用於轉基因植物安全性控制的基因刪除系統及含有其的植物表達載體的製作方法

2023-05-14 05:57:16 5

專利名稱：用於轉基因植物安全性控制的基因刪除系統及含有其的植物表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種解決轉基因植物生物安全性的高效基因刪除系統，具體地說，涉及基於來源於酵母的FLP/FRT和細菌噬菌體的Cre/loxP位點特異性重組酶(Site specific recombinase)系統。
本發明還涉及含有該基因刪除系統的植物表達載體。
背景技術：
上個世紀90年代發展起來的植物轉基因技術，隨著技術日趨成熟、應用日益廣泛，該技術已經成為增加作物產量、改善作物品質的一個重要手段。目前，在世界範圍內，轉基因作物的種植面積正在迅速增加，轉基因技術給人類帶來的好處日漸顯著。
儘管轉基因植物已經給人類帶來了巨大的利益，轉基因技術被認為是人類解決土地資源銳減和人口急劇膨脹這一矛盾最有效的方法之一，但由於該技術開發和利用的時間很短，人類對其生物安全性認識很有限，在科學界和社會公眾中，很多人對植物轉基因技術的安全性心存顧慮，認為目前人類還不能對轉基因技術潛在危險性做出正確的評價。特別是2001年David和Ignacio在《Nature》上發表論文指出，轉基因玉米可以通過花粉將外源基因轉移到其近緣物種，在全世界範圍內掀起了一場關於轉基因植物是否安全的爭論。
目前，人們對轉基因植物生物安全性的擔憂主要集中在①外源基因可能對生態環境和生物多樣性帶來不利的影響。如轉基因植物花粉或種子的擴散造成基因逃逸(Gene flow)，可能使外源基因轉移到雜草或近緣物種中，以及外源基因(如Bt基因)對非靶標生物的傷害，這些都可能給生態平衡和生物多樣性造成災難性的後果。②轉基因食品對人類健康的潛在危害。如一些殺蟲、抗菌基因以及過敏蛋白可能危害人類的健康，以及抗生素抗性基因逃逸到人類病原微生物中構成的潛在危險等等。
為了消除公眾對轉基因植物生物安全性的擔憂，近年來，一些生物技術如共轉化技術(Komari，T.et al，Plant J.1996，10165-174.)、位點特異性重組酶技術(Lyzniik，L.A.et al，Plant Cell Rep.2003，21925-932)等已經先後應用於轉基因植物生物安全性的控制中。但迄今報導的這些技術存在以下的缺點①目前這些技術主要關心的是將轉基因植物中的報告基因(如GUS基因或GFP基因)或抗性標記基因(如NPTII基因或Bar基因等)去除，而對其它改良作物品質、增加作物產量以及提高作物抗性等外源目的基因，在完成其功能後，並沒有從轉基因植物中刪除，這些外源基因依然可能逃逸到自然界中，對生態環境和人類健康構成威脅，公眾對轉基因植物及其食品安全性的擔憂也仍將存在。②上述技術刪除轉基因植物中外源基因的效率都比較低，只能在一定程度上刪除轉基因植物中的外源基因，無法滿足轉基因作物田間大面積釋放後高效刪除轉基因的要求，不能徹底解決轉基因植物中的生物安全性問題。③另外，這些技術往往需要通過雜交途徑或二次轉化等方法，才能實現對轉基因植物中外源基因的刪除，獲得無外源基因的植株，該過程周期太長，可操作性差。因此，現有的基因刪除技術均不能滿足轉基因植物安全性控制的需要。
比較而言，在這些技術中，來源於微生物的位點特異性重組酶系統在植物中的應用最為廣泛，其刪除效率也相對較高。目前，已經在植物上得到較多應用的位點特異性重組酶系統包括1)來源於細菌噬菌體P1(Bacteriophage P1)的Cre/loxP系統(Odell，J.et al，Mol.Gen.Genet.1990，223369-378.)。2)來自於酵母(Saccharomyces cerevisiae)2μ質粒的FLP/FRT系統(Lloyd，A.M.et al.Mol.Gen.Genet.1994，242653-657.)。所有重組酶系統完成重組過程所需元件僅僅包括重組酶(Recombinase)和該重組酶能特異識別的位點(Recognitionsite)，其工作原理也十分簡單，過程為重組酶識別並結合轉基因植物基因組中對應的特異性識別位點，形成所謂的Holliday結構，來自於重組酶C-端酪氨酸殘基的羥基基團產生親核攻擊，破壞識別位點裡不對稱8bp序列兩端的磷酸鍵，然後，參與重組反應的重組酶蛋白4個單體發生脂基轉移反應，基因組DNA分別解鏈，再重新連接，完成重組過程(Voziyanov，Y.et al，Nucleic AcidsRes.1999，27930-941.)。
通常情況下，位點特異性重組酶系統根據識別位點方向和位置的不同，能夠產生3種效應，分別為①當一對反向識別位點位於目的基因的兩端時，在對應重組酶的作用下，識別位點間的所有基因將發生倒置，即倒位(Inversion)。②當一對同向識別位點位於目的基因的兩端時，其相應的重組酶將刪除識別位點之間的所有外源基因和一個識別位點，最後在基因組中只留下一個識別位點，這就是重組(Recombination)。③如果識別位點分別位於細胞中不同的染色體上，那麼在對應重組酶的作用下，兩條染色體可以在識別位點的位置發生染色體片段的互換，產生雜合的染色體，這種作用就叫作位置互換(Translocation)。
Cre重組酶是整合酶家族中的一員，其基因表達是一個38kD大小的蛋白質分子，它能特異識別位點loxP，調節loxP位點的分子內(切除、反接)和分子間(整合)的特異性重組。loxP是一段34bp的DNA序列，兩端是兩個13bp的反向重複序列，中間有一個8bp非對稱間隔區域，Cre重組酶與非對稱間隔區域識別結合後，將兩個反向重複序列間的DNA片段切除。這個過程不需要其它任何輔助因子。
利用重組酶Cre/loxP系統對抗生素標記基因進行刪除主要有幾種方式，最早主要採用雜交的方式是，將重組酶基因導入到含識別位點和抗生素標記基因的轉基因植物中去，從而刪除標記基因。1991年，Dale等報導將標記基因NPTII置於兩個loxP位點之間，通過表達Cre重組酶基因，可將標記基因NPTII從轉基因植物基因組中切除。後來Russell等(1992)和Srivastava等(1999)都有成功的報導。這個方法需要在受體基因組內引入重組酶基因，剔除標記基因後還必須經過雜交和有性世代的遺傳分離，去除重組酶基因，因此操作複雜，實驗需要的時間很長。
作為改進，重組酶基因Cre、識別位點loxP以及標記基因放在同一表達載體上，Cre基因的表達受組織特異性啟動子或化學誘導型啟動子的控制，標記基因就可以在轉基因植物生長的任何組織或任何階段被刪除。Zuo等(2001)採用化學誘導啟動子獲得了一個Cre/loxP自動刪除系統，同樣，Hoff等(2001)以及Zhang等(2003)利用熱激蛋白啟動子啟動Cre基因的表達，分別在擬南芥和玉米愈傷組織中也自動刪除了標記基因。與雜交系統相比，自動刪除系統有以下幾個明顯的優點1)Cre基因的表達在轉基因植物的T0代就可以表達，簡化了操作程序，節約了時間。2)自動刪除系統中Cre基因只在需要的時候才表達，且表達的時間很短，避免了Cre基因長時間大量表達對植物造成的傷害。3)這是目前唯一能在無性繁殖植物品種中刪除標記基因的刪除系統。
Mlynarova和Nap在2003年報導了一個將Cre/loxP自動刪除和二次轉化相結合的新的刪除系統，在這個系統中，Cre基因的表達量受到了限制。他們轉化菸草後發現，少量的Cre基因表達足以滿足刪除標記基因的需要，而且相對於組成型表達，其刪除效率更高。
在FLP/FRT系統中，重組酶的識別位點由三個重複的13bp鹼基片段構成，其中的兩個片段鹼基方向完全相同，另一個片段則與這兩個片段的方向相反，這兩部分之間被一個不對稱的8bp間隔子(Spacer)隔開，整個識別位點的方向由該間隔子決定。48kD的FLP重組酶特異性識別FRT重組酶位點，FRT的方向性決定了FLP重組酶與之結合後，DNA片段是被重組還是被倒置。
