一種與臨床原因不明的noa輔助診斷相關的低頻snv標誌物及其應用的製作方法
2023-05-16 00:55:06
一種與臨床原因不明的noa輔助診斷相關的低頻snv標誌物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於基因工程及生殖醫學領域，公開了一種與臨床原因不明的NOA輔助診斷相關的低頻SNV標誌物及其應用。該標誌物為rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、rs3130785、rs117524265、rs9369640、rs34902660、rs2298090、rs13194053、rs11965377、rs3893259、rs9261588、rs1264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221等32個低頻SNV的組合。該標誌物可用於製備臨床原因不明的非梗阻性無精子症輔助診斷試劑盒。
【專利說明】-種與臨床原因不明的NOA輔助診斷相關的低頻SNV標誌 物及其應用 發明領域
[0001] 本發明屬於基因工程及生殖醫學領域，涉及一種與臨床原因不明的NOA輔助診斷 相關的低頻SNV標誌物及其應用。
【背景技術】
[0002] 生育是一個複雜的過程，不能由單獨的個體完成，而是取決於男女雙方，只有在雙 方各種條件均適宜的情況下，才能順利完成。WHO的統計數據顯示，不孕不育已經成為人類 生殖健康領域最為常見的疾病之一，大約每七對夫婦中就有一對存在著各種程度的生育障 礙，其中有近一半是由於男性問題所致，由此被稱為男性不育。男性不育給個人、家庭造成 了沉重的精神及經濟負擔，成為家庭及社會的不穩定因素之一。
[0003] 在所有導致男性不育病因中，無精子症最為常見，流行病學數據表明，成年男性無 精子症患病率將近1 %。無精子症是指患者三次正常排精後，精液中沒有精子。它可分為梗 阻性和非梗阻性無精子症。梗阻性無精子症【obstructive azoospermia(OA)】是因輸精管 道梗阻而導致精液中沒有精子，非梗阻性無精子症【non-obstructive azoospermia (NOA)】 是由於男性睪丸生精障礙所致，後者的精子數量和形態均較差，所有的睪丸精子活動能力 都很低，或者沒有活動能力，其危害程度遠大於0A。引起NOA的原因很多，包括遺傳學疾病 (如Klinefelter症候群）、先天性睪丸異常、睪丸本身病變（如睪丸外傷，炎症，扭轉及睪 丸血管病變）、內分泌疾病（如垂體功能亢進或低下、垂體腫瘤、腎上腺功能亢進或低下、甲 亢或甲減等）、嚴重全身性疾病和營養不良，以及放射性損傷及藥物等。值得注意的是，相當 數量的NOA臨床原因不明，其早期診斷和治療就顯得更為困難。在我國，約有25%的男性不 育患者是Ν0Α，因此，Ν0Α，尤其是臨床原因不明的Ν0Α，不僅是我國成年男性生殖健康面臨 的最主要威脅之一，也是男性不育治療的一個嚴峻問題。
[0004] 目前，NOA的初步診斷方法主要為病史詢問、體格檢查、精液參數、精漿生化、血性 激素檢測、B超以及染色體檢測等。世界衛生組織在男性不育的診斷檢查及處理手冊指明 ： 無精子症是指精子密度等於0,即使將精液離心後檢查亦不能發現精子。臨床上通常3次 離心鏡檢精液仍未見到精子，同時，排除不射精和逆行射精後方可確診為無精子症病人。常 規的精子密度分析目前主要依靠精子密度判別（人工計數或利用計算機輔助系統分析，即 CASA)，尚無其他有效手段，但其自身存在一定的缺陷，如個體精液質量波動較大，尤其易受 到禁慾天數、溫度、採集精液方法等因素的影響，從而造成精子密度測量不準確，對相應疾 病的早期診斷效果也遠不能滿足需要。而明確診斷常需進行睪丸穿刺活檢，這給尋求生育 幫助的人群帶來極大的痛苦。儘管目前國內外研究者正努力探索新的NOA診斷生物標誌 物，對現有評估手段進行有效的補充，但一直難以突破傳統生物標誌物發展在男性生殖實 際應用中的瓶頸，即有創穿刺活檢、精液質量分析結果波動、以及早期診斷困難等。此外，由 於病因不明，缺乏有效的治療手段，大多數NOA病人只能選擇ICSI或AID等輔助生育手段， 不僅無法滿足心理上的需求，還有可能出現後代的遺傳缺陷。
[0005] 研究表明，遺傳因素約佔男性不育因素的15% -30%，是男性不育的主要病因，單 核苷酸變異（single nucleotide variant, SNV)在其中起重要作用。SNV是指在基因組水 平上由單個核苷酸的變異一A，T，C或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在 內的物種之間染色體基因組的多樣性，是人類可遺傳變異中最常見的一種。SNV的存在被認 為賦予了個體不同的表型性狀，以及對於環境暴露、藥物治療等因素的不同反應性。SNV包 括常見遺傳變異（common variants)和低頻遺傳變異（rare variants),前者最小等位基因 頻率> 5%，為低外顯率突變，而後者的最小等位基因頻率< 5%，為高度外顯率突變。研究 發現，人類基因組中低頻遺傳變異的數目遠超過常見遺傳變異，並且，低頻遺傳變異能解釋 常見複雜疾病中相當大一部分的遺傳貢獻。因此低頻高外顯性遺傳標誌物可能是導致個體 對常見疾病發病和預後易感性差異的重要遺傳基礎。利用疾病易感的低頻SNV譜診斷疾病 的發生，靈敏、準確和快速，具有廣闊的應用前景。近年來，利用低頻高外顯性遺傳標誌物診 斷疾病的發生發展已經成為臨床和科研工作者的研究熱點，在腫瘤和心血管疾病等常見重 大疾病的應用價值已初見端倪。
