用於核酸的合成和/或檢測的組合物、試劑盒及方法

2023-05-14 01:13:31

專利名稱：用於核酸的合成和/或檢測的組合物、試劑盒及方法
用於核酸的合成和/或檢測的組合物、試劑盒及方法相關申請的交叉參考本申請要求2010年6月21日提交的美國臨時申請號61/357，031在35U.S. C. 119(e)下的優先權的利益，將所述臨時申請通過引用整體併入本文。背景本公開內容涉及用於核酸的合成和/或檢測的組合物、試劑盒及方法。對於許多醫學、診斷和法醫應用，特定DNA序列的擴增是使其能夠在其以極低量存在於其中的樣品中被檢測或使其能夠從所述樣品分離所必需的。最近，特定基因的體外擴增已提供了強大的成本較低的方法以促進利用子生物學技術的治療性蛋白質的生產，並且同樣可用於基因療法。聚合酶鏈式反應(PCR)技術公開於美國專利號4，683，202;4, 683，195;4, 800，159和4，965，188中。PCR法也描述於Saiki等人，1985，Science230:1350中。以其最簡單形式，PCR是用於使用兩個寡核苷酸引物酶促合成特定DNA序列的體外方法，所述兩個引物與相反鏈雜交並且側翼連接靶DNA的目標區域。重複系列的反應步驟(包括模板變性、引物退火和通過DNA聚合酶進行的退火引物的延伸)導致其末端由引物的5』末端界定的特定片段的指數積累。PCR能夠選擇性富集特定DNA序列至IO9倍。

商購可得的PCR預混合物(master mix)提高了效率並且減小了與高通量分析所需的大量PCR反應的裝配相關的錯誤。此類預混合物包含對於所有PCR反應是共同的試劑的組合。例如，預混合物可包含緩衝劑、鹽例如MgCl2、脫氧核苷三磷酸(dNTP)和熱穩定性DNA聚合酶。每一個孔可包含共同的預混合物以及特定靶核酸和引物對。通常，以濃縮液或凍乾粉(當裝配終反應時，所述濃縮液或凍乾粉隨後被稀釋或溶解)的形式製備和分配預混合物。為了進行準確分析，PCR預混合物應當提供可靠的、堅實的和可重現的PCR結果。此外，PCR預混合物應當允許檢測低拷貝靶核酸。PCR預混合物還應當允許進行快速PCR反應循環以允許快速篩選核酸(例如，DNA和cDNA)。此外，PCR預混合物還應當能夠在環境溫度或室溫下在實驗臺上是穩定的，以便PCR反應不必在裝配後立即擴增。核酸樣品的來源包括但不限於例如衣服、土壤、紙、金屬表面、空氣、水、植物部分以及人和/或動物皮膚、頭髮、血液、血清、糞便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液體。此類來源還可包含抑制PCR擴增的化合物。因此，需要鑑定阻斷或減弱在核酸樣品的來源中發現的組分對PCR擴增的抑制的試劑。概述本文中公開了用於通過聚合酶鏈式反應合成和/或檢測核酸的組合物、試劑盒和方法，所述組合物、試劑盒和方法包括DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑。PCR抑制劑阻斷劑減緩由多種通常在包含通過PCR分析的核酸的樣品中發現的化合物引起的PCR的抑制。本文中公開的組合物、試劑盒和方法確保在大範圍靶核酸濃度上的靈敏可靠的PCR結果。組合物還允許在快速PCR熱循環中獲得快速結果。組合物還提供了可在室溫下穩定長達72小時或更長時間的裝配的PCR反應。本文中公開了包含熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在。本文中還提供了包括含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物的試劑盒，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在。本文中還公開了包括含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑、引物和標記的探針的組合物的試劑盒，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在。本文中還公開了用於核酸合成的方法，包括將含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑探針的組合物與核酸樣品和引物混合，和使用核酸樣品作為模板合成核酸，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在；和使用核酸樣品作為模板合成核酸。在一些實施方案中，合成可在將組合物與核酸樣品和引物混合長達72小時後發生。 本文還公開了用於裝配聚合酶鏈式反應(PCR)的方法，包括向反應容器中添加含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在；和向反應容器中添加核酸樣品和引物。本文還公開了用於通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增核酸的方法，包括向反應容器中添加含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在；向反應容器中添加核酸樣品和引物；和對核酸樣品進行PCR。本文還公開了用於通過聚合酶鏈式反應(PCR)檢測核酸的方法，包括將含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物添加至反應容器中，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在；向反應容器中添加核酸樣品和引物；對核酸樣品進行PCR ;和檢測擴增的靶。本文還公開了用於阻斷PCR抑制劑對聚合酶鏈式反應(PCR)的抑制的方法，包括向反應容器中添加含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在，其中組合物阻斷PCR抑制劑對PCR的抑制；向反應容器中添加核酸樣品和引物；和對核酸樣品進行PCR。本文還公開了用於減少PCR抑制劑對聚合酶鏈式反應(PCR)的運行時間的方法，包括向反應容器中添加含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在，其中組合物減少PCR的運行時間；向反應容器中添加核酸樣品和引物；和對核酸樣品進行PCR。上述和其它特徵通過下列附圖和詳細描述來舉例說明。附圖描述

圖1顯示了比較使用2X濃度的本文中公開的組合物的實施方案和商業組合物TAQMAN 通用PCR預混合物進行的一組13個TAQMAN 基因表達測定的循環閾值(Ct)的曲線。圖2顯示來自在Applied Biosystems7500快速實時PCR系統上於ΓΝI TAQMAN .基因表達測定中使用2X濃度的本文中公開的組合物的實施方案在4個重複反應中擴增的人cDNA的系列稀釋物的實時PCR的代表性擴增曲線。圖3顯示作為在終反應物的裝配後(A)和在30° C將裝配的終反應物溫育72小時後(B)，使用2X濃度的本文中公開的組合物的實施方案在B2MTAOMAN 基因表達測定的4個重複反應中擴增的人cDNA的系列稀釋物的PCR循環的函數的ARn的曲線。圖4，圖框A顯示了 cDNA的終濃度(ng/μ L)的函數的Ct的曲線，該曲線將使用2Χ濃度的公開的組合物的實施方案進行的系列稀釋物的單靶(β_肌動蛋白基因(ACTB)或外源內部陽性對照(IPC)靶)PCR反應TAQMAN 基因表達測定與使用2X濃度的公開的組合物的實施方案進行的系列稀釋物的雙重靶(ACTB和IPC)PCR反應TAQMAN .基因表達測定相比較。 圖4，圖框B顯示了作為cDNA的終濃度(ng/μ L)的函數的Ct的曲線，該曲線將使用2Χ濃度的公開的組合物的實施方案進行的系列稀釋物的單靶(β-肌動蛋白基因(ACTB)或內源內部陽性對照(IPC)靶)PCR反應TAQMAN 基因表達測定與使用要求保護的組合物的實施方案進行的系列稀釋物的雙重靶(ACTB和IPOPCR反應TACJMAN 基因表達測定相比較。圖5顯示了作為使用2X濃度的公開的組合物的實施方案在AppliedBiosystems7900H 快速實時 PCR 系統上進行的 Let7_c TAQMAN MicroRNA 測定的4個重複反應的系列稀釋物的實時PCR的終核酸濃度的函數的Λ Rn對PCR循環的擴增曲線(上圖框)和Ct的標準曲線(下圖框)。