RNA聚合酶的pha-1(e2123)突變型蠕蟲中。T7 RNA聚合酶的表達可以是組成型的，或可以被調節，可以是普遍性的或是組織特異性的。這些pha-1(e2123)蠕蟲在高於25℃的溫度下不能產生後代，這是由於胚胎發生中的發育問題引起的。當在該株系中sup-35被失效或抑制時，後代可以在該溫度下生長。
如果將該載體引入到所述蠕蟲中，則該載體可以通過同源重組而整合(Campbell樣整合)。已經表明，在C.elegans中發生同源重組，儘管其頻率低(Plasterk和Groenen，EMBO J.11287-290，1992)。與sup-35基因的同源重組將導致該基因的失效，因為所產生的兩個sup-35基因將含有終止密碼子。如果這種重組發生在卵中，則所產生的蠕蟲及其後代將具有一個拷貝的整合到基因組中的所述載體。可以將其選擇出來，因為僅有sup-35已經被失效的蠕蟲在高於25℃的溫度下具有後代。此外，所產生的蠕蟲將穩定地從所述兩個T7啟動子之間的克隆的DNA片段產生雙鏈RNA。這種蠕蟲現在可以被認為是基因功能減低的穩定的轉基因蠕蟲株系，而所述基因是所述兩個T7啟動子之間所克隆片段所屬的基因。
可以通過幾種技術將所述DNA傳遞至蠕蟲，所述技術包括注射、彈道轉化(ballistic transformation)、浸泡在所述DNA溶液中、飼餵所述細菌。可以考慮提高轉化率的新方法和其它方法。
另外，C.elegans靶株系可以具有除pha-1(e2123)突變以外的其它突變，並且可以表達除T7 RNA聚合酶以外的其它基因。
實施例B酵母雙雜種-RNAi載體可以構建含有所述兩個T7啟動子的酵母雙雜種載體。所述載體可被設計為既在酵母中複製，又在大腸桿菌中複製。一般而言，可以在Ga14或LexA載體中製備適合於所述酵母雙雜種系統的cDNA文庫。在具有這些基因中的一個基因的激活域的載體中構建該文庫。可以構建一種載體，該載體在酵母雙雜種篩選中仍可以執行功能，但它也含有兩個彼此相對定向的T7啟動子，並且在所述兩個啟動子之間具有一個克隆位點。在該質粒中所述序列的順序則將為「質粒骨架、(GAL4-T7)、MCS、T7、骨架」。在實驗中在該載體中構建的C.elegans cDNA文庫可以用作標準酵母雙雜種文庫，以分離與給定蛋白相互作用的蛋白。一旦分離出克隆，則可以將該質粒引入到表達T7RNA聚合酶的大腸桿菌菌株中，並因此將產生所克隆片段的dsRNA。可以將產生該dsRNA的細菌飼餵所述蠕蟲，並可記錄表型。如先前的實施例中，這種對於新分離的酵母雙雜種克隆的驗證方法明顯比標準方法省時，標準方法需要PCR步驟和/或克隆步驟、RNA實驗和/或失效實驗。在大多數情況下，首先對分離出的克隆測序，在該序列的基礎上，作出繼續進行進一步的實驗的決定。在本發明中，可以容易地將每個分離出的克隆引入到合適的大腸桿菌中並將其飼餵所述蠕蟲。然後通過表型分析進行驗證。
為了應用該方法，用一個已知基因作餌，用新構建的文庫作為靶，使用酵母雙雜種。在所述靶中，由所述克隆編碼的與餌蛋白相互作用的蛋白，將產生表達報導分子的陽性酵母克隆，所述報導分子諸如可以通過用X-gal的LacZ染色觀察到的報導分子。直接從該酵母菌株中分離出編碼靶蛋白的質粒，並將其引入到大腸桿菌中。該大腸桿菌為產生T7 RNA聚合酶的大腸桿菌。在這種情況下，從克隆在該載體的多克隆位點中的DNA產生雙鏈RNA。如果用前述方法將該dsRNA飼餵所述蠕蟲，則所述基因在蠕蟲中被抑制，產生特定表型。
-這種酵母雙雜種載體可以有利地用來構建一個先前實施例中所述的有序且等級匯集的文庫。
-也可以構建一種有條件地產生T7 RNA聚合酶的酵母菌株。在酵母雙雜種實驗後，可以誘導所述T7聚合酶的表達，導致在酵母細胞中產生dsRNA。因此，可以將該酵母飼餵蠕蟲。可得到的證明表明，C.elegans蠕蟲可以攝食酵母。
產生T7 RNA聚合酶的菌株的構建及其應用可以構建表達T7 RNA聚合酶的C.elegans株系。表達可以是普遍的和組成型的，但也可以在一個組織特異性啟動子、誘導型啟動子或瞬時啟動子或含有這些特徵之一或特徵組合的啟動子之下而被調節。可以將DNA引入到該C.elegans株系中。這種引入或者通過注射、用粒子射擊、電穿孔進行，或者如上所述通過攝食進行。如果所述DNA為前述實施例中描述的質粒，即在兩個側翼T7啟動子之間具有所克隆cDNA片段或PCR片段的質粒，則在所述細胞或整個生物中形成該cDNA或PCR片段的dsRNA，導致向下調節相應的基因。所引入的DNA可以具有有效的瞬時向下調節作用。所引入的DNA可以形成染色體外布置(array)，所述布置可能導致更具催化性的功能表型的剔除或降低。該質粒也可能整合到所述生物的基因組中，導致同樣催化性的功能表型的剔除或降低，但這可被穩定地傳遞。
-如實施例A)和B)中所述，可以通過標準技術，將在兩個T7啟動子之間具有一個克隆的C.elegans cDNA或cDNA部分或EST或PCR片段的質粒引入到T7 RNA聚合酶蠕蟲中。可以分析表型-可以通過標準技術(注射、射擊)，將如同實施例A)中的、得自有序匯集文庫的DNA引入到T7 RNA聚合酶蠕蟲中。可以分離表型。用所述等級庫，可以容易地發現原始克隆。
-可以用表達T7 RNA聚合酶的突變蠕蟲完成同樣的步驟。篩選增強的、降低的或新的表型。
-可以使用能夠篩選化合物的方法。或者用野生型株系或者用突變株系篩選增強的表型或新表型。
-可以用新方法將所述DNA引入到蠕蟲中。其中一個方法是用大腸桿菌傳遞DNA。在這種情況下，用所述等級匯集文庫飼餵所述動物。為了防止所述大腸桿菌DNA在線蟲腸中被消化，優先使用DNA酶缺陷型C.elegans，例如nuc-1(e1392)。這種方法將的最令人感興趣的方法，因為它與其它技術的轉化效率無關，並且一般更快且工作量更少。
2)該方法推定的增強作用-設計一種載體，使其含有sup-35cDNA或該cDNA的一部分，將其克隆在兩個T7啟動子之間。該載體的其餘部分如實施例A)和B)中所述。可以將該載體引入到pha-1ts突變C.elegans中。在這種情況下存在一個溫度選擇系統，只有已經攝入所述DNA並表達雙鏈sup-35RNA的那些蠕蟲將在限制溫度下存活。可以通過上述任何方法傳遞所述等級匯集文庫。
-可以用該載體構建一個文庫，將所述載體引入到表達T7 RNA聚合酶的大腸桿菌中。在這種情況下，我們已經如部分A)中所述，類似地進行了篩選，並在sup-35的dsRNA有活性的場合下，對蠕蟲進行額外的篩選。
-可以在不同質粒上傳遞sup-35的DNA和或dsRNA。對於飼喂，即對於DNA飼餵(實施例C)和dsRNA飼餵實施例A)和B)，這意味著所述兩種質粒可以存在於一種細菌中，或意味著用細菌混合物飼餵蠕蟲，其中一種細菌含有sup-35構成物。