[0006] 然而，目前還沒有將低頻高外顯性遺傳標誌物應用於臨床原因不明的NOA診斷的 報導，若能篩選出臨床原因不明的NOA易感的低頻SNV作為生物標誌物，並研製相應的診斷 試劑盒，對我國臨床原因不明的NOA的診斷現狀必將是一次有力的推動，也為其藥物篩選、 藥效評價及靶向治療開闢了新的途徑。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是針對上述技術問題，提出一種與臨床原因不明的NOA輔助診斷相 關的低頻高外顯性遺傳標誌物及其應用
[0008] 本發明的第二個目的是提供上述低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性擴增引物。
[0009] 本發明的第三個目的是提供上述低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性延伸引物。
[0010] 本發明的第四個目的是提供上述低頻高外顯性遺傳標誌物及其特異性擴增引物 和特異性延伸引物在製備臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒中的應用。
[0011] 本發明的第五個目的是提供臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒。
[0012] 發明人通過分離和研究臨床原因不明的NOA患者及其年齡匹配的健康男性對照 外周血DNA中的低頻高外顯性遺傳標誌物，尋找一組與臨床原因不明的NOA高度相關的 特異性和敏感性的遺傳標誌物，並研製出可便於臨床應用的原因不明的NOA輔助診斷試劑 盒，為臨床原因不明的NOA的篩查和診斷提供數據支持，為發現具有潛在治療價值的新型 小分子藥物提供數據支持。
[0013] 本發明的目的是通過下列技術方案實現的：
[0014] 一種與臨床原因不明的非梗阻性無精子症輔助診斷相關的低頻高外顯性遺傳標 志物，其特徵在於該標誌物為 rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、 rs3130785、rsll7524265、rs9369640、rs34902660、rs2298090、rsl3194053、rsll965377、 rs3893259、rs9261588、rsl264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221、rs3135374、 rs3892710、rs9471969、rs76491994、rsll3857788、rs61756355、rsl80810179、rsl0830430、 rs34719836、rsl87646949、rsl51176313、rs28599881、rsl49543099 和 rsl99747280 的組 合。
[0015] 所述的低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性擴增引物，這些引物為：
[0016] rs2294228 的擴增引物序列為 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 ;rs2180233 的擴增引 物序列為SEQIDNo:4和SEQIDNo:5;rs41360247 的擴增引物序列為SEQIDNo:7和SEQ ID No:8;rs895497 的擴增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:ll ;rs6806528 的擴增引 物序列為SEQ ID No: 13和SEQ ID No: 14 ;rs3130785的擴增引物序列為SEQ ID No: 16和 SEQ ID No:17;rsll7524265 的擴增引物序列為 SEQ ID No:19和SEQ ID No:20;rs9369640 的擴增引物序列為SEQ ID No:22和SEQ ID No:23;rs34902660的擴增引物序列為SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ;rs2298090 的擴增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29; rsl3194053的擴增引物序列為SEQ ID No:31和SEQ ID No:32;rsll965377的擴增引物序 列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35 ;rs3893259 的擴增引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38;rs9261588 的擴增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41;rsl264429 的擴 增引物序列為SEQ ID No:43和SEQ ID No:44;rs2523480的擴增引物序列為SEQ ID No:46 和SEQ ID No:47;rs2524276 的擴增引物序列為 SEQ ID No:49和 SEQ ID No:50;rs2255221 的擴增引物序列為SEQ ID No:52和SEQ ID No:53;rs3135374的擴增引物序列為SEQ ID No:55 和 SEQ ID No:56;rs3892710 的擴增引物序列為 SEQ ID No:58 和 SEQ ID No:59; rs9471969的擴增引物序列為SEQ ID No:61和SEQ ID No:62;rs76491994的擴增引物序列 為 SEQ ID No:64 和 SEQ ID No:65;rsll3857788 的擴增引物序列為 SEQ ID No:67 和 SEQ ID No:68;rs61756355 