FLP/FRT系統首先被Lyznik等在1993年應用到玉米和水稻的瞬時表達系統中，在他們的實驗裡，其中一個工程載體包含有uidA基因，但它的啟動子和編碼序列之間有一段1.31kb的DNA片段將其隔開，使該基因不表達，在這個片段兩端分別有一個FRT識別位點，當FLP重組酶作用於兩個同向識別位點後，將把這個片段切除掉，GUS報告基因就可以表達。另一個工程載體則只包含有adh1啟動子或Ubiquitin啟動子和FLP重組酶。當FLP基因在adh1啟動子啟動下，兩個載體通過共轉化方式倒入到原生質體中，GUS蛋白的活性恢復了陽性對照的10％。當FLP基因如果被Ubiquitin啟動子作用時，GUS基因的活性可以達到60％～90％。另外，當識別位點FRT中的重複序列為3個(48bp)時，GUS基因的表達可以達到25％～50％，但如果FRT中的重複序列僅為兩個(37bp)時，GUS基因的活性反而更高(60％～90％)。
1994年，Lloyed和Davies將FLP/FRT位點特異性重組酶系統穩定轉化到菸草中去。表達FLP重組酶的植物與帶有FRT識別位點的植株雜交，在T1代中，重組酶的刪除效率為70％。在玉米細胞的穩定遺傳轉化中，Lyznik等(1996)發現通過二次轉化將FLP基因和FRT識別位點共同轉入植物，得到的愈傷組織中，4個中只有1個有GUS基因的表達，說明這種轉化方法中重組的效率更低。Luo等(2000)採用雜交的方法，將FLP重組酶基因導入到擬南芥中，獲得了很高的刪除效率。
目前，已有的位點特異性重組酶系統存在著以下明顯的缺點一是在這些系統中，重組酶基因一般都通過再轉化或雜交的方法導入植物，這就帶來了問題，當重組酶基因完成其功能，將需要刪除的片段去除後，重組酶基因本身也是多餘的，需要將其從轉基因植物中刪除掉，當然，通過後代遺傳分離的方式，得到沒有重組酶基因的植株也是可能的，但這樣就很費時間，而且對於轉基因植物材料是以無性生殖的植物品種那就很難了。對於Cre/loxP系統，為了克服這個缺點，Gleave等通過Cre基因在菸草中瞬時的表達，已經得到了無Cre基因的轉基因植株。在這篇報導中，作者在沒有抗生素篩選的情況下，從773株再生苗中，得到了兩株含有loxP位點，但沒有Cre基因的轉基因植株。雖然這個方法確實可以在沒有雜交和後代分離的情況下，得到了無重組酶基因的轉基因植株，但由於這種方法效率低，而且需要做二次轉化，大大限制了該方法在實際生產中的應用。
另一個潛在的問題是，我們目前還不十分清楚重組酶基因在轉基因植物的大量表達，到底對植株有多大不利的影響。比如目前可以肯定的是Cre基因在馬鈴薯和矮牽牛中表達能夠顯著地抑制其生長，最近在菸草中也有類似的報導(Coppoolse，E.R.et al，Plant Mol.Biol.2003，51263-279.)。但目前我們還不知道，這種影響是因為Cre蛋白大量存在所產生的毒害作用引起的呢？還是由於其在基因水平上所造成的影響。如果是前者，隨著Cre基因的不表達或弱表達，這種毒害就會隨之消失；但如果是後者，這種影響可能就更長久一些。
更為關鍵的問題是，現有的位點特異性重組酶系統，主要考慮的是如何刪除將轉基因植物中的標記基因、報告基因，對於目的基因和重組酶基因本身，並沒有被刪除，而且這些重組酶系統刪除外源基因的效率均不夠高，很難滿足在田間大規模釋放的轉基因作物中，完全刪除外源基因，這大大限制了位點特異性重組酶系統在實際生產上的應用。
前人的研究發現，儘管重組酶系統Cre/loxP和FLP/FRT來源於不同微生物，但識別位點loxP和FRT的基本結構非常相似，兩者都是由兩端2個13bp的反向重複序列和中間一個8bp的非對稱間隔序列(Spacer)構成。Lauth等(Lauth，M.et al.，Nucleic Acids Res.30115-128)研究發現，將loxP和FRT分別置於目的基因的兩端，在重組酶Cre或FLP的作用下，能夠提高重組酶蛋白識別和刪除的效率。

發明內容
鑑於以上情況，為了獲得高效的基因刪除系統，解決轉基因植物生物安全性問題，實現通過轉基因植物獲得非轉基因產品的目的，本發明以位點特異性重組酶刪除技術為基礎，針對該技術目前在轉基因植物中存在的轉基因刪除效率低的問題，構建新的高效基因刪除系統。據此，構建了一個包含識別位點loxP和FRT的融合識別位點loxP-FRT，獲得了一個全新的基因刪除系統，希望該系統能夠增強重組酶蛋白對識別位點序列的識別、結合以及切割作用，提高位點特異性重組酶系統在轉基因植物中對外源基因的刪除效率。
本發明的一個目的在於提供一種用於轉基因植物安全性控制的高效基因刪除系統，其含有融合的位點特異性重組酶系統Cre/loxP和FLP/FRT，該系統能夠在轉基因植物發育的特定發育階段將其特定組織或器官中的外源基因徹底刪除。
本發明的另一個目的在於提供一個融合的特異性識別位點核苷酸序列loxP-FRT，其至少包含34bp的loxP序列(如SEQ ID NO.1所示)和48bp的FRT序列(如SEQ ID NO.2所示)；更進一步地，考慮到當兩個識別位點在一起，由於重組酶結合將佔有一定的位置，在這種情況下如果識別位點直接相連接，將影響下一個重組酶結合到識別位點，因此可以在loxP與FRT之間插入一段間隔序列，而提高重組酶的結合效率，在本發明的一個具體實施方式
中，插入了一個4bp的間隔序列，構建成如SEQ ID NO.3所示的特異性識別位點序列。
本發明的再一個目的在於提供一種含有上述基因刪除系統的植物表達載體，其將上述基因刪除系統與植物的組織特異性啟動子基因連接構建成植物表達載體，可在特定的植物器官中刪除外源基因。
本發明的又一個目的在於提供一種製備安全轉基因植物的方法。
根據本發明的一方面，一種用於轉基因植物安全性控制的基因刪除系統包括兩個同向的融合特異性識別位點loxP-FRT，在兩個特異性識別位點之間包含一段多克隆位點序列，所述多克隆位點用於插入各種需要導入植物中的目的基因序列，例如報告基因、篩選基因以及需轉化入植物內的外源基因。
在本發明的一個具體實施方案中，採用人工化學合成的方法得到一段核苷酸序列loxP-FRT-MCS-loxP-FRT，該序列包括兩個同向的融合特異性識別位點loxP-FRT，其間包含一段多克隆位點(Multiple Cloning Sites，MCS)序列。融合識別位點loxP-FRT共86bp，其中包括34bp的loxP序列、48bp的FRT序列以及在兩個識別位點之間4bp的間隔序列，序列如SEQ ID NO.4所示，將該核苷酸序列插入到質粒載體pBIN19上。
同時，本發明也構建了融合基因35S-GUS∷NPTII-Nos，並將該融合基因片斷插入到loxP-FRT-MCS-loxP-FRT片段的多克隆位點中。在構建的融合基因中，GUS作為報告基因，NPTII作為篩選基因。
根據本發明的另一方面，為了控制重組酶基因在特定植物器官中的表達，從而可以有目的地從特定的植物組織器官中刪除外源基因，本發明提供了含有本發明基因刪除系統的植物表達載體。通過將植物特定器官的組織特異性啟動子序列插入本發明的基因刪除系統中構建成本發明的植物表達載體，這些組織特異性啟動子包括但不限於花粉特異性啟動子、花器官和胚早期特異性表達的啟動子，還包括根特異性啟動子、葉特異性啟動子等等其他植物特異性啟動子。
在本發明的一個具體實施方案中，通過PCR方法從油菜基因組中克隆了BGP啟動子，插入到FLP-Nos片段前，得到BGP-FLP-Nos，再將該片斷引入質粒載體pBIN19上人工合成序列的多克隆位點中，獲得最終的植物表達載體，將其命名為pLF-BGP-FLP-GN。將pLF-BGP-FLP-GN載體轉化根癌農桿菌，並轉化菸草。將花粉特異性啟動子BGP與FLP基因融合，可以控制基因刪除系統在轉基因植物的花粉中特異表達，以刪除轉基因植物花粉中所有的外源基因。
在本發明的另一個具體實施方案中，採用類似方法，克隆了一個來自於擬南芥基因組花器官和胚早期特異性表達的啟動子PAB5，將其插入到FLP-Nos片段前，在將PAB5-FLP-Nos片斷引入質粒載體pBIN19上人工合成序列的多克隆位點中，獲得植物表達載體，將其命名為pLF-PAB5-FLP-GN。將PAB5啟動子融合到重組酶FLP基因的上遊，可以控制基因刪除系統在轉基因植物的花粉和種子中特異表達，以刪除轉基因植物花粉和種子中所有的外源基因。
根據本發明的再一方面，製備安全的轉基因植物的方法，包括將本發明的基因刪除系統、組織特異性啟動子與外源基因構建成植物表達載體轉化植物而獲得安全的轉基因植物。
