一種重組核酸酶及其製備方法

2023-05-14 03:28:41 1

一種重組核酸酶及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種核酸酶及其製備方法。本發明的重組核酸酶，由粘質沙雷氏菌胞外核酸酶和融合標籤肽段組成。本發明還提供了製備重組核酸酶的方法，包括基因序列的優化、融合標籤肽段的編碼序列與核酸酶基因相連接、克隆、轉化和篩選高表達菌株、培養並進行分離純化得到高純度重組核酸酶。本發明的重組核酸酶及其製備方法，表達方案簡單，表達量高，達到30％，純化工藝特異性強，收率高。本發明的重組核酸酶應用於醫藥產品的工藝中，在產品分離純化過程中很容易利用親和層析技術從產品中去除，有助於提高產品質量。
【專利說明】-種重組核酸酶及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種核酸酶及其製備方法。

【背景技術】
[0002] 生物技術產品在高效表達時宿主細胞或菌體也大量增殖，這一過程中往往伴隨著 大量的宿主或菌體核酸的擴增，在後續的分離過程中大量的核酸釋放會給目標產品的分離 純化增加難度，同時部分殘留宿主DNA與產品結合也很難去除。宿主細胞的DNA同藥物一 起進入人體會產生不可預料的副作用，殘留DNA可能造成機體DNA的插入突變，導致抑癌基 因失活、癌基因被激活等，有可能造成藥物使用者致癌，因此宿主細胞DNA殘留量是產品質 量控制的重要指標之一。
[0003] 許多機構都對重組蛋白類藥物的DNA殘留制定了嚴格的標準，1984年的國際會議 上採納了殘餘DNA的臨時限度標準，即來自連續傳代細胞系的生物製品每人份劑量DNA殘 留不能超過l〇pg。1986年WHO會議一致認為不高於100pg/劑量的細胞DNA對於非口服途 徑的產品，其危險性是可以忽略不計的。1987年，美國FDA建議每人份劑量殘餘細胞DNA的 可接受限度為l〇pg。1997年，美國FDA將生物製品可以允許的殘餘DNA限度修改為不超過 100pg。歐洲藥典通則中對於殘餘DNA的限度規定為不超過10ng/劑量，但針對個別疫苗 (如A型肝炎滅活疫苗殘餘DNA應不超過100pg/劑量；B型肝炎疫苗DNA殘留量應不超過 l〇pg/劑量）會有所不同。
[0004] 1990年2月，衛生部頒布的《人用重組DNA製品質量控制要點》3. 3. 1. 6條款規定， 必須用敏感的方法測定來源於宿主細胞的殘餘DNA含量，這對於用哺乳動物傳代細胞（轉 化的細胞系）生產的製品尤為重要。一般認為殘餘DNA含量小於100pg/劑量是安全的。 《中國藥典》三部（2005年版）對CH0細胞表達的重組B型肝炎疫苗提出CH0細胞殘餘DNA 含量不高於l〇pg/劑量。近幾年，我國採用Vero細胞生產滅活疫苗逐漸增多，疫苗的種類 包括人用狂犬病純化疫苗、腎症候群出血熱純化疫苗、A型肝炎滅活疫苗、乙型腦炎純化疫 苗。《中國藥典》（2005年版三部）及（2010年版三部）對於V ero細胞培養疫苗一般要求 殘餘外源DNA不超過100pg/劑量。
[0005] 生物組織及菌體裂解後大量的核酸釋放使樣品的黏度很高，不利於分析及從中分 離目標產品。使用核酸酶降解DNA是除去宿主細胞DNA殘留的常用方法。核酸酶通過降低 生物製品，尤其是病毒類產品外源性核酸的含量，減少過敏反應，提高製品安全性。工程細 胞裂解後加入核酸酶可降低料液的黏度，縮短處理時間，提高蛋白產量，離心時有利於沉澱 和上清液的分離，超濾時有利於各成分的分離，提高柱層析純化時的有效性。顆粒（病毒、 包涵體等）用核酸酶預處理有助於顆粒的純化。在ELISA、柱層析、二維電泳和免疫印跡等 生物樣品分析中，通過核酸酶的作用可提高解析度和回收率。
[0006] 非特異性核酸內切酶是一類高活性的水解酶，其最大特點是能非特異性地降解 幾乎所有形式的核酸。來自粘質沙雷氏菌非特異性核酸內切酶（Serratia marcescens non-specific endonuclease，SMNE，E. C. 3· 1· 30. 2)是其中的典型代表，該酶能降解各種形 式核酸的核酸內切酶，包括單鏈，雙鏈，線性和環狀DNA和RNA以及基因組DNA，對核酸的序 列沒有嚴格要求，並且沒有蛋白酶活性。該酶在廣泛條件範圍具有很高的核酸降解活性，能 將核酸完全消化成雜交限度以下的2-5個鹼基長度的5' -單磷酸寡核苷酸。