圖6顯示了使用2Χ濃度的公開的組合物的實施方案在AppliedBiosystems7300實時PCR系統上進行的FNl TAQMAN 基因表達測定的4個重複實時pcr反應中擴增的人cDNA的系列稀釋物的Λ Rn對PCR循環的曲線圖。圖7Α顯示了柱形圖，該圖顯示對於8個存在10-50 μ M的血色素的單重(上圖框)或雙重(下圖框)TAQMAN 基因表達測定測量的ct。圖7B顯示了柱形圖，該圖顯示了對於8個存在10-50 μ M的血色素的單重和雙重(上圖框)TAQMAN 基因表達測定測量的dct和對於8個存在10-50 μ M的血色素的雙重vie對照TAQMAN 基因表達測定測量的ct。圖8顯示了柱形圖，該圖顯示在添加劑BSA和魚膠存在或不存在的情況下，在不存在腐殖酸或存在15ng/20 μ L反應物的腐殖酸的情況下對於2個TAQMAN .基因表達測定測量的平均ct。圖9顯示了柱形圖，該圖顯示在添加劑BSA和魚膠存在或不存在的情況下，在肝素不存在和存在O. OIU/μ L的肝素的情況下對於3個TAQMAN 基因表達測定測量的平均Ct。圖10顯示了單重和雙重擴增反應在快速熱循環條件下的結果。詳述本公開內容總地說來涉及用於檢測和/或定量核酸的即可使用的試劑混合物、試劑盒和方法。已開發了具有預料之外的優良性質的改進的組合物。本發明組合物提供了裝配的聚合酶鏈式反應(PCR)預混合物，當所述預混合物在標準PCR儀上運行時與利用標準試劑混合物裝配的PCR相比較顯示優良的靈敏性、準確性、動態範圍和特異性。在一些實施方案中，利用本文中公開的組合物裝配的PCR的優良靈敏性允許減少在FAST或標準PCR儀上的PCR運行時間。此外，在一些實施方案中，本文中公開的組合物提供了在室溫(例如，23-30° C)下具有長達72小時的極長的穩定性的裝配的PCR，該特徵有益於高通量液體處理系統的用戶獲得的結果的準確性。在一些實施方案中，本文中公開的組合物對於許多檢測核酸的測定是有用的。例如，組合物可用於用於檢測基因表達、miCToRNA(miRNA)表達或基因分型的基於PCR的測定。還公開了包括組合物的試劑盒，同樣地包括了使用所述組合物和試劑盒的方法。在一個實施方案中，組合物包含熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在。在實施方案中，PCR抑制劑阻斷劑為蛋白質。適當的蛋白質包括白蛋白和明膠。在一些實施方案中，PCR抑制劑阻斷劑選自血清白蛋白、魚膠或上述物質的組合，其中組分以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在。血清白蛋白可來自任何動物，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)。在實施方案中，組合物以這樣的濃度包含白蛋白，以便其在裝配的PCR(例如，工作溶液)中的濃度為約O. 05mg/mL至約O. 8mg/mL、約O. lmg/mL至約O. 6mg/mL,更特別地約O. 2mg/mL至約O. 4mg/mL,以這樣的濃度包含明膠以便其在裝配的PCR中的濃度為約O. 05%(w/v)至約O. 8%(w/v),更特別地約O. 2%(w/v)至約O. 4%(w/v)或上述濃度的組合。在另一個實施方案中，PCR抑制劑阻斷劑可以是濃度約O. 3mg/mL的白蛋白和濃度約O. 3%(w/v)的明膠。在一個實施方案中，白蛋白為BSA，明膠為魚膠。在一些實施方案中，本文中使用的熱穩定性DNA聚合酶當經歷升高的溫度，進行實現單鏈核酸的去穩定作用或在PCR擴增過程中實現雙鏈核酸的變性所必需的時間時，不被不可逆地滅活。酶的不可逆變性是指大體上失去了酶活性。優選地熱穩定性DNA聚合酶在例如進行PCR擴增通常所需要的條件下在約90° -100°C下將不會發生不可逆變性。在一些實施方案中，組合物還可包含另外的組分例如甘油、牛明膠、NaN3、緩衝劑、鹽、dNTP、表面活性劑和/或一般地任何陽離子、陰離子、兩性離子和/或非離子型去垢劑、用於熱啟動PCR的試劑、使定量實時DNA檢測測定的樣品間和/或孔間變化最小的被動參考對照和/或尿卩密唳-DNA糖基化酶。組合物還可包含擁擠試劑(crowding agent)例如Ficoll70、糖原和聚乙二醇(PEG)。在一些實施方案中，甘油可以以這樣的濃度存在於組合物中，以便其在裝配的PCR中的濃度為約6至約11%(w/v)，特別地約8. 5%(w/v)。牛明膠可以以這樣的濃度存在於組合物中，以便其在裝配的PCR中的濃度為約0.3至約0.7%(w/v)，特別地約0.5%(w/v)。NaN3可以以這樣的濃度存在於組合物中，以便其在裝配的PCR中的濃度為約O. 007至約O. 013%(w/V)，特別地約 0.01% (w/v) 。組合物可包含緩衝劑和/或鹽溶液來提供適當的pH和離子條件以維持DNA聚合酶的穩定性。術語"穩定"和"穩定性"，如本文中所用，通常意指在將酶或包含酶的組合物在約室溫(例如，約20°C至約25°C )的溫度下貯存約3天後，在約4°C的溫度下貯存約I周后，在約-20°C的溫度下貯存約2至6個月後，以及在約_80°C的溫度下貯存約6個月或更長時間後，使組合物例如酶組合物保留至少70%，優選至少80%，最優選至少90%的原始酶活性(以單位表示)。此類緩衝劑的實例可包括例如TRIS、TRICINE、BIS-TRICINE、HEPES、MOPS、TES、TAPS、PIPES和CAPS。此類鹽溶液的實例可包括例如氯化鉀、醋酸鉀、硫酸鉀、硫酸銨、氯化銨、醋酸銨、氯化鎂、醋酸鎂、硫酸鎂、氯化錳、醋酸錳、硫酸錳、氯化鈉、醋酸鈉、氯化鋰和醋酸鋰。應理解，許多緩衝劑和鹽溶液在本領域是已知的，包括例如未在本文中明確公開的那些。 在另一個實施方案中，可以以濃縮原液的形式提供通組合物。如本文中所用，術語"濃縮原液"意指在需要進一步稀釋以達到用於進行特定功能(例如核酸的擴增)的溶液的最佳濃度的濃度。如本文中所用，「工作溶液」可用於指具有進行特定功能的最佳濃度的溶液。例如，組合物可以是約2X、約3X、約4X、約5X、約6X、約IOX等的原液。在一些優選實施方案中，組合物可需要高於2X、高於3X、高於4X、高於5X、高於6X、高於IOX等的稀釋度以成為用於核酸合成法的工作濃度或最佳濃度。可在組合物中提供dNTP。組合物中包含的每一種dNTP的濃度應當為這樣的濃度以便在裝配的PCR中獲得約O. 15mM至約O. 65mM的dNTP的濃度。包含的dNTP可以是dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP。各個dNTP的濃度不必相同。在實施方案中，dATP、dCTP、dGTP以這樣的濃度存在於組合物中以便每一種dNTP在裝配的PCR中的濃度為約O. 15至約O. 35mM，特別地約O. 25mM，並且dUTP以這樣的濃度存在於組合物中，以便其在裝配的PCR中的濃度為約O. 35至約O. 65mM，特別地為O. 5mM。非離子型去垢劑可以為例如TRITON X-100 、NonidetP_40 (NP-40)、TWEEN20 或Bri j35。非離子型去垢劑可以以這樣的濃度存在於組合物中以便其在裝配的PCR中的濃度為約O. 007至約O. 013%(w/v)，特別地約O. 01%(w/v)。在一些實施方案中，TWEEN-20以這樣的濃度存在於組合物中以便其在裝配的PCR中的濃度為約O. 007%(w/v)。用於熱啟動PCR的試劑可以是抗體、適體、髮夾型引物或隔離石蠟珠。用於熱啟動pcr的石蠟珠是商購可得的，例如AmpliWax PCRGemioo和AmpliWax pcrGem50 (Applied Biosystems)。適當的適體的選擇可通過本領域已知的方法來進行或可使用商購可得的適體。類似地，適當的髮夾型引物的選擇可通過本領域已知的方法來進行或可使用商購得的引物。可通過本領域已知的方法產生或選擇用於熱啟動PCR的抗體。或者，可使用商購可得的抗體，例如對於任何Taq-衍生的DNA聚合酶是有效的TaqStart抗體(Clontech)，包括天然、重組和N末端缺失突變體。可通過本領域已知的方法,或對於商業產品按照製造商所推薦的方法確定裝配的PCR中用於熱啟動PCR的試劑的適當濃度。以允許其用作可檢測對照的濃度包含使定量實時核酸檢測測定的樣品間和/或孔間變化減小至最小的被動參考對照。在實施方案中，將參照發色團，特別地螢光基團用作被動參考對照。在實施方案中，參照發色團為染料ROX(InvitiOgen)。可以以這樣的濃度將ROX包含在組合物中，以便其在終裝配的PCR中的濃度為約40至約80nM，特別地約60nM。可將尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)包含在組合物中。該酶可從許多商業來源例如Invitrogen>EnzymatiCs>New England Biolabs、Genscript 或 USB 商購獲得。可將 UNG 以這樣的量包含在組合物中，以便其在終裝配的PCR中的濃度為約0. 005至約0. 015U/y L，特別地約0. OlU/μ L0在實施方案中，組合物包含熱穩定性DNA聚合酶、PCR抑制劑阻斷劑的組合、緩衝鹽溶液、熱啟動組分、dNTP、甘油、非離子型去垢劑和被動參照染料。可替換或修飾組分。