採用GUS組織染色、PCR鑑定和Southern雜交等手段對本發明的轉基因植株進行檢測，確定轉基因植物外源基因的拷貝數。此外，分別對轉基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物的不同組織進行GUS染色，發現在轉基因植株的根、莖、葉中，轉基因能夠正常表達，說明重組酶基因FLP在花粉和種子特異性啟動子驅動下沒有在營養器官中表達，外源基因的表達沒有受到影響。通過對轉基因菸草花粉和種子中的GUS基因進行檢測，在轉基因pLF-BGP-FLP-GN菸草花粉中，GUS組織染色後的結果說明，外源基因被完全刪除。而在轉基因pLF-PAB5-FLP-GN菸草中花粉和種子GUS組織染色後的結果，說明在轉基因植物花粉和種子中，外源基因同樣都被完全刪除。
為了進一步確證外源基因的徹底刪除，將轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物花粉與野生型菸草進行雜交，雜交後代GUS組織染色顯示，沒有外源基因存在。同樣地，將轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物分別自交，以及與野生型雜交，對自交和雜交後代分別進行GUS組織染色，結果都沒有發現外源基因的表達。上述結果表明，在轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物中，轉基因在花粉基因組被特異性地刪除，而在轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物的花粉和種子中，轉基因都已經被徹底刪除。
通過對pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN基因刪除系統在轉基因菸草中的刪除效率進行了統計，統計結果顯示兩者的刪除效率都達到了100％。
另外，為了確證外源基因是否徹底刪除，分別對刪除後的轉基因植物採用Southern雜交和PCR進行檢測，結果都沒有發現外源基因的檢測信號。進一步對PCR擴增獲得的殘餘片進行測序驗證，結果顯示，在轉基因植物基因組僅殘留了一個loxP-FRT融合識別位點。
因此，本發明成功地構建了基因刪除系統和包含該刪除系統的植物表達載體，該刪除系統大大高於現有基因刪除系統的刪除效率。
為了更好地理解本發明的本質，下面結合附圖，通過對本發明較佳實施方式的描述，詳細說明但不限制本發明。
附圖的簡要說明

圖1為PCR擴增人工合成序列FRT-MCS-FRT和loxPFRT-MCS-loxPFRT的電泳圖譜其中，泳道1，FRT-MCS-FRT片段，161bp；泳道2，loxPFRT-MCS-loxPFRT片段，237bp；泳道MMDNA marker；圖2為PCR擴增花粉特異性啟動子BGP和花器官及胚早期特異性啟動子PAB5的電泳圖譜其中，泳道1為花粉特異性啟動子BGP；泳道2為花器官及胚早期特異性啟動子PAB5；CK為陰性對照，水作為模板；圖3為PCR擴增CaMV 35S啟動子、GUS基因和NPTII-Nos基因片段的電泳圖譜其中，泳道MMDNA marker，泳道1為CaMV 35S啟動子；泳道2為GUS基因；泳道3為NPTII-Nos基因片段；圖4為pLF-GN質粒結構圖；圖5為pF-BGP-FLP-GN質粒結構圖；圖6為pLF-BGP-FLP-GN質粒結構圖；圖7為pLF-PAB5-FLP-GN質粒結構圖；圖8為PCR驗證轉基因pF-BGP-FLP-GN和pLF-BGP-FLP-GN植物的結果其中，MM，DNA分子Marker；CK為陰性對照；泳道10，陽性對照；泳道1、2、3、4、5分別代表GUS染色結果呈陽性的轉基因pF-BGP-FLP-GN植物植株2、5、6、10、12的PCR檢測結果；泳道6、7、8、9分別為GUS染色結果呈陽性的轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株2、4、6、9的PCR檢測結果。
圖9為PCR分子驗證轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植株的結果其中，MM，DNA分子Marker；CK，陰性對照；泳道6，陽性對照；泳道1、2、3、4、5、7、8、9、10分別代表GUS染色結果呈陽性的轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植株1、2、4、5、9、11、13、15、16的PCR檢測結果；圖10為Southern雜交驗證轉基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植株結果其中，AMM，DNA分子marker；F2、F4、F6分別為轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株2、4、6的基因組DNA被HindIII酶切後的電泳圖譜，F9、F11分別為轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物植株9、11的基因組DNA被HindIII酶切後的電泳圖譜；WT，為野生型植株，作為陰性對照。BMM，DNA分子marker；F2、F4、F6、F9、F11分別為轉基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物植株2、4、6和9、11，WT為野生型植株，作為陰性對照。結果顯示，植株2為多拷貝T-DNA片斷插入，植株4、6、9為單拷貝，植株11為兩個拷貝。DNA探針為GUS基因的酶切片段；圖11為GUS基因在轉基因pLF-BGP-FLP-GN菸草不同組織中的表達情況其中，(A)葉片(橫切)；(B)莖(橫切)；(C)根；(D)花(縱切)；圖12為GUS基因在轉基因pLF-PAB5-FLP-GN菸草不同組織中的表達情況其中(A)葉片(橫切)；(B)莖(橫切)；(C)根；(D)花(縱切)；圖13為轉基因pLF-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物T0代花粉GUS染色後不同時期的顯微觀察結果其中，A，為菸草時期7的花；B，菸草時期12的花；C，轉基因pLF-GN植物T0代時期7時花粉GUS組織染色；D，轉基因pLF-GN植物T0代時期12時花粉GUS組織染色；E，轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物T0代時期7時花粉GUS組織染色；F，轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物T0代時期12時花粉GUS組織染色；G，轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物T0代時期7時花粉GUS組織染色；H，轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物T0代時期12時花粉GUS組織染色；圖14為轉基因pLF-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN菸草T0代植株與野生型雜交後代幼苗的GUS組織染色結果其中，A轉基因植物pLF-GN自交後代幼苗的GUS染色；B轉基因植物pLF-GN(父本)與野生型菸草(母本)雜交後代幼苗的GUS染色；C轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物自交後代幼苗的GUS染色，含有loxPFRT融合識別位點的重組酶刪除系統；D轉基因植物pLF-PAB5-FLP-GN自交後代幼苗的GUS染色；E轉基因植物pLF-BGP-FLP-GN(父本)與野生型菸草(母本)雜交幼苗的GUS染色；F轉基因植物pLF-PAB5-FLP-GN(父本)與野生型菸草(母本)雜交後代幼苗的GUS染色。