[0007] 該酶由分子量為30kDa的兩個亞基組成，作用的pH範圍為6?10,溫度0?42°C， 酶發揮活性需要1?2mM Mg2+。在離子型及非離子型表面活性劑和lmm〇l/L PMSF，lmmol/ LEDTA，尿素存在下，核酸酶仍具有活性。大於150mmol/L的單價陽離子，大於100mmol/L的 磷酸根，大於100mm〇l/L硫酸銨和大於100mmol/L鹽酸胍抑制酶的活性。
[0008] 核酸酶具有廣闊的應用前景，目前市場上銷售的核酸酶產品主要是德國Merck公 司的Benzonase? endonuclease。該產品是將Serratia marcescens核酸酶基因克隆到 pNUCl質粒載體，轉化大腸桿菌W3310實現核酸酶基因的分泌表達，生產工藝保證了產品的 純度和活性，使該產品同自然提取酶相比，最大限度地降低了蛋白酶活性和病毒汙染。
[0009] 美國Acambis公司的ChimeriVax? Platform疫苗研究平臺系統，米用黃熱病毒載 體研究生產登革熱、WN和JE腦炎疫苗。這些重組疫苗的研發始於1997?1999年，在2000? 2003年獲得IND批准。在質量控制方面包括：（1)種子系統（外源因子檢測，逆轉錄病毒檢 測，效力，基因序列鑑別和免疫染色鑑別，小鼠和猴體神經毒力的安全性，無菌性等）；（2) 疫苗收穫液檢定（無菌性，效力，外源因子檢測，逆轉錄病毒檢測，基因序列鑑別等）；（3)純 化的疫苗原液（無菌性，效力，基因序列鑑別，HAS，殘餘DNA檢測，內毒素等）；(4)半成品 (無菌性，效力，基因序列鑑別和免疫染色鑑別小鼠神經毒力安全性，殘餘Benzonase檢測， 殘餘DNA檢測，賦形劑，滲透壓等）；（5)成品（無菌性，內毒素，免疫染色鑑別，一般安全性、 外觀、pH、滲透壓、賦形劑等）。這表明Benzonase核酸酶已經用於疫苗的開發和生產。
[0010] 2007年，薛惠斌在腺病毒CNHK200-hEndostatin的質量控制及其大規模擴增-純 化的初步研究中應用Benzonase提高重組腺病毒的質量，工藝條件：最佳的作用濃度在 100?200u/ml，置於37°C水浴，60分鐘。重組複製型溶瘤腺病毒p53產品工藝中也使用了 benzonase酶，質量標準制定了相應的殘留量檢測項目。《Vaccine》雜誌2007年發表了關於 人用羅斯河病毒感染（Ross River virus)疫苗的臨床前試驗文章，其中疫苗製備工藝首先 是40升反應器中病毒的微載體培養，然後收穫培養上清進行過濾，濾液中加入Benzonase 核酸酶處理，濃度2000U/L，37°C，1小時以消化殘留的Vero細胞DNA。後續病毒經甲醛滅活 24小時後再加入Benzonase核酸酶1000U/L以進一步處理殘留的核酸。
[0011] 2009年發表於《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》的一項關於腺病毒載體純 化的石開究（Purification of adenoviral vectors by combined anion exchange and gel filtration chromatography)中應用 Benzonase 的條件為：1200U Benzonase 加到 12. 5ml (98U/ml)粗裂解物，37°C保溫1小時，然後2-8°C條件3000g離心10分鐘後進一步 純化。結果病毒顆粒的收率有很大改善，在超濾後純化的第一步97%的Benzonase核酸酶 能夠去除。
[0012] 2010年《Gene Therapy》雜誌報導了通過單純皰疫病毒互補系統生產、純化腺相 關病毒的工作，其中重組病毒顆粒釋放後採用Benzonase核酸酶（25U ml/L，MgCl22mmol/ L).處理，37°C振蕩保溫2?4小時，這樣便於在後續的工藝中有效地去除殘留DNA。
[0013] 2011年，Langfield Κ· Κ·等在《Methods Mol Biol.》雜誌發表了關於製備麻疫病 毒的文章。麻疹病毒作為具有腫瘤治療前景的溶瘤病毒，正在進行臨床試驗，但溶瘤病毒的 活性依賴於高濃度具有感染性的病毒顆粒。在純化中，病毒培養上清過濾後採用Benzonase 核酸酶處理來消化其中的核酸以便於後續的製備工作。