的擴增引物序列為 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71 ;rsl80810179 的 擴增引物序列為SEQ ID No:73和SEQ ID No:74;rsl0830430的擴增引物序列為SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ;rs34719836 的擴增引物序列為 SEQ ID No:79 和 SEQ ID No:80; rsl87646949 的擴增引物序列為 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83;rsl51176313 的擴增引物 序列為 SEQ ID No:85和 SEQ ID No:86;rs28599881 的擴增引物序列為 SEQ ID No:88和 SEQ ID No:89;rsl49543099 的擴增引物序列為 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92;rsl99747280 的擴增引物序列為SEQ ID No:94和SEQ ID No:95。
[0017] 所述的低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性延伸引物，這些引物為：
[0018] rs2294228的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ;rs2180233的延伸引物序列為SEQ ID No:6;rs41360247的延伸引物序列為SEQ ID No:9;rs895497的延伸引物序列為SEQ ID No: 12 ;rs6806528的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ;rs3130785的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ;rsll7524265的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ;rs9369640的延伸引物序列為SEQ ID No:24;rs34902660的延伸引物序列為SEQ ID No:27;rs2298090的延伸引物序列為SEQ ID No:30;rsl3194053的延伸引物序列為SEQ ID No:33;rsll965377的延伸引物序列為 SEQ ID No:36;rs3893259的延伸引物序列為SEQ ID No:39;rs9261588的延伸引物序列為 SEQ ID No:42;rsl264429的延伸引物序列為SEQ ID No:45;rs2523480的延伸引物序列為 SEQ ID No:48;rs2524276的延伸引物序列為SEQ ID No:51;rs2255221的延伸引物序列為 SEQ ID No:54;rs3135374的延伸引物序列為SEQ ID No:57;rs3892710的延伸引物序列為 SEQ ID No:60 ;rs9471969 的延伸引物序列為 SEQ ID No:63 ;
[0019] rs76491994的延伸引物序列為SEQ ID No:66 ;rsll3857788的延伸引物序列為 SEQ ID No:69;rs61756355 的延伸引物序列為 SEQ ID No:72;rsl80810179 的延伸引物序 列為SEQ ID No:75;rsl0830430的延伸引物序列為SEQ ID No:78;rs34719836的延伸引物 序列為 SEQ ID No:81 ;rsl87646949 的延伸引物序列為 SEQ ID No:84;rsl51176313 的延伸 引物序列為 SEQ ID No:87 ;rs28599881 的延伸引物序列為 SEQ ID No:90 ;rsl49543099 的 延伸引物序列為SEQ ID No:93;rsl99747280的延伸引物序列為SEQ ID No:96。
[0020] 所述的低頻高外顯性遺傳標誌物在製備臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒中 的應用。
[0021] 所述的低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性擴增引物在製備臨床原因不明的NOA 輔助診斷試劑盒中的應用。
[0022] 所述的低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性延伸引物在製備臨床原因不明的NOA 輔助診斷試劑盒中的應用。
[0023] -種臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒，該試劑盒用於檢測外周血DNA中 rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、rs3130785、rsll7524265、 rs9369640、rs34902660、rs2298090、rsl3194053、rsll965377、rs3893259、rs9261588、 rsl264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221、rs3135374、rs3892710、rs9471969、 rs76491994、 rsll3857788、 rs61756355、 rsl80810179、 rsl0830430、 rs34719836、 rsl87646949、rsl51176313、rs28599881、rsl49543099 和 rsl99747280。