實驗中所用轉基因植株均為單拷貝植株；圖15為轉基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物及其與野生型雜交後代的Southern雜交結果其中，F4和F6中基因組DNA來自轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4和6的T0代；F4×WT、F6×WT、F9×WT分別代表轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物株系4、6、9的T0代作為父本與野生型作為母本雜交，提取雜交後代基因組DNA做Southern分析的結果；F11×WT代表轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物株系11的T0代作為父本與野生型作為母本雜交，提取雜交後代基因組DNA做Southern分析的結果；WT為野生型菸草，作為陰性對照；圖16為PCR擴增轉基因pLF-BGP-FLP-GN的T0植物及其與野生型菸草雜交後代中殘餘片段的瓊脂糖凝膠電泳結果其中，wt-A為野生型菸草以開花前基因組DNA作為模板PCR擴增的結果，F4-A、F6-A、F9-A分別為以轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4、6、9開花前基因組DNA作為模板PCR擴增的結果。wt-B為野生型菸草以開花後基因組DNA作為模板PCR擴增的結果，F4-B、F6-B、F9-B分別為以轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4、6、9與野生型菸草雜交後代基因組DNA作為模板PCR擴增的結果；圖17為構建的FRT-MCS-FRT的序列結構示意圖；圖18為構建的loxPFRT-MCS-loxPFRT的序列結構示意圖。
發明的
具體實施例方式
本發明所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品。
實施例1植物表達載體的構建1、FRT-MCS-FRT和loxPFRT-MCS-loxPFRT片段的克隆為了獲得FRT-MCS-FRT片斷(MCS為多克隆位點Multiple Cloning Sites)，合成以下引物序列引物序列P15′GCGAATTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCGGTACCTAT3′P25′GTCGACGTAGAGCTCGACTCGAGAAGGATCCTTCCCGGGGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATA3′P35′GGAACTTCGGAATAGGAACTTCGCTAGCGGC3′P45′TCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAATTCGC3′P55′GGATCCTTCTCGAGTCGAGCTCTACGTCGACATAGGTACCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTAT3′P65′GCCGCTAGCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCCCGGGAA3′FRT-MCS-FRT的序列結構請參見圖17所示。
為了獲得loxPFRT-MCS-loxPFRT片斷，合成帶有兩個同向loxP-FRT融合識別位點序列，在兩個位點之間含有一個多克隆位點序列(MCS)，具體過程和序列如下引物序列P15′GCGAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAC-GAAGTTATGACCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAG3′P25′AATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCGGTACCTA-TGTCGACGTAGAGCTCGACTCGAGAAGGATCCTT3′P35′CCCGGGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAA-GTTATCTGAGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAA3′P45′TAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCGCTAGCGGC3′P55′TATAATGTATGCTATACGAAGTTATGAATTCGC3′P65′TAGGTACCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATT-CTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGGTCATAACTTC3′P75′CGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCCGGGA-AGGATCCTTCTCGAGTCGAGCTCTACGTCGACA3′P85′GCCGCTAGCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTAT-TCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCTCAGATAACTT3′loxPFRT-MCS-loxPFRT的序列結構請參見圖18所示，核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
根據上述序列和引物，通過人工合成的方式得到全序列後，退火，並以兩端的引物作為擴增引物，用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，USA)進行PCR擴增。反應成分人工合成DNA產物(25ng/μL) 2微升dNTP(各10mM) 2微升氯化鎂(5mM)+10倍緩衝液 2微升上遊引物、下遊引物(各100μM) 2微升Platimum Pfx DNA聚合酶 2UDNA聚合酶10倍緩衝液5微升總反應體積 50微升
PCR擴增條件如下94℃，1min，然後室溫下緩慢退火至20℃，放置10min。然後94℃，1min，58℃，1min，72℃，30s，20個循環。最後72℃延伸10min。PCR擴增獲得了約240bp的導向片段，並引入相應酶切位點，擴增後凝膠電泳的結果見圖1。
PCR產物經小量膠回收試劑盒(Qiagene，USA)純化後，以EcoRI/NheI雙酶切，然後克隆於pUCm-T(Takara，USA)。用EcoRI/NheI雙酶切鑑定，獲得的陽性克隆再測序(PE公司，377測序儀；University of Connecticut，USA)驗證，測序正確的質粒命名為pUC-F和pUC-LF。
2、花粉特異性啟動子BGP的克隆根據Xu等(Xu，H.et al，Mol.Gen.Genet.1993，239，58-65)的報導分別合成兩對引物，上遊引物為5′GCGGTACCTATCATTCCTTTAATTTCAAGG3′(KpnI)，下遊引物為5′GTCTGCAGTTGGAGAGGAGATGGGTTG3′(PstI)，從油菜(Brassica napus)基因組中，PCR擴增出花粉特異性啟動子BGP。
反應成分基因組DNA(25ng/μL) 2微升dNTP (各10mM) 2微升氯化鎂(5mM)+10倍緩衝液 2微升上遊引物、下遊引物(各100μM)2微升Platimum Pfx DNA聚合酶 2UDNA聚合酶10倍緩衝液 5微升總反應體積 50微升反應參數95℃，5分鐘。94℃，1分鐘，56℃，1分鐘，72℃，1分鐘，35個循環。72℃延伸10min。
