鞘氨醇激酶-1介導的單核細胞化學引誘蛋白-1基因的基因表達調節的製作方法

2023-05-13 23:23:41

專利名稱：鞘氨醇激酶-1介導的單核細胞化學引誘蛋白-1基因的基因表達調節的製作方法
技術領域：
本發明涉及鑑別、監測和Y吏用調節鞘氨醇激酶-1生物活性的化 合物的方法。具體地說，本發明的方法涉及包含鞘氨醇激酶-1、凝血 酶或單核細胞化學引誘蛋白-1的信號轉導。
背景技術：
血管內皮曾經被認為在血管-組織間室之間提供被動性屏障功 能，現在被公認為在維持正常止血和協調對傷害的組織應答方面起 主要作用。當血管系統同血液的細胞組分以及由於脫粒而釋放的蛋 白接觸時，同在輕微炎症或血栓形成事件中一樣，在急性傷害期當 中發生內皮與廣i普刺激物接觸增加。在被認為存在於糖尿病或動脈 粥樣硬化中的更持久血管系統活化的情況下，與提高的脂質接觸、 高血糖和剪切力改變在調節內皮病理生理學的刺激物的相互作用方 面還存在另 一種水平的複雜性。內皮刺激導致眾多生物活性介導物 的釋放以及促進血小板和白細胞粘附和遷移的內皮表面分子的改 變，改變了血管完整性和血管反應性。
鞘氨醇激酶(SK)是新近發現的脂質激酶家族，從進化上講在人、 小鼠、酵母和植物中是保守的(Nava等，F五^S丄e". 2000， 473:81-84)。 近期已由人和小鼠中克隆出兩種SK同種型SK1和SK2 (Liu等,/說o/ C/ ew. 2000, 275(26):19513畫20)。 SK1和SK2在動力學特性、組織分 布和發育表達模式上不同，提示可能不同的調節和功能作用(Fukuda等，說oc/2em說o/ /2;A i^y Cowmw ., 2003, 309:155-160)。 SK在眾多細 胞類型中表達，包括人血管內皮細胞和血管平滑肌細胞(VSMC)(Xu 等，Atherosclerosis 2002， 164:237-43; Ren等，World J. Gastroenterol. 2002, 8:602-7)。 SK催化由鞘氨醇形成鞘氨醇-l-磷酸(SlP)。
SIP是一種在胞外和胞內均調節不同生物過程的生物活性脂質。 例如，SIP減輕已知為程序性細胞死亡或凋亡有效誘導物的細胞毒性 神經醯胺的產生(Maceyka等，5"c/j/w/'ca " 5/o; /2>^,'ca爿cto fSSA -A/o/ecw/ar Ce〃說o/ogy o/Xz^/cfe, 2002, 1585:193-201)。而且，業已 表明，SIP在以三磷酸肌醇(IP3)非依賴性方式釋放胞內鈣儲存(Mattie 等，C7ze附.1994， 269:3181-3188)、活化轉錄因子如CREB (Coussin等，5/oc/2em屍/2ammc0/, 2003, 66:1861-1870)和AP-l (Su等， / 說o/C/^m 1994,269:16512-16517)、增加炎症相關蛋白的表達(Xia等, 屍rac 爿cad [/&4, 1998, 95:14196-14201)和刺激有絲分裂發生 (Auge等， /編O e附.1999, 274:21533-21538)方面直接或間接起作 用。最近，已表明S1P信號轉導在動脈粥樣硬化損害的發病機理中 起重要作用，但S1P是致動脈粥樣硬化的還是抗動脈粥樣硬化的仍 有待研究(Xu等，Acta Pharmacol Sin 2004, 25:849-954)。
業已描述了 SK活化在眾多細胞類型中處於幾個不同受體家族下 遊。例如，SK參與由促炎細胞因子受體如TNF-oc受體介導的信號轉 導途徑(Xia等，出處同上)。SK還參與其它受體家族的信號轉導途徑， 所述受體家族例如為受體酪氨酸激酶(即VEGF或PDGF受體)(Wu等, (9"coge"e 2003, 22:3361-3370; Meyer zu Heringdorf等，F五5S 1999,461:217-222;和Hobson等，Sc/e"ce 2001, 291:1800-1803)、高 親和性FcsRI受體(Choi等，M/fwre 1996， 380:634-636)和GPCR (即毒 蕈鹼(Meyer zu Heringdorf等，出處同上)和SIP受體。
凝血酶是一種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，在止血和血栓形成中 均發揮核心作用(參見綜述Srivastava等，A^of i " Wev. 2005年1月； 25(l):66-92)。血栓形成在發達國家是最常見的單一死因，其具有異
常凝結和血小板聚集的特徵。 一些衰弱徵兆自身以心肌梗塞、中風、 深靜脈血栓形成和肺栓塞形式表現出來。實際上，美國心臟協會估
計在美國全部死亡的54%可歸因於心血管疾病。血栓形成相關並發 症單在美國每年就導致約2百萬人死亡。即便不是大多數，也有許 多血栓形成事件可通過使用合適的初級抗血栓形成治療來防止，幾
乎所有的復發情況都可通過使用合適的二級治療來防止。止血是一 種在血管損傷事件中抵禦不受控的出血的複雜過程，可通過血管損
傷、組織損傷或在血流中存在異物而被活化。止血作用機制包括(a) 被損傷血管的血管痙攣；(b)形成短期血小板栓；(c)形成強血纖維蛋 白凝塊(血栓)；和(d)凝塊分解(血纖維蛋白溶解)。
已知凝血酶的主要功能在於通過其在凝結途徑中已充分表徵的 作用維持止血。凝血酶將纖維蛋白原蛋白酶剪切為血纖維蛋白肽A 和B,並產生纖維蛋白。纖維蛋白形成在血管傷害後防止血液流失的 纖維蛋白凝塊(血栓)。所述凝塊隨後在傷口癒合時由纖維蛋白溶解系 統(血纖蛋白溶解)去除。凝血酶除了在凝結過程(即形成凝塊的過程) 最後一步的關鍵作用之外，還在啟動抑制途徑下調凝結過程並活化 纖維蛋白溶解系統方面起關鍵作用。凝結活化的增加可產生嚴重的 血栓栓塞性疾病，例如血栓形成。
凝血酶還被指為是組織損傷的細胞應答中的關鍵介導物，其通 過已知為蛋白酶活化受體(PAR)的七跨膜G蛋白偶聯受體新家族活化 血小板、血管細胞、成纖維細胞和免疫細胞(丁1^16 ,(^//"0^附.2000, 46:1260-1269)。凝血酶誘導粘附分子表達，增加血管通透性、血管生 成以及細胞因子和生長因子的釋放，並促進血管調節素如一氧化氮 和前列腺素的釋放。凝血酶的大部分細胞應答都歸因於PAR-1 (Derian 等，EXPERT OPINION ON INVESTIGATIONAL DRUGS, 2003, 12(2):209-21)。但是，已鑑別出兩種另外的凝血酶反應性受體PAR-3 (Z^/tora等，Nature, 1997, 386:502-506)和PAR隱4 (Xu等，PNAS 1998， 95:6642-6646)。還已鑑別出在此GPCR家族中的凝血酶不敏感受體
PAR-2,其在血管內皮上表達(Bohm等，歷0c/7ew / 1996, 314 (Pt 3:1009-1016),在活化時介導許多和PAR-1類似的生物過程。凝血酶 信號轉導途徑抑制劑已變成當前血栓形成和其它疾病的治療研究的 主要目標。
不同報告提示，SK在不同細胞類型中或者參與或者不參與凝血 酶信號轉導途徑。例如，已報導SK活化參與凝血酶誘導的小鼠肥大 細胞的IL-6分泌(Gordon等，Cell Immunol. 2000年11月1日；205(2): 128-35)。但是，在用卩H]-鞘氨醇標記的完整人血小板中，用凝血酶 刺激不影響卩H]-S1P形成(Yang等，J Biochem (Tokyo). 1999年7月； 126(1):84-9)。最近，已報導在豚鼠的腸肌層神經膠質中PAR-2的活 化經涉及鞘氨醇激酶活化的信號轉導機制導致胞內鉤增加(Garrido等, J A^wrac/ e附.2002年11月；83(3):556-64), PAR國2是一種由胰蛋白 酶和肥大細胞類胰蛋白酶活化4旦不由凝血酶活化的GPCR。有趣的 是，同一報導表明，在豚鼠的腸肌層神經膠質中，PAR-1的活化經 不涉及鞘氨醇激酶活化而涉及》痔脂酶C活化的信號轉導機制導致胞 內鉤增加，PAR-1是一種由凝血酶活化的GPCR。
單核細胞化學引誘蛋白-1 (MCP-1)是一種C-C趨化因子，對在 生理和病理生理條件下募集單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞起關 鍵作用。MCP-1的趨化作用由趨化因子受體CCR2介導(Boring等，>/. C7/". /騰對.1997, 100: 2552-2561)。 MCP國1在各種組織中表達，例如 內皮、支氣管、上皮、平滑肌細月包、巨噬細胞等(Antoniades等,屍racWw/ 爿cad S" OX4， 1992, 89:5371-5375; Lyonaga等，Z/i/w P^/zo/， 1994, 25:455-463; Car等，爿w Ji e^/r O" C"^ Me《1994, 149:655-659)。
MCP-1涉及各種炎性疾病的病理發生，所述疾病包括受感染組 織的單核細胞/巨噬細胞浸潤。MCP-1的水平在類風溼性關節炎患者 的滑液和血清中和在患有膠原蛋白誘導的關節炎(CIA)的大鼠滑液中 升高(Koch等，C"w. /面f. 90， 1992: 772-779; Ogata等，/.涵o/. 1997, 182: 106-114)。動物模型的數據支持MCP-1在類風溼性關節炎發展
中的必需作用。例如，在CIA大鼠中，給予抗MCP-1的中和單克隆 抗體減輕關節胂脹和巨噬細胞侵襲；在小鼠MRL-// r關節炎模型中， 注射顯性失活形式的MCP-1防止關節炎症和骨破壞的發生(Ogata等, 出處同上；和Gong等，/, 5xp Met/. 1997, 186: 131-137)。 MCP-1是治 療嚴重炎性疾病的潛在治療標靶，包括類風溼性關節炎和慢性阻塞 性月巿病。
近期研究已揭示，MCP-1表達增加在血管疾病的發病機理中起 核心作用(Charo等，Ooz/Wo" /^^fln:/ . 2004; 95: 858)。在由血液向 早期動脈粥樣硬化病灶中募集單核細胞、血管成形術後出現內膜增 生以及血管生成和血栓形成方面，MCP-1已被指為是關鍵作用物。 沒有MCP-1或CCR2的轉基因小鼠顯示出對經實驗誘發的動脈粥樣 硬化的部分抗性(參見例如Yla-Herttuala等，屍rac. 爿cat/. Sc/' 1991, 88: 5252-5256; Boring等，Atowre, 1998, 394: 894-897)。
另外， 一些研究已將MCP-1與慢性阻塞性肺病(de Boer等，屍W/ o/. 2000, 190: 619-626; Traves等，2002, 772orax 57: 590-595)和中風後的 局部缺血性組織損傷(Hughes等，J. CereZ). B/ood F/ow M""Z). 2002, 22: 308-317)關聯起來。
用於抑制MCP-1生物活性的化合物可在眾多疾病領域提供治療 利益。業已表明，抗MCP-1基因治療是抗MCP-1相關性心血管疾病 的有用且可行的策略(Kitamoto等，五x/ ert Caraf/ova化77je廣2003 年9月；1(3):393掘)。例如，用MCP-1的顯性失活抑制劑轉染骨 骼肌在大鼠中抑制由慢性抑制 一 氧化氮合成誘發的動脈粥樣硬化變 化。此基因治療在載脂蛋白E敲除小鼠中抑制動脈粥樣硬化的出現、 進行和不穩定化。該策略還在大鼠、兔和猴中降低球嚢損傷後的再 狹窄，在兔和猴中降低支架植入後的新生內膜形成(Kitamoto,出處同上)。