[0014] 2012年，Bandeira V.等在純化慢病毒顆粒載體（Lentiviral vector)的工藝過 程中使用了 Benzonase核酸酶，結果能去除99%的DNA殘留。美國食品藥品監督管理局網 站（WWW. fda. gov)公開了病毒載體的生產工藝過程，其中有Benzonase核酸酶的處理步驟， 通過37°C保溫1小時，就能有效去除細胞及質粒DNA。宮頸癌疫苗GARDASIL的工藝過程中 使用Benzonase核酸酶4°C處理病毒顆粒過夜以幫助消化DNA從而使宿主殘留DNA在後續 純化過程中容易去掉，降低終產品中宿主DNA的殘留量。
[0015] Benzonase核酸酶的應用使細胞基質DNA被水解成小片段甚至寡核苷酸後在疫苗 的純化過程中很容易去除，大大降低了殘留DNA的含量，提高了疫苗產品的質量。保證了產 品的安全性。同時與疫苗顆粒相比，Benzonase核酸酶是小分子蛋白質，在去除血清蛋白的 過程中也很容易去除。然而Benzonase核酸酶的使用是直接加入到疫苗溶液中，終產品可 以控制含量，但無法完全避免。Benzonase核酸酶是外源性蛋白，極微量的殘留都有可能引 發個別接種者出現過敏反應，導致臨床不測事件發生。
[0016] 2009年，張開俊等發表了《Serratia marcescens非特異性核酸內切酶的原核表 達及其應用》的研究工作，其中採用分泌表達的方式進行表達，表達量非常低，目標蛋白佔 大腸桿菌菌體總蛋白約5%，只有8. 0mg/L。2011年，蔡俊傑進行了《粘質沙雷氏菌胞外核 酸酶重組表達純化及鑑定》的研究工作，表達量有所提高，達到菌體總蛋白的10%。但產品 沒有活性。
[0017] 因此非常有必要開發一種高效表達的重組核酸酶以滿足醫藥產品開發的需求，又 能方便地與產品實現分離。


【發明內容】

[0018] 本發明的目的在於提供一種表達量高，而且使用後容易從樣品中去除的重組核酸 酶，為了實現發明的目的，本發明採用了以下技術方案：
[0019] 一種重組核酸酶，由粘質沙雷氏菌胞外核酸酶和融合標籤肽段組成。
[0020] 融合標籤肽段序列在粘質沙雷氏菌胞外核酸酶的N端，或者融合標籤肽段序列在 粘質沙雷氏菌胞外核酸酶的的C端。或者融合標籤肽段序列在粘質沙雷氏菌胞外核酸酶的 的N端和C端。
[0021] 本發明採用的融合標籤肽段為2?10個組氨酸的多聚胺基酸、FLAG(DYKDDDDK氨 基酸序列）、人c-myc蛋白表位、流感病毒血凝素表面抗原決定簇、葡萄球菌蛋白A、穀胱甘 膚疏基轉移酶、綠色突光蛋白和硫氧環蛋白序列。
[0022] 優選的融合標籤多聚胺基酸肽段序列為6個組氨酸序列。
[0023] 本發明的重組核酸酶的分子量為26kd_45kd，優選的分子量為30?40kd，其中最 優選的為28kd。
[0024] 本發明重組核酸酶的比活性為0. 2?1. 5xl06U/mg，優選的為1. 0?1. 5xl06U/mg
[0025] 本發明還提供了一種製備重組核酸酶的方法，包括（1)、重組核酸酶基因的獲得； (2)表達載體的構建及轉化大腸桿菌工程菌：將融合標籤肽段的編碼序列與核酸酶cDNA 相連接的片段插入到表達載體質粒的酶切位點，然後轉化大腸桿菌宿主菌；（3)、陽性克隆 的篩選、培養、誘導表達：篩選出陽性克隆在培養基上進行培養，經誘導使目標蛋白表達； (4)、重組核酸酶的分離、純化：首先將大腸桿菌工程菌菌體收集、破菌，經離心得到破菌液 上清，然後對破菌液上清用層析技術純化得到重組核酸酶。
[0026] 核酸酶cDNA序列是已知的，編碼一個全長246個胺基酸的蛋白質。核酸酶的編碼 序列可以來源於基因文庫，再1根據表達的序列進行序列優化；或根據文獻報導的核酸酶 cDNA序列優化後進行全基因合成，標籤肽段的編碼序列和核酸酶編碼序列通過PCR擴增獲 得重組核酸酶的編碼序列。
[0027] 本發明一種重組核酸酶的製備方法步驟（3)中是用氨苄青黴素做抗性篩選，也可 以使用卡那黴素做抗性篩選。
[0028] 本發明一種重組核酸酶的製備方法步驟（3)中誘導表達使用濃度為0. 1? 1. 5mmol/L的IPTG作為誘導劑，優選0. 4?1. Ommol/L的IPTG作為誘導劑。
[0029] 本發明一種重組核酸酶的製備方法步驟（3)中誘導表達使用濃度為0. 1? 20mmol/L的乳糖作為誘導劑，優選1?5mmol/L的乳糖作為誘導劑。