擴增後凝膠電泳的結果見圖2，PCR產物經小量膠回收試劑盒純化後，以KpnI/PstI雙酶切，然後克隆於pBlue-FLP-Nos(O′Gorman，S.et al，Science，1991，12511351-1355)。用KpnI/PstI雙酶切鑑定，獲得的陽性克隆再測序(PE公司，377測序儀；University of Connecticut，USA)驗證，測序正確的質粒命名為pBlue-BGP-FLP-Nos。
3、花器官和胚早期特異性啟動子PAB5的克隆根據Belostotsky等(Belostotsky D.A.et al.，Plant Cell 1996，81261-1275)的報導，分別合成兩對引物，上遊引物為5′GGCGGTACCCTAGAAAGAGAACCAGGGAC3′(KpnI)，下遊引物為5′CGGCTGCAGCCCCGAATTCCAGATGCAAC3′(PstI)，從擬南芥(Arabidopsis tanefacien)基因組中，PCR擴增出花粉特異性啟動子PAB5。
反應成分除了模板DNA為擬南芥DNA外，其他都相同於擴增BGP啟動子的成分，反應條件也基本相同。
擴增後凝膠電泳的結果見圖2，PCR產物經小量膠回收試劑盒純化後，以KpnI/PstI雙酶切，然後克隆於pBlue-FLP-Nos。用KpnI/PstI雙酶切鑑定，獲得的陽性克隆再測序(PE公司，377測序儀；University of Connecticut，USA)驗證，測序正確的質粒命名為pBlue-PAB5-FLP-Nos。
4、35S-GUS-NPTII-Nos融合基因的獲得參照Fabijanski等專利(Fabijanski，S.F.，Robert，L et al，WO 0159086 andGenBank Accession No.M26402GUS∷NPTII fusion.2001)，構建GUS基因和NPTII基因的融合基因。
具體過程為首先根據Chen等的報導(Chen，P.Y.et al，Mol.Breed.2003，11287-293)，分別合成兩對引物，上遊引物為5′GGTCTAGAATGATTGAACAAGATGGATT-G3′(含XbaI)，下遊引物為5′GGGTCGACAGACTCCCCGATCTAGTAAC-ATAGTA3′(含SalI和SacI)。採用上述引物，以pBI121質粒DNA為模板，用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，USA)進行PCR擴增。
反應成分除了模板DNA為質粒pBI121外，其他都相同於擴增BGP啟動子的成分。
反應參數95℃，5分鐘。94℃，1分鐘，57℃，1分鐘，72℃，1.5分鐘，20個循環。72℃延伸10min。
擴增後凝膠電泳的結果見圖3，PCR產物經小量膠回收試劑盒純化後，將NPTII-nos片段通過XbaI/SacI酶切位點裝入到pBluescript II KS(+)上，用XbaI/SacI雙酶切鑑定，獲得的陽性克隆再測序驗證，測序正確的克隆命名為pBlue-NPTII-Nos。
採用上述同樣的方法，通過PCR擴增的方式獲得GUS基因片段，根據Chen等的報導合成以下引物，上遊引物為5′GGTCIAGAATGTTACGTGGTG-TAGAAACC3′(XbaI)，下遊引物為5′GGGGATCCTCATTGTTTGCCTCCC-TGCT3′(BamHI)。採用上述引物，以pBI121質粒DNA為模板，用高保真的Puf DNA聚合酶(Invitrogen，USA)進行PCR擴增。
反應成分除了模板DNA為質粒pBI121外，其他都相同於擴增BGP啟動子的成分。
反應參數95℃，5分鐘。94℃，1分鐘，57℃，1分鐘，72℃，1.5分鐘，20個循環。72℃延伸10min。
最後通過PCR擴增CaMV 35S組成型啟動子，合成PCR引物，上遊引物為5′CCCTCGAGCCAGTATGGACGATTCAAGGC3′(XhoI)，下遊引物為5′CCGGATCCCGTGTTCTCTCCAAATGAAATG3′(BamHI)。以pBI121質粒DNA為模板，用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，USA)進行PCR擴增。
反應成分除了模板DNA為質粒pBI121外，其他都相同於擴增BGP啟動子的成分。
反應參數95℃，5分鐘。94℃，1分鐘，56℃，1分鐘，72℃，1分鐘，20個循環。72℃延伸10min。
擴增後凝膠電泳的結果見圖3，PCR產物經小量膠回收試劑盒純化後，將GUS基因片段通過XhoI/BamHI酶切位點裝入到pBlue-GUS∷NPTII上，用XhoI/BamHI雙酶切鑑定，獲得的陽性克隆再測序驗證，並命名為pBlue-35S-GUS∷NPTII。在該融合基因兩端分別含有一個XhoI和SalI位點，以便下一步構建。
5、植物表達載體的構建用EcoRI/NhEI雙酶將FRT-MCS-FRT和loxPFRT-MCS-loxPFRT片段分別從中間載體pEGFP-F和pEGFP-LF上切下，插入植物載體pBIN19(Bevan，M.Binary，Nucl.Acids Res.1984，12，8711-8721)的相應位點，在將GUS∷NPTII融合基因從載體pBlue-35S-GUS∷NPTII上用XhoI/SalI切下，插入到FRT-MCS-FRT和loxPFRT-MCS-loxPFRT片段中間的多克隆位點(MSC)中，得到載體pF-GN和pLF-GN(loxP簡寫為L，FRT簡寫為F，35S-GUS∷NPTII簡寫為GN)，質粒結構圖見圖4。
用KpnI和SalI雙酶從中間載體上pBlue-BGP-FLP-Nos切下BGP-FLP-Nos基因片段，插入到載體pF-GN和pLF-GN上的GUS∷NPTII融合基因前面的KpnI和SalI酶切位點之間，獲得植物表達載體pF-BGP-FLP-GN和pLF-BGP-FLP-GN，質粒結構圖見圖5和圖6。同樣地，用KpnI和SalI從中間載體pBlue-PAB5-FLP-Nos上切下PAB5-FLP-Nos片段插入到載體pLF-GN上的GUS∷NPTII融合基因前面的KpnI和SalI酶切位點之間，獲得植物表達載體pLF-PAB5-FLP-GN質粒結構圖見圖7。
將各個質粒採用液氮凍融法轉化到根癌農桿菌LBA 4404中。
實施例2轉基因菸草植株的獲得種子消毒方法清水浸泡半小時，70％酒精消毒30秒，10％次氯酸鈉溶液浸泡15分鐘，在用無菌水漂洗3-4次；消毒後的種子置於1/2MS固體培養基上，於25℃的光照培養箱中培養成無菌苗，取葉片進行轉化。
根癌農桿菌的培養首先從-80℃低溫保存菌株中劃平板，在平板上挑單菌落，置於液體YEB+50mg/L卡那黴素培養基中，於28℃(200轉/分鐘)搖床上培養28-36小時，取出200μl菌液於20ml液體YEB+50mg/L卡那黴素培養基中，繼續培養4-6小時，至OD600值＝0.8左右，6000轉/分鐘離心10分鐘收集菌體，棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，用於菸草轉化。
菸草轉化採用葉盤法轉化，在超淨工作檯內用消毒後的刀片切割外植體為0.5cm2左右，將切好的外植體放入菌液中浸泡10分鐘左右，用無菌濾紙吸去葉片表面的菌液。
將葉片轉入無抗生素的MS固體培養基中，置於暗箱中培養2-3天，然後將葉片轉入含有50mg/L卡那黴素的篩選培養基(MS固體培養基+100mg/L頭孢酶素+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA)中，在25℃光照為2000～10000lux條件下進行選擇培養，選擇培養的時間大約為3～4周，期間每兩周更換一次新鮮的篩選培養基，直至抗性芽及植株產生，去其中的葉片用於進一步檢測。
GUS檢測將轉基因植物材料(葉片、莖、根等)切成薄片，放入新鮮配置的X-Gluc染色液(Promega，USA)中，37℃保溫1～12小時。待充分染色後，用75％(v/v)酒精脫色2～3次，至對照材料(野生型植物)呈白色。花粉和種子由於包被角質層和種皮，X-Gluc染色液難以浸透，為了染色充分，通常情況下，加入X-Gluc染液後，先抽真空5～10分鐘，再按以上程序進行GUS組織染色。