[0024] 所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性擴增引 物和/或特異性延伸引物。
[0025] 所述的診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應常用的酶和試劑，如Taq酶、 dNTP混合液、Mgcl2溶液、去離子水等；還可以含有標準品和/或對照品。
[0026] 具體地說，本發明解決問題的技術方案包括：（1)建立統一標準的標本庫和數據 庫：以標準操作程序（SOP)採集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料和臨床 資料。⑵基因型檢測：選擇臨床原因不明的NOA病例、與臨床原因不明的NOA病例年齡匹 配的健康男性對照，利用高密度低頻高外顯性遺傳標誌物晶片，在全外顯子範圍內找出與 臨床原因不明的NOA相關的遺傳標誌物。（3)對篩選出的陽性關聯遺傳標誌物，進一步採用 Sequenom MassARRAY基因分型平臺進行檢測，以驗證將其應用於診斷的可重複性。（4)臨 床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒的研製：根據臨床原因不明的NOA病例和健康男性對照 中基因型分布頻率又顯著差異的遺傳標誌物開發輔助診斷試劑盒。
[0027] 本發明人以標準操作程序（SOP)採集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人 口 學資料、臨床資料等，並米用了 Illumina Infinium? Human Exome Beadchip (Illumina Inc.，San Diego, CA)晶片進行全外顯子區掃描，初篩陽性位點米用Sequenom MassARRAY時 間飛行質譜生物晶片系統進行驗證。
[0028] 具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾部分：
[0029] 1.研究樣本的選擇
[0030] (1)重複精液質量檢測/辜丸穿刺活檢，確診為無精子症；
[0031] (2) -次射精精液經離心無精子，排除梗阻性病因；
[0032] (3)性功能正常；排除具體隱睪症病史、血液外傷史、睪丸炎、輸精管梗阻、輸精管 切除術、多染色體異常及Y染色體無精子症因子微缺失等具有已知病因的患者；
[0033] (4)與病例年齡匹配的健康男性對照。
[0034] 本研究共採用5560例符合標準的樣本進行研究。（960+1800+1400+1400)
[0035] 2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規方法操作。通常能得到20-50ng/ul DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在1. 6-2. 0。
[0036] 3. Illumina Infinium? Human Exome Beadchip (Illumina Inc.，San Diego, CA)芯 片檢測
[0037] (1)取受試者DNA樣本；
[0038] (2)在 Illumina lnfiniumIC Human Exome Beadchip (IIlumina Inc. , San Diego, CA)晶片上進行全外顯子區掃描；
[0039] (3)檢測並比較各基因型在臨床原因不明的NOA病例與健康男性對照中的分布差
[0040] 4.低頻高外顯率遺傳標誌物的Sequenom MassARRAY基因分型檢測
[0041] (1)取受試者全基因組DNA樣本；
[0042] (2)設計低頻高外顯率遺傳標誌物的特異性擴增引物和特異性延伸引物；
[0043] (3)進行PCR擴增反應及產物純化；
[0044] (4)進行單鹼基延伸反應及產物純化；
[0045] (5)檢測並比較臨床原因不明的NOA病例與健康男性對照中不同基因分型的分布 差異。
[0046] 5.診斷試劑盒製備方法
[0047] Illumina Infinium? Human Exome Beadchip (I I lumina Inc. , San Diego, CA)芯 片進行全外顯子區掃描和低頻高外顯率遺傳標誌物Sequenom MassARRAY基因分型平臺 進行驗證後確認臨床原因不明的NOA病例與健康男性對照中基因型分布頻率有顯著差異 的遺傳標誌物，作為臨床原因不明的NOA診斷的指標。最後篩選出的與臨床原因不明的 NOA發病有關的低頻高外顯率遺傳標誌物組成輔助診斷試劑盒（rs2294228、rs2180233、 rs41360247、rs895497、rs6806528、rs3130785、rsll7524265、rs9369640、rs34902660、 rs2298090、 rsl3194053、 rsll965377、 rs3893259、 rs9261588、 rsl264429、 rs2523480、 rs2524276、rs2255221、rs3135374、rs3892710、rs9471969、rs76491994、rsll3857788、 rs61756355、 rsl80810179、 rsl0830430、 rs34719836、 rsl87646949、 rsl51176313、 rs28599881、rs 149543099和rs 199747280)。診斷試劑可以包括這些低頻標誌物的特異性 擴增引物和/或特異性延伸引物，以及Taq酶、dNTP等試劑。
[0048] 6.統計分析方法