構建產生T7 RNA的C.elegans的實施例為了在所述蠕蟲中產生T7 RNA聚合酶，有幾種可能性。所述T7聚合酶可以在不同啟動子下表達，即在誘導型啟動子、組成型啟動子、普遍性啟動子和組織(細胞)特異性啟動子或它們的組合下表達。這些啟動子的實例是熱激啟動子hsp-6、腸啟動子ges1、得自cet858的啟動子，而且也有dpy7的啟動子和啟動子元件GATA1。在該實施例中，在pPD49.78載體中可利用的hsp-16啟動子控制下表達所述T7 RNA聚合酶。用GN3和GN4引物，分離作為PCR產物的T7 RNA聚合酶。
用NheI和NcoI消化所產生的PCR產物，同樣消化我們想用於克隆的載體，即Fire載體pPD49.78。所產生的載體為圖2中說明的pGN100，包括oGN3CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATCGC oGN4ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CGpGN100。
用標準技術例如微注射，將該載體引入到蠕蟲中。
然後構建以下株系-野生型(pGN100)-nuc-1(e1392)(pGN100)-pha-1(e2123)(pGN100)-pha-1；nuc-1(pGN100)當溫度誘導時，或者用金屬諸如應用重金屬鎘或汞時，所有這些株系均能夠產生T7 RNA聚合酶。溫度誘導方法是將動物轉移至30-33℃的溫度下達至少1小時，然後可將所述動物轉移回到標準溫度(15-25℃)下。
可以用產生T7 RNA聚合酶的野生型株系在所述蠕蟲中產生任何RNA。更具體地講，可以將得自所述文庫的質粒引入到這些蠕蟲中，並可記錄表型。
用nuc-1突變蠕蟲，通過餵給蠕蟲的細菌來引入DNA。因為nuc-1蠕蟲不消化所述DNA，所以所述質粒DNA可以穿過腸壁。如果所述DNA被產生T7 RNA聚合酶的細胞吸收，則將產生dsRNA，由此抑制轉錄出所述RNA的基因。
產生T7 RNA聚合酶的pha-1突變株系可以用來增強上述方法。可以通過射擊、微注射或攝食引入DNA。更具體地講，對於從sup-35和從目的基因產生dsRNA的載體，可以使用該株系，所述目的基因可以是PCR產物、cDNA或所述的文庫。
產生T7 RNA聚合酶的pha-1、nuc-1突變體可以用於所述DNA的細菌傳遞。DNA將優選為從sup-35和目的基因產生dsRNA的質粒。該蠕蟲株系將優先在腸中產生T7 RNA聚合酶。優選通過用帶有該質粒的細菌飼餵蠕蟲而發生傳遞。
RNAi技術在植物中的應用線蟲是使植物受到損害的一個很大原因，對於農業產業中使用的植物更尤其如此。可以將按照本發明的RNAi方法用於植物，以阻止這些寄生線蟲攝食更長時間。第一步，從寄生於植物的線蟲中分離出對於所述動物生存或生長或攝食或增殖重要的cDNA片段。必需表達的任何基因均適用於此目的。
克隆該基因、外顯子或cDNA的一部分。可以將該DNA片段克隆置於組織特異性啟動子的影響之下，所述啟動子優選根特異性啟動子，甚至更優選將該DNA片段克隆在兩個根特異性啟動子之間。可以用植物轉基因技術，將在根特異性啟動子控制下的所克隆基因的DNA引入目的植物中。對於每種寄生線蟲，可能需要不同片段的DNA，同樣，對於每個植物品種，將需要不同的啟動子。
當利用根特異性啟動子時，根將從引入的DNA片段產生RNA或dsRNA。因為線蟲在植物上攝食，故所述線蟲將消耗或攝入所述RNA和/或dsRNA。所述RNA和/或dsRNA可以進入線蟲的細胞，並對所述靶DNA發揮其抑制作用。根據所克隆的蠕蟲的DNA片段的性質，所述線蟲將不能存活、進食、增殖等，在所有情況下均阻止該動物在所述植物上更長久地攝食，並因此保護植物。
產生T7 RNA聚合酶的C.elegans的構建為了在動物中、更具體地講在線蟲中，更尤其在C.elegans中產生T7 RNA聚合酶或其它RNA聚合酶，可以設想幾種可能性。可以在各種啟動子下表達T7 RNA聚合酶。這些啟動子可以是誘導型啟動子、組成型啟動子、普遍性啟動子、組織特異性啟動子或它們的組合。
實施例1構建用於在C.elegans中表達T7聚合酶的基本載體用引物oGN26(ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG)和oGN46(CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC)，採用標準方法(PCR，A practical A practical approach，1993，J.McPherson等編輯，IRL Press)，從λCE6(Novagen，Madison，USA)經PCR擴增T7聚合酶的編碼序列。用AgeI和EcoRI消化所得的編碼T7 RNA聚合酶的DNA片段，並插入用AgeI和EcoRI消化的Fire載體pPD97.82中。所得的構成物編碼一個與SV40大T抗原核定位信號(NLS)融合的T7 RNA聚合酶的可讀框，其中NLS的胺基酸序列為MTAPKKKRKVPV。將T7RNA聚合酶從胞質轉運至細胞核需要這種核定位信號序列，在細胞核中T7 RNA聚合酶能夠結合於名為T7啟動子的其特異性啟動子上。T7聚合酶融合蛋白編碼序列的上遊為最小啟動子(myo-2)，在最小啟動。子之前為一個多克隆位點(MCS)，在其中可以插入幾個C.elegans啟動子。該質粒(示於圖11的pGN105)為基本T7 RNA聚合酶質粒，該質粒能夠在C.elegans中表達T7聚合酶。其中將啟動子克隆到該質粒多克隆位點中的該質粒衍生物，在C.elegans中可提供T7 RNA聚合酶的誘導型、組成型、普遍型和組織特異性表達，因為表達將受到在多克隆位點中所克隆的啟動子的調節。
儘管不限於這些實施例，但對於以下啟動子，已知它們在以下組織中誘導表達let-858(遍在表達)、myo-2(咽表達)、myo-3(體壁肌)、egl-15(陰戶肌)、unc-119(全身神經元)。
實施例2構建用於在C.elegans肌肉組織中表達T7 RNA聚合酶的載體用引物oGN43(GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC)和oGN44(CACTAGTGGGCCCTTACGCGAACGCGAAGTCCG)，從λCE6經PCR擴增T7 RNA聚合酶的編碼序列，用AgeI/SpeI消化，並插入用AgeI/SpeI消化的pGK13載體中。(該載體含有在咽、陰戶肌、尾部和體壁肌中驅動表達的強SERCA啟動子)。通過將兩個重疊寡核苷酸oGN45(CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT)和oGN46(CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC)插入SacI/AgeI限制位點中，將SV40大T抗原的核定位信號(NLS)插入T7聚合酶編碼序列之前。將所得的構成物稱為pGN108，如圖10所示。將該質粒引入到C.elegans中，導致T7RNA聚合酶在咽、陰戶肌、尾部和體壁肌中表達。
