一種含γ-聚穀氨酸的肥料添加劑的生產方法

2023-05-13 19:18:26

專利名稱：：一種含γ-聚穀氨酸的肥料添加劑的生產方法
技術領域：
：本發明涉及一種有機肥料添加劑的生產方法，具體地說，涉及一種以微生物對工農業廢物料等廉價材料進行固體發酵生產含聚穀氨酸的肥料添加劑的方法。
背景技術：
：味精發酵廢液、蘇氨酸等胺基酸發酵廢液是由味精廠、食品廠排出的生產廢液，這些廢液由於具有高COD、BOD、氨氮、有機物等，成為嚴重的環境汙染源。利用這些廢液作為製備有機肥料是處理這些廢液的一個重要途徑。目前利用味精發酵廢液製備有機肥料的方法一般是將味精發酵廢液與一些適當的配料直接混配、固化、造粒而成，如CN1442396公開的"味精副產物生產的胺基酸有機無機肥及其生產方法"，該方法是將味精尾液與菌泥、化肥混合、脫水、造粒而製成有機無機肥料；CN101045657A公開的"利用味精廢液生產的無公害有機肥料及其製備方法"，是將味精廢液與木質素、風化煤、磷酸銨、氯化鉀和微量元素混配、固化、造粒而製成有機肥料。直接添加味精發酵廢液、蘇氨酸等胺基酸發酵廢液到相關配料中以製作有機肥，由於這些廢液中含有大量的銨鹽，因此可以也提高肥效，但如同直接使用尿素或硫酸鉸等氮肥一樣，胺基酸廢液中的銨鹽在施肥過程中約有80%的銨轉化為氣態氨釋放至U大氣中(Miflin，B.J,，andP.J.Lea.1982.Ammoniaassimilationandaminoacidmetabolism,p.5-64./"D.Boulter,andB.Parthier(ed.)，Nucleicacidsandproteinsinplants,vol.1.Springer-Verlag，Berlin,Germany.)，豐直物能夠直接吸收的氮素營養只有肥料中總含氮量的56%(w/w)(Syrett，P.J.1988.Uptakeandutilizationofnitrogencompounds,p.23-39.L.丄Rogers,and丄R.Gallon(ed.)，Biochemistryofthealgaeandcyanobacteria.OxfordSciencePublicationsClarendonPress,Oxford,UnitedKingdom,),另夕卜，氮月巴!皮土i襄吸收後，由於土壤中微生物的作用，有部分銨離子被轉化成硝酸鹽，硝酸鹽能溶解於土壤的水中，其中約有40%(w/w)的硝酸鹽隨土壤的水流失到地下水系或其它水源中(Birrer，GA.，A.M.CromwickjandR.A.Gross.1994.Tf-Poly(glutamicacid)formationby5ad/,itf"c/)ew(/bnMhATCC9945a:physiologicalandbiochemicalstudies.Int.J.Biol.Macromol.16:265-275)，從而造成月巴料中氮素營養的下降，使其應用效果受到影響。
發明內容發明人在進行利用枯草芽孢桿菌(Ba"7/MPGA-7微生物菌株製備？聚穀氨酸的研究中，發現在味精發酵廢液、蘇氨酸發酵廢液等高濃度有機廢水及相關配料中加入枯草芽孢桿菌(5acz7/wPGA-7微生物菌株後，菌株能將上述發酵物中的銨離子等營養物質轉化成Y-聚穀氨酸，同時，Y-聚穀氨酸枯草芽孢桿菌的夾膜的一部分附著在菌體上，成為含有少量的Y-聚穀氨酸和其產生菌的物料，這些物料中的？聚穀氨酸可以通過土壤微生物的作用緩慢降解釋放碳、氮素營養，就可以克服以上直接添加胺基酸廢液會造成氮素營養損失的缺點，同時產生的Y-聚穀氨酸由於是一種有網狀碳骨架結構的高分子，還有一定的保水、吸水能力，因而可以作為肥料添加劑應用在農業上，從而作出本發明。因此，本發明的目的是提出一種利用枯草芽孢桿菌(fiflci""sPGA-7菌株對包括胺基酸有機廢水等工農業廢料進行固體發酵以生產含Y-聚穀氨酸的肥料添加劑的方法。實現本發明的技術方案如下採用的微生物菌株是經選育的Y-聚穀氨酸(Y-PGA)產生菌--枯草芽孢桿菌(5。a7/^rato'fe)PGA-7，該菌株於2006年9月30日保藏於屮國典型培養物保藏中心(CCTCC)，編號為CCTCCM206102。