其它生物物質，包括抗體和抑制肽，也已被開發用於治療MCP-1相關性疾病。例如，阻斷MCP-1與CCR2結合的單克隆抗體正用
於類風溼性關節炎的II期臨床實驗(Charo等，出處同上)。但是，盡 管進行了深入篩選，但仍沒有可在臨床上使用的CCR2受體的小分 子拮抗劑(Daly等，M/c腦.簡/Wo". 2003年6月；10(3-4): 247-57)。 因此，需要開發治療MCP-1相關疾病的新治療劑的新策略。
發明概述
現在已發現鞘氨醇激酶-1 (SK1)由經Par-l的凝血酶和腫瘤壞死 因子a活化。血栓形成或炎症刺激物對SK1的活化誘導單核細胞化學 引誘蛋白-1 (MCP-1)基因的表達。通過SK1活性抑制劑或特異性降 低SK1基因表達的siRNA降低SK1活性抑制SK1誘導的MCP-1基
因表達。
在一個一般方面，本發明^提供一種測定細胞中的鞘氨醇激酶-1 生物活性的方法，其包括測定所述細胞的單核細胞化學引誘蛋白-1 基因的表達水平的步驟。
在另一個一般方面，本發明提供一種監測給予受試者的化合物 的效力的方法，其中預期所述化合物增加或降低所述受試者細胞中 的鞘氨醇激酶-1生物活性，所述方法包括以下步驟a)檢測所述受試 者的單核細胞化學引誘蛋白-1基因的表達水平；和b)比較步驟a)中 測定的表達水平和給予所述化合物之前所述受試者中的單核細胞化 學引誘蛋白-1基因的表達水平。在一個具體實施方案中，所述方法 的步驟(a)包括檢測所述受試者的生物樣品中單核細胞化學？ 1誘蛋白-1 的量的步驟。
本發明的另 一個一般方面是一種鑑別增加或降低鞘氨醇激酶-1 生物活性的化合物的方法，其包括以下步驟a)使鞘氨醇激酶-l反應 性系統與含緩衝液和測試化合物的溶液接觸，其中所述鞘氨醇激酶-1 反應性系統包含鞘氨醇激酶-1或其功能衍生物，以及其表達受單核 細胞化學引誘蛋白-1基因的調節序列控制的基因；b)檢測所述鞘氨醇 激酶-1反應性系統中其表達受單核細胞化學引誘蛋白-1基因的調節
序列控制的基因的表達水平；和c)根據其與其中鞘氨醇激酶-l反應
性系統僅與緩衝液接觸的對照相比增加或降低所述表達水平的能力 鑑別所述化合物。
在該方面的一個具體實施方案中，所述方法還包括以下步驟d) 使鞘氨醇激酶-1與溶液接觸，所述溶液含由以上步驟c)鑑別的化合 物以及包含鞘氨醇和腺苷三磷酸的緩衝液；e)檢測由所述鞘氨醇產生 的鞘氨醇-l-磷酸的量；和f)根據其與其中鞘氨醇激酶-l僅與緩衝液 接觸的對照相比增加或降低由鞘氨醇生產鞘氨醇-l-磷酸的能力鑑別 所述化合物。
本發明的另一個一般方面是一種增加或降低細胞中的單核細胞 化學引誘蛋白-1基因表達的方法，所述方法包括以下步驟增加或 降低所述細胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性，使得所述單核細胞化學 引誘蛋白-1基因的表達分別被增加或降低。
本發明的另 一個一般方面是一種抑制細胞中的凝血酶信號轉導 的方法，所述方法包括以下步驟降低細胞中的鞘氨醇激酶-1生物 活性，使得所述凝血酶信號轉導得以抑制。
本發明還提供在受試者中治療或預防與凝血酶信號轉導途徑相 關的疾病或與MCP-1生物活性或基因表達增加相關的疾病的方法。 這些方法包括以下步驟降低所述受試者中的鞘氨醇-l-磷酸的生物 活性，使得所述疾病得以治療或預防。在具體實施方案中，這種疾 病是血栓形成或動脈粥樣硬化。
附圖簡述


圖1圖示了微陣列分析的結果。分析揭示了凝血酶信號轉導和 鞘氨醇激酶的關聯，MCP-1基因表達響應於兩種刺激物凝血酶和 TNF-a被誘導，所述誘導在於剌激前加入DMS的條件下被抑制。
圖2表明，根據Taqman定量RT-PCR的檢測，設計的siRNA 顯示出對其各自的人SK同種型的特異性。
圖3表明，特異性抑制SK-1消除了 TNFa或凝血酶對MCP-1 的誘導在hSK-l特異性siRNA存在下MCP-1的誘導受到抑制，但 在hSK-2特異性siRNA或對照非沉默siRNA存在下未受抑制。
圖4表明，MCP-1分泌為PAR-1依賴性機制，需要鞘氨醇激酶活性。
圖5表明，PAR-1介導的凝血酶對MCP-1的誘導需要hSKl， 但不需要hSK2:凝血酶/PAR-l介導的MCP-1誘導在hSKl特異性 siRNA存在下受到抑制，但在hSK-2特異性siRNA或對照非沉默 siRNA存在下未受抑制。
圖6表明，誘導的HMVEC的MCP-1分泌需要NF-kB活性。 圖7表明，SIP受體活化不介導MCP-1的誘導。
發明詳述
後文提及的所有出版物都通過引用結合到本文中。除非另有限 定，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域 一般技術人員的通常理解相同的含義。
本文使用的術語"包含"、"含有"、"具有"和"包括"以 其開放的、非限制性的含義使用。
以下是在本說明書中有時使用的一些縮寫
ATP =腺苷三磷酸；
bp:鹼基對；
cDNA-互補DNA;
DMS-二曱基鞘氨醇；
ELISA =酶聯免疫吸附測定；
FLIPR=焚光成像板讀數器；
GPCR-G蛋白偶聯受體；
hSK =人鞘氨醇激酶；
kb-千石威基對；IOOO個鹼基對；
MCP-1 -單核細胞化學引誘蛋白-l;
NF-kB-核因子kB;
nt-核苷酸；
PAGE =聚丙烯醯胺凝膠電泳；
PAR-蛋白酶活化受體；
PCR-聚合酶鏈反應；
RT-PCR =逆轉錄聚合酶鏈反應；
SlP-鞘氨醇-l-磷酸；
SDS-十二烷基硫酸鈉；
siRNA-小幹擾RNA;
SSC-氯化鈉/檸檬酸鈉；
SK卜鞘氨醇激酶-1;
TNFa-腫瘤壞死因子ot;
UTR-非翻譯區。
多肽或核酸的"活性"、"生物活性"或"功能活性"指多肽 或核酸分子發揮的活性，其按照標準技術在體內或體外測定。此活 性可為直接活性，例如離子通道活性。其還可以與笫二種蛋白或底 物相關聯，或為對於第二種蛋白或底物的酶活性，例如，凝血酶的 絲氨酸蛋白酶活性或SK的脂質激酶活性。蛋白的生物活性還可為間 接活性，例如由所述蛋白與一種或一種以上其它蛋白或分子的相互 作用介導的細胞信號轉導活性，所述相互作用包括但不限於以多步、 連續方式發生的相互作用。
本文使用的"生物樣品"指含細胞或組織物質或由其組成的樣 品，例如分離自受試者的細胞或生物流體。"受試者"可為已成為 治療、觀察或實驗目標的哺乳動物，例如大鼠、小鼠、猴或人。生 物樣品的實例包括例如痰、血、血細胞(例如白細胞)、羊水、血漿、 精液、骨髓、組織或細針活檢樣品、尿、腹膜液、胸膜液和細胞培 養物。生物樣品還可包括組織切片，例如為組織學用途而獲取的冷
凍切片。測試生物樣品是已成為分析、監測或觀察目標的生物樣品。 對照生物樣品可為測試生物樣品的陽性或陰性對照。對照生物樣品 常常包含與測試生物樣品相同類型的目標組織、細胞和/或生物流體。 在具體的實施方案中，生物樣品是"臨床樣品"，其是來源於 人類患者的樣品。生物樣品還可被稱為"患者樣品"。測試生物樣 品是已成為分析、監測或觀察目標的生物樣品。對照生物樣品可為 測試生物樣品的陽性或陰性對照。對照生物樣品常常包含與測試生 物樣品相同類型的目標組織、細胞和生物流體。
"細胞"指適合於檢測方法靈敏度的至少一個細胞或多個細胞。 適於本發明的細胞可為細菌，但優選為真核細胞，最優選為哺乳動 物細胞。"內皮細胞"是薄的扁平細胞，可作為層狀物存在於體腔、 血管和淋巴管表面內部，形成內皮。業已確認，"內皮細胞"的細 胞系可在培養基中體外保持。內皮細胞系的實例包括但不限於成人
孩bk管內皮細胞(HMVEC)、 HUV-EC-C、人主動脈內皮細胞(HAEC)。 "克隆"是通過有絲分裂來源於單個細胞或共同祖先的細胞群。 "細胞系"是衍生出克隆擴充的細胞並能夠在體外穩定生長很多代 的原初細胞。
"基因，，是參與產生肽、多肽或蛋白以及編碼這些蛋白物質的 mRNA的DNA節段，包括編碼區、編碼區之前的非編碼區("5' UTR") 和之後的非編碼區("3' UTR")。"基因，，還可包含在各個編碼節段 ("外顯子")之間的插入非編碼序列("內含子")。"啟動子"指參 與RNA聚合酶的結合以啟動基因轉錄的DNA調節序列。啟動子經 常在基因轉錄起始位點的上遊("5'")。"調節序列"指可控制基因 表達的基因部分。"調節序列"可包括啟動子、增強子和其它表達 控制元件，例如聚腺苷酸化信號、核糖體結合位點(用於細菌表達)和/ 或操作子。"增強子"指可以距離或方向依賴性方式調節基因表達 的DNA調節序列。"編碼區，，指通過三聯體鹼基密碼子編碼用於對 應多肽翻譯的胺基酸以及起始和終止信號的基因部分。
"基因表達微陣列分析"指其中探針寡核苷酸的"微陣列"與 目標核酸樣品接觸的測定，所述目標核酸樣品例如為耙樣品，例如
特定組織類型的聚腺苷酸化mRNA或其逆轉錄物。參見例如Nees等, (2001)， Cwr Owcer Z>wg 7brge"， 1(2): 155-75。接觸在雜交條件下進 行，去除未結合核酸。所獲得的雜交核酸模式提供了有關測試樣品 的遺傳鐠的信息。基因表達分析可同時檢測成千上萬基因的表達， 提供有關基因相互作用和功能的廣泛信息。基因表達分析可用於各 種用途，例如鑑別基因表達、關聯基因表達和具體表型、篩選疾病 易感性以及鑑別特定因子對細胞基因表達的影響，例如在毒性測試 中。本文使用的"微陣列"指基質，例如大致平的基質，如生物芯 片或基因晶片，其具有大量聚合分子，這些聚合分子在空間上分布 於基質表面上，並與基質表面穩定締合或固定在基質表面上。示例 性的微陣列形式包括寡核苦酸陣列和點陣列。關於基因表達微陣列 分析的方法是本領域技術人員已知的。參見例如Yang等，(2002)， 細3(8): 579-88的綜述或美國專利第6,004,755號，該專利公 開了關於使用DNA微陣列進行定量基因表達分析的方法。
"單核細胞化學引誘蛋白-l基因"、"MCP1"或"MCP-1基 因"各自均指編碼單核細胞化學引誘蛋白-1的基因，MCP-1基因(l) 在嚴格雜交條件下與同人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸檢索號 NM—002982)編碼區具有約60%以上核苷酸序列同一性的核酸分子特 異性雜交；(2)編碼同人MCP-1蛋白(NCBI蛋白檢索號NP_002973) 具有約60%以上胺基酸序列同一性的蛋白；或(3)編碼能夠結合抗體 的蛋白，所述抗體針對本文描述的人MCP-1蛋白產生，例如為多克 隆抗體或單克隆抗體。
"MCP-1基因，，可在嚴格雜交條件下與同人MCP-1 cDNA(NCBI 核苷酸檢索號NM—002982)編；馬區具有約65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上核*酸序列同一性的核酸分子特異性雜交。在 其它實施方案中，MCP-1基因編碼的蛋白與人MCP-1蛋白(NCBI蛋
白檢索號NP—002973)具有約65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90% 或95%以上的胺基酸序列同一性。示例性的"MCP-1基因"包括用 於人MCP-1的結構和功能多態性的基因，以及其在其它動物如大鼠 (即NCBI核苷酸檢索號NM—03"30)、小鼠(即NCBI核苷酸檢索號 NM一011333)、豬、狗和猴中的直系同源物。"多態性"指在群體中 的個體當中的特定基因座上的一組遺傳變體。