為了測試T7 RNA聚合酶在C.elegans中處於SERCA啟動子調節下的表達和功能性，將編碼在SERCA啟動子控制下的T7RNA聚合酶的pGN108注射到C.elegans中。共同注射一種試驗載體。該試驗載體編碼在T7啟動子控制下的GFP(圖13中的pGN401)。通過將兩個重疊的寡核苷酸oGN41(CCCGGGATTAATACGACTCACTATA)和oGN42(CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT)插入SacI/AgeI打開的Fire載體pPD97.82中，產生一個T7啟動子，來構建質粒pGN401。此外，共注射一種選擇標記以選擇轉化體(ro16，pRF4)。後一選擇載體pRF4是本領域技術人員眾所周知的。可以容易地分離出轉基因F1，因為它們表現出ro16表型。這些轉基因C.elegans均在咽、陰戶肌、尾部和體壁肌中表達GFP。該數據清楚地表明，T7 RNA聚合酶在SERCA啟動子調節下進行功能性表達，並且所表達的T7RNA聚合酶結合於pGN401中存在的T7啟動子，從而啟動GFP基因的轉錄，然後功能性地表達GFP，在SERCA正在誘導表達T7 RNA聚合酶的肌肉組織中產生螢光。
實施例3構建用於在C.elegans中遍在表達T7聚合酶的載體用XmaI/Bsp1201從pGN108中分離NLS-T7 RNA聚合酶融合基因，將其克隆到用XmaI/Bsp120I消化的Fire載體pPD103.05中。這產生一種載體，其中將T7 RNA聚合酶克隆在let858啟動子調節之下。這種特異性啟動子使得能夠在所有組織中表達T7 RNA聚合酶。將所得的質粒命名為pGN110(圖14)。
實施例4構建一種載體，用於經T7 RNA聚合酶介導在T7啟動子控制下表達DNA片段、基因和cDNA用SacI/AgeI消化Fire載體pPD97.82，通過將兩個重疊寡核苷酸oGN41(CCCGGGATTAATACGACTCACTATA)和oGN41(CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT)插入SacI/AgeI限制性內切核酸酶位點中，產生一個T7啟動子序列。該構成物(圖12中的pGN400)含有一個克隆在SacI和EcoRI限制性內切核酸酶位點之間的、在T7啟動子調節之下的GFP可讀框。通過缺失作為AgeI/SacI片段的GFP基因，並將目的DNA片段插入該載體中，可以在該載體中克隆任何基因、cDNA或DNA片段。優選可以通過PCR擴增獲得目的DNA片段，將其插入引物的SacI/AfeI位點中。將PCR擴增後所得的DNA片段消化，用擴增的DNA片段取代pGN400中的GFP基因。對於在C.elegans中由T7RNA聚合酶誘導的表達而言，可以使用含有T7啟動子的每種載體，所述載體諸如市售的pGEM載體和pBluescript載體。通過pGN401載體清楚地表明了這一點pGN401在表達T7 RNA聚合酶的轉基因C.elegans中，在T7啟動子調節下表達GFP。
應用pGN400的優點是該載體包括得自unc-54的3』UTR片段，該片段增強所述RNA的轉錄或穩定性。
永久性、組織特異性「假失效」RNAi C.elegans系的產生目前，在隨機大規模誘變和PCR鹼基同胞選擇後，獲得C.elegans中的基因失效。該方法工作量大、非常耗時並且煩瑣。已經描述了，將雙鏈RNA引入到細胞中導致內源基因表達的有效而特異性的幹擾。在C.elegans中，通過將RNA注射到該蠕蟲的體腔中、將蠕蟲浸泡在含dsRNA的溶液中，或飼餵表達對應於目的基因的dsRNA的大腸桿菌，可以向下調節基因的表達。C.elegans細胞具有從其胞外環境中攝入dsRNA的能力。已經報導mRNA是該ds RNA介導的遺傳幹擾的靶(Montgomery和Fire 1998)。也提示了，在可以發生翻譯之前，所述靶RNA在細胞核中被降解。雖然RNAi介導的基因表達的降低可以傳遞至下一代，但可遺傳性差，在更遠的後代期間該效應迅速喪失。這可能是由於dsRNA庫的持續減少。我們在這裡提出一種方法，來構建具有永久性的、可遺傳的RNAi表型的C.elegans系。該方法包括通過將含有義方向和反義方向靶基因cDNA片段的質粒引入並置於蠕蟲啟動子的控制之下，或通過從單一構成物轉錄反向重複的所述cDNA，產生轉基因C.elegans系。或者，可以在表達T7聚合酶的C.elegans株系中，從含有鄰接兩個T7啟動子的cDNA的載體轉錄dsRNA。結果是具有可遺傳的穩定的「假失效」表型的轉基因蠕蟲。所述cDNA或T7聚合酶的表達可以是普遍型的和組成型的，但也可以在組織特異性啟動子下而被調節。與通過外來ds RNAi(注射的、浸泡的或飼餵的)誘導的RNAi對比，該方法使人們能夠獲得基因表達的有條件的、組織特異性抑制。
通過RNA幹擾抑制unc-22表達導致「痙攣(twicthing)」表型將uno 22cDNA(外顯子22)以有義和反義方向克隆到pPD103.05中。(A.Fire nr L2865)含有能夠在所有組織中表達RNA序列的let 858啟動子。將所得的質粒命名為pGN205(圖19a)和pGN207(圖19b)。將這些構成物與一種選擇標記(rol-6；GFP)一起引入到C.elegans中。轉基因F1個體(表達rol-6或GFP)表現出「痙攣」表型，表明RNAi可以通過從轉基因DNA內源轉錄的RNA來介導。RNAi表型與所述選擇標記共分離到更遠的後代。這導致具有永久性RNAi表型的C.elegans系的產生。
穩定系T7 RNA聚合酶系的產生和雙轉基因蠕蟲的產生在C.elegans中基於外源RNA聚合酶的一種表達系統要求兩種質粒。一種質粒編碼在特異性啟動子控制之下的RNA聚合酶，而另一種質粒編碼在T7啟動子調節下表達的DNA片段。對於也稱為假穩定失效的半穩定RNAi而言，將目的DNA克隆到兩個T7啟動子之間，使得可以產生dsRNA。