[0030] 本發明一種重組核酸酶的製備方法，表達載體是pET系列載體質粒和載體上含有 融合標籤肽段編碼序列的質粒載體。
[0031] 本發明一種重組核酸酶的製備方法，步驟（3)中培養的溫度控制在25°C?40°C， 優選在28°C?30°C。
[0032] 本發明一種重組核酸酶的製備方法，採用親和層析技術，凝膠顆粒上結合了能與 融合標籤肽段特異結合的配基，再結合離子交換層析、分子篩層析、疏水層析一種或多種方 法進行純化使產品純度達到95%以上。
[0033] 本發明一種重組核酸酶及其製備方法，其表達方案簡單，表達量高，達到30 %，純 化工藝特異性強，收率高。本發明的重組核酸酶應用在醫藥產品的工藝中，在產品分離純化 過程中很容易利用親和層析技術從產品中去除，從而提高了產品的質量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 附圖1、pET-22a-NU-n質粒編碼重組核酸酶表達全菌蛋白SDS-PAGE分析
[0035] Μ :標準蛋白質分子量（97. 4、66· 2、43、31、20、14· 4kd);
[0036] 1 :未誘導菌體總蛋白；
[0037] 2-4:誘導菌體總蛋白。
[0038] 附圖2、pET-llb-NU-c質粒編碼重組核酸酶表達全菌蛋白SDS-PAGE分析
[0039] Μ :標準蛋白質分子量（97. 4、66· 2、43、30、20· 1、14· 4kd);
[0040] 1、2:誘導菌體總蛋白；
[0041] 3:未誘導菌體總蛋白。
[0042] 附圖3、pET-28a-NU-nc質粒編碼重組核酸酶表達全菌蛋白SDS-PAGE分析
[0043] Μ :標準蛋白質分子量（97. 4、66· 2、43、31、20、14· 4kd);
[0044] 1 :未誘導菌體總蛋白；
[0045] 2-5:誘導菌體總蛋白。
[0046] 附圖4、pGEX-NU-GST質粒編碼重組核酸酶表達全菌蛋白SDS-PAGE分析
[0047] Μ :標準蛋白質分子量（97. 4、66· 2、43、31、20、14· 4kd);
[0048] 1 :未誘導菌體總蛋白；
[0049] 2、3:誘導菌體總蛋白。
[0050] 附圖5、IMAC親和層析結果圖譜
[0051] 附圖6、離子交換Q柱層析結果圖譜
[0052] 附圖7、HIC疏水層析結果圖譜
[0053] 附圖8、純化重組核酸酶（pET-28a-NU-nc質粒編碼）SDS-PAGE分析
[0054] Μ :標準蛋白質分子量（97. 4、66· 2、43、31、20、14· 4kd);
[0055] 1:重組核酸酶5以8;
[0056] 2:重組核酸酶2以8;
[0057] 3:重組核酸酶1以8。
[0058] 附圖9、純化重組核酸酶（pET-28a-NU_nc質粒編碼）免疫印跡分析
[0059] Μ :標準蛋白質分子量（97. 4、71· 4、43、31、24· 7、16· 6kd);
[0060] 1:重組核酸酶2以8;
[0061] 2:重組核酸酶lyg;
[0062] 3 :重組核酸酶0. 5μ g ;
[0063] 4 :Benzonase 酶 0· 5 μ g。
[0064] 附圖10、ELISA檢測重組核酸酶含量與0D450nm的關係圖 具體實施例
[0065] 下面結合具體實施例進一步說明本發明，但是並非限定本發明。
[0066] 實施例一重組核酸酶基因的獲得
[0067] 根據文獻報導（GenBank :M19495. 1)的粘質沙雷菌（S. marcescens)核酸酶基因序 列，進行基因表達序列優化，優化後序列見序列表1，合成20段互補的寡核苷酸，按分子克 隆的常規方法，首先用T4噬菌體多核苷酸激酶37°C處理30min，磷酸化的各寡核苷酸片段 以等摩爾混合，94°C變性5min，立即65°C退火lOmin，然後加入T4連接酶，16°C連接過夜，獲 得目的基因模板片段。取4個滅菌的微量離心管，加入 ：
[0068] 4 μΙ 目的基因 1 μΙ Τ載體 0.5 μΙ Τ4 DNA 連接酶（30〇υ/μΙ) 1 μΙ 連接酶緩衝液10x buffer 3.5 μΙ 滅菌雙蒸水 總體積 10 μΙ
