通過殼聚糖存儲dna的方法，以及利用該方法的產物的製作方法

2023-05-13 11:07:56 3

專利名稱：通過殼聚糖存儲dna的方法，以及利用該方法的產物的製作方法
專利說明通過殼聚糖存儲DNA的方法，以及利用該方法的產物 本發明涉及存儲DNA的方法，分析通過上述方法存儲的DNA的方法以及利用該方法的產物。更詳細地，本發明涉及用於長期在室溫下存儲穩定狀態的DNA的方法，分析通過上述方法存儲的DNA的方法以及如由紙製成的DNA卡片或由塑料製成的DNA卡片的DNAID卡，其利用上述的存儲和分析方法產生。生物體攜帶的所有基因的總體稱為基因組。據報導人基因組由30億個鹼基組成並且具有約30,000個基因。最近，解碼全部人類基因組鹼基序列的人類基因組計劃已完成，因此獲得通過利用基因提供疑難疾病診斷和治療的劃時代的改進。可以說，已開始了個人化醫學和預測性醫學的時代。
生命現象由三種主體決定(1)基因組DNA的遺傳信息，(2)基因轉錄本和(3)表達的蛋白質。為了了解和分析生命現象，和開發用於疾病診斷和治療的方法，重要的是精確分析上述的三種主體。個體中基因的總數稱為基因或基因組，並且因此個體中轉錄的基因的總數(即mDNA)和表達的蛋白質的總數分別稱為轉錄本組(transcriptome)和蛋白質組。最近，對所述全部信息自動分析的研究進展積極。對於分析的自動化，微陣列或生物晶片尤其有用，並且其代表性的實例包括DNA晶片和蛋白質晶片。
作為用於基因組DNA遺傳信息定性和定量分析的常規方法，可提及雜交分析、序列分析、DNA微陣列或晶片等等，經PCR、PCR-RFLP、克隆和文庫產生、Southern印跡法等等(Sambrook，J. Russell，D.W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，(2001))。
當檢驗人DNA時，有可能了解人的健康狀態並且給出該人是否感染各種疾病如癌症或傳染病的診斷，以及預測遺傳疾病今後發作和傳遞至該人後代的可能性。另外，DNA檢測為證實人的身份以及親緣關係如親子關係的最精確的方法。其在證實家系或家譜中也有用。據此，DNA檢測已必然用作法醫學的方法以及用於辨別捐贈骨髓，其他內臟等等時的適配性。此外，通過分析單核苷酸多態性(SNP)，有助於預測疾病今後的發作，對藥物的反應等等的可能性。
由於認識到存儲DNA對於將來DNA檢測的必要性，每個國家已迅速地建立了DNA庫，並且由於存儲有關旅客保險或事故保險的DNA，存儲美國武裝部隊的DNA等等的原因，DNA庫中樣品數目趨於大量增加。然而，在國家組織或商業組織存儲個人的DNA，可能存在如個人遺傳信息濫用的問題。而且，為了通過現有技術長期安全地存儲DNA，需要冰箱和特定試劑，因此存儲DNA的成本由此很大。
事實上，當從細胞分離和純化的DNA處於室溫下時可能存在DNA被脫氧核糖核酸酶(DNAse)迅速降解或片段化的問題。因此，用於基因研究中存儲DNA的方法很重要。目前，對於廣泛使用的存儲或運載DNA的方法，可提及通過純化分離自體液如血液、細胞或組織的DNA而以液態存儲DNA的方法；存儲在冰箱中的方法；凍幹存儲的方法；存儲在2-丙醇中的方法等等。然而，就成本和損耗而言這些方法存在許多缺點。以液態存儲純化的DNA的方法很容易用於立即使用該DNA，但DNA在長期存儲時存在著很容易破壞的問題。存儲在冰箱中的方法和凍幹的方法在使用該樣品的過程中存在DNA可能受反覆凍融而破壞的問題。此外，使用如乙醇的試劑存儲的方法以及其他方法在預處理和後處理過程中也麻煩。而且，上述過程中最重要的問題為DNA必須首先從體液如血液純化而用於存儲。
上述用於存儲DNA的方法需要專門的昂貴的設備如超低溫冰箱、液氮等等。因此，由於從經濟的角度該方法可能增加負擔，其是不利的，該方法在再使用存儲的DNA用於分析時需要預處理和後處理的過程，並且該方法可能在重複的冷凍和融解過程中破壞DNA。
除上述方法外，，最近引入了一些用於在室溫下存儲質粒DNA的商業化產品如FTA卡或Whatman plc生產的卡製品等等。然而，該方法其有效性有限，並且建議在-15℃或-20℃而不是在室溫存儲DNA，因此其比原來的方法沒有大的優點，反而不利的是成本的增加。
因此，在分子遺傳學和醫學領域中一個重要的目標為開發通過形成與DNA的穩定結合，在室溫下以穩定狀態存儲DNA，並且進一步利用DNA直接應用於研究和分析，而用於保護DNA免受脫氧核糖核酸酶分解的可能的方法。存儲的理想方法應當包括(1)在室溫下穩定存儲而沒有DNA降解的方法；(2)方法應該簡單；(3)方法應該經濟合算；(4)DNA存儲不應該僅用於分離的和純化的DNA本身，也用於包含體液如血液和不同DNA的樣品，而對該DNA無破壞；(5)不同的DNA樣品應該存儲在有限的空間；(6)個體應當能存儲個人的DNA；和(7)此後對各種基因的分析不應該存在任何問題，並且這些遺傳檢測應該有助於實際的診斷或研究。然而，滿足這些條件的方法或產品至今還未引進，並且未發現用於與人遺傳信息在一起存儲的個人DNA的產品的報導。
殼聚糖為生物產生的聚合物，其在穩定性、生物降解性和在生物體的適合性方面優良，並且廣泛用於醫學領域。當殼聚糖用酸處理後，其形成水溶性的殼聚糖鹽，變成具有強的正電荷，因此最近幾年中已指出殼聚糖鹽作為藥物、蛋白質和DNA的優秀的投遞方法。尤其，水溶性的殼聚糖與作為陰離子物質的DNA形成強結合，用於DNA的保護。因此，該水溶性的殼聚糖可用作用於投遞基因的介質物質。
殼聚糖為葡糖胺和N-乙醯葡糖胺的共聚物並且獲自殼多糖。殼多糖在甲殼動物如蟹或蝦中很多，並且為次於纖維素的最豐富的天然聚合物物質。殼聚糖為通過將殼多糖經過強鹼脫乙醯作用而獲得的陽離子聚合物的通稱(Errington N.，Harding S.E.，Varum R.M.，Ilium L.，Int.J.Biol.Macromol.，15，1123-1127(1993))。
殼聚糖不溶於中性或鹼性pH，而在與酸類如穀氨酸、鹽酸、乳酸等等反應時形成殼聚糖鹽或陽離子殼聚糖。殼聚糖鹽溶於水，並且其溶解度與脫乙醯作用的程度和pH成比例。就水溶性殼聚糖來說，其通過將質子添加至胺基而成為帶正電荷的。此外，水溶性殼聚糖可製成凍幹狀態。
水溶性殼聚糖具有形成帶有強正電荷的膜或凝膠的特性。在這方面，殼聚糖用於汙水、重金屬和飲用水以及抗真菌物質的淨化器中。其也用作飲料、保健食品和化妝品的原料。此外，殼聚糖用作藥學領域的重要方法。例如，殼聚糖廣泛用於疫苗的投遞、DNA的投遞、促進經純化產生的蛋白質、肽和藥物的投遞和和受控的藥物釋放系統的投遞，凝膠、膜、潤溼劑、塗層劑、微球體、微膠囊、生物粘合劑和黏膜等等的投遞(Illum L.，Pharmaceutical Research，15，1326-1331(1998))。
殼聚糖非常安全並且不呈現由免疫引起的副作用。當殼聚糖吸收進入生物體時，其在用於糖蛋白的合成後由溶菌酶降解為N-乙醯葡糖胺，且隨後殘留的生成物以二氧化碳的形式排放(Chandy T.，SharmaCP.，Biomat.Art.Cells Art.Org.，18，1-24(1990))。
本發明的水溶性殼聚糖或陽離子殼聚糖最重要的特性為其與為陰離子物質的DNA形成強的結合，使得其可用作DNA的保護和投遞方法，即作為基因投遞材料。在利用質粒DNA的實驗中，據報導殼聚糖作為穩定儲存的而不經DNA核酸酶如DNase I和DNase II分解的DNA而起作用，且當殼聚糖和質粒DNA的複合物注射入體外培養的細胞時，其觸發投遞基因的表達(Lee M.，Nah J-W.，Kwon Y.，Koh J.J.，Jo K.S.，Kim S.W.，Pharmaceutical Research，18(4)，427-531(2001))。基因投遞效果由(1)殼聚糖的分子量和(2)殼聚糖對DNA的比率，尤其陰離子DNA的含磷分子對陽離子殼聚糖的含氮分子的氮/磷比率確定(Borchard G.，Advanced Drug Delivering Reviews，52，145-150(2001))。
據報導當質粒DNA置於室溫時，該質粒DNA在數小時內分解；然而當質粒DNA保持與殼聚糖的複合物形式時，有可能存儲該質粒DNA 3個月或更長時間(Leong K.W.，Mao H.Q.，Turong-Lee V.L.，Roy K.，Walsh S.M.，August J.T.，J.controlled ReI.，53，183-193(1998))。同時，已有報導，當殼聚糖和質粒DNA的複合物以凍幹狀態存儲時基因投遞效果可持續至4周後(Mao H.Q.，Turong-Lee V.L.，August J.T.，Leong K.W.，Proc.Intl.Symp.Control.ReI.Bioact.Mater.，24，671-772(1997))。