該菌株以下簡稱枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102。中國典型培養物保藏中心的聯繫資料如下電話027-87682319傳真(027)87883833E-mail:[email protected]地址武漢武漢大學郵編430072。該菌株的菌學特性和保藏情況均己記載於CN1932007之中。本發明所提供的含Y-聚穀氨酸的肥料添加劑的生產方法，其特點是用枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102做發酵菌株，以胺基酸發酵廢液、豆粕、花生餅粉、麩皮、稻草粉等為主要發酵基料進行固體發酵。具體工藝過程如下(1)斜面菌種活化將培養好的保藏斜面種(枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102)劃線於新配製的LB斜面上，LB斜面組成如下蛋白腖812g，酵母膏38g，NaCl9llg，瓊脂1522g,自來水1L，調pH值至6.87.4，33-38°C培養1224小時，再冷藏於4'C15天。(2)菌種的液休活化將上述斜面上約1on2面積的菌種刮下，接種於液體活化培養基中，液體活化培養基組成如下蛋白腖812g，酵母膏38g，NaCl911g，自來水1L，調pH值至6.87.4.。液體活化培養基裝於250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml,於32-36'C往復式搖床振蕩培養1836小時，搖床轉速為80-110r/m，衝程為65-75mm。(3)固體發酵按0.5-1.5%接種量，取(2)中活化好的液體菌種，接入固體發酵培養基中，固體發酵培養基組成按每公斤固體發酵培養基所含克重g/kg計算為8(M20g胺基酸發酵廢液、70-110g豆粕、60-100g麩皮、300-400g稻草粉、20-40g葡萄糖或蔗糖，其餘成分為水，將水均勻噴曬入上述物體中，攪拌均勻，117-12rC滅菌30分鐘，冷卻至32-4(TC，按三角錐形堆放於已滅菌的恆溫環境中，於32-40'C，培養120-168h，停止發酵，發酵完畢的固體物料即為含聚穀氨酸的肥料添加劑。發酵完畢的固體物料即含有Y-聚穀氨酸成分和枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102菌體，不必再進行任何提取等後工序，可以直接作為有機肥料的添加劑。通過此方法發酵完畢後所得的固體物料中，固體發酵培養基的Y-PGA含量為0.080.26g/kg固體料，枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102活菌體數為1.0X107cfu/g固體料-1.0X10scfu/g固體料。所述的固體發酵培養基中的胺基酸發酵廢液可以是味精發酵廢液或蘇氨酸發酵廢液，其中，味精發酵廢液的主要化學成分如下味精發酵廢液(％，w/v):總氮7.02~7.81%，有效磷0.28~0.36%,總鉀0.34~0.40%，有機質7.63~8.03%，水分36~40%，pH值5.56.0。蘇氨酸發酵廢液(％，w/v):總氮6.90~7.15°/。，有效磷0.17~0.21%，有機質9.55~9.95%,水分4450%，pH值5.56.5。固體發酵培養基中的豆粕是大豆經過提取豆油後得到的一種副產品，其主要化學成分如下(％，W/W):蛋白質40%48%，賴氨酸2.5%3.0%，色氨酸O.6%0.7%，蛋氨酸O.5%0.7%。固體發酵培養基中的麩皮是小麥提取麵粉後的副產品，麩皮為小麥的外皮，包含胚芽及胚乳兩部分，約佔整粒小麥的12.5%。其主要化學成分如下(％，w/w):碳水化合物59.463.4%，粗蛋白質13.517.0%，粗脂肪3.04.75%，粗纖維9.512.0%，粗灰分5.07.0%，鈣0.050.14%，磷l.101.50%，水分1115.0%。稻草粉是普通農業上收割水稻後廢棄的稻草打碎後的廢渣粉，其主要化學成分如下(％，粗蛋白質4.184.38%,粗脂肪2.172.37%，粗纖維36.5540.05%，粗灰分13,8014.20%，釣0.450.49%，磷O.180.20%，水分3541%。