[0049] 運用X 2檢驗（用於分類變量）或者student t檢驗（用於連續性變量）比較人 口學特徵等在研究對象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進行關 聯分析。計算比值比（Odds Ratio, 0R)以及它們的95%可信區間。定義那些OR小於1的 標誌物為保護性位點；定義那些OR大於1的標誌物為危險性位點。
[0050] 為了進一步研究這32個低頻高外顯率遺傳標誌物構成的綜合指徵用於早期診斷 的效果，我們構建了一個數學公式，綜合考慮每個低頻高外顯率遺傳標誌物與臨床原因不 明的NOA發病的正、負關聯情況和聯繫強度。具體來說，我們對每個低頻標誌物的三種基因 型進行評分，野生純合型=，以單個低頻SNV分析時的 additive模型下的回歸係數為權重，綜合考慮每個低頻高外顯率遺傳標誌物的情況給每個 研究對象確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下；危險分值=(0.48Xrs2294228 的評分）+ (1. 62Xrs2180233 的評分）+ (0· 81 Xrs41360247 的評分）+ (1. 25Xrs895497 的評分）+ (1. 49Xrs6806528 的評分）+ (0· 57Xrs3130785) + (0. 48Xrsl 17524265 的評 分）+ (0· 63Xrs9369640 的評分）+ (1. 06Xrs34902660 的評分）+ (1. 37Xrs2298090 的評 分）+ (0· 56Xrsl3194053 的評分）+ (0· 69Xrsll965377 的評分）+ (0· 77Xrs3893259 的評 分）+ (0· 78Xrs9261588 的評分）+ (0· 56Xrs 1264429 的評分）+ (0· 86Xrs2523480 的評 分）+ (L 26Xrs2524276 的評分）+ (L 12Xrs2255221 的評分）+ (0· 44Xrs3135374 的評 分）+ (0· 68Xrs3892710 的評分）+ (0· 58Xrs9471969 的評分）+ (0· 47Xrs76491994 的評 分）+ (2. 17Xrsl 13857788 的評分）+ (0· 49Xrs61756355 的評分）+ (2. 09Xrsl80810179 的 評分）+ (1. 34 X rsl0830430 的評分）+ (0· 78 X rs34719836 的評分）+ (1. 47 X rsl87646949 的 評分）+ (1. 〇3Xrsl51176313 的評分）+ (0· 98Xrs28599881 的評分）+ (L llXrsl49543099 的評分）+ (1. 25Xrsl99747280的評分），獲得的危險分值係數以及界限值被直接應用於 使用外顯子晶片進行全外顯子區掃描的2760例樣本中。（以rs2294228為例：0. 48為 rs2294228的回歸係數（見表I)，變，某個SNV的基因型由儀器檢測結果確定；某個樣本的總評分是這些個SNV 分別評分的總和，單個SNV的基因型只是計算評分的一個中間過程，不需要知道具體基因 型。）
[0051] 統計學分析均通過專門的統計學分析軟體完成（PLINK1. 07)。統計學顯著性水平 P值設為〇. 05,所以統計學檢驗均為雙側檢驗。
[0052] 以下是本發明進一步的說明：
[0053] 在上述960例符合條件的臨床原因不明的NOA病例及1800例健康男性對 照中，兩組年齡均均衡可比。我們將這兩組人群經11 lumina InHiiium? Human Exome Beadchip (Illumina Inc.，San Diego, CA)晶片進行全外顯子區掃描獲得相關結果。
[0054] 根據 Illumina InHnium? Human Exome Beadchip (Illumina Inc. , San Diego, CA) 檢測，本發明人檢測到在"臨床原因不明的NOA病例"組和"健康男性對照"組中基因型 分布頻率存在差異的遺傳標誌物包括：rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、 rs6806528、rs3130785、rsll7524265、rs9369640、rs34902660、rs2298090、rsl3194053、 rsll965377、rs3893259、rs9261588、rsl264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221、 rs3135374、rs3892710、rs9471969、rs76491994、rsll3857788、rs61756355、rsl80810179、 rsl0830430、 rs34719836、 rsl87646949、 rsl51176313、 rs28599881、 rsl49543099 和 rsl99747280〇
[0055] 根據上述檢測結果，我們將這32個與臨床原因不明的NOA發病相關的低頻遺傳標 志物在另外1400例臨床原因不明的NOA病例及與其年齡匹配的1400例健康男性對照中進 行了單個低頻遺傳標誌物的檢測，結果與晶片檢測一致。
[0056] 單因素和多因素 logistic回歸分析結果均表明，這32個低頻遺傳標誌物與臨床 原因不明的NOA的發病存在著顯著關聯，28個低頻遺傳標誌物為危險因素，4個為保護因 素，變異等位基因可增加或減少臨床原因不明的NOA發病風險。
[0057] 進一步分析這32個低頻遺傳標誌物的組合用於臨床原因不明的NOA診斷的效果， 發現其組合能夠很好的區分病例與對照。