然而，至今還沒有報導用殼聚糖穩定存儲哺乳動物大基因組DNA的可能性研究或用殼聚糖在室溫下長期穩定存儲DNA的可能性研究。而且，還未製備利用殼聚糖產生的存儲DNA的產物。並且，還沒有報導利用殼聚糖-結合的DNA和以殼聚糖和體液而不是和DNA本身，如血液的混合形式存儲DNA進行基因表達分析的可能性。此外，除了本發明的產品外，還未發布用於利用殼聚糖存儲、運載和分析人類或動物的基因組DNA的產品。[技術問題]本發明的一個方面為其提供了利用水溶性殼聚糖在室溫下以穩定狀態存儲和運載DNA樣品的方法。
本發明的另一方面為其提供了水溶性殼聚糖和穩定DNA的複合物，其可用於各種DNA檢測方法中。
根據本發明的殼聚糖存儲DNA的方法，本發明的另外一方面為其提供了具有合適特性和濃度的殼聚糖溶液，其可與DNA形成穩定的結合而可能在室溫下長期運載和存儲DNA，方便研究和分析DNA並且方便應用。
本發明更進一步的方面為其提供了用於製備包含殼聚糖的紙型卡片(DNA卡片)的方法，其可以液態存儲結合的殼聚糖和DNA並且最小空間中存在大量DNA樣品，提供了用於進行遺傳分析的方法如PCR、PCR-RFLP、克隆、序列分析和Southern印跡、微陣列檢測等等，並且提供了用於從其結合狀態分離殼聚糖和DNA的方法。在這種情況下，DNA卡片可主要分為1型和2型1型在包含殼聚糖的紙型卡片上存儲DNA本身，而2型在包含殼聚糖和細胞裂解緩衝液的紙型卡片上存儲包含DNA的生物樣品，如血液而不是DNA本身。兩種情況中，目的為在室溫下長期以穩定狀態存儲DNA以及如有必要進行此後的各種遺傳分析。
本發明的另一個方面為其提供了DNA標識卡(DNA ID卡)，其中個體的DNA樣品以與殼聚糖的混合物形式存儲，並且通過進行檢測如用於個人鑑定的遺傳檢測，HLA基因分型檢測等等而獲得的個體的遺傳信息在塑料卡的磁條上或晶片上保存。塑料DNA ID卡可用於存儲個人信息如各種信用卡和現金卡、重要機構的入場卡、生物護照、軍事力量等等，或用於共享器官移植如骨髓移植的遺傳信息。本發明中，研究了用於存儲動大的動物和植物基因組DNA的新方法，並且因此證實當水溶性殼聚糖與DNA混合時，形成穩定的結合而保護DNA免受脫氧核糖核酸酶分解並且可在室溫下以穩定狀態長期存儲，並且因此完成本發明。
通過本發明的方法和產品所要達到的狀況如下1)DNA應當以在室溫下不降解的穩定狀態存儲；2)此處的DNA樣品應當包括人類、動物、植物和細菌基因組DNA和cDNA，以及質粒DNA；3)該方法應當是簡單的並且應當不需要使用專用設備或儀器；4)成本應當是合算的；5)DNA存儲應當不僅用於分離的和純化的DNA本身，而且用於包含體液如血液以及各種DNA的生物樣品而不破壞DNA；6)DNA樣品應當利用簡單的介質如紙或卡片存儲；7)大量DNA樣品應當存儲在有限的空間中；8)個人應當可以存儲個人的DNA；9)關於通過上述方法和產物存儲以及運輸的DNA樣品，各種遺傳分析如PCR、PCR-RFLP、雜交、序列分析、SNP分析等等應當甚至在長時期後精確和簡單地進行，並且應當有助於研究及各種臨床檢查；和10)，DNA ID卡應當起存儲個人的DNA的DNA庫的作用，並且此外還一起存儲該人的遺傳信息。
以下，本發明將根據附圖詳細描述。


圖1為舉例說明本發明的DNA和水溶性殼聚糖結合產物的製造和分析過程的方塊圖。在檢查製造DNA和水溶性殼聚糖結合產物的方法時，參考圖1，首先，建立DNA和水溶性殼聚糖結合的最佳條件，並且分析DNA和殼聚糖混合物對DNA核酸酶的保護效果和遷移率轉變(S101)。隨後，對於液態的DNA和殼聚糖混合物，進行PCR測定和存儲DNA效果的分析(S102)。利用上述結果，製造1型DNA卡，並且進行PCR測定和存儲DNA效果的分析(S103)。以同樣的方式，製造2型DNA卡，並且進行PCR測定和存儲DNA效果的分析(S104)。分析以在上述製造的1型和2型DNA卡上長期存儲的樣品為基礎的遺傳分析的可能性(S105)。隨後，製造包含殼聚糖的一體型PCR試劑盒，並且分析其可用性(S106)。隨後，製造塑料的DNA ID卡(S107)。
本發明中，為了與DNA形成穩定的複合物以保護DNA免受脫氧核糖核酸酶分解，並且在室溫下以穩定狀態存儲DNA，使用了具有合適特性和濃度的水溶性殼聚糖溶液、包含所述溶液的紙型卡片或PCR試劑盒和塑料型DNA ID卡等等。
優選本發明中所用的殼聚糖具有10至500kD的分子量。具有小於10kD分子量的殼聚糖在與DNA形成穩定的結合中存在問題，以及具有超過500kD分子量的殼聚糖可能干擾分析利用DNA的基因表達。此外，優選60％或以上脫乙醯作用程度的殼聚糖，並且當脫乙醯作用程度小於60％時出現殼聚糖的水溶性問題，因此其難以與DNA形成穩定的結合。製備的殼聚糖水溶液的濃度，按照重量體積比(w/v)為0.02％至1％，並且優選0.1％。混合殼聚糖水溶液和DNA水溶液時的混合比率按照殼聚糖水溶液中的殼聚糖對DNA水溶液中的DNA的重量比，為1∶0.5或以上，並且優選1∶0.5至1∶3(實施例1和2)。
本發明的DNA/殼聚糖結合產物在室溫至-70℃的較寬的溫度範圍存儲，並且存儲在無水分的暗處。
同時，以與本發明的水溶性殼聚糖結合的形式存儲的DNA即使存在脫氧核糖核酸酶的降解也是穩定地儲存的，因此可用於遺傳分析(參見實施例2)。
根據本發明，可以在與殼聚糖的混合物中存儲的DNA包括人類、動物或植物、細菌的基因組DNA和質粒DNA，並且優選包括cDNA。可以在與殼聚糖的混合物中存儲的DNA的大小的差異，可以從幾十個至幾億個鹼基。
同時，本發明與水溶性殼聚糖結合的DNA的液體混合物穩定儲存，並且通過進行檢測如聚合酶鏈式反應(PCR)、克隆、印跡、序列分析等等而很容易證實本發明存儲DNA的方法的有效性。
根據本發明，可通過將合適濃度的殼聚糖和尿酸混合(詳細地，0.1％至1％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液混合物與濃度為0.5mM至20mM尿酸的體積比為1-1)，並且將該混合物吸附於用於印跡的紙上，且隨後乾燥而製備用於DNA存儲(1型DNA卡)的卡片。利用上述卡片，大量DNA可在室溫下長期存儲且攜載於最小空間中。至於製備用於存儲DNA的卡片所用的紙，可使用商業上可用的用於色譜法的各種紙或用於印跡的紙，並且紙的厚度優選約0.3mm至1.2mm。用於存儲DNA的卡片的存儲合適的溫度是室溫，但允許降溫至-20℃和-70℃，並且在室溫下存儲6個月或以上是可能的。
當本發明中進行PCR時，其中DNA和殼聚糖的混合物為液體的情況中，混合物本身用作模板，而當混合物為卡片形式的情況中，切割卡片的片段並且用作模板以進行PCR擴增、克隆和測序分析的常規方法。因此，證實了DNA儲存得足構穩定，可以利用本發明的方法存儲的DNA執行遺傳分析方法(實施例5)。
根據本發明，可通過將合適的殼聚糖溶液與包括Tris、EDTA、SDS和尿酸(詳細地，Tris(8mM)、EDTA(0.5mM)、SDS(0.1％w/v)和尿酸(2mM))的細胞裂解緩衝液的混合物吸附至用於印跡的紙上，且隨後乾燥而製備用於存儲DNA的卡片(2型DNA卡)。利用上述卡片，DNA可以在包含DNA的生物樣品如血液的狀態在室溫下長期存儲和攜載(實施例6)。
同時，利用本發明的DNA卡存儲的DNA穩定儲存，並且此後可進行如PCR、PCR-RFLP、克隆、序列分析等等的檢測(實施例7至10)。
此外，為了進行Southern印跡法，DNA和殼聚糖的複合物應當分離以使DNA能移至瓊脂糖凝膠上。因此，通過利用對DNA無破壞並且不影響Southern印跡法結果的基於硫酸鹽的陽離子鹽分離DNA。上述基於硫酸鹽的陽離子鹽的實例包括十二烷基磺酸鈉(SDS)、辛基硫酸鈉(SOS)或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(實施例9)。
本發明中作為利用殼聚糖的DNA存儲方法的應用，製備PCR試劑盒，其中Taq聚合酶、引物、dNTP和緩衝液等等加至具有殼聚糖的一個管(所有的在一個管中)，並且樣品如DNA或血清加至該管以引起PCR反應。特徵在於，該PCR試劑盒可用於DNA存儲和PCR測定(實施例11)。
此外，本發明提供了DNA ID卡，其中個體的DNA樣品以與殼聚糖混合形式存儲，並且通過進行遺傳檢測，或HLA基因分型檢測而獲得的個體的遺傳信息在塑料卡的磁條上或晶片上保存(實施例12和13)。塑料DNA ID卡可用作個人的DNA庫以及用於個人身份、個人器官移植、個人臨床診斷等等的個人遺傳信息庫。圖1為顯示本發明的DNA和水溶性殼聚糖複合產物的產生和分析過程的方塊圖。