[0069] 上述混合物輕輕震蕩混勻後再短暫離心，然後置於14°C水浴中保溫連接過夜 (12?16h)。取5 μ 1連接產物加入到50 μ 1冰上解凍的大腸桿菌T0P10感受態細胞中，輕 旋幾次混勻，冰上放置30分鐘。將管放入預加溫到42°C的水浴中，熱激90秒。然後迅速 置於冰上，使細胞冷卻10分鐘。每管中加800 μ 1 LB培養基（不含抗生素），37°C振蕩培 養1小時。室溫4, OOOrpm離心5分鐘，棄去800 μ 1上清後，用剩餘50 μ 1培養基重懸細胞 並塗布到含Amp的LB瓊脂平板表面，再在平板上滴加40 μ 1 20mg/ml X-gal、7 μ 1200mg/ ml IPTG。將平板置於室溫直至液體被吸收。倒置平皿，於37°C培養，12-16小時後可出現 菌落，白色菌落即為獲得陽性菌落。
[0070] 實施例二N端帶融合標籤重組核酸酶基因的表達
[0071] 設計一對引物，引物1和2分別見序列表序列2和序列3,基因5'端引物帶有Nde I酶切位點，3'端引物帶有BamH I酶切位點，在0. 2ml PCR微量離心管中配製25 μ 1反應 體系：
[0072] 滅菌雙蒸水 16 μΙ 10XPCR buffer (不含 MgCL2) 2.5 μΙ 25mmol/L MgCL2 1.5 μΙ 2.5mmol/L dNTP(each 0.2mM) 2.0 μΙ 10 pmol/L 引物 1 1.0 μΙ 10pmol/L 引物 2 1.0 μΙ 模板質粒 用小槍頭粘一下選中的白色菌落，再慎入PCR混合液中洗一洗 Taq 酶 0.5 μΙ (1.5U)
[0073] 94°C 預變性 5min，設置 94°C lmin、55°C lmin、72°C 2min，共 30 個循環，最後 72°C lOmin。PCR結束後取10 μ 1產物進行瓊脂糖凝膠電泳，片段大小與設計的大小777bp 一致，見序列表序列4,其編碼的胺基酸序列見序列表序列5。
[0074] pET_22a質粒用Nde I、BamH I雙酶切回收大片段，與PCR的核酸酶基因片段連接， 20yL反應體系基因片段與載體大片段的比例為10 : 1，加 T4DNA連接酶300單位，15°C連 接過夜，取10 μ L連接產物直接轉化大腸桿菌宿主菌BL21 (DE3)感受態細胞，塗布於氨苄青 黴素抗性平板，37°C培養過夜，獲得工程菌進行進一步篩選。
[0075] 氨苄青黴素做抗性篩選，得到陽性克隆pET-22a-NU_n。提取質粒，用限制性內切酶 進行鑑定。陽性轉化子用通用引物進行序列分析，結果克隆序列與設計序列完全一致。
[0076] 接種陽性克隆進行培養，經0. 8mmol/L的IPTG誘導，表達結果見附圖1，與對照相 t匕，重組核酸酶的表達量達到30%以上。
[0077] 實施例三C端帶融合標籤重組核酸酶基因的表達
[0078] 設計一對引物，引物3和4分別見序列表序列6和序列7,基因5'端引物帶有Nde I酶切位點，3'端引物帶有BamH I酶切位點，在0. 2ml PCR微量離心管中配製25 μ 1反應 體系：
[0079] 滅菌雙蒸水 16 μΙ 10XPCR buffer (不含 MgCL2) 2.5 μΙ 25mmol/L MgCI_2 1.5 μΙ 2.5mmol/L dNTP(each 0.2mM)風採 2.0 μΙ 10pmol/L 引物 3 1.0 μ| 10pmol/L 引物 4 1.0 μ| 模板質粒用小槍頭粘一下選中的白色菌落，再慎入PCR混合液中洗一洗。 Taq 酶 0.5 μΙ (1.5U)
[0080] 94°C 預變性 5min，設置 94°C lmin、56°C lmin、72°C 2min，共 30 個循環，最後 72°C lOmin。PCR結束後取10 μ 1產物進行瓊脂糖凝膠電泳，片段大小與設計的大小784bp 一致，見序列表序列8,其編碼的胺基酸序列見序列表序列9。
[0081] PET-Ilb質粒用Nde I、BamH I雙酶切回收大片段，與PCR的核酸酶基因片段連接， 20yL反應體系基因片段與載體大片段的比例為10 : 1，加 T4DNA連接酶300單位，15°C連 接過夜，取10 μ L連接產物直接轉化大腸桿菌宿主菌BL21 (DE3)感受態細胞，塗布於氨苄青 黴素抗性平板，37°C培養過夜，獲得工程菌進行進一步篩選。