發酵完畢的固體物料可通過以下方法分析測試Y-PGA含量取發酵完畢的固體物料50g按l:1(w:w)比例加入清水50mL，充分攪拌均勻後，4000r/m離心30min，取離心後的上清液，先計算好總體積，再計算好測穀氨酸單體的含量；將上清液與6mol/L的鹽酸按l:l(體積比)加入玻璃水解管中，真空封口後於IIO。C水解24h，然後測定水解液中穀氨酸總量；2次測得的穀氨酸之差為離心後上清液的Y-PGA的含量，再折算成發酵完畢的固體物料的的Y-PGA的含量。上述對穀氨酸的分析方法可以採用胺基酸自動分析儀，或高效液相色譜儀(HPLC)，或紙層析方法進行測定。紙層析方法如下取IOPI離心發酵上清液或它的水解液點樣，層析過夜，用0.5%茚三酮丙酮溶液顯色，65'C顯色10min，剪下斑點用lg/L硫酸銅洗脫液(CuS(X'5&0:75%乙醇=2:38)5mL浸泡20min以上至紙條無色，A隨x二570nm測其OD值，與穀氨酸標準曲線比較算出相應含量，再計算發酵醪液含Y-PGA量。發酵完畢的固體物料中枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102活菌體數可按NY/T798-2004中5.3.2規定的方法進行測定，即中華人民共和國農業行業標準——複合微生物肥料(NY/T798-2004)中5.3.2(有效活菌數的測定)規定的方法進行測定。本發明在最佳固體發酵工藝條件下，產Y-PGA最高可達0.26g/L，枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102活菌體數最高含量為1.0X10Vfu/g固體料。同時，肥料添加劑還含有其它成分(%):有機質42-46，全N1-7，全P0.2-2，總Ca1-5，總MgO.1-0.7，其餘為水。本發明最大的特點在於用枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102做發酵菌株，以工農業廢棄物包括味精發酵廢液、蘇氨酸發酵廢液、豆粕、花生餅粉、麩皮、稻草粉等為主要發酵基料進行固體發酵，將上述物料中的銨離子等營養物質轉化成Y-聚穀氨酸，發酵成本極低，工藝非常簡單，發酵產物不需再分離提取。發酵完畢的固體物料由於含有少量的Y-聚穀氨酸和其產生菌，既能提高肥料的氮素營養利用率，對所施用的植物又有一定的保水作用，能減少植物生長所需的用水量，特別適合作為肥料功能添加劑。本發明為味精發酵廢液、蘇氨酸發酵廢液、豆粕、花生餅粉、麩皮、稻草粉等工農業廢料的綜合利用提供新的途徑，還為工農業廢物料如味精發酵廢液、蘇氨酸發酵廢液等高濃度有機廢水的處理找出另一出路，起到變廢為寶、資源化利用的目的。具體實施例方式下面的實施例對本發明作詳細說明，但對本發明沒有限制。下面的實施例中用到的斜面種採用如下方法培養枯草芽孢桿菌(5fl"7/M仰to'fc)PGA-7CCTCCM206102劃線於新配製的LB斜面上，LB斜面組成如下蛋白腖10g，酵母膏5g，NaCl10g，瓊脂20g，自來水1L，調pH值至7.2.。337°C培養17小時，再冷藏於4'C冰箱備用。實施例一取4"C冰箱內保藏1天的斜面種[保藏斜面培養基的組成蛋白腖10g，NaC110g，酵母膏5g，瓊脂18g，自來水1L，pH7.O]，用接種針將上述斜面上約1cm2面積的菌種刮下，接種於液體活化培養基中，液體活化培養基組成如下蛋白腖8g，酵母膏3g，NaCl9g，自來水1L，調pH值至6.8.。液體活化培養基裝於250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20mL,於32。C往復式搖床振蕩培養20小時，搖床轉速為80r/m，衝程為65mm,培養結束後，即為液體活化種。取5mL上述液體活化種，均勻噴曬接種於己滅菌的1000g固體發酵培養基上，固體發酵培養基的組成(g/kg)如下80g味精發酵廢液、70g豆粕、60g麩皮、300g稻草粉、20g葡萄糖，其餘成分為水。冷卻至。