圖2為DNA/殼聚糖複合物在0.8％瓊脂糖凝膠上的電泳照片，其通過將分離自正常成熟單核細胞的基因組DNA以1μg/μl的濃度與不同濃度的水溶性殼聚糖溶液以各種比率混合而獲得((泳道1分子量大小標記(1kb)，泳道2僅DNA，泳道30.02％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.2，泳道40.02％(w/v)的殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.4，泳道50.02％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.6，泳道60.1％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶1，泳道70.1％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶2，泳道80.1％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶3，泳道90.25％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶2.5，泳道100.25％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶5，泳道110.25％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶7.5)。
圖3為DNA/殼聚糖複合物在0.8％瓊脂糖凝膠上的電泳照片，其通過將4.0kb大小的質粒DNA(pCMV-β-半乳糖苷酶)以1μg/μl的濃度與不同濃度的水溶性殼聚糖溶液以各種比率混合而獲得(泳道1分子量大小標記(1kb)，泳道2僅DNA，泳道30.02％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.2，泳道40.02％(w/v)的殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.4，泳道50.02％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.6，泳道60.1％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶1，泳道70.1％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶2，泳道80.1％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶3，泳道90.25％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶2.5，泳道100.25％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶5，泳道110.25％(w/v)的水溶性殼聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶7.5)。
圖4為在1％的瓊脂糖凝膠上比較和分析通過用脫氧核糖核酸酶(DNAse I)處理結合到殼聚糖的人淋巴細胞基因組DNA和未結合殼聚糖的DNA的DNA裂解程度的照片(泳道1分子量大小標記(1kb梯度)，泳道2僅DNA，泳道3殼聚糖/DNA複合物，20分鐘後，泳道4殼聚糖/DNA複合物，40分鐘後，泳道5殼聚糖/DNA複合物，60分鐘後，泳道6未結合殼聚糖的DNA，20分鐘後，泳道7未結合殼聚糖的DNA，40分鐘後，泳道8未結合殼聚糖的DNA，60分鐘後)。
圖5為表示分別以DNA/殼聚糖複合物和未結合殼聚糖的人白細胞基因組DNA為模板進行針對β-肌動蛋白基因的PCR，而在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳的結果的照片，所述複合物模板通過將0.1％(w/v)殼聚糖溶液和1μg/μl濃度的人白細胞基因組DNA水溶液以1∶1的體積比混合而獲得(泳道1分子量大小標記(100bp)，泳道2陰性對照，泳道3陽性對照(直接分析白細胞基因組DNA)，泳道4在將基因組DNA滴至DNA卡(1型)上並且隨後在室溫下存儲一年後的分析，泳道5在將血液滴至DNA卡(2型)上並且隨後在室溫下存儲一年後的分析，泳道6在血液吸收於用於印跡的紙上並且隨後在室溫下存儲一年後的分析，和泳道7在白細胞基因組DNA吸收於用於印跡的紙上並且隨後在室溫下存儲一年後的分析)。
圖6為表示以DNA/殼聚糖複合物和未結合殼聚糖的DNA為模板進行β-肌動蛋白基因PCR而在0.8％的瓊脂糖凝膠上進行的電泳結果的照片，所述複合物通過將0.1％(w/v)殼聚糖溶液和1μg/μl濃度的人白細胞基因組DNA水溶液以1∶1的體積比混合而獲得，和所述未結合的DNA兩者以不同的溫度和時間存儲(泳道1分子量大小標記(100bp)，泳道2陰性對照，泳道3陽性對照(分離和純化自血液，且因此隨後立即進行PCR的DNA)，泳道4隻有在-70℃存儲三個月的DNA，泳道5隻有在室溫下存儲一周的DNA，泳道6隻有在室溫下存儲一個月的DNA，泳道7在室溫下存儲三周的DNA/殼聚糖複合物，泳道8在室溫下存儲三個月的DNA/殼聚糖複合物，泳道9在室溫下存儲一年的DNA/殼聚糖複合物，泳道10DNA滴於此上的1型DNA卡片，其在室溫下存儲三周，和泳道11DNA滴於此上的1型DNA卡片，其在室溫下存儲三個月)。
圖7為表示通過PCR比較和分析每種DNA卡片結果的瓊脂糖凝膠電泳照片，其通過將殼聚糖吸附至不同種類的印跡紙並且乾燥以製備1型DNA卡片，用移液管將正常成人的白細胞DNA滴至此，並且在室溫下存儲6個月而製備(泳道1分子量大小標記(100bp)，泳道2陰性對照，泳道3陽性對照(直接分離和純化自血液的DNA)，泳道4在0.3mm厚的印跡紙上用0.02％殼聚糖溶液處理的DNA卡片，泳道5在0.9mm厚的印跡紙上用0.02％殼聚糖溶液處理的DNA卡片，泳道6在0.3mm厚的印跡紙上用0.1％殼聚糖溶液處理的DNA卡片，泳道7在0.9mm厚的印跡紙上用0.1％殼聚糖溶液處理的DNA卡片，泳道8在0.3mm厚的印跡紙上用0.25％殼聚糖溶液處理的DNA卡片，泳道9在0.9mm厚的印跡紙上用0.25％殼聚糖溶液處理的DNA卡片，泳道100.3mm厚的印跡紙上未處理的DNA卡片，和泳道110.9mm厚的印跡紙上未處理的DNA卡片)。
圖8顯示對於人基因組DNA樣品PCR後利用RFLP測定法的基因分型檢測結果，樣品利用本發明的水溶性殼聚糖和1型DNA卡片存儲((a)陽性對照，直接分離和純化自成人白細胞的DNA樣品，(b)分離和純化自成人白細胞，並且與本發明的殼聚糖溶液混合，且在室溫下存儲三月的DNA樣品，(c)分離和純化自成人白細胞，轉至本發明的1型DNA卡片以存儲，並且在室溫下存儲一年的DNA樣品)(泳道1和12100bp大小分子量標記，泳道1125bp大小分子量標記，泳道2和3對載脂蛋白E(Apo E)基因的測定，泳道4和5對血管緊張素原(AGT)基因的測定，泳道6和7對血管緊張肽轉化酶(ACE)基因的測定，泳道8對血管緊張素1受體(AT1R)基因的測定，泳道9和10對內皮氧化氮合酶(eNOS)基因的測定，和泳道13和14對MTHFR基因的測定)。
圖9顯示利用PCR-RFLP測定對本發明的2型DNA卡片的樣品基因分型檢測的結果，樣品在吸收於其上時存儲((a)陽性對照，直接分離和純化自成人白細胞的DNA樣品，(b)通過將成人血液吸附於本發明的2型DNA卡片上並且在室溫下存儲三個月而製備的DNA樣品，(c)通過將成人血液吸附於本發明的2型DNA卡片上並且在室溫下存儲的DNA樣品)(泳道1和8100bp分子量大小標記，泳道7和1525bp分子量大小標記，泳道2和3血管緊張素原基因，泳道4和5血管緊張肽轉化酶(ACE)基因，泳道6血管緊張素受體1(AT1R)基因，泳道9和10內皮氧化氮合酶(eNOS)基因，泳道11和12MTHFR基因，和泳道13和14載脂蛋白E(Apo E)基因)。
圖10為表示通過自動鹼基序列測定搜索APC(結腸腺瘤息肉病)基因結果的圖，以成人結腸組織的基因組DNA為模板對其進行PCR，其與根據本發明方法的水溶性殼聚糖溶液混合，並且在室溫下存儲一個月，並克隆其產物。
圖11為表示通過自動鹼基序列測定搜索p53基因結果的圖，以肺癌組織的基因組DNA為模板對其進行PCR，模板根據該方法滴至本發明的DNA卡片上並且在室溫下存儲三個月，且克隆其產物。
圖12為表示利用SDS從殼聚糖和DNA的複合物分離殼聚糖和DNA的結果的瓊脂糖凝膠電泳照片(泳道1分子量大小標記(100bp)，泳道2-僅DNA，泳道30.1％(w/v)殼聚糖溶液/DNA水溶液(1μg/μl)，泳道40.1％(w/v)殼聚糖溶液/DNA水溶液的複合物(1μg/μl)，其用0.1％(w/v)SDS處理，泳道50.1％(w/v)殼聚糖溶液/DNA水溶液(1μg/μl)，其用1％(w/v)SDS處理，和泳道60.1％(w/v)殼聚糖溶液/DNA水溶液的複合物(1μg/μl)，其用5％(w/v)SDS處理)。