"單核細胞化學引誘蛋白-l" 、 "MCP1" 、 "MCP-1"或"MCP-1 蛋白"各自均指為C-C趨化因子的蛋白，其在生理和病理生理條件 活化下均募集單核細胞、巨噬細胞或T淋巴細胞。MCP-1 (l)與人 MCP-1蛋白(NCBI蛋白檢索號NPJ)02973)具有約60%以上的氨基 酸序列同一性；(2)結合針對人MCP-1 (NCBI蛋白檢索號NP—002973) 產生的抗體，例如多克隆或單克隆抗體；或(3)由在嚴格雜交條件下 與核酸分子特異性雜交的多核苷酸編碼，所述核酸分子具有的序列 與人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸檢索號NM—002982)編碼區具有約 60%以上的核苷酸序列同 一性。
在某些實施方案中，MCP-1與人MCP-1 (NCBI蛋白檢索號 NP—002973)具有約65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上 的胺基酸序列同一性。示例性的MCP-1包括人MCP-1，其包括在NCBI 蛋白4企索號NP—002973中所示的人MCP-1蛋白的結構和功能多態 性。MCP-1還包括人MCP-1在其它動物如大鼠(即NCBI蛋白檢索號 NP—113718)、小鼠(即NCBI蛋白檢索號NP—035463)、豬、狗和猴
中的直系同源物。
"鞘氨醇激酶-l基因"、"SK1基因"或"SphKl基因"各自 均指編碼鞘氨醇激酶-1的基因，SK1基因(l)在嚴格雜交條件下與同 人SK1 cDNA (NCBI核苷酸檢索號NM—021972)編碼區具有約60% 以上核苷酸序列同一性的核酸分子特異性雜交；(2)編碼同人SK1蛋 白(NCBI蛋白檢索號NPJ)68807)具有約60%以上胺基酸序列同一 性的蛋白；或(3)編碼能夠結合抗體的蛋白，所述抗體針對本文描述
的人SK1蛋白產生，例如為多克隆抗體或單克隆抗體。
"SKI基因"可在嚴格雜交條件下與同人SKI cDNA(NCBI核 苷酸檢索號NM—021972)編碼區具有約65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上核苷酸序列同一性的核酸分子特異性雜交。在其它實 施方案中，SKI基因編碼的蛋白與人SKI蛋白(NCBI蛋白檢索號 NPJ)68807)具有約65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上 的胺基酸序列同一性。示例性的"SKI基因，，包括用於人SKI的結 構和功能多態性的基因，以及其在其它動物包括大鼠(即NCBI核苷 酸檢索號NM—133386)、小鼠(即NCBI核苦酸檢索號NM—011451)、 豬、狗和^ff美中的直系同源物。
"鞘氨醇激酶-l" 、 "SKI" 、 "SphKl"或"SKI蛋白"各自 均指在活化時能夠催化由脂質鞘氨醇形成鞘氨醇-l-磷酸(SlP)的蛋 白。
"SKI" (l)與人SKI蛋白(NCBI蛋白檢索號NPJ)68807)具有 約60%以上的胺基酸序列同一性；(2)結合針對人SK1 (NCBI蛋白檢 索號NPJ)68807)產生的抗體，例如多克隆抗體或單克隆抗體；或(3) 由在嚴格雜交條件下與核酸分子特異性雜交的多核苷酸編碼，所述 核酸分子具有的序列與人SKI cDNA (NCBI核苷酸檢索號 NM—021972)編碼區具有約60%以上核苷酸序列同一性。
在某些實施方案中，"SKI"與人SKI (NCBI蛋白檢索號 NPJ)68807)具有約65o/o、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上 的胺基酸序列同一性。示例性的SKI包括人SKI,其包括在NCBI 蛋白4企索號NP_068807中所示的人SKI蛋白的結構和功能多態性。 SKI還包括人SKI在其它動物如大鼠(即NCBI蛋白檢索號 NP—596877)、小鼠(即NCBI蛋白檢索號NP—035581)、豬、狗和猴
中的直系同源物。
"SKI功能衍生物"是來源於SKI的蛋白，其仍具有SKI生物 活性，即由鞘氨醇形成SIP。 SKI功能衍生物的實例包括但不限於含SKI的催化結構域的截短SK1，或含SKI催化結構域和其它蛋白氨 基酸序列的SKI融合蛋白。
"SKI活化刺激物"是可活化SK1生物活性的任何刺激物。SKI 在活化時催化由鞘氨醇形成S1P。各種SKI活化剌激物在眾多細胞 類型中經涉及不同受體家族的信號轉導活化SK1。在一個實施方案 中，SKI由促炎細胞因子(如TNFa)經促炎細胞因子受體(如TNFa受 體)活化。在另一個實施方案中，SKI由受體酪氨酸激酶如VEGF或 PDGF受體傳導的信號活化。在再另一個實施方案中，SKI由高親和 性FcsRI受體傳導的信號活化。而且，SKI由GPCR如毒蕈鹼受體、 SIP受體或PAR傳導的信號活化。例如，本文發現凝血酶是經涉及 PARI的信號轉導活化SKI的SKI活化刺激物。
"蛋白酶活化受體"、"PARI" 、 "PAR-l" 、 "Par-l"或"PAR-1 蛋白，，各自均指為七跨膜G蛋白偶聯受體的蛋白，在凝血酶信號轉 導途徑中用作凝血酶的細胞受體。其還叫做凝結因子II受體。其通 過蛋白酶剪切活化。
"PARI" (l)與人PARl蛋白(NCBI蛋白檢索號NPJ)01^!3)具 有約60%以上的胺基酸序列同一性；(2)結合針對人PARI (NCBI蛋 白檢索號NP—001983)產生的抗體，例如多克隆抗體或單克隆抗體； 或(3)由在嚴格雜交條件下與核酸分子特異性雜交的多核苷酸編碼， 所迷核酸分子具有的序列與人PARI cDNA (NCBI核苷酸檢索號 NM—001992)編碼區具有約60%以上的核普酸序列同 一性。
在某些實施方案中，"PARI"與人PAR1 (NCBI蛋白檢索號 NP—001983)具有約65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上 的胺基酸序列同一性。示例性的PAR1包括人PARl,其包括在NCBI 蛋白檢索號NP_001983中所示的人PARI蛋白的結構和功能多態 性。Pari還包括人PARI在其它動物如大鼠(即NCBI蛋白檢索號 NP—037082)、小鼠(即NCBI蛋白檢索號NP—034299)、豬、狗和猴 中的直系同源物。
"信號轉導"是過程級聯，其中胞外信號與細胞表面上的受體 相互作用，引起第二信使水平的改變，並最終實現細胞機能的改變。
"凝血酶信號轉導"指其中胞外信號為凝血酶的信號轉導。在 一個實施方案中，"凝血酶信號轉導"是過程級聯，其中凝血酶結
合細胞表面上的PAR-1、 PAR-3或PAR-4受體，引起笫二信使如4丐、 環化AMP或S1P水平的改變，並最終實現細胞機能的改變。細胞機 能的改變可為凝血酶參與的任^T細胞過程的改變。例如，凝血酶信 號轉導可導致凝結、針對組織損傷的細胞應答、粘附分子表達、血 管通透性、血管生成以及細胞因子和生長因子的釋放等改變。
"核酸序列"或"核苷酸序列"指在聚合物中脫氧核糖核苷酸 或核糖核苷酸殘基以單鏈或雙鏈形式的排列。核酸序列可由以下鹼 基的天然核苷酸和/或由合成類似物組成胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧 啶、鳥嘌呤和尿嘧啶；分別縮寫為T、 A、 C、 G和U。
術語"寡核苷酸"指長度相對短的單鏈DNA或RNA序列，例 如少於100個殘基長。對於許多方法來說，長約16-25個核苷酸的寡 核苷酸是有用的，儘管有時可j吏用超過約25個核苷酸的較長寡核苷 酸。 一些寡核苷酸可用作合成互補核酸鏈的"引物"。例如，DNA 引物可與互補核酸序列雜交，以在使用DNA聚合酶的反應中啟動互 補DNA鏈的合成。寡核苷酸還可在幾種核酸檢測方法中用於雜交， 例如在RNA印跡或原位雜交中。
"多肽序列"或"蛋白序列"指胺基酸殘基在聚合物中的排列。 多肽序列可由20個標準天然胺基酸連同稀有M酸和合成胺基酸類 似物組成。4交短的多肽一般稱為肽。
"分離的"或"純化的"蛋白或其生物活性部分基本上不含得 到蛋白的細胞或組織源的細胞物質或其它雜蛋白，或在化學合成時 基本上不含化學前體或其它化學物質。表述"基本上不含細胞物質" 包括其中蛋白與分離出其或重組產生其的細胞的細胞組分分離的蛋 白製品。因此，基本上不含細胞物質的蛋白包括具有少於約30%、
20%、 10%或5%(乾重)的異源蛋白(本文也稱為"雜蛋白")的蛋白制 品。當蛋白或其生物活性部分重組生產時，優選其還基本上不含培 養基，即培養基佔蛋白製品體積少於約20%、 10%或5%。當蛋白通 過化學合成產生時，優選其基本不含化學前體或其它化學物質，即 該蛋白與參與合成其的化學前體或其它化學物質分離。因此，此蛋 白製品具有少於約30%、 20%、 10%、 5% (乾重)的目標多肽以外的 化學前體或化合物。
分離的生物活性多肽可具有幾種不同的物理形式。分離多肽可 以全長的初生多肽或未加工多肽存在，或者以部分加工的多肽或加 工多肽的組合存在。全長初生多肽可通過導致形成全長初生多肽片 段的特異性蛋白酶剪切事件進行翻譯後修飾。片段或物理結合的片 段可具有與全長多肽相關的生物活性；但是，與單個片段相關的生 物活性程度可變化。分離的或大致純化的多肽可為由分離核酸序列 編碼的多肽，以及由例如化學合成方法合成的多肽，和與生物物質 分離的多肽，然後使用常規蛋白分析或製備方法純化至允許其按照 本文所述方法使用的程度。
"重組體"指已使用分子生物學技術修飾得與其天然狀態有些 不同的核酸、由核酸編碼的蛋白、細胞或病毒顆粒。例如，重組細 胞可包含在天然(非重組)形式的細胞中不存在的核苷酸序列，或者可 表達在不同情況下會異常表達、不充分表達或根本不表達的天然基 因。重組細胞還可包含存在於天然形式細胞中的基因，其中所述基 因通過人工方法修飾並再導入細胞中。該術語還包括含內源核酸的 細胞，所述內源核酸已被修飾，但沒有由細胞中去除核酸；這種修 飾包括例如通過基因置換和位點特異性突變獲得的修飾。
"重組宿主細胞"或"重組細胞"是其中已導入重組DNA序列 的細胞。可使用任何合適的方法將重組DNA序列導入到宿主細胞中， 包括例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、孩￡注射、轉化、粒子轟擊和病毒感 染。重組DNA可整合或不整合(共價連接)入構成細胞基因組的染色
體DNA中。例如，重組DNA可保持在游離型元件如質粒上。或者， 就穩定轉化或轉染的細胞而言，重組DNA已整合入染色體中，以便 其通過染色體複製由子細胞遺傳。這種穩定性由穩定轉化或轉染細 胞建立含外源DNA子細胞群組成的細胞系或克隆的能力來證實。重 組宿主細胞可為原核細胞或真核細胞，包括細菌如大腸桿菌、真菌 細胞如酵母、哺乳動物細胞如人、牛、豬、猴或齧齒動物源的細胞 系，以及昆蟲細胞，如果蠅和蠶來源的細胞系。還要理解的是，術 語"重組宿主細胞"不僅指具體的所指細胞，而且指此細胞的子代 或潛在子代。因為某些修飾可由於突變或環境影響而在後代中發生， 所以這種子代實際上可能與親代細胞不完全相同，但仍包括在本文 使用的術語範圍內。