在一些實施方案中，當在約-20° C貯存至少5. 5個月時，公開的組合物是穩定的。可將組合物包裝在能夠保持組合物並且不會與組合物的組分明顯相互作用的適當的容器中。容器可以是被設計來允許由個人或由液體操作儀容易地分配劑型的容器。還可將組合物容器包裝至多包(mult1-pack)單元中。本文中還公開了包括組合物的試劑盒。試劑盒可進一步包含用於一個或多個測定中以合成、檢測或定量核酸的試劑。在實施方案中，除所述組合物外，試劑盒還可包括特異於DNA靶的PCR擴增的引物對以及特異於DNA靶的探針。例如，探針可以是TAQMAN 探針、HydrolEasy 探針、小溝結合(MGB)探針、鎖核酸(LNA)探針或循環探針技術(CPT)探針。在另一個實施方案中，試劑盒還可包括對照核酸樣品，以及特異於對照核酸樣品上的DNA靶的PCR擴增的引物對。還可在試劑盒中包括用於檢測擴增的探針。視情況而定，可在各個容器中或單個容器中提供除組合物外的試劑盒的組分。可有利地提供使用試劑盒的說明書和方案。可將公開的組合物和試劑盒用於多種檢測或定量核酸的基於PCR的測定。例如，可將組合物用於基因表達測定(例如，TA0MAN 基因表達測定)、miRNA測定(例如，TAQMAN MicroRNA測定)、基因分型測定(例如，TA0MAN 藥物代謝基因分型測定或TAQMAN SNP基因分型測定)或RNA定量測定(例如，兩步逆轉錄-聚合酶鏈式反應測定)和TAQMAN 低密度陣列測定。本文中還公開了使用試劑濃度和試劑盒的方法。在實施方案中，用於裝配聚合酶鏈式反應(PCR)的方法包括將包含熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物添加至反應容器，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在；和將核酸樣品和引物添加至反應容器中。反應容器的實例包括微量離心管、孔板(wellplate)中的孔、毛細管或微流控晶片。在實施方案中，用於利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增核酸的方法包括將包含熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物添加至反應容器，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在；將核酸樣品和引物添加至反應容器中；和對核酸樣品進行PCR，其中在將組合物、核酸樣品和引物添加至反應容器後長達72小時才進行PCR。在一些實施方案中，用於擴增靶核酸的方法可以是其中同時擴增多個靶的多重PCR擴增。擴增的靶的數目可達到10個靶，特別地達到6個靶，更特別地達到3個靶，更特別地2個靶。在實施方案中，多重化的靶之一是用於擴增的內源或外源內部陽性對照。一般而言，PCR熱循環包括在高溫下的初始變性步驟，隨後是被設計來允許模板變性、引物退火和通過聚合酶進行的退火引物的延伸的重複的系列的溫度循環。通常，開始時將樣品在約95° C的溫度下加熱約2至10分鐘以使雙鏈DNA樣品變性。隨後，在每一個循環開始時，取決於樣品和使用的儀器類型，將樣品變性約10至60秒。變性後，使引物在更低的溫度(從約40° C至約60° C)下與靶DNA退火，進行約20至60秒。通常在約60° C至約72° C範圍內的溫度下進行聚合酶對引物的延伸。用於延伸的時間量將取決於擴增子的大小和用於擴增的酶的類型，並且可通過常規實驗容易地確定。此外，可將退火步驟與延伸步驟組合，從而導致兩步驟循環。熱循環在PCR測定中還可包括另外的溫度變動。用於測定的循環次數取決於許多因素，包括使用的引物、存在的樣品DNA的量及熱循環條件。用於任何測定的循環次數可由本領域技術人員使用常規實驗容易地確定。任選地，可在完成熱循環後加上終延伸步驟以確保所有擴增產物的合成。在一個實施方案中，使用本文中公開的組合物進行PCR擴增的示例性熱循環條件如下UNG步驟(任選的):50°C , 2分鐘活化95O ,20 秒(變性:95-970C /1-3 秒)(延伸:60-620C /20-30 秒)x40 個循環 在一個實施方案中，當本文中公開的組合物用於TAQMAN 低密度陣列(TLDA)平臺時，推薦在92°C下活化10分鐘。可在「標準」PCR儀例如 Applied Biosystems7900HT,7500 和 7300 標準 PCR 系統上，或「快速叩CR 儀例如 Applied BiosystemsStepOne,StepOne Plus、7500 和 7900HT 快速實時PCR系統上進行利用公開的組合物的PCR。核苷酸。如本文中所用，「核苷酸」是指鹼基-糖-磷酸組合。「核苷」是指鹼基-糖組合。核苷酸是核酸序列(例如DNA和RNA)的單體單位。術語核苷酸包括脫氧核糖核苷和核糖核苷的單、二和三磷酸形式及其衍生物。術語核苷酸具體地包括脫氧核糖核苷三磷酸例如dATP，dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP或其衍生物。此類衍生物包括例如[a S]dATP, 7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP。術語核苷酸，如本文中所用，還指二脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。適用於本發明組合物的核苷酸的實例包括但不限於dUTP，dATP，dTTP, dCTP, dGTP, dITP, 7-脫氮-dGTP, a-硫代-dATP, a-硫代-dTTP, a-硫代-dGTP, a-硫代-dCTP 或其衍生物，其全都可從來源包括Life Technologies (Carlsbad, CA)、NewEnglandBioLabs (Beverly, Mass.)和 Sigma Chemical Company (SaintLouis, Mo.)商購獲得。此類dNTP可不被標記，或它們可通過利用本領域已知的方法將其與放射性同位素(例如，3H、14C、32P或35S)、維生素(例如，生物素)、螢光部分(例如，螢光素、羅丹明、德克薩期紅或藻紅蛋白)、化學發光標記物地高辛(DIG)等偶聯來進行可檢測地標記。標記dNTP也可例如從 Life Technologies (Carlsbad, CA)或 Sigma ChemicalCompany (Saint Louis, MO)商購獲得。在本發明組合物的一些實施方案中，可添加dNTP以在工作溶液中產生約0. 001至約100毫摩爾、約0. 01至約10毫摩爾、約0.1至約I毫摩爾或優選約0. 2至約0. 6毫摩爾的每一種dNTP的終濃度。多核苷酸和寡核苷酸。如本文中所用，「多核苷酸」和「寡核苷酸」是指合成或生物產生的分子，其包含可通過一個核苷酸的戊糖的3'位與相鄰核苷酸的戊糖的5'位之間的磷酸二酯鍵連接的核苷酸的共價連接的序列。此外，多核苷酸或寡核苷酸可包含修飾的或非天然存在的糖殘基(例如，阿拉伯糖)和/或修飾鹼基殘基。多核苷酸或寡核苷酸還可包括阻止分子與特定蛋白質、酶或底物的相互作用的封閉基團。核酸。如本文中所用，「核酸」包括具有多個天然核苷酸和/或非天然(或「衍生的」)核苷酸單元的化合物。「核酸」還可包括非核苷酸單元，例如肽。「核酸」因而包括化合物例如DNA、RNA、肽核酸、含硫代磷酸酯的核酸、含膦酸酯的核酸等。關於核酸中的單元的數目不存在特別限制，只要核酸包含2個以上的核苷酸、核苷酸衍生物或其組合，特別地5、10、15、25、50、100個或更多個。核酸可包括單鏈和雙鏈形式，以及完全或部分雙鏈體嵌合體(例如，RNA-DNA、RNA-PNA 或 DNA-PNA)。引物。