圖13為以DNA/殼聚糖複合物為模板對K-ras基因進行Southern印跡的照片，根據本發明的方法，通過將胰腺癌組織的基因組DNA水溶液(1μg/μl)和0.1％(w/v)殼聚糖溶液以1∶1的體積比混合，並且在室溫下存儲三個月而獲得複合物(泳道1胰腺癌組織的DNA，其在室溫下存儲一個月，泳道2胰腺癌組織DNA/殼聚糖溶液的複合物，其在室溫下存儲一個月，泳道3獲自正常人外周血白細胞的DNA，其在-70℃存儲一個月，和泳道4獲自正常人外周血白細胞的DNA，其在室溫下存儲一個月)。
圖14為顯示製備塑料DNA ID卡的過程的流程圖，其利用本發明的DNA卡片製備。
圖15為一個簡圖，顯示利用STR檢測的15個組合鑑定個人基因型，並且製備個人基因型分布圖，以及編碼個人基因型數據的過程的簡圖。其為本發明塑料DNA ID卡一個實例的簡圖。
圖16為顯示在製備本發明的DNA ID卡過程中1型或2型DNA卡片整合入PVC卡內部的簡圖。
圖17為本發明塑料DNA ID卡的一個實例的簡圖。
圖18為本發明塑料DNA ID卡編碼信息的一個實例的簡圖。
圖19顯示了比較eNOS基因PCR擴增的結果，其為老年疾病基因的一種，當血液和gDNA存儲於塑料DNA ID卡上時在高溫和高壓下製備的塑料DNA ID卡(對於血液)上進行PCR擴增(泳道1和7分子量大小標記(100bp)，泳道2DNA ID卡，其上滴有血液(對於血液)，泳道3DNA ID卡，其上滴有gDNA(對於血液)，泳道4DNAID卡(對於血液)，其上滴有血液，並且塑料護封，泳道5DNA ID卡(對於血液)，其上滴有gDNA，並且塑料護封，和泳道6陰性對照)。
圖20顯示了利用塑料DNA ID卡進行eNOS基因PCR擴增的結果，其為老年疾病基因的一種，卡為在實驗室中用高溫在無人工壓力下處理的卡以及實際上在高溫和高壓下通過改變放樣品的時間而製備的卡(泳道1用於DNA的DNA ID卡，其中在室溫下裝載DNA，泳道2DNA ID卡，其中在180℃燒30分鐘後裝載DNA，泳道3DNA ID卡，其中在180℃燒1小時後裝載DNA，泳道4DNA ID卡，其在室溫下裝載DNA後在180℃處理1小時，泳道5DNA ID卡，其在DNA裝載後在180℃處理30分鐘，泳道6DNA ID卡，其在DNA裝載後在180℃處理1小時，泳道7用於血液的DNA ID卡，其在高壓(125bar)和高溫(180℃)下產生，且隨後裝載血液，泳道8用於血液的DNA ID卡，其在高壓(125bar)和高溫(180℃)下產生，且隨後裝載DNA，泳道9用於血液的DNA ID卡，其裝載血液，且隨後在高壓(125bar)和高溫(180℃)下製備，泳道10用於血液的DNA ID卡，其裝載DNA，且隨後在高壓(125bar)和高溫(180℃)下製備)。
圖21顯示了利用在高溫和高壓下製備的塑料DNA ID卡，對eNOS基因PCR擴增的結果，具體地，為用於DNA和用於血液的卡片段，其通過改變滴量而分別滴有150nμg/μlgDNA和血液，隨後存儲(泳道1陰性對照，泳道2陽性對照(血液的gDNA)，泳道3DNA ID卡(對於DNA)，其中在室溫下裝載gDNA(5μl)，泳道4DNA ID卡(對於DNA)，其中裝載gDNA(10μl)，泳道5DNA ID卡(對於DNA)，其中裝載gDNA(50μl)，泳道6DNA ID卡(對於DNA)，其中裝載血液(10μl)，泳道7DNA ID卡(對於DNA)，其中裝載血液(50μl)，泳道8DNA ID卡(對於DNA)，其中裝載血液(100μl)。
圖22顯示利用存儲於在高溫和高壓下製備的DNA ID卡上的樣品，進行內皮氧化氮合酶(eNOS)基因PCR擴增的結果，其為一種老年疾病基因，其中該卡片的一些片段用洗滌緩衝液處理而作為PCR擴增的預處理過程，而其它的未處理(泳道1和10100bp分子量大小標記，泳道2陰性對照，泳道3通過用洗滌緩衝液在室溫下處理其中存儲DNA四天後的收集卡製備的卡片段，泳道4通過用洗滌緩衝液在室溫下處理其中存儲DNA並且包含BPB(溴酚藍)的收集卡四天後製備的卡片段，泳道5通過置於室溫下四天後用洗滌緩衝液處理其中存儲DNA的塑料DNA ID卡製備的卡片段，泳道6通過將0.1％殼聚糖/DNA複合物滴於3mm紙上，用高壓滅菌器滅菌，置於室溫下四天，並且用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道7通過將0.1％殼聚糖/DNA複合物滴於收集卡上，置於室溫下四天，並且用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道8通過將0.1％殼聚糖/DNA複合物滴於BPB收集卡，用高壓滅菌器滅菌，置於室溫下四天，並且用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道9通過將0.1％殼聚糖/DNA複合物滴於塑料DNA ID卡上，用高壓滅菌器滅菌，置於室溫下四天，並且用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道11通過在室溫下存儲其中DNA作為血液狀態存儲四天的收集卡，且不用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道12通過在室溫下存儲其中DNA作為血液狀態存儲四天的BPB收集卡，且不用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道13通過在室溫下存儲其中DNA作為血液狀態存儲四天的塑料DNA ID卡，且不用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道14通過將0.1％殼聚糖/DNA複合物滴於3mm紙上，用高壓滅菌器滅菌，置於室溫下四天，且不用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道15通過將0.1％殼聚糖/DNA複合物滴於收集卡上，置於室溫下四天，且不用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道16通過將0.1％殼聚糖/DNA複合物滴於BPB收集卡上，置於室溫下四天，且不用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段，泳道17通過將0.1％殼聚糖/DNA複合物滴於塑料DNA ID卡上，置於室溫下四天，且不用洗滌緩衝液處理而製備的卡片段)。本發明將用以下的實施例進一步說明。然而，本發明的範圍不限於此。
實施例1DNA和殼聚糖的複合物通過瓊脂糖凝膠電泳的遷移率轉變測定為了產生在與DNA混合時形成穩定複合物的殼聚糖的合適的特性、濃度和混合條件，不同濃度的水溶性殼聚糖與從正常成人血液的單核細胞分離的全部DNA以不同的比率混合，且隨後通過瓊脂糖凝膠電泳進行結合到殼聚糖的DNA遷移率轉變的測定。此外，對小鼠肝組織的基因組DNA和4.0kb大小的質粒DNA(pCMV-β-半乳糖苷酶)以同樣的方法進行結合到殼聚糖的DNA的遷移率轉變測定。用於實驗的方法和結果如下。
A.DNA分離和製備分離來自正常成人白細胞的細胞的全部DNA，根據已知方法(Sambrook J Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，Cold Spring Harbor Press.20017.1-7.88)利用三蒸水進行實驗。
外周靜脈血收集於含有檸檬酸鈉的試管中(vaccutainer CTAD管，目錄No 367946，Becton Dickinson，USA)，並且通過離心分離單核細胞的血漿和白細胞層(buffy coat layer)。單核細胞DNA，大多數為淋巴細胞，利用QIAamp DNA血液minikit(Qiagen，Germany)以下列方法分離。
20μl蛋白激酶K(QIAGEN蛋白酶)放入1.5毫升微量離心管，此外按順序添加200μl白細胞層和200μl緩衝液AL，並且通過渦流15秒混合。在56℃靜置10分鐘並且離心以收集粘至管帽的溶液。此外添加200μl乙醇，通過渦流15秒混合，並且所有溶液添加至QIAamp離心柱，且在8,000rpm離心一分鐘。隨後，2ml收集管插入柱中，此外添加500μl緩衝液AW1，並且在8,000rpm再離心一分鐘。丟棄由此獲得的濾液，且提供新的試管，並且進一步在最高轉速離心一分鐘。再次插入新的1.5ml微量離心管，向其中添加200μl蒸餾水或緩衝液AE，在室溫靜置一分鐘，且隨後在8,000rpm離心一分鐘以洗脫DNA。利用分光光度計測量由此分離的DNA的濃度，並且比較A260/A280比率以測定分離的DNA的純度。在這時候，DNA純度應當為依據分光光度計的測量A260/280為1.6至1.8。根據上述方法，從200μl人血液平均可獲得6μg純的DNA。