因為已知T7 RNA聚合酶表達系統是一種高效表達系統，所以這將導致產生雙轉基因動物的問題。如果要在C.elegans線蟲中表達的基因有毒性，則這將導致致死效應，並因此導致在構建出的C.elegans中沒有目的基因的高度調節的穩定表達。如果目的基因對於所述生物的生存是必不可少的，則具有得自該基因的DNA片段的RNAi也將導致致死效應，使得不可能假穩定失效。
為了解決這一問題，本發明人已經設計出一種由兩種轉基因動物組成的系統。第一種動物為T7 RNA聚合酶的轉基因動物，正如前述實施例中所表明的，這種T7 RNA聚合酶可以在所有細胞或特定細胞或組織中表達。第二種轉基因動物是目的DNA片段的轉基因動物。這可以是連接於T7啟動子的基因或cDNA，或者如果人們想要進行RNAi，則它可以是克隆在兩個T7啟動子之間的這樣的基因的DNA片段。
這兩種轉基因動物均是活的，並且不表現出任何異常表型。這是因為在第一種轉基因生物中表達的T7 RNA聚合酶即使以相對高水平表達，也對該生物無毒性。在第二種轉基因生物中，不表達目的基因，或者不產生所述dsRNA，因為這些轉基因動物不含有T7 RNA聚合酶。
通過讓這兩種轉基因動物交配，可以獲得目的基因或目的cDNA的表達、或具有DNA片段的RNAi。這些轉基因動物的後代是雙轉基因動物，並且表達目的基因，或表達目的DNA片段的dsRNA。為了在這種交配中產生足夠的雄性動物，其中一種所述轉基因雄性動物可以是具有適於產生雄性的表型的C.elegans突變體。這樣一種突變體的實例是him-5。將優選用這樣一種突變體來產生T7 RNA聚合酶的轉基因C.elegans，而雌雄同體動物含有在T7啟動子調節下的所述DNA片段。
為了有效選擇所述雙轉基因後代，可以將一種第二轉基因引入到所述第二種轉基因動物中。這種轉基因含有一個在T7啟動子調節下的報導基因。所述報導基因可以是GFP、螢光素酶、β半乳糖苷酶或β-內醯胺酶。這種轉基因的實例是載體pGB400和pGN401。
為了在C.elegans中獲得轉基因的可誘導的組織特異性表達，我們可以產生這樣的雄性原種(即him-5)所述雄性原種(即him-5)攜帶使得能夠進行例如組織特異性表達的不同C.elegans啟動子控制下的T7聚合酶構成物。可以使這種雄性動物與攜帶在T7啟動子控制下的目的基因的雌雄同體交雜。
此外，可以將所述轉基因整合到動物的基因組中。已經描述了導致質粒穩定地整合到動物基因組中的方法(Methods in cell biology，第48卷，1995，epstein和Shakes編輯，Academic Press)，所述方法涉及對所述動物輻照。可以對兩種動物輻照，但優選對表達T7 RNA聚合酶的動物進行這種處理。這產生一群在不同啟動子控制下穩定表達T7RNA聚合酶的C.elegans線蟲，這樣的啟動子的實例是myo-2(咽表達)、myo-3(體壁肌)、dgl-15(陰戶肌)、unc-119(全身神經元)、SERCA(肌肉)、let858(所有細胞)、ges-1(腸)。
RNAi T7啟動子酵母雙雜種載體的構建具有正向和反向T7T3和或Sp6的pGAD424在大多數雙雜種實驗中，用已經進行工程改造的、在多接頭中具有額外限制位點(諸如Ncol位點)的質粒pGAD424(圖16)(Clontech)，克隆一個cDNA文庫。該文庫便於在酵母雙雜種實驗中篩選結合蛋白。我們構建了一種新的酵母雙雜種載體，該載體具有完成酵母雙雜種的同樣的可能性，但它含有兩個額外的T7啟動子，使得該載體可以用於T7 RNA聚合酶誘導的假穩定失效。為此，通過用一個T7接頭(由以下引物aattcttaatacgactcactatagggcc和catgggccctatagtgagtcgtattaag構成)，我們將一個正向T7插入pGAD424的EcoRI-NcoI位點中。我們將所得的載體命名為pGAD424-without-FULL-ICE-both-T7。小心地去除終止密碼子並使用最大多接頭可匹配的胺基酸。對於反向T7(由兩種引物gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca和gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg構成)，我們採用同一策略並使用BamHl和Patl。為了避免喪失SalI，我們在所述引物中包括了這一位點。
所述SalI位點是重要的，因為大多數文庫均在該位點克隆，連接物也買得到。這使得新構建的載體與現有的載體相容。
具有正向和反向T7/T3和或Sp6的pAS2基於pAS2(Clontech)構建了一種類似的酵母雙雜種載體。通過用EcoRV部分消化，我們能夠去除cyh2基因相當大的部分。可以分離出正確的構成物，並通過用BglII限制消化進行檢查，該位點存在於被去除的PAS2的EcoRV片段中。這消除了略有毒性並涉及生長延遲的cyh2基因。該基因對於進行RNAi和酵母雙雜種實驗不是必不可少的。在消除EcoR片段後，位於編碼GAL4DB和HA(表位)的DNA序列之間的EcoRI限制位點成為該載體唯一的EcoRI限制位點，可以用來用含接頭的T7啟動子取代HA。這確保所有的限制位點存留，允許既符合讀框地克隆，也與先前的載體和pAD424相容。我們使用了以下接頭(引物aattcttaatacgactcactatagggca和tatgccctatagtgagtcgtattaag)，使用EcoRI和NdeI克隆位點。我們採用同一策略用於反向T7(引物gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcacatgggccctatagtgagtcgtattaag和gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg)，使用BamH1和Pst1。為了避免喪失Sal1，我們在所述引物中包括了該位點。將所得的載體命名為pAS2-cyh2-HA+both T7-final。
在PGAD424中具有T7啟動子(或者T3，或SP6啟動子)，使得可以很快地從相互作用蛋白轉變至RNAi，並將功能確定至所分離的DNA片段。另一優點是具有這樣一種能力，即能夠通過與體外翻譯偶聯的體外轉錄(有一個ATG或者GAL4DB或者GAL4AD的讀框符合)，製備可以用於體外控制(例如摧毀(pull down)測定)實際蛋白-蛋白相互作用的標記蛋白。
在以下提供的序列表中確定了所產生的質粒序列和SP6和T3聚合酶的序列。