術語「引物」可指超過一個引物，以及可指寡核苷酸，無論是天然存在(如在純化的限制酶切降解物中)還是合成產生，所述寡核苷酸當置於其中催化與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成的條件下時能夠作為沿著互補鏈的合成的起始點。此類條件包括4種不同的脫氧核糖核苷三磷酸和聚合誘導劑例如DNA聚合酶或逆轉錄酶在適當的緩衝液(「緩衝液」包括作為輔因子或影響pH、離子強度等的取代物)中的存在和在適當的溫度下。引物優選為單鏈以在擴增中具有最大效率。引物通常為11個鹼基或更長，更特別地，引物為17個鹼基或更長，雖然取決於需要可使用更短或更長的引物。如本領域技術人員將理解的，寡核苷酸可用作各種延伸、合成或擴增反應的一個或多個引物。如本文中所用，核酸序列的互補序列是指當與核酸序列對齊以便一個序列的5』末端與另一個序列的3』末端配對時處於「反向平行締合」中的寡核苷酸或多核苷酸。通常不在天然核酸中發現的某些鹼基可被包含在本發明的核酸中，包括例如肌苷和7-脫氮鳥嘌呤。互補性不必完美；穩定的雙鏈體可包含錯配鹼基對或未匹配的鹼基對。核酸技術領域的技術人員通過考慮許多變量包括例如寡核苷酸的長度、鹼基組成和寡核苷酸的序列、離子強度以及錯配鹼基對的發生率來經驗地確定雙鏈體穩定性。核酸雙鏈體的穩定性通過解鏈溫度(「Tm」)來測量。在指定的條件下特定核酸雙鏈體的Tm為一半鹼基對已分離時所處的溫度。如本文中所用，「核酸樣品」是指用於測試核酸的存在或不存在的樣品。可從任意來源獲得核酸樣品。核酸樣品的來源包括但不限於衣服、土壤、皮膚、頭髮、血液、血清、糞便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液體。當提及熱穩定性DNA聚合酶時，一個活性單位為在標準引發的DNA合成條件下在30分鐘內將10納摩爾的dNTP摻入酸不溶性物質(即，DNA或RNA)的酶的量。「工作濃度」在本文中用於指為或接近溶液中使用的進行特定功能(例如核酸的擴增、測序或降解)的最佳濃度的試劑的濃度。如本文中所用，術語「穩定」和"穩定性"，通常意指在將酶或包含酶的組合物在約20°C至約25°C的溫度下貯存至少4周，在約4°C的溫度下貯存I年或在約_20°C的溫度下貯存至少2年後，使酶仍然保留至少70%，優選至少80%，最優選至少90%的原始酶促活性(以單位表示)。如本文中所用，術語「靶」、「靶序列」或「靶核酸序列」是指待被擴增、檢測或擴增和檢測的核酸的區域。靶序列位於用於擴增的兩個引物序列之間。組合物還可包括用於檢測靶核酸的探針。 各種探針在本領域是已知的，例如(TaqMan 探針(參見，例如，美國專利號5，538，848)、各種莖-環分子信標(參見，例如，美國專利號 6，103, 476 和 5，925，517 以及 Tyagi and Kramer, 1996，NatureBiotechnologyl4:303-308)、無莖或線性信標(參見，例如，W099/21881)、PNA 分子信標 (參見，例如，美國專利號6，355，421和6，593，091)、線性PNA信標(參見，例如，Kubista等人，2001，SPIE4264:53-58)、非-FRET探針(參見，例如，美國專利號 6，150,097)、Sunrise /Amp丨丨fluor 探針(美國專利號 6，548，250)、莖-環雙鏈體Scorpion 探針(參見，例如，Solinas等人，2001，Nucleic AcidsResearch29:E96和美國專利號6，589，743)、凸環探針(參見，例如，美國專利號6，590，091)、假結探針(參見，例如，美國專利號6，589，250)、cyclicons (參見，例如，美國專利號 6，383，752)、MGB Eclipse 探針(EpochBiosciences)、髮夾型探針(參見，例如，美國專利號6，596，490)、在例如美國專利號6，485，901;MhIanga等人，2001，Methods25:463-471;ffhitcombe 等人,1999, Nature Biotechnology. 17:804-807;Isacsson 等人，2000，Molecular Cell Probes. 14:321-328;Svanvik 等人，2000，AnalBiochem. 281:26-35;Wolffs 等人，2001，Biotechniques766:769-771;Tsourkas 等人，2002，Nucleic Acids Research. 30:4208-4215; Riccelli 等人，2002，Nucleic AcidsResearch30:4088-4093;Zhang 等人，2002Shangha1. 34:329-332;MaxwelI 等人，2002，J.Am. Chem. Soc. 124:9606-9612;Broude 等人,2002, Trends Biotechnol. 20:249-56;Huang等人，2002，Chem Res. Toxicol. 15: 118-126;和 Yu 等人，2001，J. Am. Chem.Socl4:11155-11161中描述的肽核酸(PNA)照亮(light-up)探針、自我裝配納米顆粒探針和二茂絡鐵修飾探針。探針可包含報導染料例如6-羧基螢光素(6-FAM)或四氯螢光素(TET)等。檢測探針還可包含猝滅劑部分例如四甲基羅丹明(TAMRA)、Black Hole猝滅劑(Biosearch) > Iowa Black (IDT)、QSY 粹滅劑(Molecular Probe)以及 DABSYL 和 DABCEL 石黃酸鹽/羧酸鹽猝滅劑(Epoch)等。探針還可包含兩個探針，其中例如螢光基團在一個探針上，猝滅劑在另一個探針上，其中兩個探針一起對靶的雜交猝滅信號，或其對靶的雜交通過螢光的改變來改變信號特徵。

在一些實施方案中，按照例如美國專利號6，727，356中描述的方法和原理來設計探針。一些探針可以是基於序列的，例如5』核酸酶探針，一些探針例如呂YBR 綠可以是非序列特異性DNA結合染料。在一些優選實施方案中，檢測探針為TaqiVlan 探針(AppliedBiosystems, Foster City,CA)。應理解,許多種可用於本發明的探針在本領域是已知的,包括本文中未明確公開的那些探針。在公開的組合物的一些實施方案中，工作溶液中的終探針濃度可以為約5nM至約750nM 例如約 IOnM 至約 600nM、約 25nM 至約 500nM、約 50nM 至約 400nM、約 75nM 至約 300nM或其間任意數字。在一些示例性實施方案中，探針濃度為約IOOnM至約250nM。本發明的反應混合物可包含能夠促進或增強擴增、逆轉錄和/或兩種反應的組合的添加劑(例如，用於促進/增強PCR的試劑)。添加劑可以是有機或無機化合物。適當的添加劑包括多肽以及非多肽添加劑。此類添加劑可包括例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、外源凝集素、大腸桿菌(E. co)單鏈結合(SSB)蛋白、tRNA、rRNA、7_脫氮-2』 -脫氧鳥苷(dC7GTP)、含硫化合物、含乙酸酯化合物、二甲基亞碸(DMSO)、甘油、甲醯胺、甜菜鹼、氯化四甲胺(TMAC)、聚乙二醇(PEG)、各種表面活性劑和/或去垢劑，包括陰離子、陽離子、兩性離子或非離子型去垢劑(例如，TWEEN20、NP-40、Triton X-100)、四氫嘧啶(ectoine)、疊氮化鈉、凱松(kathon)和多元醇等等。本領域技術人員將能夠鑑定按照本發明組合物、方法和試劑盒使用的其它添加劑。示例性核酸包括DNA和RNA。在一個實施方案中，核酸為分離和/或純化的核酸。分離或純化的核酸大體上不含其它組分例如蛋白質、多糖或其它細胞、細菌或病毒組分。在另一個實施方案中，核酸未被分離或純化。例如，核酸可存在於複雜混合物例如粗製裂解物或完整細胞提取物中。在另一個實施方案中，核酸可原位存在和存在於其正常細胞、細菌或病毒環境內。核酸可獲自天然來源，例如多種細胞、組織、器官或生物體(包括病毒)。核酸可獲自處於不同發育階段的細胞、組織、器官或生物體。核酸可獲自病毒、原核生物或真核生物。適當的病毒包括皰疹病毒、HIV、流感病毒、Epstein-Barr virus、肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒和類病毒。