[0082] 氨苄青黴素做抗性篩選，得到陽性克隆pET-llb-NU-c。提取質粒，用限制性內切酶 進行鑑定。陽性轉化子用通用引物進行序列分析，結果克隆序列與設計序列完全一致。
[0083] 接種陽性克隆進行培養30°C，250rpm，6個小時，經1.0mmol/L的IPTG誘導，表達 結果見附圖2,與對照相比，重組核酸酶的表達量達到30%以上。
[0084] 實施例四兩端帶融合標籤重組核酸酶基因的表達
[0085] 設計一對引物，引物5和6分別見序列表序列10和序列11，基因5 '端引物帶有 Nde I酶切位點，3'端引物帶有BamH I酶切位點，在0.2ml PCR微量離心管中配製25 μ 1 反應體系：
[0086] 滅菌雙蒸水 16 μΙ 10XPCR buffer (不含 MgCL2) 2.5 μΙ 25mmol/L MgCi_2 1.5 μΙ 2.5mmol/LdNTP (每種 0.2mM) 2.0 μΙ 10pmol/L 引物 5 1.0 μ| lOpmol/L 引物 6 1.0 μΙ 模板質粒，用小槍頭粘一下選中的白色菌落，再慎入PCR混合液中洗一洗。 Taq 酶 0.5 μΙ 1.5U)
[0087] 94 °C 預變性 5min，設置 94 °C lmin、58 °C lmin、72 °C 90s，共 35 個循環，最後 72°C 10min。PCR結束後取10μ 1產物進行瓊脂糖凝膠電泳，片段大小與設計的大小811bp 一致，見序列表序列12,其編碼的胺基酸序列見序列表序列13。
[0088] pET_28a質粒用Nde I、BamH I雙酶切回收大片段，與PCR的核酸酶基因片段連接， 20yL反應體系基因片段與載體大片段的比例為10 : 1，加 T4DNA連接酶300單位，15°C連 接過夜，取10 μ L連接產物直接轉化大腸桿菌宿主菌BL21 (DE3)感受態細胞，塗布於氨苄青 黴素抗性平板，37°C培養過夜，獲得工程菌進行進一步篩選。
[0089] 氨苄青黴素做抗性篩選，得到陽性克隆pET-28a_NU-nc。提取質粒，用限制性內切 酶進行鑑定。陽性轉化子用通用引物進行序列分析，結果克隆序列與設計序列完全一致。
[0090] 接種陽性克隆進行培養，經0. 5mmol/L的IPTG誘導，表達結果見附圖3,與對照相 t匕，重組核酸酶的表達量達到30%以上。
[0091] 實施例五GST融合重組核酸酶基因的表達
[0092] 設計一對引物，引物7和8分別見序列表序列14和序列15，引物7帶有BamH I酶 切位點，引物8帶有Xho I酶切位點。以重組質粒pET-22a-NU-n為模板，50 μ L體系擴增 核酸酶基因，擴增程序為：94°C 5min ;94°C 30s，52°C 30s，72°C 3〇8,30個循環；最後72°〇延 伸lOmin。將PCR產物切膠回收，用BamH I和Xho I同時酶切PCR純化產物和pGEX-4T-l， 酶切後切膠回收，以T4連接酶16°C連接過夜，構建表達載體pGEX-NU-GST，轉化GT116,提 取質粒，雙酶切鑑定及測序。重組質粒的GST融合重組核酸酶編碼基因序列見序列表序列 16,其編碼的胺基酸序列見序列表序列17。重組表達載體pGEX-NU-GST轉化到感受態大腸 桿菌BL21(DE3)中。將陽性菌落過夜培養物按1 %比例接種到含氨苄青黴素（Amp) 100 μ g/ mL的LB液體培養基中，37°C、250rpm培養至0D600約0. 6,取2mL菌液做未誘導對照，剩餘 菌液添加 IPTG至終濃度為lmmol/L，25°C繼續培養6h，離心收集菌體，進行SDS-PAGE分析， 結果見圖4,目標蛋白的表達量大於30%。
[0093] 實施例六重組核酸酶的分離純化
[0094] 1、菌體培養
[0095] 配製4升LB培養基（胰蛋白腖10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH7. 0)， 培養基配好後於121°C溫度下溼熱消毒滅菌30min。滅菌結束後待培養基冷卻不燙手時於 超淨臺中加 Amp使其終濃度為100mg/L，冷卻後置4°C冰箱中備用。