SP6DNA依賴性RNA聚合酶 SEQENCE ID NO.1swissprot登錄號P06221蛋白序列1 mqdlhaiqlq leeemfnggi rrfeadqqrq iaagsesdta wnrrllseli apmaegiqay61 keeyegkkgr apralaflqc venevaayit mkvvmdmlnt datlgaiams vaeriedqvr121 fskleghaak yfekvkkslk asrtksyrha hnvavvaeks vaekdadfdr weawpketql181 gigttlleil egsvfyngep vfmramrtyg gktiyylqts esvggwisaf kehvaqlspa241 yapcvipprp wrtpfnggfh tekvasrirl vkgnrehvrk ltgkgmpkvy kainalqntq301 wginkdvlav ieevirldlg ygvpsfkpli dkenkpanpv pvefghlrgr elkemlspeq361 wqqfinwkge carlytaetk rgsksaavvr mvggarkysa fesiyfvyam dsrsrvyvqs421 stlspqsndl gkallrfteg rpvngvealk wfcinganlw gwdkktfdvr vsnvldeefg481 dmcrdiaadp ltftgwakad apyeflawcf eyaqyldlvd egradefrth lpvhgdgscs541 giqhysamlr devgakavnl kpsdapqdiy gavaqvvikk nalymdadda ttftsgsvtl601 sgtelramas awdsigitrs ltkkpvmtlp ygstrltcre svidyivdle ekeaqkavae661 gttankvhpf eddrqdyltp gaaynymtal iwpsisevvk apivamkmir qlarfaakrn721 eglmytlptg fileqkimat emlrvrtclm gdikmslqve tdivdeaamm gaaapnfvhg781 hdashliltv celvdkgvts iavihdsfgt hadntltlrv alkgqmvamy idgnalqkll841 eehevrwmvd tgievpeqge fdlneimdse yvfaT3DNA依賴性RNA聚合酶 SEQENCE ID NO.2swissprot登錄號P07659蛋白序列1 mniieniekn dfseielaai pfntladhyg salakeqlal ehesyelger rflkmlerga61 kageiadnaa akpllatllp klttrivewl eeyaskkgrk psayaplqll kpeasafitl121 kvilasltst nmttigaaag mlgkaiedea rfgrirdlea khfkkhveeq lnkrhggvyk181 kafmqvvead migrgllgge awsswdkett mhvgirliem liestglvel qrhnagnags241 dhealglaqe yvdvlakrag alagispmfg pcvvppkpwv aitgggywan grrplalvrt301 hskkglmrye dvympevyka vnlaqntawk inkkvlavvn eivnwkncpv adipslerqe361 lppkpddidt neaalkewkk aaagiyrldk arvsrrisle fmleqankfa skkaiwfpyn421 mdwrgrvyav pmfnpqgncm tkglltlakg kpigeegfyw lkihgancag vdkvpfperi481 afiekhvddi lacakdpinn twwaegdspf cflafcfeya gvthhglsyn cslplafdgs541 csgiqhfsam lrdevggrav nllpsetvqd iygivaqkvn eilkqdaing tpnemitvtd601 kdtgeisekl klgtstlaqg wlaygvtrsv tkrsvmtlay gskefgfrgg vlddtiqpai661 dsgkglmftg pngaagymak liwdavsvtv vaaveamnwl ksaakllaae vkdkktkeil721 rhrcavhwtt pdgfpvwqey rkplqkrldm iflgqfrlqp tintlkdsgi dahkqesgia781 pnfvhsqdgs hlrmtvvyah ekygiesfal ihdsfgtipa dagklfkavr etmvityenn841 dvladfysqf adqlhetqld kmpplpkkgn lnlqdilksd fafa
pGN108SEQUENCE ID NO.3gttgtcgtaaagagatgtttttattttactttacaccgggtcctctctctctgccagcacagctcagtgttggctgtgtgctcgggctcctgccaccggcggcctcatcttcttcttcttcttctctcctgctctcgcttatcacttcttcattcattcttattccttttcatcatcaaactagcattttcttactttatttatttttttcaattttcaattttcagataaaaccaaactacttgggttacagccgtcaacagatccccgggattggccaaaggacccaaaggtatgtttcgaatgatactaacataacatagaacattttcaggaggacccttgcttggagggtaccggatgactgctccaaagaagaagcgtaagctcatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctacccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgaccgcaagacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggttcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggacgtcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggtttcgtttcctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctgcaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagattcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatccgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgattcacgactccttcggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaagggcccactagtcggccgtacgggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtaactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggccttaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacggttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaacccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcaacgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaaagcggca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權利要求
1.負責在細胞中賦予特定表型的DNA的鑑定方法，所述方法包括a)以相應於啟動子、當合適的轉錄因子結合於所述啟動子時能夠啟動從所述cDNA或DNA轉錄出雙鏈(ds)RNA的方向，在合適的載體中構建所述細胞DNA的cDNA文庫或基因組文庫，b)將所述文庫引入包含所述轉錄因子的一種或多種所述細胞中，且c)鑑定和分離包含所述文庫的特定表型的所述細胞，並鑑定所述文庫中負責賦予所述表型的DNA或cDNA片段。
2.按照權利要求1的方法，其中在步驟b)之前，將所述文庫組成為等級庫。
3.將功能確定到已知DNA序列的方法，所述方法包括a)鑑定細胞中所述DNA序列的同源物，b)從所述細胞中分離出相關的DNA同源物或其片段，c)將所述同源物或其片段以相應於合適啟動子、當合適的轉錄因子結合於所述啟動子時能夠啟動從所述DNA同源物或其片段轉化dsRNA的方向，克隆到合適的載體中，d)將所述載體引入得自步驟a)的包含所述轉錄因子的所述細胞中，且e)鑑定與野生型相比的所述細胞的表型。
4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中將所述DNA文庫、同源物或片段以相應於所述啟動子的有義和反義的方向克隆。
5.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中將所述DNA文庫、同源物或片段克隆在兩個啟動子之間，使得當合適的轉錄因子結合於所述啟動子時能夠從所述DNA文庫、同源物或片段產生dsRNA。
6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其中所述細胞被改變以表達所述轉錄因子。
7.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中將所述DNA文庫、同源物或片段構建在合適的載體中，所述載體包含一段有效連接至合適啟動子的編碼所述轉錄因子的核苷酸序列。
8.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中所述轉錄因子由另一載體編碼，所述另一載體與包含所述DNA文庫、同源物或片段無關的載體，並且編碼所述轉錄因子的序列有效連接至合適的啟動子。
9.根據權利要求7或8的方法，其中所述轉錄因子包括T7、T3或SP6聚合酶中的任一種。
10.根據權利要求7或8的方法，其中所述合適的啟動子包括let858、SERCA、UL6、myo-2或myo-3中的任一種。
11.根據權利要求7-10中任一項的方法，其中所述合適的載體或所述另一載體包含一個選擇標記。
12.根據權利要求11的方法，其中所述選擇標記包含能夠抑制或防止基因在所述細胞中表達的核苷酸序列，而所述基因負責賦予一種已知表型。
13.根據權利要求12的方法，其中所述核苷酸序列包含的一段片列是賦予所述表型的所述基因的一部分，或與所述基因相同，而所述核苷酸序列本身的定向與在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時能夠啟動雙鏈RNA轉錄的合適啟動子相應。
14.根據權利要求12的方法，其中所述核苷酸序列是賦予所述表型的所述基因序列的一部分，或與所述基因序列相同，而所述核苷酸序列是這樣的序列，以致允許所述合適的載體或另一載體通過同源重組整合到所述細胞的基因組中，並且在所述整合後，所述核苷酸序列能夠抑制賦予所述表型的所述基因序列的表達。
15.根據權利要求14的方法，其中所述核苷酸序列包含足以防止所述核苷酸序列在其整合到所述基因組中之後進行翻譯的終止密碼子。
16.根據任一前述權利要求的方法，其中所述細胞為適合於飼餵、轉化或感染生物的微生物。
17.根據權利要求1-14中任一項的方法，其中所述細胞包含於生物或其胚胎中。
18.根據權利要求1-17中任一項的方法，其中所述啟動子為T7啟動子。
19.根據權利要求12-18中任一項的方法，其中所述已知基因序列包括sup-35基因或其片段，在將所述載體引入pha-1 et123ts突變C.elegans蠕蟲的基因座中之後，通過鑑定在高於25℃的溫度下生長的後代，可選擇出所述基因或其片段。
20.根據權利要求1-19中任一項的方法，其中使所述細胞或生物與用於篩選所需表型的所述化合物接觸，所述表型諸如當與野生型細胞或生物相比時對所述化合物的抗性或敏感性。
21.根據任一前述權利要求的方法，其中所述轉錄因子是可誘導的。
22.根據權利要求16的方法，其中所述微生物為RNA酶III陰性、且最好為RNA酶陰性的大腸桿菌菌株。
23.根據權利要求17的方法，其中所述生物選自線蟲綱。
24.根據權利要求23的方法，其中所述生物為Caenorhabditiselegans。
25.產生包含一種外源轉錄因子和一種轉基因的轉基因非人類生物的方法，其中所述轉基因包含一個有效連接至DNA片段的啟動子，當所述轉錄因子結合於啟動子時，表達所述DNA片段；所述方法包括a)提供包含第一構成物的第一轉基因生物和包含第二構成物的第二轉基因生物，所述第一構成物加入了編碼外源轉錄因子的DNA，而所述第二構成物包括至少一個有效連接至所需DNA序列的啟動子，在所述第一轉基因生物的所述轉錄因子結合於所述啟動子時，表達所需DNA序列。b)將所述第一轉基因生物與所述第二轉基因生物雜交，並選擇表達所述所需DNA序列的後代。