適當的原核生物包括埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷菌屬(Serraa)、沙門菌屬(Salmonella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梭菌屬(Clostridium)、衣原體屬(Chlamydia)、奈瑟球菌屬(Neisseria)、密螺旋體屬(Treponema)、支原體屬(Mycoplasma)、疏螺旋體屬(Borrelia)、軍團病桿菌屬(Legionella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)和鏈黴菌屬(Streptomyces)的種類。適當的真核生物包括真菌(特別地酵母)、植物、原生動物和其它寄生蟲，以及動物，包括無脊椎動物例如昆蟲(特別地果蠅)、線蟲(特別地秀麗隱杆線蟲)和脊椎動物例如爬行動物、兩棲動物(特別地光滑爪蟾(Xenopus Iaevis))、禽類(特別地雞)、魚(特別地鮐(Daniorerio))和哺乳動物(特別地小鼠和人)。核酸還可獲自癌細胞和癌前細胞(獲自動物包括人)。核酸還可獲自細胞培養系，包括轉化和非轉化的細胞培養系。可從多種來源提取核酸樣品。此類來源包括但不限於例如衣服、土壤、紙、金屬表面、空氣、水、植物部分以及人和/或動物皮膚、頭髮、血液、血清、糞便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液體。
在擴增或合成後，可分離擴增的或合成的核酸以進一步使用或表徵。該步驟通常通過按照大小分離擴增的或合成的核酸片段或利用任何物理或生物化學方法包括凝膠電泳、毛細管電泳、層析(包括分篩、親和力和免疫層析)、密度梯度離心及免疫吸附來實現。示例性方法是利用凝膠電泳分離核酸片段，其提供了大量核酸片段的靈敏性分離的快速高度重現性方法，並且允許直接同時比較幾個核酸樣品中的片段。在一個實施方案中，按照標準技術例如化學萃取、電洗脫或物理切割從用於鑑定(參見上文)的凝膠取出一個或多個擴增的或合成的核酸片段。隨後可將分離的獨特的核酸片段插入適用於多種原核(細菌)或真核(酵母、植物或動物包括人和其它哺乳動物)細胞的轉染或轉化的標準載體，包括表達載體。或者，可進一步表徵由所述方法產生的核酸，例如通過測序(即，測定核酸片段的核苷酸序列)，通過下文中描述的方法和在本領域中是標準的其它方法(參見，例如，美國專利號4，962，022和5，498，523，其涉及DNA測序的方法)O還可使用經典測序法例如Sanger鏈終止法(Sanger, F.,等人Proc. Natl. Acad. Sc1.USA74:5463-5467 (1977))以及 Maxam 和 Gilbert 化學切斷法(Maxam, A. M. and Gilbert, W.Proc. Natl. Acad. Sc1. USA74:560-564 (1977))。在一些實施方案中，組合物可包含DNA依賴性DNA聚合酶、用於逆轉錄的酶(RNA-依賴性DNA聚合酶)和/或兩種類型的酶的組合。在一些實施方案中，DNA依賴性DNA聚合酶的組合和/或RNA依賴性DNA聚合酶的組合可存在於本文中公開的組合物中。用於擴增和/或測序的適當的DNA聚合酶包括但不限於嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus) (Tth) DNA 聚合酶、菌嗜熱水生菌(Thermusaquaticus) (Taq) DNA 聚合酶、新阿波羅棲熱袍菌(Thermotoganeopolitana) (Tne)DNA聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotogamaritima) (Tma)DNA 聚合酶、嗜熱高溫球菌(Thermococcus litoralis)(Tli 或 VENT )DNA 聚合酶、強烈火球菌(Pyrococcus furiosus) (Pfu)DNA 聚合酶、DEEPVENT DNA 聚合酶、Pyrococcus woosii (Pwo) DNA 聚合酶、Pyrococcus sp K0D2 (KOD)DNA聚合酶、嗜熟脂肪芽抱桿菌(Bacillus sterothermophilus) (Bst)DNA聚合酶、Bacilluscaldophilus (Bca)DNA 聚合酶、嗜熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac) DNA 聚合酶、嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum) (Tac) DNA 聚合酶、黃棲熱菌(Thermus flavus) (Tf 1/Tub) DNA 聚合酶、紅棲熱菌(Thermus ruber) (Tru)DNA聚合酶、布氏棲熱菌(Thermus brockianus) (DYNAZYME ) DNA聚合酶、熱自參甲燒桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum) (Mth) DNA 聚合酶、分枝桿菌屬(Mycobacterium)DNA 聚合酶(Mtb, Mlep)、大腸桿菌(E. co)pol I DNA 聚合酶、Klenow 片段、TOTNA聚合酶、T7DNA聚合酶和通常pol I型DNA聚合酶；其突變體、變體和衍生物以及上述聚合酶的組合。適當的核酸聚合酶可以是嗜溫性或嗜熱性的，優選為嗜熱性的並且具有熱穩定性。如本文中所用，術語「熱穩定性核酸聚合酶」是指當與例如來自大腸桿菌的核苷酸聚合酶相比較時對熱相對穩定並且催化核苷三磷酸的聚合的酶。通常，酶在與靶序列退火的引物的3』末端起始合成，並且將沿著模板以5』方向前進，如果具有5』至3』核酸酶活性，水解間插的退火的探針以釋放標記和未標記探針片段，直至合成終止。從嗜熱水生菌(Thermusaquaticus) (Taq)分離的代表性熱穩定性酶描述於美國專利號4，889，818,在常規PCR中使用其的方法描述於Saiki等人，1988，Science239:487中。適當的嗜溫性DNA聚合酶包括DNA聚合酶的Pol I家族(以及其各自的Klenow片段)，其任一種酶可從生物例如大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae)、耐輻射奇球菌(D. radiodurans)、幽門螺旋菌(H. pylori)、嗜熱光合綠曲菌(C. aurantiacus)、普氏立克次體(R. prowazeki1、Tpallidum)、集胞藻(Synechocystis sp·)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、乳酸乳球菌(L.1actis)、肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、麻風分枝杆 菌(M. leprae)、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)、細菌卩遼菌體(Bacteriophage) L5、ph1-C31、T7、T3、T5、SPOl、SP02、來自釀酒酵母(S. cerevisiae)MIP-1的線粒體以及真核生物秀麗隱杆線蟲和黑腹果蠅分離而來(Astatke，M.等人，1998，J Mol.Biol. 278，147-165)、從任何來源分離的pol III型DNA聚合酶及其突變體、衍生物或變體等。可用於本發明方法和組合物的優選熱穩定性DNA聚合酶包括Taq、Tne、Tma> Pfu、KOD>Tfl、Tth、Stoffel片段、VENT 和DEEPVENT DNA聚合酶及其突變體、變體和衍生物(美國專利號 5，436，149; 4，889，818; 4，965，188; 5，079，352; 5，614，365; 5，374，553; 5，270，179; 5，047，342;5, 512，462;W092/06188;W092/06200;