B.殼聚糖的製備如果水溶性殼聚糖為脫乙醯程度為60％或以上並且分子量為10kD至500kD的產物時，其可用於本發明的應用，具體地用於與DNA形成穩定的複合物。與這些相當的許多水溶性殼聚糖產物為市場上可買到的。這其中，本發明中平均脫乙醯率為90.1％並且平均分子量為約300kD的水溶性殼聚糖產物購自Jakwang公司(Ansungsi，Republic ofKorea)，並且溶於滅菌的三蒸水。除了該殼聚糖，也可使用其他具有相似特性的水溶性殼聚糖。
C.用於製備殼聚糖和DNA複合物的方法水溶性殼聚糖溶於滅菌的三蒸水，並且以0.02％至0.05％、0.1％、0.25％、0.5％和1％重量體積比(w/v)的不同濃度製備而用於檢測。這裡，DNA用滅菌的三蒸水稀釋至500nμg/μl和1μg/μl，隨後使用。
1.5ml的離心管中，DNA溶液和上述不同濃度的殼聚糖溶液以不同的體積比混合，並且在室溫靜置15分鐘以誘導複合物的形成。
D.通過瓊脂糖凝膠電泳測定DNA和殼聚糖的複合物的遷移率轉變通過將1μg/μl濃度的從正常成人單核細胞分離的基因組DNA和質粒DNA和不同濃度的水溶性殼聚糖溶液以不同比率混合而獲得的DNA/殼聚糖複合物根據上述方法上樣至0.8％瓊脂糖凝膠，並且在100V進行電泳。結果分別在圖2和3中顯示。結果表明當僅有不與殼聚糖混合的DNA進行電泳時，DNA正常移動並且在18s和28s觀察到rDNA條帶，而DNA水溶液(1μg/μl)與0.02％、0.1％或0.25％的殼聚糖溶液分別以1∶0.2、1∶1或1∶2.5或以上的體積比混合時(在這時候，混合物中殼聚糖和DNA的重量比為1∶1或以上)，DNA完全結合殼聚糖使得其不在瓊脂糖凝膠上移動。因此，在下列實驗中其用作標準，其中殼聚糖和DNA複合物的組成為0.1％殼聚糖溶液與1μg/μl濃度的DNA溶液以1∶1的體積比混合(在這時候，混合物中殼聚糖和DNA的重量比為1∶1)。然而，此僅為組成的一個實例，並且取決於所用殼聚糖產品的特性，合適的組成可有些不同。
實施例2殼聚糖的脫氧核糖核酸酶保護測定為了確定水溶性殼聚糖是否可以保護DNA免受脫氧核糖核酸酶(DNAse)酶解，並且建立生合適的條件，用殼聚糖溶液處理的DNA和未處理的DNA分別用脫氧核糖核酸酶處理，並且通過瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。
方法和結果如下。用人淋巴細胞的基因組DNA和小鼠肝組織的基因組DNA重複進行相同的實驗。
八個試管分成兩組。一組中，殼聚糖(20g)溶於蒸餾水並且與DNA(10g)在微量離心管(1.5ml)中混合以產生複合物。另一組中，僅DNA(10g)添加至試管而無殼聚糖。第一組和第二組的每個試管，添加以1單位/l濃度溶解的5μl脫氧核糖核酸酶(DNAse I)，且隨後添加蒸餾水至100μl終體積。隨後，保存用於在37℃溫箱中分別反應0分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘。反應結束後馬上添加25μl終止溶液並且充分混合以滅活DNAse I。向其中反應被滅活的四個試管中的每一個添加110μl TE緩衝液(10mm Tris，0.1mm EDTA)並混合，並且隨後在60℃反應過夜。隨後，添加150μl苯酚/氯仿和通過渦流一分鐘混合，並且在室溫下離心5至8分鐘。隨後，取上清並且放入新的微量離心管，且抽提。此外添加300μl無水EtOH和15μl 3MNH4OAC，並且預先在冰櫃中-70℃靜置20至30分鐘。隨後，產物在4℃12,000rpm離心20分鐘，通過吸力丟棄液體。沉澱物用70％乙醇再次洗滌，並且乾燥，溶於20μl蒸餾水，其無DNAse。分別從由此獲得的全部八個試管取產物10μl(約1μg DNA)，並且在1％瓊脂糖凝膠上電泳。結果顯示在圖4中。
從圖4發現未用殼聚糖用處理的DNA在用DNAse I處理後40分鐘差不多裂解，而用殼聚糖處理的DNA在用DNAse處理後40分鐘不裂解，大多數保留在孔中。這些結果表明根據本發明的方法如果殼聚糖和DNA即使以1∶0.5的重量比混合，其也有效抑制DNA經脫氧核糖核酸酶的裂解，並且本發明的方法對DNA存儲是有效的。
實施例3對DNA和殼聚糖複合物的基因擴增可能性的研究利用根據實施例1和2製備的水溶性殼聚糖和DNA的液體複合物進行PCR以確定是否適當地擴增了靶基因，並且由此確定本發明的DNA存儲方法是否對基因分析沒有不良影響，並且在PCR中建立合適的條件以使用通過本發明的DNA存儲方法存儲的DNA。對於人白細胞基因組DNA，用每種？肌動蛋白基因進行PCR。方法和結果如下。
利用100ng對象DNA作為模板通過分別添加10pmol靶基因的正向引物和反向引物，並且進一步添加2.5mM脫氧核苷酸(dNTP)，1單位Taq聚合酶和10x聚合酶緩衝液(500mM KCl，100mM Tris-Cl，15mM MgCl2，0.1％明膠)進行PCR反應。利用GeneAmp 2700熱循環儀(Perkin-Elmer Biosystems，Inc.，USA)進行PCR，首先在第一個95℃條件下5分鐘，然後四十次的在95℃條件下30秒，55℃30秒以及72℃30秒，並且最後在72℃7分鐘以產生PCR產物。
通過將0.1％殼聚糖和DNA(1μg/μl)以1∶1的體積比混合而製備的人和小鼠基因組DNA模板和不與殼聚糖混合的DNA的模板，對β-肌動蛋白基因進行PCR。1.5％瓊脂糖凝膠上的電泳結果顯示於圖5中。與殼聚糖混合的兩者顯示相同的程度的661bp大小β-肌動蛋白基因的強DNA條帶。這表明本發明的殼聚糖混合的介質對PCR沒有不良影響，並且可有效用於查找基因表達。
實施例4在室溫下長時間存儲的DNA和殼聚糖複合物的PCR擴增實驗根據上述結果，發現水溶性殼聚糖幾乎完全結合DNA，並且穩定地保護DNA免受脫氧核糖核酸酶侵蝕。本實施例中，確定當水溶性殼聚糖和DNA的複合物在室溫下以液態長時間存儲時，存儲的DNA是否保持沒有裂解以使得可以進行基因擴增和分析。其通過如下的PCR分析進行。
1μl 0.1％的水溶性殼聚糖溶液(w/v)和1μl正常成人血液(500ng/μl)單核細胞的基因組DNA混合而形成複合物，並且進一步添加8μl蒸餾水以調節終體積至10μl。由此，在離心管中製備24個樣品並且在室溫下存儲。沒有用殼聚糖處理的1μl相同的白細胞DNA調節至終體積10μl以製備9個樣品。三個樣品存儲在-70℃，而剩下的六個樣品在室溫下存儲。對於與水溶性殼聚糖混合併且在室溫下存儲於試管中的DNA，根據實施例3的方法對三個DNA樣品分別在一周、兩周、三周、四周、三個月、六個月、九個月和一年的時間點進行PCR反應，分別確定是否適當地擴增了靶基因。沒有與殼聚糖混合的DNA樣品中，對於三個存儲在-70℃的樣品，在三個月後進行PCR，並且對於存儲在室溫下的三個DNA樣品，分別在三個月和一年後進行PCR。圖6為表示進行PCR後β-肌動蛋白基因在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳結果的照片。
根據圖6，發現當DNA不結合殼聚糖(裸露的)而在室溫下於微量離心管中存儲三個月和一年時，作為持家基因的β-肌動蛋白從不表達。相反，當DNA樣品結合殼聚糖在室溫下作為液體存儲於試管中一周至一年時，明顯檢測到β-肌動蛋白基因。發現對於不結合殼聚糖而根據常規方法存儲在-70℃的DNA樣品，擴增的β-肌動蛋白的量與結合殼聚糖而根據本發明的方法在室溫下存儲的DNA樣品的量類似。
所述結果表明當根據本發明方法的結合水溶性殼聚糖時以液體存儲DNA的方法可穩定地保存DNA至少一年，存儲的DNA在用於PCR分析中沒有問題，而且該方法可與常規的低溫冰箱存儲方法類似而穩定地存儲DNA。本實施例中的存儲溫度可從室溫至-70℃。其優選在不潮溼的暗處存儲。
實施例5DNA卡片(1型)的製備，其中殼聚糖吸附於紙上，以及因此的基因擴增可能性研究為了在室溫下最小空間中存儲和運載多個樣品DNA並且有助於自動分析，已開發了其中殼聚糖吸收於合適紙上的卡片，其稱為DNA卡片。DNA卡片種類不同，並且其中用途為存儲DNA本身的紙卡片稱為1型DNA卡片。
為了選擇水溶性殼聚糖溶液的最有效濃度和紙的合適厚度，進行下列實驗。
用於印跡的不同種類的紙浸於0.02％、0.1％或0.25％(w/v)濃度的水溶性殼聚糖溶液中足夠長的時間，然後乾燥以產生DNA卡片。在這時候，紙選自可從不同公司如Whatman plc.(UK)或Schleicher Schuell GmbH(德國)購買，並且具有合適厚度的用於印跡的紙。本發明中，從Whatman plc.購買和使用0.3mm、0.9mm和1.2mm厚用於印跡的紙。用於與殼聚糖一起存儲DNA的DNA卡片的種類和大小可根據用途而不同地製備。殼聚糖吸附其上的印跡紙切割成與24-孔、96-孔和384-孔板(多孔板)(8.1cm-12.3cm)的相同大小，其通常充分使用，並且像板一樣將孔和分隔區印刷和標記於紙上。每一孔上用移液管滴下DNA樣品，並且在室溫下存儲一周至一年以上。因此，一個DNA卡片可存儲24至96，至384個DNA樣品的部分。