26.根據權利要求25的方法，其中通過將所述第一和第二構成物轉化到相應的微生物中，隨後用所述微生物飼餵所述相應的生物，來產生所述第一和第二轉基因生物。
27.根據權利要求25或26的方法，其中所述第二構成物包含所述所需DNA序列，所述所需DNA序列相應於所述啟動子的方向，使得可以當所述轉錄因子結合於所述啟動子時，能夠啟動從所述DNA轉錄出dsRNA。
28.根據權利要求27的方法，其中所述第二構成物包含兩個鄰接所述所需DNA序列的啟動子，所述啟動子在所述轉錄因子與其結合時，可以啟動從所述DNA序列轉錄出dsRNA。
29.根據權利要求27的方法，其中以相應於所述啟動子的有義和反義的方向提供所述DNA序列，使得在所述轉錄因子結合於所述啟動子時產生dsRNA。
30.根據權利要求25-29中任一項的方法，其中所述第二轉基因生物還包含一個有效連接至啟動子的報導基因，所述啟動子在所述轉錄因子與其結合時能夠啟動所述報導基因的轉錄。
31.根據權利要求25-30中任一項的方法，其中所述轉錄因子包括聚合酶。
32.根據權利要求31的方法，其中所述聚合酶包括T7、T3或SP6聚合酶中的任一種。
33.根據權利要求25-31中任一項的方法，其中所述啟動子包括T7、T3或SP6啟動子中的任一種。
34.根據權利要求30的方法，其中所述報導基因包括包括螢光素酶、綠螢光蛋白、β半乳糖苷酶或β-內醯胺酶的編碼序列中的任一種。
35.根據權利要求25-30中任一項的方法，其中所述生物為線蟲綱物種的生物。
36.根據權利要求35的方法，其中所述線蟲綱物種為C.elegans。
37.根據權利要求25-34中任一項的方法可獲得的轉基因非人類多細胞生物。
38.在酵母雙雜種載體實驗所鑑定的克隆的驗證方法，所述方法包括a)提供一種構成物，所述構成物包含在雙雜種載體實驗中所鑑定的蛋白的編碼DNA，所述構成物使得所述DNA以相應於一個或多個啟動子的方向定向，在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時，所述啟動子能夠啟動從所述DNA轉錄出雙鏈RNA，b)用所述構成物轉化包含所述轉錄因子的細胞，並且c)鑑定在所述細胞或生物中與野生型相比的表型變化。
39.根據權利要求38的方法，其中在兩個啟動子之間提供所述DNA序列，所述啟動子在所述轉錄因子結合於所述啟動子時，能夠啟動從所述DNA序列轉錄出dsRNA。
40.根據權利要求38的方法，其中以相應於所述啟動子的有義和反義的方向提供所述DNA，使得合適的轉錄因子與所述啟動子的結合，啟動從所述DNA轉錄出dsRNA。
41.根據權利要求38-40中任一項的方法，其中所述轉錄因子在所述細胞中是可誘導的。
42.根據權利要求38-41中任一項的方法，其中所述啟動子為噬菌體聚合酶啟動子，而所述轉錄因子為RNA聚合酶。
43.根據權利要求42的方法，其中所述聚合酶為T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶中的任一種。
44.根據權利要求43的方法，其中所述啟動子包括T7、T3或SP6啟動子中的任一種。
45.根據權利要求38-44中任一項的方法，其中所述構成物使得它可以用於酵母雙雜種實驗。
46.根據權利要求38-45中任一項的方法，其中所述細胞為大腸桿菌細胞。
47.根據權利要求38-45中任一項的方法，其中所述細胞為生物或其胚胎的一部分。
48.根據權利要求47的方法，其中所述生物為線蟲綱物種的生物，最好為C.elegans。
49.在圖1中圖解的質粒pGN1。
50.在圖2中圖解的質粒pGN100。
51.在圖4、15或16(Sequence ID No 8和9)的任一個中圖解的酵母雙雜種載體質粒。
52.在圖7中圖解的質粒。
53.在圖8中圖解的質粒。
54.減輕植物害蟲侵染的方法，所述方法包括a)從所述害蟲中鑑定出對其生存、生長、增殖重要的DNA序列，b)在合適的載體中，以相對於啟動子的方向克隆得自步驟a)的所述序列或其片段，所述啟動子在合適的轉錄因子與其結合時能夠啟動從所述DNA序列轉錄出RNA或dsRNA，並且c)將所述載體引入所述植物中。
55.根據權利要求54的方法，其中在兩個啟動子之間提供所述DNA序列，使得所述轉錄因子結合於所述啟動子，導致從所述DNA序列轉錄出dsRNA。
56.根據權利要求54的方法，其中以相應於所述啟動子的有義和反義的方向提供所述DNA，使得所述轉錄因子結合於所述啟動子，導致從所述DNA轉錄出dsRNA。
57.根據權利要求54的方法，其中所述害蟲為線蟲蠕蟲。
58.根據權利要求57的方法，其中所述線蟲包括小墊刃線蟲屬物種(Tylenchulus ssp.)、穿孔線蟲屬物種(Radopholus ssp.)、細杆滑刃線蟲屬物種(Rhadinaphelenchus ssp.)、異皮線蟲屬物種(Heterodera ssp.)、小盤旋線蟲屬物種(Rotylenchulus，ssp.)、短體線蟲屬物種(Pratylenchusssp.)、刺線蟲屬物種(Belonolaimus ssp.)、Canjanus ssp.、根結線蟲屬物種(Meloidogyne ssp.)、球異皮線蟲屬物種(Globodera ssp.)、科布線蟲屬物種(Nacobbus ssp.)、莖線蟲屬物種(Dity1enchus ssp.)、滑刃線蟲屬物種(Aphelenchoides ssp.)、潛根線蟲屬物種(Hirschmenniella ssp.)、鰻線蟲屬物種(Anguina ssp.)、紐帶線蟲屬物種(Hoplo1aimus ssp.)、螺旋線蟲屬物種(Heliotylenchus ssp.)、小環線蟲屬物種(Criconemella ssp.)、劍線蟲屬物種(Xiphinema ssp.)、長針線蟲屬物種(Longidorus ssp.)、毛刺線蟲屬物種(Trichodorus ssp.)、副毛刺線蟲屬物種(Paratrichodorus ssp.)、真滑刃線蟲屬物種(Aphelenchs ssp.)中的任一種。
59.根據權利要求55的方法，其中將所述DNA序列或其片段克隆在兩個組織特異性啟動子之間，最好是克隆在兩個根特異性啟動子之間。
60.用於按照任一前述權利要求的方法的表達載體，所述載體包含一個或多個啟動子，所述啟動子相對於DNA序列的定向使得在合適的轉錄因子結合於所述一個或多個啟動子時，所述啟動子能夠啟動從所述DNA序列轉錄出雙鏈RNA。
61.根據權利要求60的表達載體，其包含兩個鄰接所述DNA序列的相同的啟動子。