W096/10640;W097/09451;Barnes, ff. Μ.，Genel12:29-35 (1992) ;Lawyer, F. C.，等人，PCR Meth.Appl. 2:275-287 (1993) ;Flaman, J.-Μ·，等人，Nucl. AcidsRes. 22 (15) : 3259-3260 (1994))。示例性熱穩定性聚合酶包括來自Roche MolecularDiagnostics (Pleasanton, CA)的 AmpliTaq 聚合酶。在某些實施方案中，核酸聚合酶具有5』 一 3』外切核酸酶活性。如本文中所定義，「5』 一3』核酸酶活性」或「5』至3』核酸酶活性」是指模板特異性核酸聚合酶的活性，包括常規地與一些DNA聚合酶(通過所述聚合酶以順序方式從寡核苷酸的5』除去核苷酸)相關的5』 一3』外切核酸酶活性(即，大腸桿菌DNA聚合酶I具有該活性而Klenow片段不具有該活性)，或其中切割發生在離5』末端超過I個磷酸二酯鍵(核苷酸)上的5』 一3』內切核酸酶活性，或兩者。Taq DNA聚合酶具有DNA合成依賴性鏈置換5』-3』外切核酸酶活性(參見 Gelfand, 「Taq DNA Polymerase，，in PCR Technology!Principles and Applicationsfor DNA Amplification, Erlich, Ed. , Stockton Press, N. Y. (1989),第 2 章)。在溶液中，存在極少(如果有的話)的標記的寡核苷酸的降解。具有DNA聚合酶活性的酶可以例如從Roche MolecularDiagnostics (Pleasanton,CA)> Life Technologies Corp. (CarIsbad,CA)、Perkin-Elmer(Branchburg, NJ)、New England BioLabs(Beverly, MA)或 BoehringerMannheim Biochemicals (Indianapolis, IN)商購獲得。或者，可按照本領域技術人員公知的分離和純化天然蛋白質的標準方法(參見，例如，Houts, G. E.,等人，J.Virol. 29:517(1979))從其天然來源分離聚合酶。此外,此類聚合酶可利用本領域技術人員熟悉的重組 DNA 技術(參見,例如,Kotewicz, M. L.，等人，Nucl. Acids Res. 16:265(1988);美國專利號 5，244，797; W098/47912; Soltis, D. A 和 Skalka, A. M.，Proc. Natl. Acad. Sc1.USA85:3372-3376 (1988))來進行製備。允許進行RT-PCR的實施方案還包括具有逆轉錄酶活性的酶。具有逆轉錄酶活性的適當的酶可以是例如逆轉錄病毒的逆轉錄酶，例如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉錄酶、勞斯肉瘤病毒(RSV)逆轉錄酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆轉錄酶、AMV逆轉錄酶、RAV逆轉錄酶、MAV逆轉錄酶、ASLV逆轉錄酶以及慢病毒逆轉錄酶，或其具有逆轉錄酶活性的相應的突變體、變體或衍生物。如本文中所用，「突變體、變體或衍生物」是指可存在或產生的化學種類的所有變換，其仍然保留該化學種類的確定的化學活性。用於本發明的一些優選酶為RNA酶H+酶的酶，例如RNA酶H+M-MLV或RNA酶H+AMV逆轉錄酶。或者，本發明組合物中使用的逆轉錄酶可具有減小的，顯著減小的或消除的RNA酶H活性(參見，例如，美國專利號7，078, 208，將其公開內容通過引用整體併入本 文)。RNA酶H為特異於RNA-DNA嵌合體的RNA鏈的前進性5』和3』核糖核酸酶(Perbal, A Practical Guide to MolecularCloning, New York: Wiley&Sons (1984))。RNA酶H活性可通過許多測定例如在例如美國專利號 5，244，797 中，Kotewicz, M. L.，等人，Nucl. Acids Res. 16:265(1988)中和 Gerard, G.F.，等人，FO⑶S14 (5) :91(1992)中描述的那些測定來進行測定。所述逆轉錄酶與天然存在的逆轉錄酶相比較可包含許多突變。例如，可修飾逆轉錄酶以包含提供增強的逆轉錄酶穩定性和/或功能性的突變。適當的酶還可包括其中末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)活性已被減小，顯著減小或消除的酶。顯示此類增強的或減弱的功能性的逆轉錄酶描述於例如美國專利號7，056，716和7，078，208 (將所專利的公開內容通過引用整體併入本文)中。在一些實施方案中，反應混合物還包含至少一種PCR抑制劑阻斷劑，其幫助克服多種通常在用於核酸製備和/或分離的樣品中發現的抑制劑化合物對PCR反應的抑制。此類抑制劑包括例如肝素(血液)；血色素(血液)；EDTA (血液)；檸檬酸鹽(血液)；免疫球蛋白G (血液，血清)；腐殖酸(土壤，糞便)；乳鐵蛋白(牛奶、唾液、其它分泌液體)；尿素(尿)；植物多糖(植物)；黑色素(皮膚、頭髮)；肌紅蛋白(組織)；和靛青染料(紡織品)°
適當的PCR抑制劑阻斷劑包括蛋白質例如但不限白蛋白(例如，牛血清白蛋白(BSA)和重組BSA))、明膠(例如，牛明膠和魚膠)和/或其肽或多肽變體、片段或衍生物。用作PCR抑制劑阻斷劑的示例性蛋白質包括牛血清白蛋白(BSA)和魚膠。PCR抑制劑阻斷劑可包括PCR抑制劑阻斷劑的組合。PCR抑制劑阻斷劑的示例性組合是BSA和魚膠.我們已發現BSA和魚膠單獨地和組合地在減弱由至少腐殖酸、血色素和/或肝素引起的PCR抑制中是有效的。在一些實施方案中，PCR抑制的該減弱由更低的Ct值顯示。如本文中所用，術語「Ct」或「Ct值」是指循環閾值並且表示其中來自報導分子的表示擴增子產生的信號(例如，螢光)最早變得高於本底水平而可被檢測的PCR擴增測定的循環。在一些實施方案中，循環閾值或「Ct」為PCR擴增變成指數擴增時的循環數。在一個實施方案中，來自報導分子的信號例如螢光被描述為ARn。如本文中所用，術語「dRn」或「ARn」是指標準化報導分子信號(Rn)與本底信號(基線)之差(然後其通過被動參考信號被標準化)。Λ Rn可利用式[Rn+-RrT來測定，其中Rn+是包括所有組分(包括模板)的反應的Rn值，RrT是未反應的樣品的值。 根據不同的實施方案，可使用PCR曲線的導數來測定Ct值。例如，可對PCR曲線進行一階、二階或η階導數法以測定Ct值。在不同的實施方案中，導數的特徵可用於測定Ct值。此類特徵可包括但不限於二階導數的正拐點(positive inf lection)、二階導數的負拐點(negative inf lection)、二階導數的零交叉或一階導數的正拐點。在不同的實施方案中，可使用閾值和基線法(thresholding and baselining method)來測定Ct值。例如,可使用導數法來確定PCR曲線的指數期的上限，可測定PCR曲線的基線來確定PCR曲線的指數期的下限。根據PCR曲線的上限和下限，可確定閾值以從其測定Ct值。用於測定Ct值的其它方法在本領域是已知的，例如但不限於擬合點法(fit point method)的各種實施方案以及反曲法(sigmoidal method)的各種實施方案(參見,例如,美國專利號6，303，305;6，503，720; 6，783，934; 7，228，237和美國申請公布No. 2004/0096819;將所述專利和申請公布的公開內容通過引用整體併入本文)。此外，我們已發現使用的BSA的濃度越高，反應對血色素和腐殖酸抑制越耐受。然而，隨著BSA的量不斷增加，我們還確定dRn減小並且基線值(或本底信號)增加。如本文中所用，術語「dRn」或「ARn」是指標準化的報導分子信號(Rn)與本底信號(基線)之差(然後其通過被動參考信號被標準化)。Λ Rn可利用式[Rn+-RrT來測定，其中Rn+是包括所有組分(包括模板)的反應的Rn值，Rn-是未反應的樣品的值。令人驚訝地，通過使用此類組合的PCR抑制劑阻斷劑，例如魚膠和BSA，我們觀察到抑制劑耐受性的水平得到大大增強。因此，PCR抑制劑阻斷劑(包括但不限於魚膠和BSA或其組合)的添加在減輕通常在用於核酸分析的樣品中發現的多種PCR抑制劑的抑制中是有效的。可將PCR抑制劑阻斷化合物或試劑添加至本發明組合物以在工作溶液中產生0. 05mg/mL 至約 0. 8mg/mL、約 0. lmg/mL 至約 0. 6mg/mL,更特別約 0. 2mg/mL 至約 0. 4mg/mT,的濃度。