產生水溶性殼聚糖-浸沒的DNA卡片的方法如下。
在高溫下高壓鍋中滅菌來自Whatman plc.用於印跡的0.3mm厚的紙，然後乾燥。隨後，預先製備的0.1％(w/v)濃度的水溶性殼聚糖溶液和2mM尿酸溶液以1∶1的體積比混合，並且該紙浸沒足夠的時間，隨後乾燥而產生1型DNA卡片。
其中點樣人基因組DNA並且長時間存儲的人基因組DNA滴於如上製備的1型DNA卡片上，並且存儲一段時期。利用穿孔機、鉗子或小鑷子從存儲的DNA卡片取直徑為約1mm至2mm的卡片碎片，並且加至試管用於進行PCR。用該卡片碎片為模板，根據實施例3的方法進行β-肌動蛋白基因的PCR。該PCR反應的方法如下。
1.利用穿孔機等等從其中存儲DNA的殼聚糖浸沒的紙卡片取直徑為約1.2mm的碎片並且加至試管用於PCR。
2.添加200μl TE緩衝液(10mM Tris-Cl，0.1mMEDTA，pH＝8.0)，混合，並且隨後置於室溫下5分鐘。此後，利用移液管完全除去TE緩衝液。
3.第二個步驟重複兩次。
4.在室溫下乾燥1小時或在56℃乾燥10分鐘。
5.合適組成的PCR樣品添加至經上述步驟處理的卡片碎片並且根據實施例3的方法PCR擴增β-肌動蛋白基因。
圖7顯示瓊脂糖凝膠電泳實驗照片的結果，其顯示通過PCR的比較和分析結果。發現對於所有通過浸在0.1％殼聚糖溶液中而製備的DNA卡片，靶基因表達強，而且紙越厚如0.9mm或1.2mm，則產生PCR產物越多。此外，當吸附於本發明的DNA卡片上而存儲時，β-肌動蛋白基因即使在室溫下在長時間如三個月至一年後在PCR中也能強烈擴增，與存儲在-70℃的情況類似。所述結果表明當存儲在本發明的DNA卡片中時，多種不同的DNA樣品可甚至在室溫下長時間穩定儲存，並且可在長時間後分析。因此，發現本發明的DNA卡片可用於簡單地在室溫下長時間存儲和運載多種不同的DNA樣品，並且此外也可用於各種基因分析如PCR或鹼基測序，如本實施例及其後的實施例所示。
實施例6DNA卡片(2型)的製備，其中殼聚糖和細胞裂解緩衝液吸附於紙上，以及因此基因擴增可能性的研究該2型DNA卡片通過將殼聚糖和細胞裂解緩衝液吸附於用於印跡的不同種類的紙並且乾燥而產生。該2型DNA卡片設計成用於存儲樣品如包含細胞的體液如血液，並且隨後通過PCR擴增而用於基因分析。人血液滴於該2型DNA卡片上，並且一段時間後通過PCR比較和分析其性能。
如實施例5中製備的用於印跡的紙卡片浸在水溶性殼聚糖溶液和細胞裂解緩衝液中足夠的時間並且乾燥以產生DNA卡片。在這時候，從Whatman plc.購買和使用0.3mm、0.9mm和1.2mm厚的用於印跡的紙。產生用於以血液存儲的2型DNA卡片的方法如下。
在高溫下滅菌和乾燥來自Whatman plc.用於印跡的0.3mm厚的紙。隨後，之前產生的0.1％(w/v)濃度的水溶性殼聚糖和細胞裂解緩衝液(0.5mMEDTA，8mMTris-Cl，2mM尿酸，1％(w/v)SDS)以1∶1的體積比混合，並且該紙浸沒足夠的時間，隨後乾燥而產生2型DNA卡片。
如實施例5中那樣，從上述DNA卡片取直徑為約1mm至2mm的卡片碎片，並且加至試管用於進行PCR。用該卡片碎片為模板，進行β-肌動蛋白基因的PCR。該PCR反應的方法如下。
1.利用穿孔機等等從其中存儲DNA的殼聚糖-浸沒的紙卡片取直徑為約1.2mm的碎片並且被加至試管用於PCR。
2.添加200μl洗滌液(GG純化試劑；0.5mM EDTA，8mMTris-Cl，2mM尿酸，1％(w/v)SDS)，混合且置於室溫下5分鐘。隨後，利用移液管完全除去洗滌液。
3.第二個步驟重複三次。
4.隨後，添加200μl TE緩衝液(10mMTris-Cl，0.1mM EDTA，pH＝8.0)，混合且置於室溫下5分鐘。隨後，利用移液管完全除去TE緩衝液。
5.第四個步驟重複兩或三次。
6.其在室溫下乾燥1小時或在56℃乾燥10分鐘。
7.合適組成的PCR樣品添加至經上述步驟處理的卡片碎片並且根據與實施例2中相同的方法PCR擴增β-肌動蛋白基因。
作為實驗結果，發現對於所有2型DNA卡片，靶基因強表達，而且紙越厚如0.9mm或1.2mm，則產生越多的PCR產物。此外，當吸附於本發明的DNA卡片上而存儲時，β-肌動蛋白基因甚至在室溫下在長時間如三個月至一年後在PCR中強擴增。所述結果表明當存儲於本發明的DNA卡片中時，DNA樣品如血液可在不需要分離和純化DNA的條件下在室溫下長時間穩定儲存，並且可在長時間後分析。因此，發現本發明的DNA卡片可用於簡單地在室溫下長時間存儲和運載DNA樣品如血液，並且此外也可用於各種基因分析如PCR等等。
實施例7對長時間存儲的DNA和殼聚糖複合物克隆靶基因以及鹼基測序可能性的研究根據實施例4，對作為液體在室溫下長時間存儲的殼聚糖/DNA複合物進行PCR，並且克隆獲得的產物。隨後，通過自動鹼基測序確定根據本發明的方法存儲的DNA是否可穩定地保存並且在存儲後使用。
用成人結腸組織的基因組DNA樣品為模板，其根據本發明的方法與0.1％水溶性殼聚糖混合而在室溫下存儲三個月，對腺瘤息肉結腸(APC)基因進行PCR。產物克隆入質粒載體中，且隨後再次通過鹼基測序查找。方法如下。
重要的是調節基因的PCR產物至合適的濃度以用作測序反應中的模板。本發明中，使用10ng APC基因。APC基因的每一外顯子PCR產物，3.2pmol的正向或反向引物之一和8μl反應混合物(Terminatorready反應混合物；Perkin-Elmer，USA)添加至PCR試管，並且添加滅菌的蒸餾水至20μl終體積且充分混合。利用GeneAmp 2700熱循環儀對混合物進行循環測序反應，96℃10秒、50℃5秒以及60℃6分鐘25次。獲得的反應產物用乙醇沉澱並且離心以除去游離引物和反應混合物(terminator ready反應混合物)中的螢光標記的雙脫氧核苷酸(ddNTP)，並且乾燥。由此-獲得的DNA與甲醯胺25mM EDTA(pH8.0)藍葡聚糖和10μl上樣緩衝液的混合物混合，並且在沸水中變性5分鐘。隨後，樣品置於冰上，並且變性的DNA樣品加至平板的每個孔，其之前已用5.5％長程凝膠(BMA，catalogue No.，USA)澆鑄。電泳進行2至4個小時並且利用ABI Prism 377自動測序儀(Perkin-Elmer Biosystems，USA)的軟體進行鹼基測序。
對APC基因的自動鹼基測序結果顯示在圖10中。
如測序的結果，發現正常APC基因正確擴增，且因此本發明方法的DNA和殼聚糖液體複合物很穩定地儲存DNA，甚至在室溫下長時間存儲後可進行克隆和鹼基測序，表明其也可用於檢測基因突變和查找癌症。
實施例8長時間存儲在DNA卡片中的DNA的基因克隆和鹼基測序可能性的研究確定了對於在室溫下長時間吸附於DNA卡片上而存儲的DNA樣品是否可以通過PCR和自動鹼基測序而恰當地對獲得的產物進行克隆。
用人肺癌組織的基因組DNA樣品為模板，其滴在根據實施例5製備的DNA卡片上而存儲三個月，對p53腫瘤抑制基因進行PCR。產物克隆入質粒載體中，且隨後再次通過自動鹼基測序查找。方法與實施例7的相同。結果在圖11中顯示。
結果發現突變的p53基因正確擴增(圖11)，而且當利用根據本發明的方法製備的DNA卡片存儲DNA時，保存DNA以允許在甚至很長時間後克隆和自動鹼基測序，至此其也可用於檢測基因突變和查找癌症。
實施例9用DNA/殼聚糖複合物為模板的Southern印跡在通過根據本發明的方法存儲的DNA和殼聚糖複合物的雜交分析如Southern印跡等等分析特定基因的存在和量中，結合殼聚糖的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中不移動，所以其難以進行印跡分析。因此，對於印跡分析，DNA樣品應當除去殼聚糖而使用。因此本發明中，已建立了除去殼聚糖而不破壞結合殼聚糖的DNA的方法。
如上所述，水溶性殼聚糖為陽離子鹽並且結合DNA，所以殼聚糖可通過用強陽離子鹽如SDS(十二烷基磺酸鈉)、SOS(辛基硫酸鈉)和CTAB(溴化十六烷基三甲銨)的硫酸鹽處理而與DNA分離。在這種情況下，陽離子鹽應當是便宜的並且對印跡分析沒有影響且不破壞DNA。因此本發明中，使用SDS(Sigma Co.，USA)，其是便宜的並且對DNA和探針之間的雜交反應沒有影響。
根據本發明的方法通過將殼聚糖溶液和胰腺癌組織DNA混合而獲得的DNA/殼聚糖複合物在室溫下存儲三個月。隨後，5至10μg該DNA/殼聚糖複合物與5％(w/v)SDS混合，並且在瓊脂糖凝膠上電泳用於Southern印跡。通過已知的方法(Sambrook J Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)對K-ras基因進行Southern印跡。結果分別在圖12和圖13中顯示。