本文使用的"有效連接"指兩個核酸序列之間的功能關係。例 如，控制編碼序列表達(例如轉錄)的啟動子序列有效連接至該編碼序 列。有效連接的核酸序列可為連續的，以許多啟動子序列為代表， 或者可為非連續的，例如對於編碼抑制子蛋白的核酸序列而言。在 重組表達載體中，"有效連接的"往往意指目標編碼序列以允許編 碼序列表達的方式連接至調節序列，例如在體外轉錄/翻譯系統中或 當載體導入到宿主細胞中時在宿主細胞中。
"載體"或"構建物"指異源核酸可處於其中或插入其中的核 酸分子。某些載體可導入到允許載體複製或允許由載體或構建物編 碼的蛋白表達的宿主細胞中。載體通常具有選擇標記(例如編碼允許 藥物抗性的蛋白的基因)、複製起點序列和允許插入異源序列的多克 隆位點。載體通常是基於質粒的，由小寫字母"p"後接字母和/或數 字的組合命名。本文公開的起始質粒是可市售獲得的，在未受限基 礎上可公開獲得，或者可通過應用本領域已知的方法由可用質粒構 建。可按照本發明使用的許多質粒和其它克隆和表達載體是眾所周 知的，本領域技術人員容易獲得。而且，技術人員可容易地構建許 多適用於本發明的其它質粒。技術人員由本發明公開內容顯而易見
這些質粒以及其它載體在本發明中的特性、構建和使用。
"序列"指單體在聚合物中存在的線性順序，例如胺基酸在多 肽中的順序或核苷酸在多核苷酸中的順序。
本領域已知的"序列同一性或相似性"是兩個或多個多肽序列 或兩個或多個多核苷酸序列之間的關係，可通過比較序列來測定。 在兩個或多個核酸序列或兩個或多個多肽序列之間的關係的範圍 內，本文使用的"同一性"分別指在序列最優比對和分析時相同的 核苷酸或胺基酸殘基的百分率。為了將查詢序列與例如人SK1的氨
基酸序列(NCBI蛋白檢索號NP—068807)對比，查詢序列與人SK1 最佳比對，獲得在全長人SK1中的最佳局部比對。
分析可人工進行，或使用序列比較算法進行。對於序列比較， 通常一個序列用作參比序列，查詢序列與其對比。當使用序列比較 算法時，將測試序列和參比序列輸入計算機，如果需要的話指定亞 序列坐標，並指定序列算法程序參數。
例如可通過使用Needleman & Wunsch, J MoL Biol., 48:443 (1970) 的同源性比對算法進行待比較序列的最佳比對。進行Needleman & Wunsch分析的軟體可通過Institut Pasteur (France)生物軟體站點 http:〃bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/needle.html 乂>開獲；f尋。 NEEDLE程序使用Needleman-Wunsch全局比對算法來獲得兩個序列 在考慮其全長時的最佳比對(包括空位)。同一性根據報告的比對區(包 括長度中的任何空位)內兩個序列之間的相同匹配百分率計算。還提 供相似性得分，其中相似性根據報告的比對區(包括長度中的任何空 位)內兩個序列之間的匹配百分率計算。標準比較使用EBLOSUM62 矩陣(對於蛋白序列)和EDNAFULL矩陣(對於核苷酸序列)。空位開 放罰分是在建立空位時減去的分數；默認設置使用10.0的空位開放 罰分。對於空位延伸，將罰分加至空位中各個鹼基或殘基的標準空 位罰分；默認-沒置是0.5。
雜交也可用作指示兩個多核苷酸彼此基本相同的測試。共有高
度同 一性的多核苷酸在嚴格雜交條件下將彼此雜交。"嚴格雜交條
件"具有本領域已知的含義，如在Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 笫二版,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)中所描述的。示例性的嚴格雜交條件 包括在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中於約45。C雜交，接著用0.2x SSC 和0.1% SDS在50-65'C進行1次或多次漂洗，這取決於雜交多核苷 酸共有互補性的長度。
"報告基因"指編碼報告基因產物的核酸序列。正如本領域所 知，報告基因產物通常可通過標準方法容易地檢測。示例性的適宜 報告基因包括但不限於編碼螢光素酶(luc)、 (3-半乳糖苷酶(lacZ)、綠 色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、 p-葡糖醛酸酶、新黴 素磷酸轉移酶和鳥嘌呤黃嘌呤轉磷酸核糖基酶的基因。
#及增*4'爭錄SA7活^的化會錄^浴^f ^妓力^/介才法
在一個一般方面，本發明提供一種測定細胞中的SKI生物活性 的方法。此方法包含測定細胞中的MCP-1基因表達水平的步驟。
在另一個一般方面，本發明提供一種監測給予受試者的化合物 的作用的方法，其中預期所述化合物增加或降低所述受試者細胞中 的鞘氨醇激酶-1生物活性。這種方法包括檢測所述受試者細胞中的 單核細胞化學引誘蛋白-1基因的表達水平的步驟。所述化合物可給 予所述受試者，用於治療或預防各種病理狀況，例如心血管疾病、 動脈粥樣石更化、糖尿病、中風、自身免疫和炎性疾病、變應性疾病 如皮炎、T輔助細胞-l相關疾病、慢性阻塞性肺病、哮喘、細胞增殖 疾病如癌症、神經退4b性疾病或血栓形成。
取自受試者的生物樣品可用於測定所述受試者細胞中的MCP-1 基因表達水平。技術人員已知的任何合適方法都可用於獲得生物樣 品。例如，可由MCP-1主要於該處表達的上皮獲得生物樣品，即經 針式活檢。生物樣品還可由血液或血漿獲得。
在某些實施方案中，細胞中MCP-1基因的表達水平可通過檢測 所述細胞中該基因的mRNA量來測定。生物樣品中特定基因的mRNA 量可使用許多技術來檢測。例如，mRNA可通過使生物樣品與能夠 特異性檢測mRNA的化合物或物質接觸來檢測。經常使用能夠與 mRNA特異性雜交的標記核酸探針。例如，對人MCPl mRNA特異 性的核酸探針可為全長人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸檢索號 NM—002982)或其部分，例如在嚴格雜交條件下可與人MCPl mRNA 雜交的、至少長15、 30、 50、 100、 250或500個核苷酸的寡核苷酸。 在嚴格雜交條件下，對人MCPl mRNA特異性的核酸探針僅與該 mRNA雜交，但不與存在於測試生物樣品中的其它mRNA物質雜交。 對本發明有用的核酸探針包括能夠在嚴格雜交條件下與人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸檢索號NMJ)02982)雜交的探針。
另一種測定生物樣品中特定基因的mRNA量的技術是定量實時 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。基因如人MCP-1基因的互補DNA (cDNA)可經逆轉錄由所述樣品製備。cDNA可使用能夠在嚴格雜交 條件下與MCP-1 cDNA雜交的寡核苷酸引物經PCR擴增。試劑盒是 市售可得的，有利於RT-PCR,例如Applied Biosystems (Foster City， CA) 的"One-Step RT-PCR Master Mix Reagent"試劑盒。
在過去的十年當中，原位雜交已廣泛用於研究特定基因的mRNA 物質在細胞或組織的特定區室中的分布和表達。用於原位雜交測定 的核酸探針類型包括不同長度的單鏈寡核苷酸、單鏈RNA探針 (riboprobe)或雙鏈cDNA序列。探針可特異性地針對任何已知的表達 核酸序列設計。許多不同的放射性同位素和非同位素標記可市售獲 得，可用於原位雜交。關於原位雜交方法的綜述，參見McNicol等, (1997)， 涵o/ 182(3): 250-61。其它測定生物樣品中特定基因的 mRNA量的有用技術包括DNA微陣列分析、點印跡和RNA雜交。
在某些實施方案中，生物樣品中MCP-1基因的表達水平可通過 ^^測該基因編碼的多肽量來測定。細胞由MCP-1基因表達MCP-1蛋
白，隨後將MCP-1蛋白分泌到細胞外。因此，在本發明的具體實施 方案中，以受試者的血液或血漿樣品中的MCP-1量檢測所述受試者 細胞的MCP-1基因表達水平。
可通過使生物樣品與能夠特異性檢測蛋白的化合物或物質接 觸，檢測生物樣品中該蛋白的量。例如，檢測MCP-1蛋白的優選物 質是能夠特異性結合所述多肽的一部分的抗體。在一個優選方法中， 偶聯可檢測標記的MCP-1蛋白特異性抗體用於檢測MCP-1蛋白。抗 體可為多克隆抗體或單克隆抗體。可使用全抗體分子或其片段(例如 Fab或F(ab')2)。抗體可通過專業實驗室獲得。例如，可在相對短的 時間量程內開發針對MCP-1蛋白特異性的合成舦序列的抗體，使得 研究這些目標靶的靈活度更高。
檢測多肽如MCP-1蛋白的技術包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、 蛋白質印跡、免疫沉澱和免疫螢光以及免疫化學。實施這些方法的 細節可見於例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 笫二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989))。
另外，活體人器官中的MCP-1基因表達水平可通過定量非侵入 性方法測定，例如正電子發射斷層(PET)成像(Sedvall等，(1988) 屍矽c/jo; / w附aco/. 5W% 5:27-33)。例如，可將痕量的Pa9蛋白結合放 射性示蹤劑靜脈內注射入受試者中，在受試者的褐色脂肪組織、肝 髒、心臟、腎臟、肌肉或其它器官中放射性標記的分布可被成像。PET 成像以及其它定量非侵入性成像方法的程序是本領域技術人員已知 的(參見Passchier等，(2002)MeAo血27:278的綜述)。
逸舍增》/7成'聲瓶SW ;^/4^化^參付浴;^的放力浙定試浙盆
通常用最優方案，可獲得完整測定試劑盒，其中包括檢測MCP-1基因表達水平必需的所有試劑。因此，本發明還描述了監測給予受 試者的化合物作用的試劑盒，其中預期所述化合物增加或降低所述
受試者細胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性。此試劑盒優選包含適於密 封保持在至少一個容器中的分區存放的載體。所述載體還包含能夠
檢測生物樣品中的MCP-1多肽或MCP-1 mRNA的試劑以及測定所 述樣品中的多肽量或mRNA量的方法。所述試劑盒還可包含可測定 並與包含的測試樣品對比的對照樣品或 一 系歹，j對照樣品。試劑盒的 各組分可封裝在單個容器中，不同容器連同說明一起全部在單獨包 裝中，所述試劑盒用於測定包含增加或降低受試者中的MCP-1活性 的化合物的治療是有效的還是無效的。
對於基於抗體的試劑盒，該試劑盒可包含例如(l)結合MCP-1 的第一抗體(例如附著於固體支持體的抗體)；和任選的；(2)結合MCP-1
或所述第一抗體的不同的第二抗體，其綴合可檢測物質；(3)作為陽 性對照的基本純化的MCP-1;和(4)用於將由生物樣品檢測的MCP-1 量與評價化合物的效力關聯起來的說明。例如，基於抗體的試劑盒 可包含特異性結合人MCP-1 (NCBI蛋白檢索號NP—002973)、大鼠(即 NCBI蛋白檢索號NP—113718)或小鼠(即NCBI蛋白檢索號 NP一035463)、豬、狗和猴的MCP-1的抗體。所述抗體可為多克隆抗 體或單克隆抗體。可使用技術人員已知的任何合適方法開發所述抗 體。