[0058] 根據上述實驗結果，本發明人製備了一種能用於臨床原因不明的NOA輔助診斷的 試劑盒，包含測定受試者血標本DNA中上述低頻遺傳標誌物的特異性引物、特異性螢光探 針對和其他檢測試劑。
[0059] 具體而言，這32個低頻遺傳標誌物的組合，或者這32個低頻遺傳標誌物的特異性 引物及特異性螢光探針對的組合構成的相關診斷試劑盒有助於臨床原因不明的NOA的輔 助診斷，為臨床醫生快速準確掌握患者的疾病狀態和病情嚴重程度，及時採取更具個性化 的防治方案提供支持。
[0060] 本發明有益效果：
[0061] 本發明提供的低頻遺傳標誌物作為臨床原因不明的NOA輔助診斷判斷的標誌物 的優越性在於：
[0062] (1)低頻高外顯性遺傳標誌物是一種新型基因生物標誌物，區別於傳統生物標誌 物，穩定、微創、易於檢測，將大大提高疾病診斷的靈敏度和特異度，該類生物標誌物的成功 開發將為臨床原因不明的NOA的診斷和治療開創全新局面，為其他疾病生物標誌物的研製 提供借鑑。
[0063] (2)遺傳標誌物試劑盒是一種系統、全面的診斷試劑盒，可用於臨床原因不明的 NOA的輔助診斷，有助於反映患者的疾病狀態，為臨床醫生快速準確掌握患者病情、及時採 取更具個性化的防治方案提供支持。
[0064] (3)採用嚴密的驗證和評價體系，本發明人初期採用全外顯子組晶片掃描以獲得 疾病相關的低頻高外顯性遺傳標誌物譜，並在Sequenom MassARRAY基因分型平臺上進行了 驗證；以上方法和策略的應用加速和保證了低頻高外顯性遺傳標誌物的診斷試劑盒在臨床 上的應用，也為其他疾病生物標誌物的研製提供方法和策略上的借鑑。
[0065] 本發明通過控制年齡對疾病發展的影響因素，研究低頻高外顯性遺傳標誌物在臨 床原因不明的NOA輔助診斷的應用前景，闡述低頻高外顯性遺傳標誌物對於臨床原因不明 的NOA進展的影響，揭示其診斷價值。因此，本發明獲得了臨床原因不明的NOA發病相關 的低頻高外顯性遺傳標誌物譜；通過低頻高外顯性遺傳標誌物和診斷試劑盒的研製和應 用，可使得臨床原因不明的NOA的診斷更加方便易行，為臨床醫生快速準確掌握患者病情， 為臨床治療效果評價奠定基礎，並為發現具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫 助。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0066] 圖1 :顯示全外顯子組關聯研究病例組和對照組的ROC曲線。
[0067] 顯示臨床原因不明的NOA病例組對健康男性對照組為參照的ROC曲線。
[0068] 具體實施方法
[0069] 實施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0070] 發明人於2005年4月開始至2013年1月從南京醫科大學生殖醫學中心收集了大 量的NOA患者血標本,通過對樣品資料的整理,發明人從中選擇了 5560例符合下列標準的 樣本全外顯子晶片掃描和單個遺傳標誌物Sequenom MassARRAY基因分型的實驗樣品：
[0071] 1、重複精液質量檢測/辜丸穿刺活檢，確診為無精子症；
[0072] 2、一次射精精液經離心無精子，排除梗阻性病因；
[0073] 3、性功能正常；排除具體隱睪症病史、血液外傷史、睪丸炎、輸精管梗阻、輸精管切 除術、多染色體異常及Y染色體無精子症因子微缺失等具有已知病因的患者；
[0074] 4、與病例年齡匹配的健康男性對照。
[0075] 並系統採集了這些樣本的人口學資料和臨床資料等情況。
[0076] 實施例2外周血DNA中低頻SNV的全外顯子區掃描
[0077] 在上述符合條件的960例臨床原因不明的NOA患者和1800例健康男性對照中，兩 組年齡匹配。將這兩組人群經IlluminaInfinium?Human Exome BeadChip(Illumina Inc·， San Diego, CA)晶片檢測獲得相關結果。具體步驟為：
[0078] 1、向儲存於2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑（即裂解液，40份量配置方法如 下：蔗糖219. 72g、氯化鎂2. 02g和曲拉通X-100 (amresco 0694) 20ml混合後，用TrisHcl溶 液定容至2000ml，下同），顛倒混勻後完全轉入。
[0079] 2、去除紅細胞：用溶血試劑將5ml離心管補至4ml，顛倒混勻，4000rpm離心10分 鍾，棄上清。向沉澱中加入4ml溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄 上清。
[0080] 3、抽提DNA :向沉澱中加 Iml抽提液（每300ml中含有122. 5ml 0.2M氯化鈉， 14. 4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二燒基硫酸鈉，148. Iml雙蒸水，下同）和8μ1蛋 白酶Κ，振蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。
[0081] 4、去除蛋白質：加 Iml飽和酚充分混勻（手輕搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘， 取上清轉入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液（氯仿：異戊 醇=24 : 1，v/v，下同），充分混勻後（手搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘，取上清（分 入兩個I. 5ml的離心管）。