從圖12發現在具有5％SDS的電泳的情況下DNA和殼聚糖分離並且DNA在凝膠上移動。
此外，圖13顯示Southern印跡的結果，對於不結合殼聚糖存儲在-70℃的和以殼聚糖/DNA形式存儲六個月的兩種DNA，K-ras基因都強表達。因此，建立利用根據本發明的DNA存儲方法長時間存儲的DNA進行Southern印跡的方法。此外發現根據本發明的方法存儲的DNA可用於雜交分析。
實施例10對長時間存儲在DNA卡片中的DNA PCR-RFLP分析可能性的研究對利用本發明的1型DNA卡片存儲的人基因組DNA樣品進行PCR，並且隨後檢測利用RFLP(限制性片段長度多態性)分析是否可以對其進行基因分型檢測。1型DNA卡片的PCR後利用RFLP分析的基因分型結果顯示在圖8中。此外，研究了是否可以利用PCR-RFLP分析對作為血液存儲在本發明的2型DNA卡片中的人樣品進行基因分型。結果在圖9中顯示。為了證明本發明的DNA卡片事實上可用於基因診斷中，與心血管疾病的發作有關的基因通過PCR擴增，並且用下列特定的限制性酶處理。通過電泳分析結果。結果發現查找多個基因分型沒有問題。
本實施例將在下文中詳細描述。
利用本發明的1型DNA卡片和型DNA卡片以及塑料DNA ID卡，分別在PCR試管中利用下表所示的反應溶液製備下列六個與老年疾病有關的基因。
如上製備的包含反應溶液的PCR試管加至PE2700熱循環儀(Perkin Elmer，USA)，並且根據如下的每種基因擴增。
1.對於eNOS1/2、MTHFR1/2、AGT1/2、AT1R、ACE1基因95℃/5分鐘，35個循環(95℃/30秒，58℃/30秒，72℃/40秒)，72℃/10分鐘2.對於ACE2和APOE1/2基因95℃/5分鐘，35個循環(95℃/30秒，65℃/30秒，72℃/40秒)，72℃/10分鐘由此-獲得的每種基因的PCR產物通過在含有EtBr的1.2％瓊脂糖凝膠上電泳而證實。每種基因產物的大小顯示在下列表2中。
為了用由此-獲得的PCR產物進行RFLP，首先除了ACE基因外的其他五個基因(eNOS、MTHFR、AGT、AT1R和APOE)的PCR產物利用DNA Clean Concentrator試劑盒(Zymo Research Corporation，CA USA)如下純化。
1.對於PCR產物(約25μl)，DNA結合溶液雙倍體積加入，即50μl。
2.對於預先提供的Zymo spin柱，添加上述1的所有混合物並且在13,000rpm離心30秒。
3.用移液管除去收集於收集管中的溶液。
4. 200μl洗滌緩衝液加至該柱並且在13,000rpm離心30秒(重複兩次)。
5.剩下的洗滌緩衝液通過在空管中13,000rpm離心40秒而完全除去。
6.移去收集管，並且對於新柱提供乾淨的1.5ml微量離心管，並且隨後對此添加20μl滅菌的三蒸水，在13,000rpm離心40秒用於洗脫。或者，可使用加熱至大約65℃的滅菌的三蒸水。
對於在上述方法中純化和獲得的PCR產物，在對應每種限制性酶的條件下準備對應下表中每種基因的限制性酶。隨後，其保留於37℃水浴反應4至6個小時，且隨後通過2.5％的瓊脂糖凝膠電泳查找每種基因的風險率。
實施例11含有殼聚糖的PCR試劑盒的製備作為利用本發明殼聚糖的DNA存儲方法的應用，生產PCR試劑盒，其中Taq聚合酶、引物、dNTP和緩衝液等等加至具有殼聚糖的一個管(所有的在一個管中)，並且樣品如DNA或血清加至該管以產生PCR反應。特有地，該PCR試劑盒可用於DNA存儲和PCR測定。
本實施例中利用獲自B型肝炎患者血液的DNA，用本發明的PCR試劑盒找到B型肝炎病毒的存在。該試劑盒也可通過診斷癌症相關基因的而應用於癌症診斷，或B型病毒肝炎病原體或人乳頭狀瘤病毒感染、性傳播感染、其他的細菌感染等等的診斷。
該試劑盒的用法如下。
1至3ng DNA模板加至包含10μl 5GG一步PCR緩衝液TM和熱啟動型Taq聚合酶(AmpliTaq Gold，PerkinElmer，USA)，2.0μl 10mMdNTP混合物，1.0μl靶基因的每種正向引物和反向引物(5pmol)和0.1％濃度殼聚糖的一體試管。蒸餾水添加入試劑盒中至總體積50μl，並且充分混合，隨後進行PCR。首先，在50℃進行反轉錄反應30分鐘，在95℃進行變性15分鐘，隨後進行94℃一分鐘，53℃40秒和72℃一分鐘總共25至40個循環，然後以72℃反應10分鐘結束PCR擴增。因此，利用本發明的PCR試劑盒發現B型肝炎病毒DNA的存在(未附數據)。
實施例12塑料DNA ID卡的產生圖14為顯示利用本發明的DNA卡片製備塑料DNA ID卡的過程的流程圖。如圖14的流程圖進行操作過程以開發塑料的DNA ID卡。
1.接收傳送的個人樣品如血液或口腔細胞，DNA卡片等等，以及個人照片數據(S201)。
2.從樣品分離基因組DNA以及血型檢定的檢測(S202)。
3.利用提取的基因組DNA測定HLA基因分型，STR個人鑑定基因的檢測以及結果分析(S203)。圖15為顯示利用15個STR檢測組合鑑定個人基因型，製備個人基因型分布型以及編碼個人基因型數據的簡圖。
4.插入紙DNA卡片以與塑料卡附著，通過加熱和壓力製備DNAID卡的框(S205)。圖16為顯示在製備本發明的DNA ID卡過程中將1型或2型DNA卡片結合入PVC卡片的簡圖。如圖16所示，PVC軟層位於最低端，並且1型DNA卡片或2型DNA卡片位於其上。隨後，PVC核心層位於其上，其具有紙DNA卡片大小的孔(由於紙卡片的厚度以及紙和PVC由相互不同的材料製成，必須準備該卡片大小的孔，所以其沒有通過加熱一起整合。具體地，紙卡片插於該孔上)。其上存在PVC核心層，其具有另外的兩個小孔(用於將DNA或血液注射入該DNA紙卡片，由於卡片通過加熱的整合幾乎未留下空隙，所以其應當位於紙卡片上)。最後，PVC軟層位於其上。隨後，在高壓(100至140bar)和160至180℃的高溫下進行加熱8至30分鐘以整合。在這時候，紙DNA卡片的位置與磁條的位置相對，並且也與照片副本的位置相對。圖17為本發明塑料DNA ID卡的一個實施例的簡圖。
5.將個人DNA或血液滴於該塑料DNA ID卡和用於存儲的卡片上，其在S204中產生(S205)。通過利用針而將DNA或血液通過滲透PVC軟層的PVC核心層的孔注射入該紙DNA卡片而將DNA或血液滴於該塑料DNA ID卡上。注射後，通過hologram，膠棒等等封住由針產生的孔。
6.編碼在磁條或塑料DNA ID卡的晶片上分析的數據(S206)。磁條通常由三個磁軌組成。其上可寫英語的道為第一個磁軌，其具有78比特可用。第二個磁軌具有38比特可用，並且第三道具有107比特可用。因此，如圖17所示，簡要的個人信息編碼於第一個磁軌上，患者的特定疾病代碼編碼於第二個磁軌上(實施例C61-前列腺癌或N40-良性前列腺肥大)，並且STR或HLA分型的結果編碼於第三個磁軌上。然而，在連接到庫等等的情況下，塑料DNA ID卡的編碼方法為基因信息僅登記在主伺服器中，並且以庫所要求的方式編碼，且個人基因信息等等的數據利用POS系統從該主伺服器傳輸。該方法用於最大化本發明塑料DNA ID卡的另外的有效性(S206)。圖18為將信息編碼於本發明DNA ID卡上的一個實施例的簡圖。
7.個人照片的副本和簡要的人員信息通過浮雕方法刻在塑料DNA ID卡上(S207)。
8.個人數據輸入超級計算機(用於伺服器)，特定的個人ID代碼分配於塑料DNA ID卡，並且設置個人密碼(S208)。
9.POS系統的組建和操作以允許個人利用ID和密碼根據安全性維護的條件獲取信息，如有必要其由每個人、醫院、每個機構或庫等等記錄在國內外的塑料DNA ID卡中(S209)。
圖15為本發明塑料DNA ID卡的一個實施例的簡圖。卡片正面記錄個人照片和姓名，簡要的人員信息(至醫院在急診時可立即操作的水平)和地址。卡片背面存在磁條，其中編碼個人基因信息，並且其設計成能保留籤名和DNA存儲的位置。
實施例13整合入塑料DNA ID卡中而存儲的紙DNA卡片碎片的基因擴增實驗通過PCR擴增eNOS基因，一種老年疾病基因，確定了基因是否可從存儲於1型或2型紙DNA卡片中的DNA擴增，紙DNA卡片整合入塑料DNA ID卡，其在高溫和高壓下預先製備。該方法以與上述實施例10同樣的方法進行。
1型DNA卡片和2型DNA卡片分別整合入已在高溫和高壓下準備的塑料DNA ID卡，以使人基因組DNA和血液以浸入其中的各紙卡中而存儲。隨後利用這些塑料DNA ID卡，通過PCR擴增一種老年疾病基因eNOS基因而用於比較。結果在圖19中顯示。通過該實驗發現當用於血液吸收的2型DNA卡片用於本發明中時，血液樣品必須滴下，而且在PCR擴增中塑料DNA ID卡的塑料護封必須首先除去。