對於基於寡核苷酸的試劑盒，所述試劑盒例如可包含寡核苷酸 和說明，所述寡核苷酸例如為標記的寡核苷酸，在嚴格雜交條件下 與MCP-1基因的mRNA雜交，所述說明用於將由生物樣品檢測的 MCP-1基因表達量與評價化合物的效力關聯起來。例如，所述試劑 盒可包含在嚴格雜交條件下與人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸檢索 號NM—002982)雜交的標記寡核苷酸或其互補物。或者，所述試劑 盒可包含用於由MCP-1基因的mRNA逆轉錄和擴增核酸分子的引物 對。例如，所述試劑盒可包含用於由人或其它動物如大鼠、小鼠、 豬、狗和猴的MCP-1基因的mRNA擴增核酸分子的引物對。 蕃^/乂#》"戈犖錄5《/ ^務活^的^冷錄^i法
為SK1靶基因的MCP-1基因的鑑別還允許開發用於鑑別增加或 降低SK1生物活性的化合物的新篩選方法或測定。因此，本發明的 另一個一般方面涉及鑑別增加或降低鞘氨醇激酶-1生物活性的化合 物的方法。這些方法包括鑑別改變MCP-1基因的基因表達水平的化 合物。
化合物鑑別方法可使用常^L實驗室方法或以適於高通量的測定 實施。術語"高通量"指允許容易地同時篩選多個樣品的實驗設計， 可包括機器人操作能力。高通量測定的另一個期望特徵是為減少試 劑使用而優化或為實現目標分析而最小化操作數量的實驗設計。測 定方法的實例包括96-孔或384-孔平板、懸浮液滴(levitating dr叩let) 和用於液體處理實驗的"晶片實驗室"樣i通道晶片。如本領域人員 所知，隨著塑料模具和液體處理裝置小型化進展，或隨著設計出改 良的測定裝置，能夠使用發明的測定更有效地篩選更大量的樣品。
用於篩選的候選化合物可選自眾多化學類別，優選選自有機化 合物類。儘管候選化合物可為大分子，但優選所述候選化合物是小 分子有機化合物，即所具有的分子量超過50並小於2500的化合物。 候選化合物具有 一個或多個對與多肽結構性相互作用必須的化學官 能團。優選的候選化合物具有至少一個胺基、羰基、羥基或羧基， 優選具有至少兩個這種官能團，更優選具有至少三個這種官能團。 候選化合物可包含用 一個或多個以上例舉的官能團取代的環碳或雜 環結構部分和/或芳族或聚芳族部分。候選化合物還可為生物分子，
例如肽、糖、脂肪酸、甾醇、類異戊二烯、噪呤、嗜啶、以上物質 的衍生物或結構類似物或其組合等。在所述化合物是核酸的情況下， 所述化合物優選為DNA或RNA分子，儘管也設想了具有非天然鍵 或亞基的修飾核酸。
候選化合物可由各種來源獲得，包括合成或天然化合物的文庫。
的方法，包括表達隨機化寡核苦酸、合成有機組合文庫、隨機肽的 噬菌體展示文庫等。候選化合物還可使用任何本領域已知的組合文
庫法的眾多方案獲得，包括生物文庫、空間可尋址平行固相或液
相文庫、需要去巻積的合成文庫法、"一珠一化合物"文庫法和使
用親和層析選擇的合成文庫法(參見例如Lam (199"， ^ "c朋cer Z>wg D飢12:145)。或者，可利用或者可常規生產為細菌、真菌、植物和 動物提取物形式的天然化合物文庫。另外，天然和合成生產的文庫 和化合物可通過常規化學、物理和生物化學方法常規修飾。
此外，已知的藥理物質可進行定向或隨機的化學修飾，例如醯 化、烷基化、酯化、醯胺化等，以生產所述物質的結構類似物。候 選化合物可隨機選擇，或者可基於結合和/或調節SK1生物活性的現 有化合物。例如，候選物質的來源可為基於已知的SK1活化劑或抑 製劑的分子文庫，其中化合物的結構在該分子的一個或多個位置被 改變，以包含更多或更少的化學部分或不同的化學部分。為建立類
隨機的或定向和隨機的置換和/或添加的組合。
各種其它試劑也可包含在混合物中。這些試劑包括諸如鹽、緩 沖劑、中性蛋白(例如白蛋白)和變性劑的試劑，其可用於促進最佳的 蛋白-蛋白和/或蛋白-核酸結合。這種試劑還可降低反應組分的非特異 性或背景相互作用。還可使用其它提升測定效率的試劑，例如核酸 酶抑制劑、抗微生物劑等。
分子文庫合成方法的實例可見於本領域，例如載於Zuckermann 等，(1994), /Mo/. C/ ew. 37:2678。化合物文庫可製備在溶液中(例如 Houghten (1992),歷oto:/m,々j^y 13:412-421)、或珠上(Lam (1991), Atowe 354:82-84)、晶片上(Fodor (1993), A^f似re 364:555-556)、細菌 中(美國專利笫5,223,409號)、孢子上(美國專利笫5,571,698號)、質 粒中(Cull等，(1992), Prac. A^/. ^cad 89:1865-1869)或噬菌體 上(參見例如Scott和Smith (1990), &/e"ce 249:386-390)。
在一個實施方案中，本發明提供一種鑑別增加或降低SKI生物 活性的化合物的方法，所述方法包括以下步驟
a) 使SKI反應性系統與含緩衝液和測試化合物的溶液接觸，其 中所述SK1反應性系統含SK1或其功能衍生物，以及其表達受MCP-1 基因的調節序列控制的基因；
b) 檢測SKI反應性系統中其表達受MCP-1基因的調節序列控 制的基因的表達水平；和
c) 根椐其與其中SKI反應性系統僅與緩沖液接觸的對照相比增 加或降低所述表達水平的能力鑑別所述化合物。
"SK1反應性系統"在其最廣泛意義上使用，指例如通過TNFa 對SKI刺激有響應的單一細胞、組織和複雜的多細胞生物，例如哺 乳動物。在一個實施方案中，SKI反應性系統是為內源SKI和內源 MCP-1基因天然宿主的動物、組織或細胞。例如，內皮細胞如 HMVEC、 HUVEC或HAEC都是可用於本發明的天然SKI反應性系 統。SKI反應性系統還可為SKI的重組宿主細胞。技術人員已知的 任何合適方法都可用於獲得這種具有重組SKI的SKI反應性系統。 例如，SKI反應性系統可通過將編碼功能性SKI的外源DNA導入 MCP-1基因的天然宿主細胞中構建。這種SKI反應性系統的MCP-1 基因的表達水平可通過使用同上所述的方法通過SKI反應性系統的 MCP-1基因的mRNA或蛋白的量來檢測。
在另一個實施方案中，SKI反應性系統包含功能性SKI蛋白和 由MCP-1基因的調節序列控制的報告基因。所述報告基因包含MCP-l 基因的調節序列和有效連接的報告基因編碼序列。這種系統允許響 應於SKI調節物來轉錄調節報告基因。因此，SKI的生物活性可通 過報告基因活性間接檢測。例如，當螢光素酶(luc)基因用作報告基因 時，可由SKI反應性系統的生物發光量檢測SKI生物活性。其它報 告基因包括但不限於編碼綠色螢光蛋白(GFP)、 (3-半乳糖苷酶(lacZ)、 氯黴素乙醯轉移酶(cat)、 P-葡糖醛酸酶、新黴素磷酸轉移酶和鳥噪呤
黃噪呤轉磷酸核糖基酶的基因。報告基因的生物活性可容易地檢測。 試劑盒可市售獲得，有利於報告基因活性的檢測。
技術人員已知的任何合適方法都可用於構建含與MCP-1基因的
調節序列有效連接的報告基因編碼序列的核酸。MCP-1基因的調節 序列包括與MCP-1基因天然關耳關並控制MCP-1基因的基因表達的任 何核苷酸序列。優選地，所述調節序列包含轉錄因子NF-kB和AP-1 的結合位點。
在一個優選實施方案中，在尋找降低SK1生物活性的化合物時， 本發明的方法進一步包括使SK1反應性系統與SK1活化刺激物接觸 的步驟，之後是檢測系統中的基因表達的步驟。SK1活化刺激物可 在所述系統接觸測試化合物之前、同時或之後與SK1反應性系統接 觸。
例如，降低SK1生物活性的化合物可使用包含以下步驟的方法 鑑別
a) 使內皮細胞與測試化合物接觸；
b) 使所述內皮細胞與SK1活化刺激物(例如TNFa或凝血酶)接
觸；
c) 檢測所述內皮細胞的MCP-1的表達水平；和
d) 根據其與對照相比降低MCP-1基因表達的能力鑑別所述化合物。
其中步驟a)可在步驟b)之前、之後或同時進行。 在一個具體實施方案中，本發明的方法還包括以下步驟在SK1
功能性測定中證實由上述化合物鑑別方法的步驟c)鑑別的候選化合
物。這種功能性測定包括以下步驟
a) 使SK1與含候選化合物和緩衝液的溶液接觸，所述緩沖液含 鞘氨醇和ATP;
b) 檢測由鞘氨醇產生的鞘氨醇-l-磷酸的量；和
c) 根據其與其中SK1僅接觸緩沖液的對照相比增加或降低由鞘
氨醇生產的鞘氨醇-1 -磷酸的能力證實所述候選化合物。
表達SK1基因的宿主細月包(重組的或天然的)可用於所述功能性 測定。優選地，大致純化地SK1或其功能衍生物可用於所述功能性 測定。
源，MC屍-7差^或i^-才法
作為SK1靶基因的MCP-1的鑑別允許開發調節細胞中的MCP-1基因表達的新方法。調節細胞中的MCP-1基因表達直接調節細胞 產生的MCP-1量，最終實現涉及MCP-1的細胞機能的變化。因此， 本發明的另一個一般方面涉及增加或降低細胞中的MCP-1基因表達 的方法。這種方法包含以下步驟增加或降低細胞中的鞘氨醇-l-磷 酸的生物活性，使得所述單核細胞化學引誘蛋白-1基因的表達分別 被增加或降低。
業已表明，MCP-1表達缺失在幾種動脈粥樣硬化模型中提供了 抗動脈粥樣硬化損害發展的持續保護作用(Gosling等，《/ /"ve^， 1999,103:773-778;和Gu等，Mo/Ce〃， 1998, 2:275-281)。因此，本發 明提供一種在受試者中治療或預防動脈粥樣硬化的方法，所述方法 包括以下步驟降低所述受試者細胞中的鞘氨醇-l-磷酸的生物活性， 從而治療或預防所述受試者中的動脈粥樣硬化。相似的方法可用於 治療或預防通過調節MCP1基因表達可治療或預防的其它疾病或病 症。
在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟給予細胞增加或 降低SK1生物活性的化合物，即增加或降低SK1催化由鞘氨醇形成 S1P的能力的化合物。這種化合物的實例包括二曱基鞘氨醇(DMS)。 此化合物還可使用同上所述的化合物鑑別方法鑑別。
在另一個實施方案中，所述方法包括增加或降低細胞中的SK1 基因表達的步驟。在一個實施方案中，當需要降低SK1的表達或生 物活性時，可使用反義分子降低細胞中SK1基因的表達。
反義型策略的原則是基於以下假設基因表達的序列特異性抑 制可通過mRNA和互補反義物之間的胞內雜交實現。然後，雜合RNA 雙鏈體的形成可千擾靶mRNA (例如SKI基因的耙mRNA)的加工/轉 運/翻譯和/或穩定性。雜交是發生反義作用必需的。反義策略可用於 各種方法，包括使用反義寡核苷酸、注射反義RNA和反義RNA表 達載體轉染。與有義鏈的反義雜交誘導的表型作用基於標準變化， 所述標準例如為蛋白水平、蛋白活性;險測和耙mRNA水平。
反義核酸可與把基因的完整編碼鏈互補，或僅與其一部分互補。
非編碼區("5'和3' UTR")是側接編碼區的5'和3'序列，沒有翻譯成 胺基酸。優選地，所述非編碼區是用於靶基因的轉錄或翻譯的調節 區。