[0082] 5、DNA沉澱：在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無水 乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉澱物，再以12000rpm離心lOmin。
[0083] 6、DNA洗漆：在沉澱中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心IOmin,棄上清後真空抽 幹或置於清潔乾燥環境中蒸乾。
[0084] 7、測量濃度：通常能得到20-50ng/ μ I DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0085] 8、進行全外顯子組掃描：在 Illumina 丨nfinium? Human Exome Beadchip (Illumina Inc.，San Diego, CA)晶片上進行全外顯子區掃描。
[0086] 9、數據分析與處理：在"臨床原因不明的NOA病例"組和"健康男性對照"組中發 現的基因型分布頻率有顯著差異的低頻高外顯性遺傳標誌物在上文中已經羅列出，結果見 表1。
[0087] 表1.病例組與對照組全外顯子組關聯分析結果
[0088]
[0089]
【權利要求】
1. 一種與臨床原因不明的非梗阻性無精子症輔助診斷相關的低頻高外顯性遺傳標 志物，其特徵在於該標誌物為 rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、 rs3130785、rsll7524265、rs9369640、rs34902660、rs2298090、rsl3194053、rsll965377、 rs3893259、rs9261588、rsl264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221、rs3135374、 rs3892710、rs9471969、rs76491994、rsll3857788、rs61756355、rsl80810179、rsl0830430、 rs34719836、rsl87646949、rsl51176313、rs28599881、rsl49543099 和 rsl99747280 的組 合。
2. 權利要求1所述的低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性擴增引物，其特徵在於該引物 為： rs2294228的擴增引物序列為SEQ ID No:l和SEQ ID No:2;rs2180233的擴增引物序 列為 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5;rs41360247 的擴增引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8;rs895497 的擴增引物序列為SEQIDNo:10和SEQIDNo:ll;rs6806528 的擴增引 物序列為SEQ ID No: 13和SEQ ID No: 14 ;rs3130785的擴增引物序列為SEQ ID No: 16和 SEQ ID No:17;rsll7524265 的擴增引物序列為 SEQ ID No:19和SEQ ID No:20;rs9369640 的擴增引物序列為SEQ ID No :22和SEQ ID No :23 ;rs34902660的擴增引物序列為SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ;rs2298090 的擴增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29; rsl3194053的擴增引物序列為SEQ ID No:31和SEQ ID No:32;rsll965377的擴增引物序 列為 SEQ ID No :34 和 SEQ ID No :35 ;rs3893259 的擴增引物序列為 SEQ ID No :37 和 SEQ ID No:38;rs9261588 的擴增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41;rsl264429 的擴 增引物序列為SEQ ID No:43和SEQ ID No:44;rs2523480的擴增引物序列為SEQ ID No:46 和SEQ ID No:47;rs2524276 的擴增引物序列為 SEQ ID No:49和 SEQ ID No:50;rs2255221 的擴增引物序列為SEQ ID No:52和SEQ ID No:53;rs3135374的擴增引物序列為SEQ ID No:55 和 SEQ ID No:56;rs3892710 的擴增引物序列為 SEQ ID No:58 和 SEQ ID No:59; rs9471969的擴增引物序列為SEQ ID No:61和SEQ ID No:62;rs76491994的擴增引物序列 為 SEQ ID No:64 和 SEQ ID No:65;rsll3857788 的擴增引物序列為 SEQ ID No:67 和 SEQ ID No:68;rs61756355 的擴增引物序列為 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71 ;rsl80810179 的 擴增引物序列為SEQ ID No:73和SEQ ID No:74;rsl0830430的擴增引物序列為SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ;rs34719836 的擴增引物序列為 SEQ ID No:79 和 SEQ ID No:80; rsl87646949 的擴增引物序列為 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83;rsl51176313 的擴增引物 序列為 SEQ ID No:85和 SEQ ID No:86;rs28599881 的擴增引物序列為 SEQ ID No:88和 SEQ ID No:89;rsl49543099 的擴增引物序列為 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92;rsl99747280 的擴增引物序列為SEQ ID No:94和SEQ ID No:95。