還可以以例如約0. 05% (w/V)至約0. 8%(w/v)、約0. 2%(w/v)至約0. 4%(w/v),更特別地約0. 2%(w/v)至約0. 4%(w/v)的百分比終濃度添加PCR抑制劑阻斷劑。在一些方面，PCR抑制劑阻斷劑可使此類PCR抑制劑導致的PCR抑制的量與在不存在此類PCR抑制劑阻斷劑的情況下觀察到的抑制水平相比較減少至少I至100%。例如，抑制可被減小至少約1%、約2%、約5%、約10%、約20%、約50%、約75%、約100%或其間的任意百分數。此外我們已發現本發明組合物減少PCR的總運行時間。例如，總PCR運行時間與利用商購可得的預混合物的等同PCR相比較，可被減少至少約5%、約10%、約20%、約50%、約75%、約100%或其間任意百分比。可在PCR過程中發生的不期望的擴增反應通常在反應混合物的裝配過程中開始，或當熱循環儀正被加熱至初始變性溫度時發生。這些假反應可通過進行「熱啟動子」擴增來減小至最低程度。一般地，熱啟動技術限制必需反應組分的可用性直至升高的溫度(通常高於60° C)。存在用於進行熱啟動的幾種方法，包括手工技術、屏障、可逆的聚合酶失活和專門設計的髮夾型引物。手工熱啟動法需要研究人員扣留關鍵組分，通常鎂或聚合酶，直至反應物已被加熱。隨後添加被扣留的組分以起始反應。第二方法使用物理屏障(例如，石蠟)來將關鍵組分與模板和引物分隔。美國專利號5，565，339描述了使用石蠟屏障以在試管中將各種PCR試劑彼此隔開。美國專利號5，413，924描述了使用石蠟珠粒來隔離DNA聚合酶。熱啟動擴增的第三方法是可逆的聚合酶失活。將聚合酶與結合聚合酶的核苷酸結合結構域的抗體或寡核苷酸適體反應，從而使得聚合酶失活。例如，將針對Taq聚合酶的單克隆抗體例如可從Sigma獲得的抗-TaqDNA聚合酶抗體引入反應混合物。在加熱後，化合物與聚合酶解離，從而恢復酶活性。在另一個實例中，美國專利號5，677，152描述了其中化學修飾DNA聚合酶以確保其僅在升高的溫度下變得具有活性的方法。實現熱啟動擴增的另一個方法是設計將自我退火以形成特殊髮夾結構的引物。髮夾型引物在以髮夾構象存在時不能與靶核酸退火。髮夾型引物將在被加熱至變性溫度之前保持髮夾構象。然而，如果髮夾結構包括單鏈延伸，則髮夾結構本身類似對模板退火的引物，並且可導致鏈延伸。如本文中所用，術語「退火」和「雜交」可互換使用並且意指導致雙鏈體、三鏈體或其它高級結構的形成的一個核酸與另一個核酸的互補鹼基配對相互作用。在一些實施方案中，一級相互作用是通過沃爾森/克裡克和Hoogsteen型氫鍵合產生的鹼基特異性，例如A/T和G/C。在一些實施方案中，鹼基堆積和疏水性相互作用也促成了雙鏈體的穩定性。用於將核酸探針和引物與互補及大體上互補的靶序列雜交的條件也是公知的，例如如Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, B. Hames 和 S. Higgins, eds.，IRLPress, Washington, D. C. (1985) and J. Wetmur and N. Davidson, Mol. Biol. 31:349et seq.(1968)中描述的。一般而言，此類退火是否發生受到除其它以外，探針和互補靶序列的長度、pH、溫度、單價和二價陽離子的存在、雜交區域中G與C核苷酸的比例、介質的粘度以及變性劑的存在的影響。此類變量影響雜交所需的時間。因此，優選退火條件將取決於具體應用。然而，此類條件可由本領域技術人員常規地確定而無需過度實驗。此外，一般而言，本發明的探針和引物被設計來與靶序列互補，以便靶與探針或引物的雜交發生。然而，應理解，該互補性不必是完全的；可存在任何數目的鹼基對錯配，其將幹擾靶序列與本教導的單鏈核酸之間的雜交。然而，如果鹼基對錯配的數目是如此之大以致於在甚至最低的雜交嚴格度條件下雜交都不能發生，則序列與靶序列不互補。因此，本文中提及的「大體上互補」意指探針或引物與靶序列充分互補以在選擇的反應條件下雜交。
術語「標記」，如本文中所用，是指可用於提供可檢測的信號並且可被連接至核酸或蛋白質的任意原子或分子。標記可提供可通過螢光、放射性、比色法、重力分析法、X射線衍射或吸收、磁性、酶促活性等檢測的信號。在一些實施方案中，可檢測信號為可定量的信號。例如，標記可以是任何部分，其(i)提供可檢測的信號；(ii)與第二標記相互作用以修飾由第一或第二標記提供的可檢測信號；或(iii)賦予捕獲功能，例如，疏水性親和力、抗體/抗原、離子型絡合(ioniccomplexation)。本領域技術人員將理解,可將許多不同種類的報導標記單獨地或與一種或多種不同的標記組合地用於本教導。示例性標記包括但不限於螢光基團、放射性同位素、量子點、發色團、酶、抗原包括但不限於附加表位、重金屬、染料、磷光基團、化學發光基團、電化學檢測部分、親和標記物、結合蛋白、磷光體(phosphors)、稀土螯合劑、近紅外線染料包括但不限於「Cy. 7. SPh. NCS」、「Cy. 7. OphEt.NCS」、「Cy7. OphEt. C02Su」 和 IRD800(參見，例如，J. Flanagan 等人，Bioconjug.Chem. 8:751-56 (1997);和 DNA Synthesis with IRD800Phosphoramidite, L1-COR Bulletin#lll,L1-C0R, Inc.，Lincoln, NE)、電化學螢光標記，包括但不限於三(聯吡啶)釕(II)，也稱為Ru(bpy)32+、Os (I, 10-菲咯啉)2雙(二苯基膦基)乙烷2+，也稱為Os (phen) 2 (dppene) 2+、魯米諾/過氧化氫、Al (輕基喹啉_5_磺酸)、9，10- 二苯基蒽-2-磺酸酯和三(4-乙烯基-4'-甲基-2,2'-聯吡啶)釕(II)，也稱為Ru(v-bpy32+)等。突光報導分子一粹滅劑分子對已被摻入寡核苷酸探針中以監測基於突光報導分子與猝滅劑分子被分離或拉近至彼此的最小猝滅距離內的生物學事件。例如，已開發了其中報導分子螢光的強度因報導分子與猝滅分子的分離而增加的探針。還已開發了其中其螢光的喪失是因為猝滅分子被拉至與報導分子靠近的探針。此類報導分子-猝滅劑分子對探針已被用於通過監測由報導分子產生的螢光的出現或消失來監測雜交測定和核酸擴增反應，特別地聚合酶鏈式反應(PCR)。(例如，參見美國專利號6，030, 787)。示例性報導分子-猝滅劑對可選自噸染料包括螢光素和羅丹明染料。此類化合物的許多適當形式可廣泛地商購獲得，所述形式在其苯基部分上具有可用作結合的位點或用作至寡核苷酸的連接的鍵合功能性的位點的取代基。另一組螢光化合物為在α和β位具有氨基的萘胺。包括在此類萘胺化合物中的是包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽和2-對甲苯胺基-6-萘磺酸鹽。其它類型包括3-苯基-7-香豆素異氰酸酯、吖啶例如9-異硫氰酸吖啶和吖啶橙；N-(P-(2-苯丙噁唑基)苯基)馬來醯亞胺；苯並氧二唑、芪類、芘類等。
優選地，報導分子與猝滅劑分子選自螢光素和羅丹明染料。此類染料和用於至寡核苷酸的連接的適當連接方法描述於許多參考資料中，例如Khanna等人(citedabove);Marshall, Histochemical J.，7:299-303(1975);Menchen 等人，美國專利號5，188，934;Menchen等人，歐洲專利申請87310256. O;和Bergot等人，國際申請PCT/US90/05565。在另一個實施方案中，反應混合物可存在於用於擴增核酸分子的試劑盒中。根據該實施方案的試劑盒包括將容器例如小瓶、管、安瓿、板、瓶子等封裝在其中的運載工具例如箱載體例如箱、硬紙盒、管等。當在試劑盒(例如，DNA聚合酶和逆轉錄酶)中包括超過一種DNA聚合酶時，可將聚合酶作為兩種或更多種(例如，2、3、4、5種等)逆轉錄酶的混合物裝在單個容器中或裝在單獨的容器中。本發明的試劑盒還可包括(在相同或單獨的容器中)適當的緩衝液、核苷酸、PCR抑制劑阻斷劑、探針和/或引物。在一些實施方案中，將DNA聚合酶、PCR抑制劑阻斷劑、核苷酸和緩衝液組合在單個管或容器中。在另一個方面，試劑盒可包括用於核酸合成的組合物。可將此類組合物配製為濃縮原液(例如，2X、3X、4X、5X、6X等)。在一些實施方案中，可將組合物在單個管或容器中配製為濃縮原液，包含DNA聚合酶。在一些優選實施方案中，此類濃縮原液還可在緩衝液中包含PCR抑制劑阻斷劑、核苷酸、熱啟動組分和/或被動參考染料。在一些其它實施方案中，此類緩衝液可包含甘油、DMS0、Mg2+和/或去垢劑(例如TWEEN20或NP-40)。下列非限定性實施例進一步舉例說明本文中描述的各種實施方案。