固體發酵培養基呈三角錐形，放置於32'C的恆溫室中培養120h，發酵結朿，立即測定固體發酵成熟料的Y-PGA含量為0.08g/kg固體料，枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102活菌體數最高含量為1.8X107cfu/g固體料。實施例二取4'C冰箱內保藏1天的斜面種[保藏斜面培養基的組成蛋白腖8g，NaCl10g，酵母膏6g，瓊脂20g，自來水1L，pH7.2]，用接種針將上述斜面上約1cm2面積的菌種刮下，接種於液體活化培養基中，液體活化培養基組成如下蛋白腖10g，酵母膏8g,NaCl9g，自來水1L，調pH值至7.2.。液體活化培養基裝於250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20mL，於34'C往復式搖床振蕩培養26小時，搖床轉速為90r/m，衝程為70mm,培養結束後，即為液體活化種。取8mL上述液體活化種，均勻噴曬接種於已滅菌的1000g固體發酵培養基上，固體發酵培養基的組成(g/kg)如下100g蘇氨酸發酵廢液、70g豆粕、卯g麩皮、350g稻草粉、30g蔗糖，其餘成分為水。冷卻至。固體發酵培養基呈三角錐形，放置於36。C的恆溫室中培養MOh，發酵結束，立即測定固體發酵成熟料的Y-PGA含量為0.16g/kg固體料，枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102活菌體數最高含量為1.5X108cfu/g固體料。實施例三取4'C冰箱內保藏1天的斜面種[保藏斜面培養基的組成蛋白腖8g,NaClllg，酵母膏8g，瓊脂22g，自來水1L，pH7.0。]，用接種針將上述斜面上約lcm2面積的菌種刮下，接種於液體活化培養基中，液體活化培養基組成如下蛋白腖10g，酵母膏8g，NaC110g，自來水1L，調pH值至7.4.。液體活化培養基裝於250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20mL，於32'C往復式搖床振蕩培養30小時，搖床轉速為100r/m，衝程為72mm，培養結束後，即為液體活化種。取12mL上述液體活化種，均勻噴曬接種於己滅菌的1000g固體發酵培養基上，固體發酵培養基的組成(g/kg)如下110g味精發酵廢液、100g豆粕、80g麩皮、350g稻草粉、30g葡萄糖，其餘成分為水。冷卻至。固體發酵培養基呈三角錐形，放置於36。C的恆溫室中培養150h，發酵結束，立即測定固體發酵成熟料的Y-PGA含量為0.20g/kg固體料，枯草芽孢桿菌CCTCCM206102活菌體數最高含量為7.OX108Cfu/g固體料。實施例四取4'C冰箱內保藏1天的斜面種[保藏斜面培養基的組成蛋白腖12g，NaClllg，酵母膏8g，瓊脂21g，自來水1L，pH7.0]，用接種針將上述斜面上約1cm2面積的菌種刮下，接種於液體活化培養基中，液體活化培養基組成如下蛋白腖12g,酵母膏8g,NaClllg，自來水1L，調pH值至7.0.。液體活化培養基裝於250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20mL，於36'C往復式搖床振蕩培養36小時，搖床轉速為110r/m，衝程為75mm,培養結束後，即為液體活化種。取15mL上述液體活化種，均勻噴曬接種於己滅菌的1000g固體發酵培養基上，固體發酵培養基的組成(g/kg)如下120g味精發酵廢液、110g豆粕、100g麩皮、400g稻草粉、40g葡萄糖，其餘成分為水。冷卻至。固體發酵培養基呈三角錐形，放置於40。C的恆溫室中培養168h，發酵結束，立即測定固體發酵成熟料的Y-PGA含量為0.26g/kg固體料，枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102活菌體數最高含量為1.0X109cfu/g固體料。將上述製備完畢的肥料添加劑按5-10%(w/W)的添加量添加肥料廠的有機肥中，進行農業施肥的實施效果試驗實施效果試驗設2個處理，每個處理3次重複。