圖20顯示了利用實驗室中高溫而無人工壓力處理的和事實上在高溫和無壓力下製備的塑料DNA ID卡，一種老年疾病基因eNOS基因PCR擴增的結果，用以比較其中樣品在卡片製備之前添加的情況和其中樣品在卡片製備之後添加的情況。通過該實驗，獲得的結果表明最好樣品滴於預先製備的塑料DNA ID卡上，而不管所要存儲的樣品為DNA或血液。
用於滴有DNA的1型DNA卡片和用於滴有血液的2型DNA卡片分別附著於塑料卡上，其在高溫和高壓下製備以製備DNA ID卡。為了找到滴至各卡片的合適樣品的濃度和量，在基因組DNA的情況下利用如上製備的卡片碎片，DNA樣品以不同的體積中150ng/μl的濃度滴下，並且在PCR中擴增和分析eNOS基因。結果在圖21中顯示。通過該實驗發現其不適於將血液裝載於1型DNA卡片上(用於DNA)並且當滴下DNA時至少可滴下大約1.5μg。
通過PCR擴增老年疾病基因eNOS基因而比較和分析用洗滌緩衝液處理卡片碎片作為預處理過程的情況和在存儲高溫和高壓下製備的塑料DNA卡片中的樣品在PCR擴增中未處理的情況之間的差異。結果在圖22中顯示。結果是，在利用塑料DNA ID卡的PCR中當卡片碎片不用洗滌緩衝液預先處理時PCR擴增更好地完成。根據本發明利用水溶性殼聚糖存儲DNA的方法在DNA存儲效力上是優秀的，並且與常規方法相反，使得在室溫下長時間穩定地存儲DNA成為可能。利用該方法，不僅可以在室溫下長時間穩定地存儲和運載小的質粒DNA，還可以儲存大型植物和動物的基因組DNA和cDNA以及真菌、細菌和病毒的基因組DNA。根據本方法存儲的DNA可用於所有的基因分析如PCR和RFLP、克隆、鹼基測序、Southern印跡等等。此外，其可廣泛用於PCR試劑盒等中，並且其是簡單的和經濟的。尤其本發明的1型DNA卡片在室溫下長時間存儲和運載多個DNA樣品中非常有用，並且2型DNA卡片可在室溫下長時間存儲包含DNA的各種生物樣品如血液而不破壞DNA。此外，對於存儲在這些DNA卡片中的樣品，可甚至在很長時間後正確和簡單地進行各種基因分析如PCR和PCR-RFLP、雜交、鹼基測序、SNP分析等等，其在基礎研究以及各種臨床治療中非常有用。此外，本發明的DNA ID卡可起DNA庫的作用，其存儲個人的DNA，並且通過存儲個人的基因信息，其對個人鑑定和醫療如器官移植等等也有用。
權利要求
1.以殼聚糖/DNA複合物形式存儲DNA的方法，其中所述複合物通過將DNA溶液和水溶性殼聚糖溶液混合而製備，該水溶性殼聚糖具有60％或以上的脫乙醯程度，以及10kD至500kD的分子量。
2.根據權利要求1的方法，其中DNA包括動物、植物、真菌、細菌和病毒的基因組DNA、cDNA或質粒DNA，並且其大小從幾十個至幾十億個鹼基對。
3.根據權利要求1的方法，其中水溶性殼聚糖的水溶液濃度為0.02％(w/v)至1％(w/v)並且該混合物中水溶性殼聚糖對DNA的重量比為1∶0.5或以上。
4.根據權利要求1的方法，其中水溶性殼聚糖的水溶液濃度為0.02％(w/v)至0.25％(w/v)，DNA溶液的濃度為1μg/μl或更低，並且該混合物中水溶性殼聚糖對DNA的重量比為1∶0.5至1∶3。
5.根據權利要求1的方法，其中該DNA和殼聚糖的複合物在-70℃至室溫下存儲。
6.根據權利要求1至5任何一項的方法，其中該結合殼聚糖的DNA的複合物以液態存儲。
7.存儲DNA的紙型DNA卡片，其中該DNA卡片通過將其浸於包括水溶性殼聚糖和尿酸的組合物並且乾燥而製備，並且通過將DNA溶液滴於該卡片上隨著DNA與水溶性殼聚糖結合而存儲DNA。
8.存儲DNA的紙型DNA卡片，其中該DNA卡片通過將其浸於包括水溶性殼聚糖和含有尿酸的細胞裂解緩衝液的組合物並且乾燥而製備，並且通過將含有DNA的生物樣品滴於該卡片上隨著DNA與水溶性殼聚糖結合而存儲DNA。
9.根據權利要求7或8的紙型DNA卡片，其中該紙用於印跡或色譜法並且其厚度為0.3至1.2mm。
10.根據權利要求7或8的紙型DNA卡片，其中該卡片用6、24、96或384個孔標記，每個孔具有12.3cm-8.1cm直徑的大小，並且在每個孔上滴下和存儲DNA或血液樣品。
11.根據權利要求7的紙型DNA卡片，其中組合物通過將0.1％至1％(w/v)的水溶性殼聚糖與0.5mM至20mM的尿酸以1∶1的體積比混合而製備。
12.根據權利要求8的紙型DNA卡片，其中該細胞裂解緩衝液包括Tris(8mM)，EDTA(0.5mM)，SDS(0.1％w/v)和尿酸(2mM)。
13.在DNA卡片上進行PCR分析的方法，包括步驟a)將權利要求7中的DNA卡片的碎片加至PCR試管；b)將TE緩衝液(10mM Tris-Cl，0.1mM EDTA，pH＝8.0)加至該試管，並且混合後在室溫下靜止5分鐘，隨後利用移液管棄去TE緩衝液；c)重複b)步驟兩次；d)在室溫下乾燥該試管1小時或在56℃下乾燥10分鐘；和e)將PCR樣品加至該試管並且通過PCR擴增。
14.在DNA卡片上進行PCR分析的方法，包括步驟a)將權利要求8中的DNA卡片的碎片加至PCR試管；b)將洗滌緩衝液(GG純化試劑；0.5mM EDTA，8mM Tris-Cl，2mM尿酸，1％(w/v)SDS)加至該試管並且混合後在室溫下靜止5分鐘，隨後利用移液管棄去洗滌緩衝液；c)重複b)步驟三次；d)將TE緩衝液(10mM Tris-Cl，0.1mM EDTA，pH＝8.0)加至該試管並且混合後在室溫下靜止5分鐘，隨後利用移液管棄去TE緩衝液；e)重複d)步驟兩或三次；f)在室溫下乾燥該試管1小時或在56℃下乾燥10分鐘；和g)將PCR樣品加至該試管並且通過PCR擴增。
15.分析方法，其中根據權利要求6的存儲方法存儲的DNA或存儲在權利要求7或8的DNA卡片上的DNA用於PCR-RFLP、克隆、文庫合成、序列分析或Southern印跡。
16.分析DNA的方法，其中分離自根據權利要求6的存儲方法以液態存儲的殼聚糖/DNA複合物的DNA或分離自利用基於硫酸鹽的陽離子鹽存儲於權利要求7或8的DNA卡片上的殼聚糖/DNA複合物的DNA用於基因分析。
17.權利要求16的分析DNA的方法，其中基於硫酸鹽的陽離子鹽包括SDS(十二烷基硫酸鈉)、SOS(辛基硫酸鈉)和CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)。
18.包括含有寡d(T)、引物、Taq DNA聚合酶、反應緩衝溶液、dNTP和水溶性殼聚糖的試管的PCR試劑盒，其中該試管另外包含DNA或血清樣品，並且該試管用於進行PCR。
19.DNA ID卡，其中殼聚糖和個人DNA的混合物根據權利要求1的DNA存儲方法存儲於其部分上，並且個人的遺傳信息保存在磁條或嵌入的晶片上。
20.根據權利要求19的DNA ID卡，其中該DNA ID卡的基本材料為塑料。
21.製備DNA ID卡的方法，包括步驟a)將權利要求7或8中的DNA紙卡片堆積於PVC軟層上；b)在DNA紙卡片上堆積第一個PVC核心層，其具有與DNA紙卡片相同大小的孔；c)在第一個PVC核心層的孔上堆積第二個PVC核心層，其具有小於第一個PVC核心層的孔的兩個孔，；d)將PVC軟層堆積於第二個PVC核心層上；和e)向堆積的層加熱和加壓以用於彼此熱粘附。
22.根據權利要求20的DNA ID卡，包括第一個PVC軟層；DNA紙卡片；第一個PVC核心層，具有與DNA紙卡片相同大小的孔；第二個PVC核心層，具有孔，DNA或含有DNA的生物樣品通過該孔滴於DNA紙卡片上；和第二個PVC軟層，其中磁條位於DNA紙卡片上與存儲DNA或生物樣品側的對側。
23.根據權利要求22的DNA ID卡，其中個人的信息、疾病代碼、STR或HLA分型編碼於磁條上。
24.根據權利要求19的DNA ID卡，其中滴於DNA ID卡上的gDNA量為1.5μg或更多。
25.分析方法，其中權利要求19的DNA ID卡的碎片無需洗滌緩衝液處理而用於PCR擴增。
全文摘要
如果人、動物、植物或細菌的DNA或含有DNA的生物樣品如血液與水溶性殼聚糖充分混合，並且利用以液態或以固態使用固體介質如紙存儲，有可能在室溫下長時間穩定地存儲DNA，並且其也可用於此後的基因分析。該DNA存儲方法簡單且合算，並且通過應用該方法製備的產物如DNA卡片和PCR試劑盒可存儲、運載以及收集多個DNA樣品，且其也對自動分析非常有效。此外，該DNA ID卡可起DNA庫的作用，其存儲個人的DNA，並且通過存儲個人的遺傳信息，其對個人鑑定和醫療是有用的。
文檔編號C12N15/00GK101048501SQ200580037030
公開日2007年10月3日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年9月7日
發明者文宇哲, 吳明烈, 任秀彬, 嚴泰漢, 李美愛, 全富一 申請人:固德基因公司