62.根據權利要求60的表達載體，其包含相對於所述啟動子為有義和反義方向的所述DNA。
63.根據權利要求60-62中任一項的表達載體，其還包含一段編碼選擇標記的核苷酸序列。
64.根據權利要求63的表達載體，其中將編碼所述選擇標記的所述核苷酸序列相對於所述啟動子的定向，使得在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時，發生從所述核苷酸序列轉錄出雙鏈RNA。
65.根據權利要求64的表達載體，其中在兩個相同的啟動子之間提供編碼所述選擇標記的所述核苷酸序列，所述啟動子在所述轉錄因子結合於所述啟動子時，能夠啟動從所述核苷酸序列轉錄出dsRNA。
66.根據權利要求64的表達載體，其中以相對於所述啟動子的有義和反義方向提供編碼所述選擇標記的所述核苷酸序列，使得在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時，從所述核苷酸序列轉錄出雙鏈RNA。
67.根據權利要求63或64的表達載體，其中所述選擇標記包含一段編碼sup-35的核苷酸序列，用於引入具有pha-1突變的C.elegans中。
68.表達載體，用於表達用於按照權利要求1-48和54-59中任一項的方法中的合適的轉錄因子，所述載體包含一段有效連接至合適的表達控制序列的、編碼所述轉錄因子的核苷酸序列。
69.根據權利要求68的表達載體，其中所述表達控制序列包括誘導型啟動子、組成型啟動子、普遍性啟動子或組織特異性啟動子或它們的組合。
70.根據權利要求68-69中任一項的表達載體，其中所述轉錄因子包括噬菌體聚合酶，最好是T7RNA聚合酶。
71.用根據權利要求49-53中任一項的質粒或用根據權利要求60-70中任一項的表達載體轉化或轉染的生物或細胞。
72.根據權利要求71的生物，其中所述生物為線蟲綱物種的生物，最好是C.elegans。
73.將dsRNA或將能夠產生dsRNA的DNA引入生物中的方法，所述方法包括用包含根據權利要求60-67中任一項的表達載體的合適微生物飼餵所述生物，或用根據權利要求60-67中任一項的表達載體直接飼餵所述生物。
74.根據權利要求73的方法，其中所述微生物或所述生物被改變以表達所述轉錄因子。
75.根據權利要求74的方法，其中或者所述微生物或者所述生物包含根據權利要求66-69中任一項的表達載體。
76.根據權利要求73-75中任一項的方法，其中所述生物為C.elegans，而所述微生物是大腸桿菌。
77.根據權利要求76的方法，其中所述大腸桿菌菌株為RNA酶III陰性菌株。
78.根據權利要求73-75中任一項的方法，其中所述生物為C.elegans nuc-1突變體。
79.選擇系統，用於鑑定用根據權利要求60-63的載體對細胞或生物的轉化，所述系統包括一個根據權利要求60-63的載體，而所述選擇標記包括一段在所述細胞或生物中能夠抑制或防止負責賦予已知表型的基因表達的核苷酸序列。
80.根據權利要求79的選擇系統，其中所述核苷酸序列包含的一段序列是賦予所述已知表型的所述基因的一部分，或與所述基因相同，而所述核苷酸序列本身位於兩個相同啟動子之間，所述啟動子在合適的轉錄因子結合於所述啟動子時，能夠啟動轉錄雙鏈RNA轉錄。
81.根據權利要求79的選擇系統，其中所述核苷酸序列是賦予所述細胞或生物已知表型的所述基因的一部分，或與所述基因相同，並且所述核苷酸序列允許所述載體通過同源重組整合到所述細胞或生物的染色體中，並且在所述整合後，所述序列抑制賦予所述已知表型的所述基因序列的表達。
82.根據權利要求81的選擇系統，其中所述核苷酸序列包含足以防止所述核苷酸序列在整合到所述基因組中後翻譯的終止密碼子。
83.根據權利要求79的選擇系統，其中所述已知基因序列包含sup-35基因或其片段，在將所述載體引入pha-1 et123ts突變型C.elegans蠕蟲中之後，通過鑑定在高於25℃的溫度下生長的後代，可選擇出所述基因或其片段。
84.根據權利要求74的方法，其中所述轉錄因子為T7 RNA聚合酶。
85.將功能確定到多細胞生物的DNA序列的方法，所述方法包括a)將以下構成物i)第一構成物，包含以有義方向克隆的、在合適的啟動子調節下的所述DNA序列，ii)第二構成物，包含以反義方向克隆的、在與步驟(i)中的相同啟動子調節下的所述DNA序列，提供到多細胞生物中，所述多細胞生物被改變以啟動從合適的啟動子轉錄所述DNA片段，b)鑑定與野生型相比的所述多細胞生物的表型。
86.將功能確定到給多細胞生物的DNA序列的方法，所述方法包括a)在多細胞生物中提供i)第一構成物，包含在兩個能夠在所述多細胞生物中啟動轉錄的啟動子之間克隆的所述DNA片段，所述多細胞生物能夠啟動從合適的啟動子轉錄所述DNA片段，b)鑑定與野生型相比的所述多細胞生物的表型。
87.在C.elegans中表達基因、cDNA或DNA片段的方法，所述方法包括i)提供表達外源轉錄因子的轉基因C.elegans，ii)將所述基因或cDNA或DNA片段克隆到合適的載體中，與在所述外源轉錄因子與啟動子結合時能夠啟動所述基因、cDNA或DNA片段轉錄的啟動子有效連接，iii)將所述載體引入得自步驟i)的所述轉基因C.elegans中。
88.根據權利要求87的方法，其中所述外源轉錄因子為噬菌體聚合酶。
89.根據權利要求88的方法，其中所述噬菌體聚合酶為T3、SP6或T7 RNA聚合酶。
90.根據權利要求87-89中任一項的方法，其中所述啟動子為T7、T3或SP6啟動子中的任一種。
全文摘要
提供負責在細胞中賦予特定表型的DNA的鑑定方法，所述方法包括a)以相應於啟動子、當合適的轉錄因子結合於所述啟動子時能夠啟動從所述cDNA或DNA轉錄出雙鏈(ds)RNA的方向，在合適的載體中構建所述細胞DNA的cDNA文庫或基因組文庫，b)將所述文庫引入包含所述轉錄因子的一種或多種所述細胞中，且c)鑑定和分離包含所述文庫的特定表型的所述細胞，並鑑定所述文庫中負責賦予所述表型的DNA或cDNA片段。採用該技術，可以將功能確定到已知DNA序列，方法為a)鑑定細胞中所述DNA序列的同源物，b)從所述細胞中分離出相關的DNA同源物或其片段，c)將所述同源物或其片段以相應於合適啟動子、當合適的轉錄因子結合於所述啟動子時能夠啟動從所述DNA同源物或其片段轉化dsRNA的方向，克隆到合適的載體中，d)將所述載體引入得自步驟a)的包含所述轉錄因子的所述細胞中。
文檔編號C12Q1/68GK1900319SQ200610094480
公開日2007年1月24日 申請日期1999年7月2日 優先權日1998年7月3日
發明者G·普萊廷克, C·普拉託伊夫, K·莫蒂爾, T·波格爾特 申請人:德福根有限公司