PCR檢測提取植物基因組DNA，採用CTAB法，過程如下將液氮速凍後的幼嫩葉片研磨成粉末，轉移至10ml的離心管中，加入65℃預熱的CTAB提取緩衝液(0.1g/ml)，劇烈震蕩混勻。65℃水浴45分鐘，其間顛倒混勻2～3次。加入與提取緩衝液等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，渦旋混勻3～5分鐘，然後6000轉/分鐘，常溫離心15分鐘，將上清液轉移到一新離心管中。加入2/3倍於上清液體積的異丙醇，充分混勻後室溫放置2小時以上。在離心管中可見白色絮狀沉澱，可用玻璃棒挑出，放入75％(v/v)的酒精漂洗2～3次；也可直接10000轉/分鐘室溫離心10分鐘收集沉澱，用75％(v/v)的酒精洗滌沉澱。空氣乾燥後，加入適量的TE溶解沉澱即得到基因組DNA。電泳檢測植物總DNA含量。PCR檢測再生植株中的NPTII抗性基因，合成其兩端引物，上遊引物為5′-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3′，下遊引物5′-TCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′。
反應成分除了模板DNA為轉基因菸草基因組DNA外，其他都相同於擴增BGP啟動子的成分。
反應參數95℃，5分鐘；94℃，1分鐘，56℃，1分鐘，72℃，1分鐘，40個循環。72℃延伸10min。
轉基因pF-BGP-FLP-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN菸草PCR檢測的結果見圖8和圖9。
Southern雜交分析為進一步證明外源基因已經導入轉基因植物中，分別選取轉基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物中的5個T0代植株進行了Southern雜交驗證，同時確定了這幾個植株外源基因插入轉基因菸草基因組中的拷貝數。採用常用的CTAB法提取10μg植物基因組DNA用限制性內切酶HindIII充分酶切，然後在1.0％(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳，瓊脂糖電泳結果見圖10-A。再按《分子克隆實驗指南》(2001年，第三版)的高鹽法進行轉膜、預雜交、雜交、洗膜和放射自顯影。將pBI121質粒DNA的GUS片段，用RadPrime random primer labeling kit(GibcoBRL)標記上同位素α-32P，獲得DNA探針。轉基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN5個植株Southern雜交結果見圖10-B。
由於在載體pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN上存在兩個HindIII的酶切位點，其中一個位點位於FLP基因中間，另一個在CaMV 35S啟動子和GUSNPTII融合基因之間，大小為2.2kb，所以，當以GUS片段作為探針時，所有轉基因植株Southern雜交結果中，在2.2kb的位置都應該存在信號，如圖9-B中所示。在植株2中至少還有4個條帶，說明在該植株基因組上，至少有4個拷貝的外源基因插入。在植株4、6和9中，各有1條帶，說明為單拷貝。植株11有2條帶，則為雙拷貝。在野生型植株中，未檢測到任何雜交信號。以上結果與GUS染色和PCR檢測結果相符，說明外源基因確實已經導入到轉基因菸草的基因組中。
實施例3轉基因植株中外源基因的表達分析1、轉基因pLF-BGP-FLP-GN菸草中GUS基因的表達分析選取花粉特異性啟動子BGP控制位點特異性重組酶FLP基因的表達，理論上，在轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物中，BGP啟動子控制的重組酶FLP基因應該只在成熟花粉中表達，刪除外源基因。因此，在轉基因植物花粉成熟以前的所有組織中都應該能檢測到GUS報告基因(CaMV 35S啟動子控制)的大量表達。為了檢測啟動子BGP是否具有組織特異性表達特徵，分別選取轉基因pLF-BGP-FLP-GN菸草植株4中T0代植物的根、莖、葉和未成熟花器官等材料進行GUS組織染色，圖11中顯示的是pLF-BGP-FLP-GN轉基因植物不同組織的GUS染色結果。
2、轉基因pLF-PAB5-FLP-GN菸草中GUS基因的表達分析為了檢測pAB5啟動子是否具有很好的花粉、子房及胚胎早期組織表達特異性，將pAB5啟動子控制的位點特異性重組酶刪除系統導入到菸草中表達，對轉基因植物各組織中GUS基因的表達情況進行檢測。圖12顯示的是轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物GUS組織染色結果。從圖12中可知，在轉基因菸草植株8的根、莖、葉和花器官中都檢測到了GUS基因的大量表達，說明pLF-PAB5-FLP-GN載體中T-DNA片段確實已經插入到轉基因菸草的基因組中，pLF-PAB5-FLP-GN刪除系統的存在沒有影響GUS報告基因在轉基因植物根、莖、葉甚至花等組織中的正常表達，證明pAB5啟動子具有較高的組織表達特異性。
實施例4轉基因植株花粉中外源基因的刪除分析1、轉基因pLF-BGP-FLP-GN菸草花粉中外源基因的刪除分析在轉基因pLF-GN植物單拷貝植株中，由於沒有位點特異重組酶基因存在，GUS基因的表達在時期7(圖13-C)很高，GUS組織染色後多數花粉都呈藍色，在時期12(圖13-D)時，GUS基因的表達量仍然很高。在轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株的T0代花粉中，重組酶FLP基因有花粉特異性啟動子BGP控制，同時存在融合識別位點loxP-FRT，儘管在時期7(圖13-E)時GUS基因的表達同樣很高，但在時期13(圖13-F)中沒有觀察到藍色花粉，說明在花粉成熟的中後期，由於花粉特異性啟動子BGP引導重組酶FLP基因表達，該重組酶能迅速起作用，花粉基因組上的GUS等外源基因完全被刪除，細胞中GUS蛋白被降解，所以在時期12的GUS組織染色後，沒有檢測到藍色花粉的存在。
2、轉基因pLF-PAB5-FLP-GN菸草花粉中外源基因的刪除分析在轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物植株的T0代花粉中，重組酶FLP基因有花粉特異性啟動子PAB5控制，同時存在融合識別位點loxP-FRT，儘管在時期7(圖13-G)時GUS基因的表達同樣很高，但在時期12(圖13-H)中沒有觀察到藍色花粉，說明在花粉成熟的中後期，由於花粉特異性啟動子PAB5引導重組酶FLP基因表達，該重組酶能迅速起作用，花粉基因組上的GUS等外源基因完全被刪除，細胞中GUS蛋白被降解，所以在時期12的GUS組織染色後，沒有檢測到藍色花粉的存在。
實施例5轉基因植株與野生型雜交後代GUS組織染色的結果根據孟德爾經典遺傳學理論，如果轉基因T-DNA片段以單拷貝插入植物基因組中，在T1代就會表現出3∶1的分離比，因此，在轉基因pLF-GN植物自交得到的後代中，理論上GUS組織染色應該有75％幼苗能夠被染成藍色，而在pLF-BGP-FLP-GN植物自交後代中，由於位點特異性重組酶系統的存在，則應該有50％～75％的幼苗能夠染成藍色，具體數量由pLF-BGP-FLP-GN系統的刪除效率決定。在和pLF-PAB5-FLP-GN植物自交後代中，由於啟動子PAB5能夠驅動重組酶FLP在花粉和種子中特異性表達，因此，在自交後代中，應該有0％～75％的幼苗能夠染成藍色，具體數量由pLF-PAB5-FLP-GN系統的刪除效率決定。
為了確證轉基因菸草T0代花粉中GUS組織染色得到的結論是否可信，將轉基因轉基因pLF-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物單拷貝植株T0代的花粉與野生型菸草進行雜交，得到雜交後代的種子，並將這些種子和它們萌發後的幼苗進行GUS組織染色。理論上，如果花粉基因組中的GUS基因沒有被刪除，那麼雜交後代幼苗染色後就應該觀察到藍色(GUS基因的表達產物)。如果pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物單拷貝T0代植株與野生型雜交後，由於刪除系統的存在，在雜交後代幼苗中，GUS組織染色後藍色幼苗數量應該減少或者沒有藍色幼苗。