處理一將上述製備完畢的肥料添加劑按10%添加量添加到廣州某肥料廠的有機肥中，該有機肥的主要成分為(%w/w):全N,1.42,P205，2.02，K20，0.83，有機質，26.94，總Ca，4.43，總Mg0.63，其餘為水。畝施100公斤上述加有肥料添加劑的有機肥作基肥，另100公斤作追肥；處理二畝施100公斤沒有加有肥料添加劑的有機肥作基肥，另100公斤作追肥，以此與處理一作比較。試驗品種為夏陽白菜，2007年8月30日播種，9月15日移植。10月28日收穫。施肥時間及施肥量處理一，9月15日畝施100公斤加有肥料添加劑的有機肥作機肥，9月23日畝100公斤加有肥料添加劑的有機肥作追肥；處理二、，9月15日畝施100公斤的沒有加有肥料添加劑的有機肥作機肥，9月23日畝100公斤沒有加有肥料添加劑的有機肥作追肥。另外處理-、二在9月20日，畝施回青肥尿素5公斤，鉀肥5公斤。施用加有本肥料添加劑的有機肥對白菜主要農藝性狀和產量的影響的結果如下表(表1)所示表ltableseeoriginaldocumentpage9結論A、白菜施用加有肥料添加劑的有機肥，能增加植株的高度，增大葉片的長度和寬度，結球堅實，提高品質，口感好，含糖量較高。B、白菜施用加有肥料添加劑的有機肥有較好的增產效果，比滅活的生物有機肥增產14.4%，增產達極顯著水平。權利要求1.一種含γ-聚穀氨酸的肥料添加劑的生產方法，其特徵在於利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)PGA-7CCTCCM206102作為發酵菌株，在發酵培養基進行固體發酵，其工藝過程如下(1)斜面菌種活化將培養好的保藏斜面種(枯草芽孢桿菌PGA-7CCTCCM206102)劃線於新配製的LB斜面上，LB斜面組成如下蛋白腖8～12g，酵母膏3～8g，NaCl9～11g，瓊脂15～22g，自來水1L，調pH值至6.8～7.4.。33-38℃培養12～24小時，再冷藏於4℃1～5天；(2)菌種的液體活化將上述斜面上約1cm2面積的菌種刮下，接種於液體活化培養基中，液體活化培養基組成如下蛋白腖8～12g，酵母膏3～8g，NaCl9～11g，自來水1L，調pH值至6.8～7.4，液體活化培養基裝於250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，於32-36℃往復式搖床振蕩培養18～36小時，搖床轉速為80-110r/m，衝程為65-75mm；(3)固體發酵按0.5-1.5％接種量，取步驟(2)中活化好的液體菌種，接入固體發酵培養基中，固體發酵培養基組成按每公斤固體發酵培養基所含克重g/kg計算為80-120g胺基酸發酵廢液、70-110g豆粕、60-100g麩皮、300-400g稻草粉、20-40g葡萄糖或蔗糖，其餘成分為水，將水均勻噴曬入上述物體中，攪拌均勻，117-121℃滅菌30分鐘，冷卻至32-40℃，按三角錐形堆放於已滅菌的恆溫環境中，於32-40℃，培養120-168h，停止發酵，發酵完畢的固體物料即為含聚穀氨酸的肥料添加劑。2.根據要得要求l所述的含Y-聚穀氨酸的肥料添加劑的生產方法，其特徵在於所述的固體發酵培養基中的胺基酸發酵廢液為味精發酵廢液或蘇氨酸發酵廢液。全文摘要本發明提供一種含γ-聚穀氨酸的肥料添加劑的生產方法。本方法用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)PGA-7CCTCCM206102做發酵菌株，以胺基酸發酵廢液、豆粕、花生餅粉、麩皮、稻草粉等為主要發酵基料進行固體發酵。其工藝過程包括斜面菌種活化、菌種的液體活化和固體發酵。發酵完畢的固體物料含有少量的γ-聚穀氨酸和其產生菌，既能提高肥料的氮素營養利用率，對所施用的植物又有一定的保水作用，能減少植物生長所需的用水量，特別適合作為肥料功能添加劑。文檔編號C05F5/00GK101417894SQ200810027318公開日2009年4月29日申請日期2008年4月9日優先權日2008年4月9日發明者靜馮,施慶珊,李誠斌,歐陽友生,疏秀林,謝小保,穗陳,陳儀本申請人:廣東省微生物研究所