[0096] 無菌操作條件下在平板中挑取pET-22a-NU-nc單菌落於100ml LB培養基（含 Aamp)中，然後置於37°C下，180rpm搖床培養過夜。從培養過夜的種子培養物按2%接種量 轉接於LB培養基中，於37°C、250rpm培養4小時，培養液的0D600約為0. 8,然後加入誘導 劑IPTG至終濃度lmmol/L。繼續培養4小時，離心收集菌體（5, OOOrpmX 10min)。菌體用 洗滌液 20mM Tris-HCl，ρΗ7· 0,0· 15M NaCl 洗滌 2-3 次。
[0097] 2、菌體破碎
[0098] 取約10g溼菌體，按lg溼菌體加20ml破菌緩衝液（50mM Tris-HCl buffer，0· 1M NaCl，pH8. 5)懸浮菌體，即用200mL破菌緩衝液懸浮菌體，然後冰浴超聲破碎（超聲功率 5000W，每次超聲5s，間歇5s，即佔空比50 %，共進行90個循環），收集破菌上清：10, OOOrpm 離心10min,收集上清液。
[0099] 3、產物的分離
[0100] IMAC 層析柱（Chelating Sepharose Fast Flow 凝膠）用蒸饋水以流速 10ml/min 衝洗100mL。再用平衡液（20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，pH8. 0)平衡5CV至流出液與平衡 液電導及紫外吸收值一致。破菌上清補加 NaCl使終濃度為0. 5M，調pH至8. 0,然後上層 析柱，收集流出液。用平衡液洗滌層析柱使紫外吸收和電導均達到基線。用洗脫液（20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，0. 5M咪唑，pH8. 0)進行梯度洗脫，分別用150mM咪唑和300mM咪唑進 行洗脫，收集洗脫峰，層析圖譜見圖5。最後用100%洗脫液洗滌層析柱。層析結束後用蒸 餾水衝洗層析柱後保存於20%酒精中。
[0101] 4、產物的進一步純化
[0102] 將收集到的目標峰去鹽後進行離子交換層析法純化，其過程為用pH值為8. 5的 20mmol/L Tris. CL緩衝液稀釋，使其電導率小於5mS/cm。用同樣的緩衝液平衡Q柱，上樣 後用平衡緩衝液洗至基線，用〇. 〇1?〇. 5mol/LD NaCL梯度洗脫，收集目標蛋白峰，層析圖 譜見圖6。目標蛋白補加（NH4)2S04使終濃度為1. 0-1. 5mol/L，樣品上1. 0mol/L(NH4)2S04， 20mmol/L ΡΒ，ρΗ7·4的緩衝液平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，通過降低鹽濃度梯 度洗拖，收集目標蛋白峰，見圖7的疏水層析圖譜。
[0103] 得到的疏水層析峰經S印hadex G-25脫鹽，平衡液為20mmol/L ΡΒ，ρΗ7·4。樣品 脫鹽後即為精細純化的核酸酶，15% SDS-PAGE電泳分析樣品純度，結果見圖8,樣品純度達 到99%以上。
[0104] 實施例七GST融合重組核酸酶基因的表達
[0105] 含pGEX-NU-GST表達質粒的重組接種至LB液體培養基（含Amp，100 μ g/mL)，30°C 搖床振蕩（250rpm)培養過夜。次日按1 %接種LB液體培養基中（含Amp，100 μ g/mL)，30°C 搖床振蕩（250rpm)培養至0D600 = 0. 5時，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)，誘導表達5h， 離心，4°C，5000rpm，20min，棄上清，收集沉澱稱重。菌體用裂解液（500mmol/LNaCl，20mmol/ L Tris-HCl，pH7. 5)重懸菌體沉澱，超聲波破碎菌體（冰上操作，15s/5s，全程15min)，破碎 後於14000rpm、4°C離心20min，分別收集裂解上清和沉澱，
[0106] 裂解上清使用GSTrap FF(穀胱甘肽瓊脂糖樹脂GlutathioneSepharose4B)柱 進行親和層析純化，其中平衡緩衝液為PBS(140mmol/L NaCl，2. 7mmol/L KCl，10mmol/ LNa2HP04,1. 8mmol/L KH2P04, pH7. 3)，洗脫緩衝液（50mmol/LTris-HCl，lOmmol/L 還原型谷 胱甘肽，pH8. 0)，用大約5倍柱床容積的平衡緩衝液PBS平衡柱子，上樣經0. 45 μ m的過濾 器過濾的超聲裂解液的上清，再用PBS平衡洗脫雜蛋白，用5倍柱床容積的洗脫緩衝液洗脫 結合在柱子上的融合蛋白，收集洗脫液。對目標蛋白進行過夜透析，透析液為凝血酶裂解 液（PBS，pH7. 3)，以除去還原型穀胱甘肽。Lowry法融合蛋白的濃度，根據每毫克蛋白加入 10 μ L (10單位）的凝血酶，室溫（22-25°C )孵育16h，用PBS (ρΗ7· 3)緩衝液過夜透析除去 GST。然後與Glutathione Sepharose4B(按每毫升層析介質結合8mg蛋白）孵育30min， 500 Xg離心5min，上清中為不帶標籤的核酸酶。