反義寡核苷酸例如可為取自SK1 cDNA互補序列的長約15、 25、 35、 45或65個或更多個核苷酸。優選所述序列為至少18個核苷酸 長，以便實現與耙mRNA序列的足夠強的退火，以阻止所述序列翻 譯。(Izant等,1984, Ce〃， 36:1007-1015; Rosenberg等,1985,淑廳, 313:703-706)。反義核酸可使用本領域已知的方法使用化學合成和酶 連接反應構建。例如，反義核酸(例如反義寡核苷酸)可使用天然核苷 酸或者各種修飾的核香酸化學合成，所述各種修飾的核苷酸設計用 於增加所述分子的生物穩定性，或增加反義和有義核酸之間形成的 雙鏈體的物理穩定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的 核苷酸。可用於產生反義核酸的修飾核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、 5-溴尿嘧咬、5-氯尿嘧，定、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯 胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧基乙基氨基曱基-2-硫尿嘧啶、 5-羧曱基氨基曱基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、(3-D-半乳糖基Q核苷、肌 苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-曱基鳥嘌呤、l-曱基肌苷、2,2-二曱基鳥 。票呤、2-曱基腺嘌呤、2-曱基鳥嘌呤、3-曱基胞嘧啶、5-曱基胞嘧啶、 N6-腺。票呤、7-曱基鳥噪呤、5-曱基氨基曱基尿嘧啶、5-曱氧基氨基
曱基-2-硫尿嘧啶、P-D-甘露糖基Q核苷、5'-曱氧基羧曱基尿嘧啶、5-曱氧基尿嘧啶、2-曱基硫代-N6-異戊烯基腺"票呤、尿嘧啶-5-氧乙酸 (v)、 wybutoxosine、假尿嘧咬、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-曱基-2-硫尿 嘧啶、2-硫尿嘧咬、4-硫尿嘧啶、5-曱基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸曱 酯、尿嘧啶-5畫氧乙酸(v)、 5-曱基-2-硫尿嗜啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙 基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。反義核酸分子可為CC-異頭 核酸分子。CC-異頭核酸分子與互補RNA形成特異性的雙鏈雜合體， 其中，與通常的P-單元相反，所述鏈彼此平行排列(Gaultier等，(1987) M/c/e/c ^c/<* i^y. 15:6625-6641)。所述反義核酸分子還可包含2'-o-甲 基核糖核苷酸(Inoue等，(1987)^/"￡,^67^^& 15:6131-6148)或嵌合 RNA-DNA類似物(Inoue等，(1987) i^ASZ^". 215:327-330)。
或者，還可使用核酸已如上所述以反義方向亞克隆入其中的表 達載體以生物學方法生產反義核酸。反義表達載體可為重組質粒、 噬菌粒或減毒病毒形式，其中反義核酸在高效調節區控制下生產， 其活性可由載體導入其中的細胞類型來確定。為實現反義分子的足 量胞內濃度，優選其中反義核酸分子處於強pol II或pol III啟動子控 制下的載體構建物。關於使用反義基因調節基因表達的論述，參見 Weintraub等，(1985, 7>emfe ,'" Ge"e"c 巻1(1)， 22-25頁)。
通常，反義核酸通過微注射、脂質體嚢化給予受試者，或通過 由具有反義序列的載體表達原位產生。反義核酸分子給予途徑的實 例包括在組織部位直接注射。反義核酸可連接入病毒載體中，所述 病毒載體當導入宿主細胞中時介導反義核酸的轉移。合適的病毒載
體包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰滲病毒、痘苗病毒、 脊髓灰質炎病毒等。或者，反義核酸分子可被修飾，以靶向選定細 胞，然後系統給予。例如，對於系統給予，例如可通過將反義核酸 分子連接至結合細胞表面受體或抗原的肽或抗體來修飾反義分子， 以使它們特異性結合在選定細胞表面上表達的受體或抗原。
一旦進入細胞內，反義核酸分子就與編碼SK1蛋白的細胞mRNA
和/或基因組DNA雜交或結合，由此例如通過抑制轉錄和/或翻譯抑 制表達。雜交可通過常規核苷酸互補性實現，形成穩定雙鏈體，或 者例如對結合DNA雙鏈體的反義核酸分子的情況，通過在雙鏈螺旋 體大溝中的特異性相互作用實現。
在一個優選實施方案中，所述方法包括使用小幹擾RNA (siRNA)。當細胞中存在對應於基因的雙鏈RNA (dsRNA)時，許多生 物具有通過稱為RNA幹擾的過程沉默基因表達的機制。使用dsRNA 降低特定基因活性的技術首先使用蠕蟲秀麗線蟲(C. e/eg"似)開發，稱 為RNA幹擾或RNAi (Fire等，(1998), Atowe 391: 806-811)。自此之 後RNAi已被發現在許多生物體中有用，最近已擴展到哺乳動物細胞 (參見Moss, (2001), C"〃歷o/ 11: R772-5的綜述)。當表明RNAi涉及 21-25個核苷酸的小RNA產生時，取得了重要進展(Hammond等，(2000) 7\towe 404: 293-6; Zamore等，(2000) CW/ 101: 25-33)。這些小幹擾RNA 或siRNA首先可來源於開始該過程的較大dsRNA,與最終降解的靶 RNA互補。siRNA自身用各個末端的短懸垂形成雙鏈。它們起引導 RNA的作用，引導所述輩巴在亙補區中單獨裂解(Elbashir等，(2001) Ge腦Dev 15: 188-200; Zamore等，(2000) Ce〃 101: 25-33)。
在治療方法中可使用含與SEQ ID NO: 1、 3或5所示核苷酸序 列互補的約21-25個核普酸的siRNA。生產siRNA的方法是本領域 技術人員已知的。例如，WO0175164 A2描述了由體外系統生產長 21-23個核苷酸的siRNA的方法，並使用此siRNA幹擾細胞或生物 體中的基因的raRNA。 siRNA還可使用穩定表達系統由哺乳動物在 體內製備。例如，最近報導了稱為pSUPER的載體系統，其引導哺 乳動物細胞中的siRNA合成(Brummelkamp等，(2002) Sc/e"ce 296: 550-3)。使用siRNA降低細胞中的基因表達的實例示於實施例3。
在一個具體實施方案中，本發明提供一種在內皮細胞中降低單 核細胞化學引誘蛋白-1基因表達的方法，所述方法包括以下步驟
(a)將靶向待降解SK1基因mRNA的siRNA導入內皮細胞中；
(b)在一定條件下保持在(a)中產生的細胞，於所述條件下在細胞 中發生SKI基因mRNA的siRNA幹擾。
可使用和本文描述的用於反義核酸的類似方法將siRNA導入細 胞中。
在另一個實施方案中，當需要細胞中的MCP-1基因表達增加時， 所述方法包含將能夠表達SKI基因的核酸分子導入該細胞中的步 驟。
作為一個實例，首先可將編碼SKI基因的DNA分子克隆入逆 轉錄病毒載體中。所述載體表達靶基因可由其內源啟動子驅動，或 由逆轉錄病毒長末端重複序列驅動，或者由某些靶細胞特異性的啟 動子驅動。然後可將載體導入到細胞中，以在細胞中成功表達靶基 因。優選可將基因以細胞可使用的形式傳遞入細胞中，以編碼足量 蛋白來提供有效功能。逆轉錄病毒載體由於其高感染效率和穩定的 整合和表達而經常是優選基因傳遞載體。或者，可通過非病毒技術， 包括使用配體-DNA綴合物或腺病毒-配體-DNA綴合物的受體介導的 把向DNA轉移、脂轉染膜融合或定向微注射，將編碼靶基因的DNA 分子轉移到細胞中。這些方法及其變更方法適於活體外以及體內基 因治療。適合與本發明方法一起使用的基因治療分子方法學程序描 述於Gene Therapy Protocols, Paul D. Robbins編輯,Human press, TotowaNJ, 1996。
實施活體外基因治療的方法概述於美國專利第5,399,346號，還 概述於該專利的文件史中提交的展示文獻，所有這些文獻都是公開 可獲得的文件。 一般來說，基因治療可包括將基因的功能拷貝體外 導入到受試者細胞中，並將遺傳工程的細胞返回到所述受試者中。 基因的功能拷貝處於調節元件的有效控制之下，所述調節元件允許 所述基因在遺傳工程細胞中表達。眾多轉染和轉導技術以及合適的 表達載體對本領域一般技術人員來說是眾所周知的，其中一些描述 於PCT申請WO95/00654。體內基因治療使用載體，例如腺病毒、
逆轉錄病毒、疸苗病毒、牛乳頭瘤病毒和皰滲病毒，如E-B病毒。 基因轉移還可使用需要體外感染的非病毒方法實現。這種方法可包
括磷酸鈣、DEAE葡聚糖、電穿孔和原生質體融合。靶向脂質體對將 DNA傳遞入細胞中也可能有益。
在治療當中，給予個體的本發明核酸分子的有效量可根據各種 因素而變化，所述因素包括患者的類型、物種、年齡、體重、性別 和身體狀況；待治療疾病的嚴重性；給予途徑；患者的腎功能和肝 功能；以及患者使用的具體核酸分子。基因治療方面的專業醫師或 獸醫可確定和處方預防、對抗或阻止疾病進展所需的有效量。獲得 處於產生效力而無毒性的濃度範圍中的最佳精度需要基於針對靶點 的核酸分子利用度動力學的方案。這包括涉及基因治療的核酸分子 的分布、平衡和消除的考慮因素。
本文公開的基因治療可以以常規測試限定的適宜劑量單獨使 用，以便獲得MCP-1活性的最佳增加或降低，同時使任何潛在的毒 性最小。另外，可能需要共給予或依次給予其它物質。當將幾種物 質組合時調整給予劑量，以獲得期望作用。這些不同物質的劑量可 獨立地優化並組合，以獲得其中病況比任一種物質單獨使用時減輕 得更多的協同結果。
源，凝j&^Tf #, ^才法
作為SK1活化刺激物的凝血酶的鑑別允許開發一種調節細胞中 的凝血酶信號轉導的新方法，最終實現涉及凝血酶的細胞機能的改 變。因此，本發明的另一個一般方面涉及增加或降低細胞中的凝血 酶信號轉導的方法。這種方法包含以下步驟增加或降低細胞中的 鞘氨醇-l-磷酸的生物活性，使得所述信號轉導分別被增加或降低。 所述方法可用於治療或預防與凝血酶信號轉導相關的疾病或障礙。
如上文所述，使用增加或降低SK1的催化活性的化合物，或使 用核酸技術如反義技術、siRNA或表達載體等，可調節細胞中的鞘
氨醇-l-磷酸的生物活性。
以下的實施例闡述本發明，但不限制本發明。
實施例1
HMVEC中基因表達的cDNA微陣列研究
在致力於快速評價SKI在內皮細胞功能中的潛在全面作用的過 程中，在沒有和有SKI抑制劑DMS的情況下，在HMVEC中實施 cDNA微陣列分析。通過以下兩個受體亞型刺激細胞G蛋白偶聯受 體，該蛋白酶活化受體(PAR)家族用凝血酶作為激動劑；和用TNF-a 作為激動劑的細胞因子受體。
鑑別出在其中一種實驗條^f牛下被誘導或抑制的總共138個基因。 將沒有或有DMS時受刺激細月包的倍數變化結果沿著兩個軸作圖，由 此產生點印跡，以觀察檢測到超出選定閾值的基因(圖1)。這些分析 表明，鞘氨醇激酶與通過凝血酶受體產生的信號有關聯，這是以前 從未觀察到的事件。然而，先前研究已證實SK通過細胞因子受體、 受體酪氨酸激酶和其它GPCR活化，這是首個這種實例，由此，SK 是內皮細胞中選擇性的凝血酶介導事件所必需的。而且，先前的數 據已表明了粘附分子如E-選擇蛋白或VCAM的表達對hSK活性的 依賴性，凝血酶刺激的HMVEC也需要hSK活性來誘導這些分子。 回顧微陣列結果，我們選擇一個轉錄物炎性蛋白單核細胞化學引誘 蛋白-1 (MCP-1)作為目標，該轉錄物受兩種受體類型誘導，似乎由 DMS下調。如圖1所示，MCP-l響應於兩種配體凝血酶和TNF-a被 誘導，並在刺激前加入DMS的情況下被抑制。