3. 權利要求1所述的低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性延伸引物對，其特徵在於該引 物為： rs2294228的延伸引物序列為SEQ ID No:3;rs2180233的延伸引物序列為SEQ ID No:6;rs41360247的延伸引物序列為SEQ ID No:9;rs895497的延伸引物序列為SEQ ID No: 12 ;rs6806528的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ;rs3130785的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ;rsll7524265的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ;rs9369640的延伸引物序列為SEQ ID No:24;rs34902660的延伸引物序列為SEQ ID No:27;rs2298090的延伸引物序列為SEQ ID No:30;rsl3194053的延伸引物序列為SEQ ID No:33;rsll965377的延伸引物序列為 SEQ ID No:36;rs3893259的延伸引物序列為SEQ ID No:39;rs9261588的延伸引物序列為 SEQ ID No:42;rsl264429的延伸引物序列為SEQ ID No:45;rs2523480的延伸引物序列為 SEQ ID No:48;rs2524276的延伸引物序列為SEQ ID No:51;rs2255221的延伸引物序列為 SEQ ID No:54;rs3135374的延伸引物序列為SEQ ID No:57;rs3892710的延伸引物序列為 SEQ ID No:60 ;rs9471969 的延伸引物序列為 SEQ ID No:63 ; rs76491994的延伸引物序列為SEQ ID No:66;rsll3857788的延伸引物序列為SEQ ID No:69 ;rs61756355的延伸引物序列為SEQ ID No:72 ;rsl80810179的延伸引物序列為SEQ ID No:75;rsl0830430的延伸引物序列為SEQ ID No:78;rs34719836的延伸引物序列為 SEQ ID No:81 ;rsl87646949 的延伸引物序列為 SEQ ID No:84;rsl51176313 的延伸引物序 列為SEQ ID No:87 ;rs28599881的延伸引物序列為SEQ ID No:90 ;rsl49543099的延伸弓丨 物序列為SEQ ID No:93 ;rsl99747280的延伸引物序列為SEQ ID No:96。
4. 權利要求1所述的低頻高外顯性遺傳標誌物在製備臨床原因不明的非梗阻性無精 子症輔助診斷試劑盒中的應用。
5. 權利要求2所述的低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性擴增引物在製備臨床原因不 明的非梗阻性無精子症輔助診斷試劑盒中的應用。
6. 權利要求3所述的低頻高外顯性遺傳標誌物的特異性延伸引物在製備臨床原因不 明的非梗阻性無精子症輔助診斷試劑盒中的應用。
7. -種臨床原因不明的非梗阻性無精子症輔助診斷試劑盒，其特徵在於該試劑 盒用於檢測外周血 DNA 中 rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、 rs3130785、rsll7524265、rs9369640、rs34902660、rs2298090、rsl3194053、rsll965377、 rs3893259、rs9261588、rsl264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221、rs3135374、 rs3892710、rs9471969、rs76491994、rsll3857788、rs61756355、rsl80810179、rsl0830430、 rs34719836、rsl87646949、rsl51176313、rs28599881、rsl49543099 和 rsl99747280。
8. 根據權利要求7所述的診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有權利要求2所述的特 異性擴增引物和/或權利要求3所述的特異性延伸引物。
9. 根據權利要求7或8所述診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒還包括PCR技術常用的 試劑。
【文檔編號】C12N15/11GK104263822SQ201410469996
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月15日 優先權日:2014年9月15日
【發明者】胡志斌, 沈洪兵, 沙家豪, 林苑, 倪碧嫻 申請人:南京醫科大學