[0107] 實施例八重組核酸酶的活性分析
[0108] 重組核酸酶能夠將DNA消化分解為3?8b的寡核苷酸鏈。採用分光光度法進行 酶活性測定。配製以下活性測定試劑：
[0109] 溶液A :稱取3.0g Tris溶解於450ml蒸餾水中，用L0mol/L HCL調pH為8.0,定 容至 500ml，即為 50mM Tris-HCL ρΗ8·0 的溶液。取 100ml50mM Tris-HCL ρΗ8·0,加入 20mg MgCl2, lOmg BSA，完全溶解後4°C冰箱備用。
[0110] 溶液B : lOmg魚精DNA用10ml溶液A溶解，魚精DNA的濃度為lmg/ml。並經超聲 處理。
[0111] 溶液C :0· 8ml高氯酸加蒸饋水至20ml。
[0112] 將純化的帶標籤重組核酸酶用溶液A稀釋30000倍備用。按表1依次加樣，每個 樣品平行2管，然後置於37°C水浴中，保溫15、30、45、60分鐘後分別取樣0. 5ml，加入已含 有0. 5ml高氯酸溶液的小管中，混勻後置冰浴30-60分鐘，然後4°C離心（10, 000rpm，5分 鍾），轉移上清液lml置於新的小管中，以空白管上清液調零，測定0D260nm的吸收值。
[0113] 表1酶活性測定加樣表
[0114]

【權利要求】
1. 一種重組核酸酶，其特徵在於：由粘質沙雷氏菌胞外核酸酶和融合標籤肽段組成。
2. 根據權利要求1所述的重組核酸酶，其特徵在於：融合標籤肽段序列在粘質沙雷氏 菌胞外核酸酶的N端，或者融合標籤肽段序列在粘質沙雷氏菌胞外核酸酶的的C端，或者融 合標籤肽段序列在粘質沙雷氏菌胞外核酸酶的的N端和C端。
3. 根據權利要求1所述的重組核酸酶，其特徵在於：融合標籤肽段為2?10個組氨酸、 FLAG。人c-myc蛋白表位、流感病毒血凝素表面抗原決定簇、葡萄球菌蛋白A、穀胱甘肽巰基 轉移酶、綠色螢光蛋白和硫氧環蛋白。
4. 根據權利要求1所述的重組核酸酶，其特徵在於：優選的融合標籤肽段為6個組氨 酸序列。
5. 根據權利要求1-4任意一項權利要求所述的重組核酸酶，其特徵在於：重組核酸酶 的分子量為26kd-45kd。
6. 根據權利要求1-4任意一項權利要求所述的重組核酸酶，其特徵在於：重組核酸酶 的比活性為0. 2?1. 5xl06U/mg。
7. -種製備如權利要求1所述的重組核酸酶的的方法，其特徵在於：（1)重組核酸酶基 因的獲得；(2)表達載體的構建及轉化大腸桿菌工程菌：將融合標籤肽段的編碼序列與核 酸酶基因序列相連接的片段插入到表達載體質粒的酶切位點，然後轉化大腸桿菌宿主菌； (3)陽性克隆的篩選、培養、誘導表達：篩選出陽性克隆在培養基上進行培養，經誘導使目 標蛋白表達；(4)重組核酸酶的分離、純化：首先將大腸桿菌菌體收集、破菌，經離心得到破 菌液上清，然後對破菌液上清用層析技術純化得到重組核酸酶。
8. 根據權利要求7所述的一種重組核酸酶的製備方法，其特徵在於：表達載體是pET 系列載體質粒或載體上帶有融合標籤肽段編碼序列的質粒載體。
9. 根據權利要求7所述的一種重組核酸酶的製備方法，其特徵在於：步驟（3)中培養 的溫度控制在25°C?40°C，優選在28°C?30°C。
10. 根據權利要求7所述的一種重組核酸酶的製備方法，其特徵在於：採用親和層析技 術，凝膠顆粒上結合了能與融合標籤肽段特異結合的配基，再結合離子交換層析、分子篩層 析、疏水層析一種或多種方法進行純化。
【文檔編號】C12N15/70GK104099310SQ201310131713
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月12日 優先權日:2013年4月12日
【發明者】劉國安, 徐輝, 方芳 申請人:杭州俊豐生物工程有限公司