材料r人凝血酶購自American Diagnostica, Inc. (Stamford, CT)。 TNF-a購自R&D Systems, 二曱基鞘氨醇(DMS)和鞘氨醇-l-磷酸得自 Avanti， PAR肽在J&J內部製備，MCP-l ELISA試劑盒(Hycult Biotechnology), Bayl 1-7092、 GF109203和PD98059得自Calbiochem。
細胞培養一成人微血管內皮細胞(HMVEC)(Cambrex)在EGM完
全培養基(Cambrex)中培養。所有研究都使用第3代至第6代之間的 細胞。
樣l陣列研究 一將成人孩l血管內皮細胞(HMVEC)(Cambrex)接種入 培養物(5% FBS)中，在沒有或有鞘氨醇激酶有效抑制劑DMS (10 iliM) 的情況下用凝血酶(100 nM)或TNF-a (20 ng/ml)刺激。在刺激4小時 後，分離RNA (Tri-Reagent， Bio國Mol) ， ^f吏用RNeasy Maxi試劑盒(Qiagen) 進行DNA酶處理和清洗。使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢驗RNA 純度，之後對RNA進行cDNA微陣列分析。
在本研究中使用含3563個cDNA克隆的cDNA微陣列。在基因 表達研究中，使用兩種類型的重複生物重複和技術重複。收集雙 份生物樣品用於最初微陣列分析的各個實驗條件。另外，使用技術 重複，以便所有樣品都以一式三份在單獨的微陣列上進行分析。各 個樣品的樣i陣列數據基於技術重複進行異常值剔除，基於技術重複 和生物重複這二者進行標準化。標準化由單個樣品中雜交重複實驗 之間的初始標準化，以及其後覆蓋研究中所有樣品的次級標準化組 成(Shaw等，JMo/M/cra6/'o/ 5,o&c/ "o/, 2003, 5:105-122)。根據經驗估 計每個樣品的背景雜交水平，以便為樣品中的各個克隆指定沒有檢 出和有檢出。沒有在兩個強度看起來似乎都沒有的治療和對照條件 之間進行比較。在清洗並隨後標準化之後，計算各個治療對其指定 對照的單一比率。為測量基因表達模式，基因必須在17個表現出倍 數變化比率增加或降低至少1.5的比率之外具有一個比率。另外，對 標準化數據使用T統計量，以尋找在0.05顯著性水平有差異的基因。 使用windows版的S-PLUS 6.1 (Insightful Corporation, Seattle, WA)檢 測顯著性基因。
Chen等公開了在內皮細胞中SKI介導TNFoc誘導的MCP-1基 因表達(Chen等，爿w.丄屍—o/腸W Cz>—拜o/, 2004, 287:H1452-58)。
實施例2
SK-1的特異性抑制消除HMVEC中MCP-1的誘導
儘管已表明DMS以較低濃度抑制SK活性，在較高濃度時其還 可影響蛋白激酶C家族成員以及酪蛋白激酶的活性。因此，使用小 幹擾RNA (siRNA)通過專一靶向SK家族成員(具體地說是人SKI或 SK2)選擇性抑制SK。在將螢光素加入siRNA的3'末端的情況下，我 們能夠觀察到接近100%的siRNA轉染效率。根據Taqman定量RT-PCR的檢測(圖2)，設計的siRNA顯示出對其各自的人SK (hSK)同 種型的特異性。當檢測hSKl轉錄物時，觀察到僅hSKl特異性siRNA 抑制hSKl表達，而hSK2特異性siRNA和對照非沉默siRNA對hSKl 表達模式沒有作用。同樣，在檢測hSK2轉錄水平時，只有hSK2特 異性siRNA影響hSK2表達，而hSKl特異性siRNA和對照非沉默 siRNA不影響hSK2表達。因此，設計的siRNA顯示出對預定輩巴的 特異性，在hSK家族成員之間沒有交叉反應性。
為更直接地鑑別哪種hSK同種型參與HMVEC的MCP-1轉錄 物誘導，使用hSKl特異性siRNA、 hSK2特異性siRNA或對照非沉 默siRNA重複進行;^陣列分析，然後用凝血酶刺激(數據未顯示)，隨 後通過定量RT-PCR檢驗(圖3)。凝血酶介導的HMVEC活化導致 MCP-1轉錄物的誘導，如先前用微陣列分析觀察到的一樣(圖1)。在 存在hSKl特異性siRNA時，MCP-1的誘導被抑制，而在存在hSK2 特異性或對照非沉默siRNA時，MCP-1誘導未受影響。
siRNA轉染效率和沉默能力的評價一設計併合成小幹擾RNA (siRNA), 它們耙向 hSKl — SEQ ID NO: 1 (AAGAGCTGCAAGGCCTTGCCC)或 hSK2 — SEQ ID NO:2 (AACCTCATCCAGACAGAACGA)轉錄物中的任一個序列，以及在 人基因組中沒有序列靶的對照非沉默siRNA —SEQ ID NO:3 (AATCTCCGAACGTGTCACGT)(Qiagen)。寡核苷酸在有義鏈的3'末 端綴合螢光素，這利於通過螢光共聚焦顯^[效鏡(LSM 510， Zeiss)觀察
轉染效率。將HMVEC接種入培養基(4x103細胞/孔)中，按照生產商 的說明(Transmessenger, Qiagen)在6孑L板中用1.6 jig siRNA轉染，5 小時後獲取共聚焦圖象。分離用於實驗研究的RNA， DNA酶處理， 並使用得自Applied Biosystems的預先i殳計引物進行定量RT-PCR分 析，以檢測hSKl、 hSK2、 MCP-1和對照18S轉錄物的轉錄水平。 或者，DNA酶(Promega)處理單個實驗條件下的RNA,如上所述提 交進行cDNA微陣列分析。
定量RT-PCR—使HMVEC過夜培養，用凝血酶(IOO nM)刺激， 之後分離RNA，並進行DNA酶處理。按照生產商的說明(Applied Biosystems)進行TaqMan⑧定量RT-PCR三重測定，作為對孩t陣列分 析的檢驗。每個檢測器的平均量對18S檢測器的平均量標準化。
實施例3
HMVEC中的PAR表達受限於PAR-1、 PAR-2和PAR-4
為絲氨酸蛋白酶的凝血酶可作用於許多底物，但我們感興趣的 是PAR活化的凝血酶活性。迄今為止，有4個已鑑別的人PAR，我 們想通過進行RT-PCR分析確定HMVEC中的PAR表達譜。RT-PCR 結果表明，HMVEC表達凝血酶敏感的PAR-1和PAR-4，以及凝血 酶不敏感的、胰蛋白酶敏感的PAR-2。在我們的測定條件下，RT-PCR 不能擴增第三種凝血酶敏感受體PAR-3的預期條帶，提示HMVEC 不表達PAR-3或以非常低的水平表達PAR-3。
RIzECR—培養HMVEC,分離RNA (TriReagent-BioMol),隨後 進行DNA酶處理，並使用RNeasy Maxi試劑盒(Qiagen)清洗。使用 富含GC的PCR試劑(Invitrogen)和Superscript II逆轉錄酶(Invitrogen) 進行RT-PCR。結果通過紫外凝膠電泳顯現，並獲取圖象(Polaroid)。
實施例4
HMVEC的PAR-1依賴性MCP-1蛋白分泌受DMS抑制
凝血酶通過受體PAR-1介導其對細胞的初級響應。因此，我們 通過ELISA研究了 DMS預處理HMVEC是否抑制PAR-1特異性活 化肽TFLLRN (PAR-1-AP)的作用。
將HMVEC接種入培養物中，用凝血酶(100 nM)或各種濃度的 PAR活化肽刺激。24小時後，我們使用ELISA檢測分泌到上清液中 的MCP-1。如圖4所示，在用凝血酶刺激細胞時，MCP-1蛋白分泌 被放大，超過了未刺激細胞的分泌。而且，只有PAR-1-AP刺激HMVEC 的MCP-1分泌，而根據在條件培養基中的檢測，PAR-2特異性活化 肽(PAR-2-AP: SLIGRL)和PAR-4特異性活化肽(PAR-4-AP: AYPGKF) 均不調節分泌的MCP-1水平。如先前使用MCP-1轉錄物水平所證實 的，在用凝血酶或PAR-1激動肽刺激前用DMS預處理HMVEC抑 制MCP-1蛋白的分泌。
MCP-1 F丄TSA—將HMVEC接種入96孔培養皿(2x103細胞/孔) 的培養物中，在完全生長培養基中生長24小時。用對照非沉默siRNA 或hSKl或hSK2的siRNA在無血清Opti-MEM (Gibco)中轉染細胞4 小時。然後讓細胞在含10% FBS的培養基中生長24小時，此後使細 胞在0.5% FBS培養基中血清々幾俄過夜。隨後用含0.5% FBS的新鮮 培養基刺激細胞，並在不同實l^條件下再溫育24小時。有指示時， 將細胞與特異性化合物抑制劑預溫育20分鐘，然後刺激。收集上清 液，通過ELSIA (Cell Sciences)分析。
實施例5
把向hSKl的SiRNA降低PAR-1誘導的MCP-1分泌
我們的研究表明了 hSKl在凝血酶介導的MCP-1表達誘導中的 作用。因此，我們測試了 hSKl特異性siRNA阻斷凝血酶和PAR-l-AP 刺激的HMVEC的MCP-1蛋白分泌的能力。
用siRNA (1.6嗎)、hSKl特異性siRNA、 hSK2特異性siRNA 或對照非沉默siRNA轉染HMVEC。 48小時後，用凝血酶(IOO nM)、 PAR-1-AP (300 iliM)或PAR-4-AP (600 )nM)刺激細胞。進行ELISA, 以檢測分泌入細胞上清液中的MCP-1。如圖5所示，在沒有hSKl 表達時，如hSKl特異性siRNA轉染細胞所呈現的(箭頭)，增加水平 的MCP-1分泌被抑制。而且，基礎水平的MCP-1蛋白分泌似乎也受 到影響，因為未受刺激或用PAR-4-AP刺激的細胞中的MCP-1蛋白 分泌水平比hSKl特異性siRNA轉染細胞有所下降。
實施例6
凝血酶/PARl或TNF-a介導的MCP-1蛋白分泌需要hSK和NF-kB
二者的活性
為進一步表徵受刺激的HMVEC的MCP-1蛋白分泌的信號轉錄 要求，使用 一組特定細胞信號轉導組分的抑制劑。該組抑制劑包含hSK 活性抑制劑(DMS)、 NF-kB活性抑制劑(BAY11-7092)、 PKC活性抑 製劑(GF109203x)和ERK抑制劑(PD98059)。
將HMVEC過夜培養，用hSK抑制劑(DMS 10 ^M)、 NF-kB抑 製劑(Bayll-7092 10 jiM)、 PKC抑制劑(GF109203x 1 )iiM)或Erk抑制 劑(PD98059 10 fiM)預處理，然後用凝血酶(IOO nM)、 PAR-1-AP (TFLLRN 100 nM)或凝血酶(O.l ng/ml)刺激。在刺激後24小時進行 ELISA，以檢測MCP-1分泌量。如圖6所示，我們通過ELISA再次 證實，hSK活性是凝血酶和PAR-1介導的MCP-1表達所必需的。而 且，我們觀察到，和用NF-kB抑制劑預處理一樣，NF-kB活性也是 MCP-1表達的先決條件，Bayl 1-7092消除所有激動劑誘導的MCP-1 蛋白分泌。儘管NF-kB活性是HMVEC的MCP-1分泌所必需的，但 我們發現，Erk活性不是必需的，因為用PD98059預處理細胞對分 泌水平沒有影響。採用GF109203x的PKC抑制具有中間作用。
實施例7 S1P受體不參與MCP-1分泌