圖14中A、C、D分別顯示轉基因pLF-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物自交後代幼苗GUS組織染色的結果，其中藍色幼苗比例分別為75％、50％和0％。當用單拷貝轉基因植物的花粉跟野生型雜交時，在轉基因pLF-GN植物雜交後代中，應該有50％的幼苗帶有GUS基因(圖B)；在轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物的雜交後代中，推測大約0～50％的幼苗具有GUS基因。實驗中得到的結果如圖14-E中所示，在圖14-E中則沒有觀察到藍色種子，說明可能pLF-BGP-FLP-GN具有高的刪除效率，已經將雜交後代基因組中的外源基因切除得更徹底。在圖14-D和-F中GUS組織染色的結果顯示，無論是轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物花粉與野生型菸草雜交(圖D)，還是轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物自交(圖F)，都沒有檢測到藍色的幼苗，說明pAB5啟動子在轉基因植物花粉和子房中都能特異地啟動重組酶FLP基因的表達，高效地刪除外源基因。
實施例6轉基因植株中外源基因的刪除效率分析1、轉基因pLF-GN、pF-BGP-FLP-GN和pLF-BGP-FLP-GN菸草中外源基因的刪除效率分析為了獲得pF-BGP-FLP-GN和pLF-BGP-FLP-GN系統在轉基因菸草花粉中刪除外源基因的效率，比較單個融合識別位點FRT和融合識別位點loxP-FRT對重組酶系統刪除效率的影響，分別將轉基因植株(作為父本)與野生型(作為母本)進行雜交，並對雜交後代的幼苗GUS組織染色，通過對藍白幼苗的統計，得到這些系統在轉基因菸草花粉中的刪除效率，部分統計結果見表1所示。
表1.不同位點特異性重組酶系統刪除效率的比較

注如果轉基因植株為單拷貝時，雜交後代刪除效率％＝(白色幼苗數-藍色幼苗數)/(藍色幼苗數+白色幼苗數)×100％。如果轉基因植株具有兩個拷貝，則刪除效率％＝(3×白色幼苗數-藍色幼苗數)/3×(藍色幼苗數+白色幼苗數)×100％。ND表示該植株中刪除效率未統計。
結果顯示，在轉基因pLF-GN(父本)×野生型(母本)雜交後代中，儘管存在融合識別位點，但由於沒有重組酶基因，各個植株中刪除效率都為0。在pFBFGN(父本)×野生型(母本)的雜交後代中，BGP啟動子引導FLP重組酶基因表達，識別位點為其對應的FRT，在不同株系中刪除效率分別達到了18.9％～77.5％。而在pLF-BGP-FLP-GN(父本)×野生型(母本)雜交後代GUS染色統計的結果顯示，植株4、6和9的幼苗也計數到2萬以上，沒有發現藍色幼苗，這些植株都為單拷貝轉基因植物。有根據表1中GUS組織染色、Km抗性篩選以及Southern雜交的結果可知，植株11為雙拷貝轉基因植株，但與野生型雜交，幼苗GUS組織染色後，統計結果顯示，刪除效率也達到100％。而植株2為多拷貝插入，其刪除效率僅為63.5％。刪除效率最低的轉基因植株是植株17，只有49.3％。
2、轉基因pLF-PAB5-FLP-GN菸草中外源基因的刪除效率分析在轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物中，啟動子PAB5在花粉、子房以及早期胚胎中特異性表達，為了檢測pLF-PAB5-FLP-GN系統在轉基因植物花粉和子房中的刪除效率，分別將轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物作為父本與野生型作為母本雜交，同時也將野生型作為父本與轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物作為母本雜交。由於啟動子PAB5引導FLP基因特異性表達，在轉基因植物花粉或子房中外源基因都可能被刪除。為了檢測重組酶在不同組織中的刪除效率，將雜交後代種子分別萌發，然後GUS組織染色，統計各個植株中的刪除效率，其結果見表2。
表2中的統計結果顯示，轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物各個植株之間的刪除效率差異比較大。植株9中刪除效率最低，在花粉和子房中分別為19.8％和30.7％，在植株2中，儘管轉基因植物的花粉與野生型菸草雜交的結果顯示，外源基因在花粉中已經被完全刪除掉，但其子房中的刪除效率卻並不高，僅達到69.7％。但在植株8和植株12中，無論是轉基因植物作為父本與野生型雜交，還是其作為母本與野生型雜交，後代幼苗GUS組織染色後，個體統計到接近15,000時都沒有發現藍色植株，而且它們自交後代中也沒有發現藍色幼苗(結果未顯示)，說明PAB5啟動子引導重組酶FLP基因表達，在轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植物的花粉和種子中，都能將外源基因100％地刪除。
表2.轉基因pLFABFGN植物各個植株中刪除效率的統計結果


注刪除效率％＝(白色幼苗數-藍色幼苗數)/(白色幼苗數+藍色幼苗數)×100％。F父本，M母本。
實施例7轉基因植物花粉基因組中殘餘外源片段的檢測1、Southern雜交檢測通過轉基因pLF-BGP-FLP-GN菸草與野生型雜交後代的GUS組織染色，初步證實這些轉基因植株雜交後代中已經沒有GUS蛋白，由此推測，GUS基因可能已經從轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物花粉基因組中刪除。為了上述結果是否可信，分別提取轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株T0代的基因組DNA和轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物與野生型菸草雜交後代的基因組DNA，以GUS基因片斷作為DNA探針做Southern雜交，得到圖15的結果。
圖15中顯示，F4和F6為轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4和植株6的T0代Southern雜交結果，與圖10-B中的雜交結果比較，兩者雜交信號相似，說明兩次Southem雜交結果重複性很好，實驗結果可信。採用同樣的DNA探針，對轉基因pLF-BGP-FLP-GN植株4、6、9和轉基因pLF-PAB5-FLP-GN植株11分別與野生型雜交後代，以及野生型菸草做Southern雜交，結果沒有觀察到任何探針信號(圖15所示)，說明FLP重組酶基因已經不存在於轉基因植物的花粉基因組中(FLP基因片段作為雜交探針)。該結果再次從分子水平上證實所有外源基因已經從轉基因菸草花粉基因組中被徹底刪除。
2、PCR檢測根據圖14的結果，在轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4、6、9中，外源基因已經從轉基因植物花粉基因組中被刪除。為了進一步檢測了轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物中未刪除前的所有外源基因片段及其外源基因被刪除後殘留的DNA片段，確定轉基因植物花粉基因組中已被刪除的T-DNA大小，在T-DNA兩端邊界序列與loxPFRT融合識別位點序列之間分別設計了一對引物，以轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物T0代開花前及其與野生型雜交後代的基因組DNA為模板，PCR擴增，得到圖16的結果。