實施例實施例1.示例性組合物.將示例性組合物配製為2倍濃縮原液，其包含熱穩定性DNA聚合酶、包含BSA和魚膠的PCR抑制劑阻斷劑的組合、緩衝鹽溶液、熱啟動組分、dNTP、甘油、非離子型去垢劑和被動參考染料。在如下文實施例中描述的許多測定中測試示例性PCR組合物。實施例2.利用示例性組合物的PCR的優良靈敏性、準確性、動力學範圍和特異性將實施例1的PCR組合物在一組13個TAQMAN 基因表達PCR測定中的性能與商購可得的組合物TAQMAN 通用PCR預混合物(MM;Life Technologies, Inc.)的性能相比較。按照製造商的關於測定法和MM的說明書進行測定，但在一組測定中用示例性組合物替換MM。單個裝配的20 μ L PCR包含下列組分正向PCR 引物(18 μ Μ)反向PCR 引物(18 μ Μ)TAQMAN 探針(5 μ Μ)核酸樣品(10至IOOng)TAQMAN 通用pcr預混合物或實施例1的組合物( ο μ L)， 不含RNA酶的水至20 μ L的總PCR體積對於測試13個TAQMAN 基因表達pcr測定的每一個，正向pcr引物、反向pcr引物和TAQMAN 探針為TAQMAN .基因表達測定混合物(20X)的組分。按照下列方面選擇用於進行測定組的PCR擴增的熱循環條件UNG步驟(任選的)50°C，2分鐘活化95°C，20秒(變性:95-970C /1-3 秒;延伸60-620C /20-30 秒)x40 個循環使用實施例1的組合物或商業MM在標準PCR儀上對每一個測定確定的閾值循環數(Ct)示於圖1。對於大多數測定，使用示例性組合物測定到比利用商業濃縮物測定到的Ct值更小的Ct值，這表明所述組合物比商購可得的濃縮物更靈敏。使用示例性組合物進行的PCR測定的大動態範圍示於圖2中，其顯示了來自在Applied Biosystems7500快速實時PCR系統上，於FNl TAQiVlAN 基因表達測定中使用所述試劑的2倍濃縮物的實施方案在4個重複反應中擴增的人cDNA的系列稀釋物的實時PCR的代表性擴增曲線。
使用各自推薦的方案和核酸樣品，將示例性組合物在一組TAQMAN 基因表達測定中的動態範圍與幾種商購可得的試劑混合物的動態範圍相比較。該比較的結果示於下面表2中。在表2中，顯示了每一個試劑混合物的檢測限值(LOD)的對數。檢測到的對數具有85-115%的PCR效率和大於O. 98的R2值。對於每一種試劑混合物在AppliedBiosystems7900HT快速實時PCR系統上運行6個重複反應。表2.示例性組合物與商購可得的試劑混合物之間比較的測定動態範圍
權利要求
1.聚合酶鏈式反應(PCR)組合物，其包含熱穩定性DNA聚合酶；和 PCR抑制劑阻斷劑，其中所述PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存
2.權利要求1的組合物，其中所述PCR抑制劑阻斷劑為蛋白質。
3.權利要求1的組合物，其中所述PCR抑制劑阻斷劑為白蛋白、明膠或其組合。
4.權利要求1的組合物，其中所述PCR抑制劑阻斷劑為牛血清白蛋白、魚膠或其組合。
5. 權利要求1的組合物，其中達到50 μ M血色素在裝配的PCR中被耐受。
6.權利要求1的組合物，其中達到15ng的腐殖酸/20 μ L反應體積在裝配的PCR中被耐受。
7.權利要求1的組合物,其中達到O.OlU/μ L肝素在裝配的PCR中被耐受。
8.上述權利要求的任一項的組合物，其還包含非離子型去垢劑。
9.權利要求8的組合物，其中所述非離子型去垢劑選自TRITONΧ-100⑧、Nonidet P-40(NP-40)、Tween20 和 Brij35。
10.權利要求1的組合物，其中所述組合物在室溫下穩定達48小時。
11.權利要求10的組合物，其中所述組合物在室溫下穩定達約72小時。
12.權利要求1的組合物，其中所述熱穩定性DNA聚合酶選自TaqDNA聚合酶、Tne DNA 聚合酶、Tma DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶、DEEPVENT DNA 聚合酶、其突變體或衍生物以及上述酶的組合。
13.權利要求1的組合物，其中所述熱穩定性DNA聚合酶的濃度為約100至約500個單位/暈升。
14.權利要求1的組合物，其還包含用於熱啟動PCR的試劑。
15.權利要求14的組合物，其中所述試劑為抗體、適體、髮夾型引物或隔離石蠟珠。
16.權利要求1的組合物，其還包含一種或多種脫氧核苷三磷酸。
17.權利要求1的組合物，其還包含尿嘧啶DNA糖基化酶。
18.權利要求1的組合物，其還包含被動參考對照。
19.權利要求1的組合物，其中所述組合物是濃縮原液。
20.權利要求1的組合物,進一步包含甘油。
21.
22.權利要求1的組合物，其中對於相同量的模板，所述組合物的檢測限度比商購可得的PCR試劑混合物低至少一個對數。
23.權利要求22的組合物，其中對於相同量的模板，所述組合物的檢測限度比商購可得的PCR試劑混合物低至少兩個對數。
24.權利要求1的組合物，其中對於相同量的模板，所述組合物在PCR中產生的閾值Ct 低於使用商購可得的PCR試劑混合物獲得的Ct。
25.包含權利要求1的組合物的試劑盒，其還包含對照核酸樣品和特異於對照核酸樣品中的DNA靶的PCR擴增的引物對。
26.權利要求25的試劑盒，進一步包含引物和探針。
27.用於進行核酸合成的方法，包括向反應容器中添加權利要求1的組合物； 向反應容器中添加核酸樣品和引物；和 使用核酸樣品作為模板合成核酸。
28.用於裝配聚合酶鏈式反應(PCR)的方法，包括 向反應容器中添加權利要求1的組合物；和 向反應容器中添加核酸樣品和引物。
29.權利要求28的方法，進一步包括對核酸樣品進行PCR。
30.用於通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增核酸的方法，包括 向反應容器中添加權利要求1的組合物； 向反應容器中添加核酸樣品和引物；和 對核酸樣品進行PCR。
31.用於通過通過聚合酶鏈式反應(PCR)檢測核酸的方法，包括 向反應容器中添加權利要求1的組合物； 向反應容器中添加核酸樣品和引物； 對核酸樣品進行PCR ;和 檢測擴增的靶。
32.用於阻斷PCR抑制劑對聚合酶鏈式反應(PCR)的抑制的方法，包括 向反應容器中添加權利要求1的組合物，其中所述組合物阻斷PCR抑制劑對PCR的抑制； 向反應容器中添加核酸樣品和引物；和 對核酸樣品進行PCR。
33.減少PCR抑制劑對聚合酶鏈式反應(PCR)的運行時間的方法，包括 向反應容器中添加權利要求1的組合物，其中所述組合物減少PCR的運行時間； 向反應容器中添加核酸樣品和引物；和 對核酸樣品進行PCR。
34.權利要求27的方法，其中所述PCR為單重PCR。
35.權利要求27的方法，其中所述PCR為多重PCR。
36.權利要求35的方法，其中所述多重PCR包括陽性對照。
37.權利要求27的方法，其中所述核酸樣品包含PCR抑制劑。
38.權利要求27的方法，其中所述核酸樣品獲自包含PCR抑制劑的來源。
39.權利要求37的方法，其中所述PCR抑制劑選自血色素、腐殖酸、肝素，或其組合。
40.權利要求27的方法，其中在向反應容器中添加組合物、核酸樣品和引物後達72小時時進行合成。
41.權利要求27的方法，其中模板以O.OOOOlng/μ I存在。
42.權利要求27的方法，其中對於相同量的模板，檢測限值比使用不含PCR抑制劑阻斷劑的PCR混合物的方法低至少一個對數。
43.權利要求42的方法，其中對於相同量的模板，檢測限值比使用不含PCR抑制劑阻斷劑的PCR混合物的方法低至少兩個對數。
44.權利要求27的方法，其中對於相同量的模板，閾值Ct比使用不含PCR抑制劑阻斷劑的PCR混合物的方法低 。
全文摘要
包含熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在。
文檔編號C12N15/10GK103038367SQ201180037906
公開日2013年4月10日 申請日期2011年6月21日 優先權日2010年6月21日
發明者C·特裡恩, T·徐, 施雅婷, F·N·勒, C·馬約裡班克斯 申請人:生命技術公司