最近，已披露的數據提示，hSK活化產物鞘氨醇-l-磷酸可由活 化細胞釋放。因為S1P是稱為S1P受體的新GPCR家族的配體，所 以我們檢驗了由於HMVEC上的自分泌/副分泌S1P釋放而產生的 MCP-1表達潛力。
將HMVEC過夜培養，用hSK抑制劑(DMS 10 fiM)、 NF-kB抑 製劑(Bayl 1-7092 10 )、 PKC抑制劑(GF109203x 1 ^M)或Erk抑制 劑(PD98059 10jiM)預處理，然後用5jimSlP刺激。實施ELSIA,以 檢測分泌的MCP-1蛋白水平。如在圖7中所示，外部加入S1P活化 S1P受體後24小時，分泌的MCP-1水平不變化。外部加入S1P沒有 增加MCP-1蛋白。因此，我們排除了 S1P受體在HMVEC的hSK依 賴性MCP-1釋放中的作用。
權利要求
1.一種用於測定細胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性的方法，所述方法包括測定所述細胞的單核細胞化學引誘蛋白-1基因的表達水平的步驟。
2. —種監測給予受試者的化合物的效力的方法，其中預期所述 化合物增加或降低所述受試者細胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性，所 述方法包括以下步驟a. 檢測所述受試者的單核細胞化學引誘蛋白-1基因的表達水 平；和b. 比較步驟a)中測定的表達水平和給予所迷化合物之前所述受 試者中的單核細胞化學引誘蛋白-1基因的表達水平。
3. 權利要求2的方法，所述方法還包括由所述受試者獲得生物 樣品的步驟，其中由所述生物樣品測定單核細胞化學引誘蛋白-1基 因的表達水平。
4. 權利要求3的方法，其中所述受試者的生物樣品包括血液或 血漿。
5. 權利要求2的方法，其中通過檢測所述受試者中單核細胞化 學引誘蛋白-1基因的mRNA量測定所述單核細胞化學引誘蛋白-1基 因的表達水平。
6. —種監測給予受試者的化合物的效力的方法，其中預期所述 化合物增加或降低所迷受試者細胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性，所 述方法包括以下步驟a. 由所述受試者獲得測試生物樣品，其中所述測試生物樣品包 括所述受試者的血液或血漿；b. 檢測所述受試者的測試生物樣品中單核細胞化學引誘蛋白-1 的量；和c. 比較步驟a)中測定的單核細胞化學引誘蛋白-l的量和所述受 試者的對照生物樣品中的單核細胞化學引誘蛋白-1的量，其中所述 對照生物樣品在給予所述化合物之前獲得。
7. —種用於監測給予受試者的化合物的效力的試劑盒，其中預 期所述化合物增加或降低所述受試者細胞中的鞘氨醇激酶-1生物活 性，所述試劑盒包含a. 在嚴格雜交條件下與單核細胞化學引誘蛋白-I基因雜交的核 酸探針；和b. 用於將由所述受試者檢測的單核細胞化學引誘蛋白-1基因表 達水平與所述化合物的效力關耳關起來的說明。
8. —種用於監測給予受試者的化合物的效力的試劑盒，其中預 期所述化合物增加或降低所述受試者細胞中的鞘氨醇激酶-1生物活 性，所述試劑盒包含a. 與單核細胞化學引誘蛋白-1特異性結合的抗體；和b. 用於將由所述受試者檢測的單核細胞化學引誘蛋白-1的量與 所述化合物的效力關聯起來的i兌明。
9. 一種鑑別增加或降低鞘氨醇激酶-1生物活性的化合物的方 法，所述方法包括以下步驟a. 使鞘氨醇激酶-1反應性系統與含緩衝液和測試化合物的溶液 接觸，其中所述鞘氨醇激酶-1反應性系統包含鞘氨醇激酶-1或其功 能衍生物，以及其表達受單核細胞化學引誘蛋白-1基因的調節序列 控制的基因；b. 檢測所述鞘氨醇激酶-1反應性系統中其表達受單核細胞化學 引誘蛋白-1基因的調節序列控制的基因的表達水平；和c. 根據所述化合物與其中所述鞘氨醇激酶-1反應性系統僅與所 述緩衝液接觸的對照相比增加或降低所述表達水平的能力鑑別所述 化合物。
10. 權利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反應性系統是 動物、組織或細月包。
11. 權利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反應性系統包含所述系統內源性表達的鞘氨醇激酶-1。
12. 權利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反應性系統包 含由導入到系統中的外源DNA分子重組表達的鞘氨醇激酶-1 。
13. 權利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反應性系統包 含內源性單核細胞化學《I誘蛋白-1 。
14. 權利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反應性系統包 含其表達受單核細胞化學引誘蛋白-1基因的調節序列控制的報告基 因。
15. 權利要求14的方法，其中所述報告基因選自綠色螢光蛋白 (GFP)基因、(3-半乳糖苷酶(lacZ)基因、螢光素酶(luc)基因、氯黴素乙 醯轉移酶(cat)基因、p-葡糖醛酸酶基因、新黴素磷酸轉移酶基因和烏嘌呤黃嘌呤轉磷酸核糖基酶基因。
16. 權利要求9的方法，所述方法在權利要求9的步驟(b)之前 還包括使鞘氨醇激酶-1反應性系統與鞘氨醇激酶-1活化刺激物接觸 的步驟。
17. 權利要求16的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1活化刺激物是 凝血酶或腫瘤壞死因子ot。
18. —種鑑別增加或降低鞘氨醇激酶-1生物活性的化合物的方 法，所述方法包括以下步驟a. 使內皮細胞與測試化合物接觸；b. 使所迷內皮細胞與凝血酶或腫瘤壞死因子a接觸；c. 檢測所述內皮細胞的單核細胞化學引誘蛋白-1基因的表達水 平；和d. 根據所述化合物與其中所述內皮細胞不與測試化合物接觸的 對照相比增加或降低單核細胞化學引誘蛋白-1基因表達的能力鑑別 所述化合物，其中步驟(a)可在步驟(b)之前、之後進行或與步驟(b)同時進行。
19. 權利要求9的方法，所述方法還包括以下步驟d. 使鞘氨醇激酶-1與溶液接觸，其中所述溶液含由權利要求9 的步驟(c)鑑別的化合物以及包含鞘氨醇和腺苷三磷酸的緩衝液；e. 檢測由鞘氨醇產生的鞘氨醇-l-磷酸的量；和f. 根據所述化合物與其中所述鞘氨醇激酶-1僅與所述緩衝液接 觸的對照相比增加或降低由鞘氨醇生產鞘氨醇-l-磷酸的能力證實所 述化合物。
20. 權利要求19的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1是大致純化的。
21. —種增加或降低細胞中的單核細胞化學引誘蛋白-1基因表 達的方法，所述方法包括以下步驟增加或降低所述細胞中的鞘氨 醇激酶-1生物活性，使得所述單核細胞化學引誘蛋白-1基因的表達 分別被增加或降低。
22. 權利要求21的方法，所述方法包括將化合物給予所述細胞 的步驟，所述化合物增加或降低鞘氨醇激酶-1由鞘氨醇形成鞘氨醇-l-磷酸的催化活性。
23. 權利要求21的方法，所述方法包括將化合物給予所述細胞 的步驟，所述化合物增加或降^f氐所述細胞中的鞘氨醇激酶-l的表達。
24. 權利要求23的方法，所述方法包括以下步驟a. 將耙向待降解的鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA導入所 述細胞中；b. 將在(a)中產生的細胞保持在一定條件下，在所述條件下於所 述細胞中發生鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA幹擾。
25. 權利要求21的方法，其中所述細胞是內皮細胞。
26. —種在受試者中預防動脈粥樣硬化的方法，所述方法包括以 下步驟降低所述受試者中的鞘氨醇激酶-1生物活性，使得動脈粥 樣硬化得以預防。
27. 權利要求26的方法，所述方法包括將化合物給予所述受試 者的步驟，其中所述化合物降低鞘氨醇激酶-1由鞘氨醇形成鞘氨醇-l- 磷酸的催化活性。
28. 權利要求21的方法，所述方法包括將化合物給予細胞的步 驟，其中所述化合物降低所述細胞中的鞘氨醇激酶-1的表達。
29. 權利要求28的方法，所述方法包括以下步驟a. 將靶向待降解的鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA導入受 試者細胞中；b. 將(a)中產生的細胞保持在一定條件下，在所述條件下於所述 細胞中發生鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA幹擾。
30. —種在受試者中治療動脈粥樣石更化的方法，所述方法包括以 下步驟降低所述受試者中的鞘氨醇激酶-1生物活性，使得動脈粥 樣硬化得以治療。
31. 權利要求30的方法，所述方法包括將化合物給予所述受試 者的步驟，其中所述化合物降低鞘氨醇激酶-1由鞘氨醇形成鞘氨醇-l-磷酸的催化活性。
32. 權利要求30的方法，所述方法包括將化合物給予所述細胞 的步驟，其中所述化合物降低所述細胞中的鞘氨醇激酶-1的表達。
33. 權利要求32的方法，所述方法包括以下步驟a. 將靶向待降解的鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA導入受 試者細胞中；b. 將(a)中產生的細胞保持在一定條件下，在所述條件下於所述 細胞中發生鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA幹擾。
34. —種抑制凝血酶信號轉導的方法，所述方法包括以下步驟 降低所述細胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性，使得凝血酶信號轉導被 抑制。
35. 權利要求34的方法，其中所述信號轉導途徑涉及蛋白酶活 化受體-1。
36. 權利要求34的方法，所述方法包括將化合物給予所述受試 者的步驟，其中所述化合物降j氐鞘氨醇激酶-l由鞘氨醇形成鞘氨醇-l- 磷酸的催化活性。
37. 權利要求34的方法，所述方法包括將化合物給予所述細胞的步驟，其中所述化合物降低所述細胞中的鞘氨醇激酶-1的表達。
38. 權利要求37的方法，所述方法包括以下步驟a. 將靶向待降解的鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA導入受 試者細胞中；b. 將(a)中產生的細胞保持在一定條件下，在所述條件下於所述 細胞中發生鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA幹擾。
39. —種在受試者中預防血栓形成的方法，所述方法包括降低所 述受試者中的鞘氨醇激酶-1生物活性的步驟，使得血栓形成得以預 防。
40. —種在受試者中治療血栓形成的方法，所述方法包括降低所 述受試者中的鞘氨醇激酶-1生物活性的步驟，使得血栓形成得以治 療。
全文摘要
本發明涉及鑑別、監測和使用調節鞘氨醇激酶-1生物活性的化合物的方法。
文檔編號G01N33/50GK101103123SQ200580046621
公開日2008年1月9日 申請日期2005年11月16日 優先權日2004年11月16日
發明者A·伯納爾, C·K·德裡安 申請人:詹森藥業有限公司