從圖16中可知，如果以轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物T0代開花前基因組DNA作為PCR擴增的模板，能夠分別得到一條7.3kb(圖16-F4-A、-F6-A、-F9-A)的擴增產物，其中7.3kb片段代表融合識別位點loxPFRT序列、BGP-FLP-nos和35S-GUS∷NPTII-nos片段。而以轉基因植物與野生型菸草雜交後代基因組DNA作為PCR擴增的模板，由於位點特異性重組酶系統已經刪除了融合識別位點序列之間的35S-GUS∷NPTII-nos基因、重組酶基因和一個融合識別位點loxPFRT，所以PCR擴增得到的結果只包括一個融合識別位點序列以及來自於T-DNA片段上的結構序列，大小約為220bp(圖16-F4-B、-F6-B、-F9-B)。以上結果再次表明，在轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4、6、9花粉基因組中，外源功能基因已經被刪除。
3、轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物雜交後代中殘餘T-DNA片段序列分析根據前人的研究(Gwang Lee et al.，1998)，在FLP/FRT系統中，重組酶FLP特異性識別其位點FRT後，將兩位點間的DNA片段切除，剩餘部分重新連接，轉基因植物基因組上只殘留一個識別位點。在本實驗中採用了loxPFRT融合識別位點，得到了比已有報導的位點特異性重組酶系統刪除效率都高得多的重組酶刪除系統。為了搞清楚該系統刪除效率提高的原因是否與重組酶蛋白識別和結合融合識別位點，以及具體的切割位置有關，首先提取已經刪除了外源基因的轉基因植物基因組DNA，根據融合識別位點兩端的T-DNA序列設計引物，進行PCR擴增，擴增的結果見圖16所示，將其中株系4中大小約220bp的擴增片段分別回收、克隆後，測序分析。
從測序結果可知，在轉基因pLF-BGP-FLP-GN植物與野生型菸草雜交後代中，確實只剩下一個loxPFRT融合識別位點以及T-DNA兩端的非功能區序列，另外一個loxPFRT融合識別位點、35S-GUS∷NPTII-nos融合基因和BGP-FLP-nos已經被完全刪除。重組酶蛋白識別和切割融合識別位點後剩下的殘餘DNA片段與以前報導的FLP/FRT系統中類似。以上結果也進一步從分子水平確證，在轉基因pLF-BGP-FLP-GN菸草的花粉基因組中，所有外源功能基因確實已被刪除。
以上對本發明的詳細描述並不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明做出各種改變和變形，這些改變和變形均應屬於本發明所附權利要求的範圍。
05P101397.ST25.txtSEQUENCE LISTING110西南大學120用於轉基因植物安全性控制的基因刪除系統及含有其的植物表達載體130CQ302-05P1013971604170PatentIn version 3.1210121134212DNA213細菌噬菌體P1(Bacteriophage P1)220
221misc_feature222(1)..(34)223loxP位點序列4001ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat34210221148212DNA213酵母(Saccharomyces cerevisiae)220
221misc_feature222(1)..(48)223FRT位點序列4002gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttc 48210321186
212DNA213人工序列(artificial)220
221misc_feature222(1)..(86)223融合的特異性識別位點loxP-FRT4003ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgaccga agttcctata ctttctagag60aataggaact tcggaatagg aacttc 862104211237212DNA213人工序列(artificial)220
221misc_feature222(1)..(237)223基因刪除系統4004gcgaattcat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atgaccgaag ttcctatact 60ttctagagaa taggaacttc ggaataggaa cttcggtacc tatgtcgacg tagagctcga120ctcgagaagg atccttcccg ggataacttc gtatagcata cattatacga agttatctga180gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcgc tagcggc 23權利要求
1.一種用於轉基因植物安全性控制的基因刪除系統，包括兩個同向的loxP與FRT融合的特異性識別位點loxP-FRT，在所述兩個特異性識別位點之間包含一段多克隆位點序列，其中所述loxP為來源於細菌噬菌體的Cre位點特異性重組酶的識別位點，所述FRT為來源於酵母的FLP位點特異性重組酶的識別位點，所述loxP-FRT由loxP識別位點序列與FRT識別位點序列融合形成，所述多克隆位點用於插入各種需要導入植物中的目的基因序列。
2.權利要求1所述的基因刪除系統，其特徵在於所述特異性識別位點loxP-FRT至少包含34bp的loxP序列和48bp的FRT序列，分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.權利要求1所述的基因刪除系統，其特徵在於所述融合的特異性識別位點中，在loxP序列與FRT序列之間還包括一段間隔序列。
4.權利要求3所述的基因刪除系統，其特徵在於所述融合的特異性識別位點具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
5.權利要求1所述的基因刪除系統，其特徵在於其具有SEQ ID NO.4所示的序列。
6.含有權利要求1所述的基因刪除系統的植物表達載體。
7.權利要求6所述的植物表達載體，其特徵在於在所述植物表達載體中，在基因刪除系統的多克隆位點進一步引入一植物組織特異性啟動子序列。
8.權利要求7所述的植物表達載體，其特徵在於所述植物組織特異性啟動子序列為花粉特異性啟動子序列、或花器官和胚早期特異性啟動子序列。
9.一種融合的特異性識別位點序列，由來源於細菌噬菌體的Cre位點特異性重組酶的識別位點loxP與來源於酵母的FLP位點特異性重組酶的識別位點FRT融合形成，其至少包含34bp的loxP序列和48bp的FRT序列，分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
10.一種製備安全的轉基因植物的方法，包括將權利要求1所述的基因刪除系統、植物組織特異性啟動子與需導入植物的外源基因構建成植物表達載體轉化植物而獲得安全的轉基因植物。
11.權利要求1所述的基因刪除系統在製備轉基因植物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種用於轉基因植物安全性控制的基因刪除系統，包括兩個同向的loxP與FRT融合的特異性識別位點loxP－FRT，在所述兩個特異性識別位點之間包含一段用於插入需導入植物中的目的基因的多克隆位點序列，將本發明的基因刪除系統進一步引入一植物組織特異性啟動子序列而構建的植物表達載體可以在特定的植物器官完全刪除外源基因，本發明的基因刪除系統刪除效率達100％，可用於製備安全的轉基因植物。
文檔編號C12N15/82GK1769446SQ200510112579
公開日2006年5月10日 申請日期2005年10月11日 優先權日2005年10月11日
發明者羅克明, 裴炎, 李義, 段輝, 吳彥紅, 理察·麥卡沃伊, 鄭雪蓮 申請人:西南大學